CN114886114A - 百香果虫草综合体果粉及其制备方法 - Google Patents

百香果虫草综合体果粉及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及百香果虫草综合体果粉及其制备方法；本申请利用蛹虫草综合体来制备果粉，为百香果综合体提供更多的产品形式，本申请的蛹虫草综合体经过乳酸菌和百香果浆汁的逐步驯化，有效提高了蛹虫草菌株的酸耐受性，使得蛹虫草菌株在含有百香果果汁的酸性环境中生长能力更强，有效促进了蛹虫草菌株对基底料有益成分的吸收，增强了综合体的保健性能，使得整个综合体具有良好的降血糖功效；同时，在制备果粉的过程中添加了复合益生菌活菌，并研制出针对该复合益生菌的芯材和壁材，使用芯材和壁材对益生菌进行活菌包埋，大大提高了果粉中的活菌数，增强果粉的保健性能。

Description

百香果虫草综合体果粉及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及百香果虫草综合体果粉及其制备方法。
【背景技术】
在现有技术202010902421.9中已公开其百香果蛹虫草综合体的培育方法，该方法是利用百香果做为培育的容器培养蛹虫草的菌丝体，主要是将各种食材和百香果果浆组合成一体，再把蛹虫草菌种接入百香果内，使蛹虫草菌丝体长满整个百香果乃至长出蛹虫草子实体，得到一个百香果蛹虫草综合体，利用该方法制备而得的百香果蛹虫草综合体同时具有整体百香果果体、各种食材和蛹虫草原有的营养、功能成分，还不丧失百香果原有的口味，是一种同时具有美味、休闲、食疗、养生等多功能及特色的保健食品。该综合体目前由广西壮仁堂生物科技有限公司首创，由于该产品外形独特，滋味良好，保健效果突出，上市以来受到了市场的广泛热捧，因此，我们也注意到了该研发成果，并参考该方法制备百香果蛹虫草综合体和相关产品。
在研究过程中我们发现，百香果蛹虫草综合体存在以下几个问题：①蛹虫草植株在制备百香果综合体的过程中，由于培育时需要连带果肉和果汁，而百香果本身酸度较高，经检测，百香果的总酸最高可达到50g/L-60g/L左右，pH大约为2，在此酸度条件下，并不适合蛹虫草植株生长，最终导致蛹虫草植株的生长效果并不良好，对基底料有效物质的转化吸收效果并不好；②该产品不方便携带且容易变质；③该产品经过加工后无菌体活性，不存在益生菌活菌。
因此，为了解决蛹虫草菌株不适应百香果浆汁酸性环境、百香果蛹虫草综合体不方便携带、成品中不存在益生菌活菌的问题，有必要进行进一步的研究，包括对蛹虫草菌株进行驯化、加工各种方便携带的百香果蛹虫草综合体制品，并保证制品中有较高含量的益生菌活菌，能将产品的保健功效发挥到最大。
【发明内容】
鉴于上述内容，为了解决蛹虫草菌株不适应百香果浆汁酸性环境、百香果蛹虫草综合体不方便携带、成品中不存在益生菌活菌的问题，有必要进行进一步的研究，对蛹虫草菌株进行驯化、加工各种方便携带的百香果蛹虫草综合体制品，并保证制品中有较高含量的益生菌活菌，从而将产品的保健功效发挥到最大。
为达到上述目的，本申请采用如下方法：
百香果蛹虫草综合体果粉，所述百香果蛹虫草综合体果粉由百香果蛹虫草综合体、百香果果肉浆粉和复合乳酸菌微胶囊组成；所述百香果蛹虫草综合体与百香果果肉浆粉按照质量比为2:1混合，所述复合乳酸菌微胶囊的添加量为百香果蛹虫草综合体与百香果果肉浆粉混合料质量的10％；
所述百香果蛹虫草综合体由蛹虫草菌株经过驯化培养基驯化后再接种到百香果壳培养基中培养制得；所述驯化培养基中含有乳酸菌；所述百香果果壳培养基中含有中药组分；
所述复合乳酸菌微胶囊的益生菌由植物乳杆菌Lactobacillus plantarumLDVS005、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LDVS008、植物乳杆菌Lactobacillusplantarum LDVS007和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LDVS012菌种按照质量比为1:1:1:1混合而得；所述植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum LDVS005的保藏编号为：CGMCC NO：20027，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LDVS007的保藏编号为：CGMCCNO：20028，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LDVS008的保藏编号为：CGMCC NO：20029，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LDVS012的保藏编号为：CGMCC NO：20030；上述菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020 年6月8日。
