CN114875032A - 一种过表达aurka基因质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

一种过表达aurka基因质粒及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种过表达AURKA基因质粒及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明过表达AURKA基因质粒的构建方法包括：sgRNA退火形成双链；质粒酶切成线性质粒；将sgRNA与质粒连接。本发明使用CRISPRa系统对AURKA基因进行过表达，通过设计和优化sgRNA，能够准确使靶细胞中AURKA过表达。

Description

一种过表达AURKA基因质粒及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种过表达AURKA基因质粒及其构建方法和应用。
背景技术
乳腺癌仍然是威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一，乳腺癌的发生和发展与其自身的自我更新及分化存在相关性，不同类型的乳腺癌治疗手段不尽相同，因此，了解乳腺癌的生物学特征对患者治疗的选择具有重要指导意义。特殊类型乳腺癌近年发病率较前有所上升，虽然总体预后较浸润性导管癌好，但仍有一部分患者早期发生复发或转移，除了肿块大小、分期、淋巴结转移等临床病理因素以外，影响不良预后的分子机制仍不明确。
AURKA基因可参与多条重要的细胞信号通路传导,它作为激酶可直接或间接地激活多种致癌蛋白、或使多种抑癌蛋白失活,从而推动肿瘤的发生与发展。AURKA基因在不同的细胞类型和不同的外部刺激下，对肿瘤的分化作用可能有所不同。
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）技术是一种功能强大的基因组编辑技术。工程化的CRISPR/Cas9是由sgRNA和Cas9组成。CRISPRa（CRISPR-Cas9-based gene activation）是一种基于CRISPR技术的新型强力的RNA导向的转录激活系统，能够特异性激活内源性基因的表达。Cas9具有两个功能结构域HNH和RuvC，具有核酸内切酶活性。同时突变两个结构域（H840A和D10A突变），Cas9失去内切酶活性（deactivated Cas9，dCas9），转变成sgRNA导向的DNA结合蛋白。将dCas9与转录激活因子融合，在sgRNA指导下结合在基因的启动子区域，可强力激活内源性基因的表达，有效地克服了基因诱导表达中内源性基因难以活化的不足。
通过CRISPRa构建AURKA的过表达载体用以研究其与乳腺癌的相关性，具有重要意义。
发明内容
AURKA基因可以作为乳腺癌检测和治疗的研究靶点，采用分析术后患者的AURKA表达与预后相关性等方法研究其在乳腺癌发生发展中的作用。为研究AURKA的功能以及与之相关的乳腺癌生物学特征，可以通过体外调节AURKA表达进行研究，在体外调节中，需要对靶细胞中AURKA基因进行过表达，因此需要相应的过表达的“工具”和方法。
本发明的目的在于提供一种过表达AURKA基因的sgRNA序列。
为达到上述发明目的，采用如下技术方案。
一种用于CRISPRa系统的过表达靶细胞内AURKA基因的sgRNA序列，包括SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的sgRNA。
优选地，sgRNA序列还包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的反向互补序列。
优选地，sgRNA的靶序列包括AURKA转录起始点（TSS）上游-300至+0位置。
本发明提供的sgRNA能够提高CRISPRa系统的激活转录的能力，从而使目的基因过表达。
本发明的第二个目的在于提供一种过表达AURKA基因的质粒。
一种用于CRISPRa系统的的过表达靶细胞内AURKA基因的质粒，质粒包括SEQ IDNO.1和/或SEQ ID NO.2所示的sgRNA。