进一步的，所述驯化培养基中的乳酸菌为菌株LDVS005、LDVS007和/或LDVS008，其中，最佳的选择为菌株LDVS005、LDVS007和LDVS008的质量比为1:1:1。
进一步的，所述驯化培养基中还含有百香果浆汁。
进一步的，在百香果果壳培养基中所述的中药组分由如下重量份的成分组成：10份人参、 10份黄秋葵、3份黄芪、10份麦冬和2份枸杞子。
进一步的，上述复合乳酸菌微胶囊的芯材由木糖醇、脱脂乳粉、赖氨酸、维生素B按质量比为2:20:1:1混合制得；所述复合乳酸菌微胶囊的壁材由壳聚糖、氯化钙、玉米淀粉和芦荟胶按质量比为40:1:5:5混合制得。
除此外，本申请所述的百香果蛹虫草综合体果粉的方法，该方法包括如下步骤：
将百香果蛹虫草综合体粉碎备用；
将百香果果肉和果汁混合打浆、过滤、干燥后得到百香果肉浆粉备用；
将百香果蛹虫草综合体粉和百香果肉浆粉按照质量比为2:1充分混匀，之后再添加混合料质量10％的复合乳酸菌微胶囊、充分混匀即得。
上述蛹虫草菌株的驯化培养基具体配方和驯化方法如下：
在无菌条件下进行组织分离，在蛹虫草子实体上采取绿豆粒大小的组织，接种到1次驯化培养基上，放置到恒温培养箱中25℃培养，观察菌丝生长情况，如果白色菌丝已布满平板，可进行转接；将相应的菌丝转接到2次驯化培养基上，放置到恒温培养箱中25℃培养，观察菌丝生长情况，如果白色菌丝已布满平板，再进行转接；将相应的菌丝转接到3次驯化培养基上，放置到恒温培养箱中25℃培养，观察菌丝生长情况，如果白色菌丝已布满平板即完成驯化过程；
其中，驯化培养基的复合菌种制备方法为：将MRS液体培养基和过滤后的百香果浆汁按照质量比为1:1混合，之后以0.5％的接种量分别将乳酸菌LDVS005、LDVS008或LDVS007接种到混合培养基中，在37℃条件下厌氧发酵1h，之后得到含乳酸菌的MRS-百香果浆汁液体混合物；之后将含LDVS005的MRS-百香果浆汁液体混合物、含LDVS008的MRS-百香果浆汁液体混合物和含LDVS007的MRS-百香果浆汁液体混合物按照体积比为1:1:1混合得到复合菌种；
1次驯化培养基的制备方法为：将复合菌种(上段制备方法制备而得)和PDA培养基按质量比为1:5的比例混合；
2次驯化培养基的制备方法为：将复合菌种(上段制备方法制备而得)和PDA培养基按质量比为2:5的比例混合；
3次驯化培养基的制备方法为：将复合菌种(上段制备方法制备而得)和PDA培养基按质量比为3:5的比例混合。
利用上述培养基制备百香果蛹虫草综合体的方法如下：
①中药组分：将10份人参、10份黄秋葵、3份黄芪、10份麦冬、2份枸杞子烘干后粉碎、混合备用；
②配制大米培养基：称取50g大米，放入500mL的罐头瓶中，按照每克大米需要1.3mL 营养液向罐头瓶中加入营养液，浸泡2-3h；其中，营养液由如下组分组成：按照1000g大米所需要各营养物质计算，蛋白胨15g、葡萄糖5g、酵母浸膏5g、KH2PO41.5g、MgSO40.75g，加水补充至1L；封口后、高压灭菌、出锅后冷却至室温，备用。
③采集百香果：采集成熟度是8-9成的新鲜百香果为原料，将百香果从中间破开，挖出内部的果肉和浆液一并打成浆汁得到果浆，将去除内部果肉部分的百香果果壳做为培养盒；
④制备混合培养基：将步骤①粉碎的中药组分和步骤②的大米培养基按照1:2的质量比混合，然后加入步骤③的果浆调整含水量在55-60％左右，分装至百香果果壳制成的培养盒中，并将按照常规方法进行灭菌得百香果壳培养基；
接种培菌：在无菌条件下挑取驯化后的蛹虫草菌丝体为菌种接种到的百香果壳培养基中，在温度为16-20℃、湿度为70-75％及暗光的环境下培养3-5天，等菌丝长满料面时，再将培养室的室温环境调整为20-25℃，湿度调整为80-90％，并让菌丝见光，然后继续培养至蛹虫草菌丝体吃透整个培养基，等菌丝表面完全转色后即完成整个蛹虫草菌丝体培育过程；取出此时的蛹虫草菌丝体，得到百香果蛹虫草综合体。