优选地，所使用的质粒为lenti sgRNA（MS2）_zeo backbone质粒。
优选地，过表达AURKA基因的质粒的构建方法，包括：
sgRNA退火形成双链；质粒酶切成线性质粒；将sgRNA与质粒连接。
本发明的第三个目的在于提供一种过表达AURKA基因的慢病毒。
一种用于CRISPRa系统的过表达靶细胞内AURKA基因的慢病毒，慢病毒包括过表达AURKA基因的质粒。
优选地，过表达靶细胞内AURKA基因的慢病毒的构建方法，包括：
培养293T细胞；
细胞转染；
慢病毒收集。
更优选地，细胞培养的步骤包括：
取293细胞或293T细胞培养至细胞密度70-80%。
更优选地，细胞转染的步骤包括：
取sgRNA质粒、慢病毒包装质粒，加入转染试剂；混合后加入293细胞或293T细胞，培养8-10h；培养后使用PBS缓冲液洗涤，更换培养基继续培养。
更优选地，慢病毒收集的步骤包括：
转染后，取细胞上清液，离心、过滤；弃上清，向沉淀中加入病毒保存缓冲液即得sgRNA慢病毒。
本发明的第四个目的在于提供一种过表达AURKA基因的方法。
一种过表达靶细胞内AURKA基因的方法，包括使用能够过表达靶细胞内AURKA基因的慢病毒感染靶细胞。
优选地，过表达AURKA基因的方法，包括如下步骤：
sgRNA的设计；sgRNA质粒的构建；sgRNA慢病毒的构建；AURKA基因的过表达。
更优选地，AURKA基因的过表达步骤包括：
使用上述方法制得的sgRNA慢病毒感染靶细胞；感染后，对细胞进行加压筛选，筛选获得的阳性克隆即为AURKA过表达细胞。
更进一步优选地，加压筛选所使用的培养基为含Blasticidin S HCl或Hygromycin B的培养基。
更进一步优选地，加压筛选所使用的培养基为含Blasticidin S HCl（10-15μg/mL）或Hygromycin B（300-400μg/mL）的培养基。
更进一步优选地，加压筛选所使用的培养基为含Blasticidin S HCl、5,5-二甲基海因和D-半乳糖的培养基。
更进一步优选地，加压筛选所使用的培养基为含Hygromycin B、5,5-二甲基海因和D-半乳糖的培养基。
5,5-二甲基海因具有一定抗菌能力，有利于防止细菌感染，5,5-二甲基海因与D-半乳糖混合添加入培养基，给细胞生长提供一定环境压力，有利于细胞的筛选，能够使获得的细胞具有更高的AURKA表达量。
更进一步优选地，5,5-二甲基海因的添加量为每毫升培养基100-170mg。
更进一步优选地，D-半乳糖的添加量为每毫升培养基10-25mg。
本发明还公开了上述sgRNA在过表达靶细胞内AURKA基因中的用途。
本发明还公开了上述质粒在过表达靶细胞内AURKA基因中的用途。
本发明还公开了上述慢病毒在过表达靶细胞内AURKA基因中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明使用CRISPRa系统对AURKA基因进行过表达，本发明通过设计和优化sgRNA，能够准确使靶细胞中AURKA过表达；此外，在筛选AURKA过表达细胞时，除了使用抗生素进行筛选外，还使用含有5,5-二甲基海因与D-半乳糖的培养基进行筛选，通过此种方法筛选的AURKA过表达细胞中AURKA的表达量更高。
附图说明
图1为各实施例中制得的AURKA过表达细胞1中AURKA表达量的Realtime-PCR测定结果；
图2为各实施例中制得的AURKA过表达细胞1中AURKA表达量的Western blot测定结果；
图3为各实施例中制得的AURKA过表达细胞2中AURKA表达量的Realtime-PCR测定结果；
图4为各实施例中制得的AURKA过表达细胞2中AURKA表达量的Western blot测定结果。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是本公开的一些方面相一致的方法的例子。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例使用的培养基均为DMEM培养基（含10%小牛血清），购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
下述实施例和试验例所使用的细胞均购自中国科学院细胞库，由申请人实验室进行保藏。
实施例1
sgRNA的设计
在NCBI获取AURKA基因序列，以序列的第一个碱基为转录起始位点（TSS），向上游查询-300bp，作为靶序列。根据靶序列，设计sgRNA序列，如表1所示。
表1 sgRNA序列
sgRNA序列 PAM序列 距TSS的位置 所在链 编号
TAAACGCGACTCAAGGCGTC（SEQ ID NO.1） GGG -103 - 1
ACGCCTTGAGTCGCGTTTAA（SEQ ID NO.2） GGG -118 + 2
设计后交由上海生工进行合成sgRNA及其互补链。
实施例2
sgRNA质粒的构建
1、sgRNA退火形成双链
配制如下反应体系：
选择sgRNA1寡核苷酸链以及其互补链各1μL，10×Buffer 1μL，双蒸水补齐10μL；
将反应体系置于PCR仪中，按照如下条件进行退火：
37℃ 30min，95℃ 3min，90℃ 1min，梯度退火5℃/min；温度降至4℃停止；
反应结束后即得双链sgRNA1；
2、质粒酶切
选择lenti sgRNA（MS2）_zeo backbone质粒（Addgene ID 61427），配制如下体系：
10×buffer 5μL，质粒1μL，BbsI（10U/μl）1μL，双蒸水补齐50μL；
将反应体系置于37℃过夜酶切，酶切后跑胶并割胶回收即得线性质粒1；
3、sgRNA连接质粒
配制如下反应体系：
2× solution I 5μL，线性质粒1μL，双链sgRNA 1μL，双蒸水补齐10μL；
将反应体系置于22℃ 3h即得sgRNA质粒1；
4、转化
分别将10μL sgRNA质粒与100μL感受态细胞混合，进行转化，使用感受态细胞对载体进行扩增；转化时间为12h，转化温度为37℃；
转化后，挑取长势良好的单菌落进行sgRNA质粒的提取，并将提取的sgRNA质粒1保存在TE缓冲液中。
按照上述方法使用sgRNA2制得sgRNA质粒2。
实施例3
慢病毒的构建
1、sgRNA慢病毒的构建
使用实施例2中制得的sgRNA质粒与慢病毒包装质粒PMD2.G和PsPax2混合，共同转染293T细胞；具体步骤如下：
细胞培养：
取对数生长期的293T细胞，使用胰蛋白酶消化后，加入培养基稀释至2×105个/mL；将稀释后的293T细胞重新接种进新的培养皿，并培养至细胞密度70-80%；
细胞转染：
取sgRNA质粒、慢病毒包装质粒PMD2.G和PsPax2，加入转染试剂（购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司）并按说明书配比混合均匀；混合后加入293T细胞，37℃，5%CO2培养8h；培养后使用PBS缓冲液洗涤，更换培养基继续培养48h；
慢病毒收集：
转染后，取293T细胞上清液，离心除去细胞碎片；取上清使用45μm滤膜进行过滤，将滤液再次离心；弃上清，向沉淀中加入病毒保存缓冲液即得sgRNA慢病毒1。
按照上述方法使用sgRNA质粒2构建sgRNA慢病毒2。
2、dCAS-VP64融合蛋白慢病毒的构建
使用lenti dCAS-VP64_Blast质粒（Addgene ID 61425）与慢病毒包装质粒PMD2.G和PsPax2混合，共同转染293T细胞；具体步骤同“sgRNA慢病毒的构建”。
3、MS2-P65-HSF1融合蛋白慢病毒的构建
使用lenti MS2-P65-HSF1_Hygro质粒（Addgene ID 61426）与慢病毒包装质粒PMD2.G和PsPax2混合，共同转染293T细胞；具体步骤同“sgRNA慢病毒的构建”。
实施例4
AURKA基因的过表达
AURKA基因低表达的乳腺癌T47D细胞进行基因过表达转染：
所使用AURKA基因低表达的乳腺癌T47D细胞通过筛选临床样本获得；