利用上述材料制备微胶囊的方法如下：
①制备菌泥：将LDVS005、LDVS008、LDVS007和LDVS012菌种按照质量比为1:1:1:1混合，然后以5％的接种量接种于MRS培养基中，37℃条件下100r/min震荡培养24h，得活化菌液；然后以体积比为5％的接种量将活化菌液接种于上述方法所得MRS培养基中，37℃条件下100r/min震荡培养24h；取菌液、离心15min，弃上层液体，即得益生菌菌泥；
②将菌泥、芯材辅料和蒸馏水按照质量比为1:1:4混合制备成混悬液即得芯材溶液，其中，芯材辅料由木糖醇、脱脂乳粉、赖氨酸、维生素B按质量比为2:20:1:1混合制得；将壁材材料和蒸馏水按照质量比为1:2的比例配制得到壁材溶液，其中，壁材材料由壳聚糖、氯化钙、玉米淀粉和芦荟胶按质量比为40:1:5:5混合制得。
③微胶囊制备：将芯材溶液与壁材溶液按1:1的体积比混合均匀，制备混合悬浮液；将混合悬浮液，在喷雾干燥机中干燥，得到微胶囊。
上述百香果蛹虫草综合体果粉还具有降血糖和/或提高肠道活菌数上的作用。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请的蛹虫草菌株经过乳酸菌和百香果浆汁的驯化，能显著提高蛹虫草菌株的耐酸生长能力，在驯化时，课题组创新的使用了乳酸菌添加到驯化培养基中，让培养基缓慢生成乳酸，从而慢慢提高蛹虫草菌株的耐酸能力，能更好的适应百香果浆汁的酸性环境，利用该驯化菌株制备百香果蛹虫草综合体能显著提高蛹虫草对基底料有效物质的吸收，增加综合体的保健性能。
2、在百香果果壳培养基中加入具有降血糖功效的中药组合物，能使得百香果蛹虫草综合体具有良好的降血糖功能。
3、在制备果粉时，通过对芯材、壁材辅料的选择，筛选出了一组特别适合提高复合菌株 (LDVS005、LDVS008、LDVS007和LDVS012)的芯材和壁材辅料，对复合乳酸菌进行微胶囊包埋，更大限度的提高了果粉的有益菌含量，进一步提高了果粉的保健价值和营养价值，能促进人体对果粉有益物质的吸收，同时也为百香果蛹虫草综合体的有效利用提供了更多的食品形式。
【具体实施方式】
下面针对具体实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例为对蛹虫草菌株的驯化方法，具体如下：
蛹虫草菌种：由广西壮仁堂生物科技有限公司提供。
一、蛹虫草驯化研究：
(一)采用几种不同的培养基进行驯化：
CK：PDA培养基：马铃薯200g去皮、去芽眼、切块，煮汁10min，纱布过滤、蔗糖20g、蛋白胨5g、琼脂20g，加水至1000mL，高压灭菌即得。
培养基①：百香果浆汁培养基：将百香果果肉果浆取出进行榨汁、过滤得到百香果浆汁；之后将百香果浆汁和PDA培养基(CK)质量比为1:5的比例混合。
培养基②：乳酸菌培养基：将乳酸菌以0.5％的接种量，接种到MRS液体培养基中，在37 ℃条件下厌氧发酵1h，之后，将含有乳酸菌菌株的MRS液体培养基和PDA培养基(CK)质量比为1:5的比例混合。
培养基③：乳酸菌百香果浆汁培养基：将MRS液体培养基和过滤后的百香果浆汁按照质量比为1:1混合，之后以0.5％的接种量将乳酸菌接种到混合培养基中，在37℃条件下厌氧发酵1h，之后，将含有乳酸菌菌株的百香果-MRS复合培养基和PDA培养基(CK)质量比为1:5 的比例混合。
驯化方法：在无菌条件下进行组织分离，在蛹虫草子实体上采取绿豆粒大小的组织，接种到上述培养基①至③和CK培养基的平板上，放置到恒温培养箱中25℃培养，观察菌丝生长情况，如果白色菌丝已布满平板，可进行转接；将相应的菌丝转接到相应的培养基上，共转接2次，即进行3次驯化；第3次驯化培养后，将菌丝体接种在含有质量百分比为20％百香果浆汁的PDA培养基中，在常规条件下进行培养，每天标记一次菌落直径，培养7d，计算菌丝生长速率。
其中，第1次转接时培养基①的百香果浆汁和PDA培养基(CK)的质量比为2:5、培养基②的含有乳酸菌菌株的MRS液体培养基和PDA培养基(CK)的质量比为2:5、培养基③的含有乳酸菌菌株的百香果-MRS复合培养基和PDA培养基(CK)的质量比为2:5的比例混合；
第2次转接时培养基①的百香果浆和PDA培养基(CK)的质量比为3:5、培养基②的含有乳酸菌菌株的MRS液体培养基和PDA培养基(CK)的质量比为3:5、培养基③的含有乳酸菌菌株的百香果-MRS复合培养基和PDA培养基(CK)的质量比为3:5的比例混合。
测试得到的结果如下表：
表1不同培养基对蛹虫草菌株生长的影响
培养基 菌丝体生长速度(mm/d)
培养基① 3.97
培养基② 4.41
培养基③ 5.01
CK(PDA培养基) 4.33
由上表可知，在PDA培养基中加入百香果浆汁的培养基(培养基①)对蛹虫草生长有抑制作用，这与前期研究的结论一致，培养基中添加了百香果浆汁后，会形成一个酸度较高的环境，会影响蛹虫草的生长速率；
而在PDA培养基中添加乳酸菌菌株的培养基(培养基②)其菌丝体生长速率比CK组略高，由此说明了，乳酸菌虽然能形成酸性环境，但是乳酸菌产酸是个较为漫长和循序渐进的过程，在其达到发酵高峰后，蛹虫草菌株也逐渐适应了酸性环境，从而提高了蛹虫草菌株的酸耐受性，达到驯化适应酸性环境的目的；培养基②的菌丝体生长速度比培养基①高也说明了：与直接将蛹虫草菌株放入含有百香果浆汁的酸性溶液中(高酸环境)相比，在培养基②(含乳酸菌)的培养基中，蛹虫草菌株的适应能力更好，驯化效果更佳；
在PDA培养基中同时添加百香果浆汁和乳酸菌菌株培养基(培养基③)蛹虫草菌株的菌丝体生长速率最佳，与CK组相比得到显著提升，由此说明这是最适合用于驯化蛹虫草菌株的培养基，我们推断，这是因为：百香果浆汁和乳酸菌菌株培养基的添加比例为1:1刚开始的酸度并没有培养基①那么高，但是比培养基②要高，在此条件下，蛹虫草菌株的生长没有受到影响，同时还能在乳酸菌的缓慢发酵下，慢慢适应酸度逐渐升高的生长环境，产生较强的耐酸性，从而在最后在含质量百分数为20％的百香果浆汁培养基中能很好的生长，从而为下一步制备百香果综合体提提供准备。
(二)不同的乳酸菌菌株对蛹虫草生长的影响：
采用申请人自行筛选的菌株：LDVS005(保藏编号：CGMCC NO：20027)、LDVS007(保藏编号：CGMCC NO：20028)、LDVS008(保藏编号：CGMCC NO：20029)、LDVS012(保藏编号：CGMCC NO：20030)(上述菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年6月 8日)分别按照步骤(一)第③点的配方配制相应的乳酸菌菌株培养基然后对同一蛹虫草菌株按照步骤(一)的方法进行驯化，不同的是，采用的培养基为培养基③，但是乳酸菌菌株分别采用LDVS005、LDVS007、LDVS008和LDVS012；按照上述驯化方法驯化后，在第3次驯化培养结束后，将菌丝体接种在含有质量百分比为20％百香果浆汁的PDA培养基中，在常规条件下进行培养，每天标记一次菌落直径，培养7d，计算菌丝生长速率，得到的结果如下表：
表2
培养基 菌丝体生长速度(mm/d)
LDVS005 5.01
LDVS007 5.12
LDVS008 5.07
LDVS012 4.34
CK(PDA培养基) 4.13
表中可见，LDVS012的驯化的蛹虫草菌株其菌丝体长度和菌丝体生长速度与表1的CK组相差不大，由此说明了，并非所有的乳酸菌菌株都能起到能改善蛹虫草菌株本身特性，这有可能是不同的乳酸菌菌株其发酵产物有所差异，可能是这些发酵产物对菌丝体的生长产生了影响，从而让蛹虫草菌株更适合于在百香果浆汁中生长，具体的机理还需要进一步进行研究，而其他的乳酸菌菌株：LDVS005、LDVS008和LDVS007其对蛹虫草菌株的促生长作用尤为突出，说明大部分的乳酸菌菌株都能添加到百香果浆汁中，从而起到促进蛹虫草菌株能适应百香果浆汁的高酸度环境，达到良好的驯化效果。
(三)结合本实施例第(一)和第(二)点研究的结合，课题组选择采用LDVS005、LDVS008 和LDVS007组合制备复合菌株来制备蛹虫草菌株的驯化培养基，具体驯化步骤如下：
制备原料培养基：将MRS液体培养基和过滤后的百香果浆汁按照质量比为1:1混合，之后以0.5％的接种量分别将乳酸菌LDVS005、LDVS008或LDVS007接种到混合培养基中，在37 ℃条件下厌氧发酵1h，之后得到含乳酸菌的百香果-MRS复合培养基；之后将含LDVS005的百香果-MRS复合培养基、含LDVS008的百香果-MRS复合培养基和含LDVS007的百香果-MRS复合培养基按照体积比为1:1:1混合得到复合菌种；
然后将利用上述方法制备得到的复合菌种和PDA培养基按质量比为1:5的比例混合制备 1次驯化培养基、将复合菌种和PDA培养基按质量比为2:5的比例混合制备2次驯化培养基、将复合菌种和PDA培养基按质量比为3:5的比例混合制备3次驯化培养基；
驯化培养：
在无菌条件下进行组织分离，在蛹虫草子实体上采取绿豆粒大小的组织，接种到上述1 次驯化培养基平板上，放置到恒温培养箱中25℃培养，观察菌丝生长情况，如果白色菌丝已布满平板，可进行转接；将相应的菌丝转接到2次驯化培养基平板上，放置到恒温培养箱中25℃培养，观察菌丝生长情况，如果白色菌丝已布满平板，再进行转接；将相应的菌丝转接到3次驯化培养基平板上，放置到恒温培养箱中25℃培养，观察菌丝生长情况，如果白色菌丝已布满平板即完成驯化过程。
驯化后蛹虫草菌株的耐酸性实验：
培养基：以PDA培养基为基础培养基，向培养基中加入柠檬酸来调节培养基的总酸(培养基的总酸采用中和滴定法计算)；总酸调节到10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L 和70g/L。
在常规条件下培养未驯化和采用上述方法驯化后的蛹虫草菌株，每天标记一次蛹虫草菌株的菌落直径，培养7d，计算菌丝生长速率，得到的结果如下表：
表3蛹虫草菌株的耐酸实验
Figure RE-GDA0003609718830000081
从上表可见，本申请的蛹虫草菌株经过上述步骤驯化后，最高可以在总酸含量为50g/L 的培养基中生长(接近百香果果实的酸度)，在总酸含量为10-20g/L的培养基中还能保持较快的生长速率；而未经过驯化后的蛹虫草菌株，最高仅可在总酸含量为20g/L的培养基中生长，但在总酸含量为20g/L的条件下，菌丝生长速率明显降低。
实施例2：
本实施例为百香果蛹虫草综合体的制备，并研究制备得到的百香果蛹虫草综合体的降血糖功效，具体如下：
(1)挑取实施例1第(三)步骤驯化后的蛹虫草菌丝体做为实验组，挑取在PDA培养基上驯化后的蛹虫草菌丝体做为对照组；
(2)配制培养料：
①中药组分：将10份人参、10份黄秋葵、3份黄芪、10份麦冬、2份枸杞子烘干后粉碎、混合备用；
②配制大米培养基：称取50g大米，放入500mL的罐头瓶中，按照每克大米需要1.3mL 营养液向罐头瓶中加入营养液，浸泡2-3h；其中，营养液由如下组分组成：按照1000g大米所需要各营养物质计算，蛋白胨15g、葡萄糖5g、酵母浸膏5g、KH2PO41.5g、MgSO40.75g，加水补充至1L；封口后、高压灭菌、出锅后冷却至室温，备用。
③采集百香果：采集成熟度是8-9成的新鲜百香果为原料，将百香果从中间破开，挖出内部的果肉和浆液一并打成浆汁得到果浆，将去除内部果肉部分的百香果果壳做为培养盒；
④制备混合培养基：将步骤①粉碎的中药组分和步骤②的大米培养基按照1:2的质量比混合，然后加入步骤③的果浆调整含水量在55-60％左右，分装至百香果果壳制成的培养盒中，并将按照常规方法进行灭菌得百香果壳培养基。
(3)接种培菌：在无菌条件下将步骤(1)实验组和对照组的蛹虫草菌株分别接种到步骤(2)的培养基中，在温度为16-20℃、湿度为70-75％及暗光的环境下培养3-5天，等菌丝长满料面时，再将培养室的室温环境调整为20-25℃，湿度调整为80-90％，并让菌丝见光，然后继续培养至蛹虫草菌丝体吃透整个培养基，等菌丝表面完全转色后即完成整个蛹虫草菌丝体培育过程；取出此时的蛹虫草菌丝体，取出此时的蛹虫草菌丝体，得到百香果蛹虫草综合体。
此外，本实施例还设置了一个中药组，中药组即采用：10份人参、10份黄秋葵、3份黄芪、10份麦冬、2份枸杞子烘干后粉碎、混合制备得到的混合粉末。
将实验组和对照组的百香果蛹虫草综合体均经过烘干、粉碎，制备粉末，得到实验组粉末和对照组粉末。
降糖实验：
采用高血糖小鼠动物模型分析上述几组实验的降血糖能力，具体如下：
采用腹腔注射四氧嘧啶制成高血糖小鼠模型；将糖尿病模型小鼠50只，按体重与血糖均衡原则随机分为5组，每组10只，
将上述实验组、对照组、中药组的粉末与水按照质量比为1:20混合，充分搅拌制备成混悬液；然后按照10mg/kg·次的给药量对小鼠进行灌喂小鼠，一天灌喂2次，间隔12h；
同时，该实验还设有阳性对照组，阳性对照组采用降糖药物阿卡波糖，按照产品说明书给高血糖小鼠使用药品；
此外还设血糖组：血糖组不服用任何降糖药物，仅灌喂生理盐水；
正常组：正常组为正常小鼠。
按照上述的分组给药方式连续给药或产品30d，末次给药后禁食，测定空腹血糖浓度。具体试验数据见表4。
表4不同的百香果蛹虫草综合体对血糖效果的影响
组别 灌喂前血糖值(mmol/L) 灌喂30d后血糖值(mmol/L)
实验组 24.11 9.45
对照组 23.97 13.57
中药组 24.57 9.04
阳性对照组 25.14 8.13
正常组 6.34 6.38
血糖组 24.16 25.34
从上表可知，实验组、对照组、中药组、阳性对照组灌喂后血糖含量均有所降低，但仍比正常组的血糖值略高；中药组比阳性对照组血糖值略高，说明，中药组的降血糖效果接近于阿卡波糖；实验组的降血糖效果比对照组显著降低，由此说明，蛹虫草菌株经过驯化之后生长速度加快，菌丝健壮，因此能转化更多的中药培养基中的有效成分，最终使得蛹虫草菌株具有更良好的降血糖效果。
实施例3：
制备百香果果粉：
从实施例2实验可以看出，经过乳酸菌复合菌株驯化之后，百香果蛹虫草综合体的降血糖效果得到提升，但是，该百香果综合体并不方便携带，而且经过一系列的驯化、粉碎等操作后，果粉中并没有含有活菌，因此，为了方便携带且保证果粉中的活菌含量，申请人对自行筛选的益生菌：LDVS005、LDVS008、LDVS007和LDVS012复合菌进行活菌包埋，添加到果粉中以提高果粉中的活菌数，进一步达到提高食用者体内益生菌活菌数、调节肠道的作用，具体的研究方法如下：
(一)制备乳酸菌微胶囊：
(1)芯材制备；
①制备菌泥：将LDVS005、LDVS008、LDVS007和LDVS012菌种按照质量比为1:1:1:1混合，然后以5％的接种量接种于MRS培养基中，37℃条件下100r/min震荡培养24h，得活化菌液；然后以体积比为5％的接种量将活化菌液接种于上述方法所得MRS培养基中，37℃条件下100r/min震荡培养24h；取菌液、离心15min，弃上层液体，即得益生菌菌泥；
②将菌泥、芯材辅料和蒸馏水按照质量比为1:1：4混合制备成混悬液即得芯材溶液。
(2)壁材制备；
将壁材材料和蒸馏水按照质量比为1:2的比例配制得到壁材溶液。
(3)微胶囊制备；
将芯材溶液与壁材溶液按1:1的体积比混合均匀，制备混合悬浮液；将混合悬浮液，在喷雾干燥机中干燥，得到微胶囊。
课题组在选择芯材和壁材时做了如下选料实验，具体如下：
芯材的选料实验：
组1：芯材辅料为：木糖醇、脱脂乳粉按质量比为1:10制得
组2：芯材辅料为：脱脂乳粉、赖氨酸按质量比为20:1制得
组3：芯材辅料为：木糖醇、脱脂乳粉、赖氨酸、维生素B按质量比为2:20:1:1制得空白组：仅菌泥，无芯材；
测定方法：
按照步骤(1)的方法制备得到益生菌菌泥后，在37℃恒温箱中放置48h后，再按照：样品：无菌生理盐水＝1:10的质量比混合稀释，然后依次做梯度稀释，每次稀释倍数均为10倍，取各稀释度的稀释液0.05ml，均匀涂布在MRS培养基，放入37℃恒温培养箱培养24h，选择菌落数在10-200之间的稀释度作为最后稀释倍数，并取相应稀释液涂布于MRS培养基，并做3个平行板，放于37℃恒温培养箱培养24h后计数并取平均值得到的活菌数如下表所示：
表5
测试项 组1 组2 组3 空白组
活菌数(CFU/g) 8.69×10<sup>12</sup> 8.01×10<sup>12</sup> 6.45×10<sup>13</sup> 8.59×10<sup>12</sup>
由上表可知，组1的芯材辅料有效活菌数与空白组接近，组2的有效活菌数略低于空白组，组3的有效活菌数高于空白组，由此说明，并非所有有报道的芯材材料都会促进本申请的复合乳酸菌菌株活菌数，不同的微生物其生理特性不同，有些芯材辅料能促进上述乳酸菌生长，但是有些芯材辅料并不能促进乳酸菌生长，甚至还会抑制乳酸菌的生长。
壁材材料选择：
从上述芯材辅料的研究结果中知道，利用组3的芯材辅料制备微胶囊来选择壁材，具体如下：
组A：芯材材料为组3的材料(木糖醇、脱脂乳粉、赖氨酸、维生素B按质量比为2:20:1:1 制得)、壁材材料为：壳聚糖和氯化钙按质量比为40:1混合。
组B：芯材材料为组3的材料(木糖醇、脱脂乳粉、赖氨酸、维生素B按质量比为2:20:1:1 制得)、壁材材料为：壳聚糖、氯化钙和玉米淀粉按质量比为40:1:10混合。
组C：芯材材料为组3的材料(木糖醇、脱脂乳粉、赖氨酸、维生素B按质量比为2:20:1:1 制得)、壁材材料为：壳聚糖、氯化钙、玉米淀粉和芦荟胶按质量比为40:1:5:5混合。
CK组：无芯材辅料、壁材材料为：壳聚糖和氯化钙按质量比为40:1混合。
对上述益生菌活菌包埋效率进行测定，具体方法如下：
①样品表面活菌菌落数的测定：取1g样品3份，分别用1ml、2ml、4ml 0.9wt％生理盐水分散，分别取分散后混合液各1ml加入培养皿中，加入5mlMRS培养基，37℃培养72h，对菌落进行计数并取平均值，所得平均值即为样品表面的活菌菌落数。
②样品中含有的活菌菌落数的测定：将1g样品加入10ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液中，待完全溶解后进行活菌菌落数计数。
组A-组C菌泥中的活菌菌落数的测定参照表4的组3；
CK组菌泥中的活菌菌落数的测定参照表4的空白组。
计算包埋效率和包埋产率，具体如下：
包埋效率＝(1-样品表面活菌菌落数/样品中含有的活菌菌落数)×100％；
包埋产率＝(样品中含有的活菌菌落数/益生菌菌泥中的活菌菌落数)×100％；
得到的结果如下表：
表6
Figure RE-GDA0003609718830000131
由表5可知，从活菌数、包埋产率、包埋效率来看组B＞组C＞组A＞CK组，由此可见组B壳材的包埋效果、产率优于组C，优于组A优于CK组，为此，为了最大限度的提高益生菌微胶囊的活菌数，本申请应选择芯材为：芯材材料为组3的材料(木糖醇、脱脂乳粉、赖氨酸、维生素B按质量比为2:20:1:1制得)、壁材材料为：壳聚糖、氯化钙和玉米淀粉按质量比为40:1:10混合。
(二)制备百香果果粉：
具体制备方法如下：
将百香果蛹虫草综合体粉碎备用；
将百香果果肉和果汁混合打浆、过滤、干燥后得到百香果肉浆粉备用；
将百香果蛹虫草综合体粉和百香果肉浆粉按照质量比为2:1充分混匀，然后添加原料质量10％的步骤(一)制备得到的复合乳酸菌微胶囊、充分混匀即得。
综上，得出本申请的百香果果粉最佳制备方法如下：
(1)对蛹虫草进行驯化：
在无菌条件下进行组织分离，在蛹虫草子实体上采取绿豆粒大小的组织，接种到1次驯化培养基上，放置到恒温培养箱中25℃培养，观察菌丝生长情况，如果白色菌丝已布满平板，可进行转接；将相应的菌丝转接到2次驯化培养基上，放置到恒温培养箱中25℃培养，观察菌丝生长情况，如果白色菌丝已布满平板，再进行转接；将相应的菌丝转接到3次驯化培养基上，放置到恒温培养箱中25℃培养，观察菌丝生长情况，如果白色菌丝已布满平板即完成驯化过程；
其中，驯化培养基的复合菌种制备方法为：将MRS液体培养基和过滤后的百香果浆汁按照质量比为1:1混合，之后以0.5％的接种量分别将乳酸菌LDVS005、LDVS008或LDVS007接种到混合培养基中，在37℃条件下厌氧发酵1h，之后得到含乳酸菌的百香果-MRS复合培养基；之后将含LDVS005的百香果-MRS复合培养基、含LDVS008的百香果-MRS复合培养基和含 LDVS007的百香果-MRS复合培养基按照体积比为1:1:1混合得到复合菌种；
1次驯化培养基的制备方法为：将复合菌种(上段制备方法制备而得)和PDA培养基按质量比为1:5的比例混合；
2次驯化培养基的制备方法为：将复合菌种(上段制备方法制备而得)和PDA培养基按质量比为2:5的比例混合；
3次驯化培养基的制备方法为：将复合菌种(上段制备方法制备而得)和PDA培养基按质量比为3:5的比例混合；
(2)制备百香果蛹虫草综合体：
1)配制培养料：
①中药组分：将10份人参、10份黄秋葵、3份黄芪、10份麦冬、2份枸杞子烘干后粉碎、混合备用；
②配制大米培养基：称取50g大米，放入500mL的罐头瓶中，按照每克大米需要1.3mL 营养液向罐头瓶中加入营养液，浸泡2-3h；其中，营养液由如下组分组成：按照1000g大米所需要各营养物质计算，蛋白胨15g、葡萄糖5g、酵母浸膏5g、KH2PO41.5g、MgSO40.75g，加水补充至1L；封口后、高压灭菌、出锅后冷却至室温，备用。
③采集百香果：采集成熟度是8-9成的新鲜百香果为原料，将百香果从中间破开，挖出内部的果肉和浆液一并打成浆汁得到果浆，将去除内部果肉部分的百香果果壳做为培养盒；
④制备混合培养基：将步骤①粉碎的中药组分和步骤②的大米培养基按照1:2的质量比混合，然后加入步骤③的果浆调整含水量在55-60％左右，分装至百香果果壳制成的培养盒中，并将按照常规方法进行灭菌得百香果壳培养基；
2)接种培菌：在无菌条件下挑取步骤(1)驯化后的蛹虫草菌丝体为菌种接种到步骤1) 的百香果壳培养基中，在温度为16-20℃、湿度为70-75％及暗光的环境下培养3-5天，等菌丝长满料面时，再将培养室的室温环境调整为20-25℃，湿度调整为80-90％，并让菌丝见光，然后继续培养至蛹虫草菌丝体吃透整个培养基，等菌丝表面完全转色后即完成整个蛹虫草菌丝体培育过程；取出此时的蛹虫草菌丝体，取出此时的蛹虫草菌丝体，得到百香果蛹虫草综合体。
(3)制备果粉：
1)复合乳酸菌微胶囊制备：
①制备菌泥：将LDVS005、LDVS008、LDVS007和LDVS012菌种按照质量比为1:1:1:1混合，然后以5％的接种量接种于MRS培养基中，37℃条件下100r/min震荡培养24h，得活化菌液；然后以体积比为5％的接种量将活化菌液接种于上述方法所得MRS培养基中，37℃条件下100r/min震荡培养24h；取菌液、离心15min，弃上层液体，即得益生菌菌泥；
②将菌泥、芯材辅料和蒸馏水按照质量比为1:1：4混合制备成混悬液即得芯材溶液，其中，芯材辅料由木糖醇、脱脂乳粉、赖氨酸、维生素B按质量比为2:20:1:1混合制得；将壁材材料和蒸馏水按照质量比为1:2的比例配制得到壁材溶液，其中，壁材材料由壳聚糖、氯化钙、玉米淀粉和芦荟胶按质量比为40:1:5:5混合制得。
③微胶囊制备：将芯材溶液与壁材溶液按1:1的体积比混合均匀，制备混合悬浮液；将混合悬浮液，在喷雾干燥机中干燥，得到微胶囊。
将百香果蛹虫草综合体粉碎备用；
将百香果果肉和果汁混合打浆、过滤、干燥后得到百香果肉浆粉备用；
将百香果蛹虫草综合体粉和百香果肉浆粉按照质量比为2:1充分混匀，之后再添加混合料质量10％的复合乳酸菌微胶囊、充分混匀即得。
综上所述，本申请利用蛹虫草综合体来制备果粉，为百香果综合体的产品提供更多的食品形式，通过对蛹虫草菌株的驯化，有效提高了蛹虫草菌株的酸耐受性，解决了蛹虫草菌株不能在百香果浆汁中有效生长的问题，蛹虫草菌株生长旺盛，有效提高了对基底料的有益成分的吸收使得整个综合体具有良好的降血糖功效；同时，在制备果粉的过程中添加了益生菌活菌，并对益生菌进行包埋，更大限度的提高了果粉中的活菌数，增加果粉的保健性能。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (8)

1.百香果蛹虫草综合体果粉，其特征在于，所述百香果蛹虫草综合体果粉由百香果蛹虫草综合体、百香果果肉浆粉和复合乳酸菌微胶囊组成；所述百香果蛹虫草综合体与百香果果肉浆粉按照质量比为2:1混合，所述复合乳酸菌微胶囊的添加量为百香果蛹虫草综合体与百香果果肉浆粉混合料质量的10％；
所述蛹虫草综合体由蛹虫草菌株经过驯化培养基驯化后再接种到百香果壳培养基中培养制得；所述驯化培养基中含有乳酸菌；所述百香果果壳培养基中含有中药组分；
所述复合乳酸菌微胶囊的益生菌由菌株LDVS005、LDVS008、LDVS007和LDVS012按照质量比为1:1:1:1混合而得；所述菌株LDVS005的保藏编号为：CGMCC NO：20027，LDVS007的保藏编号为：CGMCC NO：20028，LDVS008的保藏编号为：CGMCC NO：20029，LDVS012的保藏编号为：CGMCC NO：20030。
2.根据权利要求1所述的百香果蛹虫草综合体果粉，其特征在于，所述驯化培养基中的乳酸菌为菌株LDVS005、LDVS007和/或LDVS008。
3.根据权利要求2所述的百香果蛹虫草综合体果粉，其特征在于，所述菌株LDVS005、LDVS007和LDVS008的质量比为1:1:1。
4.根据权利要求1所述的百香果蛹虫草综合体果粉，其特征在于，所述驯化培养基中还含有百香果浆汁。
5.根据权利要求1所述的百香果蛹虫草综合体果粉，其特征在于，所述中药组分由如下重量份的成分组成：10份人参、10份黄秋葵、3份黄芪、10份麦冬和2份枸杞子。
6.根据权利要求1所述的百香果蛹虫草综合体，其特征在于，所述复合乳酸菌微胶囊的芯材由木糖醇、脱脂乳粉、赖氨酸、维生素B按质量比为2:20:1:1混合制得；所述复合乳酸菌微胶囊的壁材由壳聚糖、氯化钙、玉米淀粉和芦荟胶按质量比为40:1:5:5混合制得。
7.如权利要求1-6任意一项所述的百香果蛹虫草综合体果粉在降血糖和/或提高肠道活菌数上的应用。
8.一种制备如权利要求1-6任意一项所述百香果蛹虫草综合体果粉的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将百香果蛹虫草综合体粉碎备用；
将百香果果肉和果汁混合打浆、过滤、干燥后得到百香果肉浆粉备用；
将百香果蛹虫草综合体粉和百香果肉浆粉按照质量比为2:1充分混匀，之后再添加混合料质量10％的复合乳酸菌微胶囊、充分混匀即得。
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