使用实施例3中制得的sgRNA慢病毒1、dCAS-VP64融合蛋白慢病毒、MS2-P65-HSF1融合蛋白慢病毒共同感染T47D细胞，取乳腺癌T47D细胞接种入6孔板培养，每孔约2×105个，将sgRNA慢病毒溶液与细胞培养液混匀，慢病毒颗粒与细胞的比为100:1；37℃培养12h后更换培养基继续培养；培养2d后，将细胞置于含Blasticidin S HCl （10 μg/mL）的培养基中进行筛选，再使用Hygromycin B（300μg/mL）进行筛选，获得阳性克隆即为AURKA过表达细胞1。
按照上述方法使用sgRNA慢病毒2获得AURKA过表达细胞2。
实施例5
AURKA基因的过表达
AURKA基因低表达的乳腺癌T47D细胞进行基因过表达转染：
所使用AURKA基因低表达的乳腺癌T47D细胞通过筛选临床样本获得；
使用实施例3中制得的sgRNA慢病毒1、dCAS-VP64融合蛋白慢病毒、MS2-P65-HSF1融合蛋白慢病毒共同感染T47D细胞，取乳腺癌T47D细胞接种入6孔板培养，每孔约2×105个，将sgRNA慢病毒溶液与细胞培养液混匀，慢病毒颗粒与细胞的比为100:1；37℃培养12h后更换培养基继续培养；培养2d后，将细胞置于含Blasticidin S HCl （10 μg/mL）的培养基中进行筛选，再使用含Hygromycin B（300μg/mL）的培养基进行筛选，最后使用含5,5-二甲基海因137mg/mL和D-半乳糖16mg/mL的培养基进行培养；培养结束获得阳性克隆即为AURKA过表达细胞1。
按照上述方法使用sgRNA慢病毒2获得AURKA过表达细胞2。
实施例6
AURKA基因的过表达
本实施例与实施例5的不同之处在于筛选后使用含5,5-二甲基海因137mg/mL的培养基进行培养，其他操作步骤均同实施例5。最终获得AURKA过表达细胞1和2。
实施例7
AURKA基因的过表达
本实施例与实施例5的不同之处在于筛选后使用含D-半乳糖16mg/mL的培养基进行培养，其他操作步骤均同实施例5。最终获得AURKA过表达细胞1和2。
实施例8
AURKA基因的过表达
本实施例与实施例4的不同之处在于使用乳腺癌T47D细胞进行基因过表达转染，其他操作步骤均同实施例4。最终获得AURKA过表达细胞1和2。
实施例9
AURKA基因的过表达
本实施例与实施例5的不同之处在于使用乳腺癌T47D细胞进行基因过表达转染，其他操作步骤均同实施例5。最终获得AURKA过表达细胞1和2。
实施例10
AURKA基因的过表达
本实施例与实施例6的不同之处在于使用乳腺癌T47D细胞进行基因过表达转染，其他操作步骤均同实施例6。最终获得AURKA过表达细胞1和2。
实施例11
AURKA基因的过表达
本实施例与实施例7的不同之处在于使用乳腺癌T47D细胞进行基因过表达转染，其他操作步骤均同实施例7。最终获得AURKA过表达细胞1和2。
试验例1
AURKA基因表达情况检测
以下检测针对各实施例中制得的AURKA过表达细胞1
1、使用荧光定量PCR检测AURKA表达情况
取未进行过表达的T47D细胞与实施例4-11中制得的AURKA过表达细胞1，使用总RNA提取试剂盒（TRIzol法）（购自深圳辉诺生物科技有限公司），按说明书操作对细胞总RNA进行提取；提取后使用逆转录试剂盒（购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司）进行逆转录，再使用Realtime-PCR进行扩增；其中，使用β actin基因作为内参基因；
扩增体系为：cDNA 2μL，上下游引物各1μL，MasterMix 5μL，双蒸水1μL；
扩增条件为：95℃ 1min，（95℃ 5s，60℃ 5s，72℃ 25s）×38循环；
所使用引物为：
鉴定AURKA：F：GTGCATGCTCCATCTTCCAG（SEQ ID NO.3）；
R：AGTCTCCTGGTACGTGTGTG（SEQ ID NO.4）；
鉴定β actin：F：TCGTGCGTGACATTAAGGAG（SEQ ID NO.5）；
R：ATGCCAGGGTACATGGTGGT（SEQ ID NO.6）；
根据检测结果统计各实施例中受试细胞中AURKA的mRNA相对表达量，如图1所示，其中，低表达为筛选临床样本得到的AURKA低表达T47D细胞的检测结果，T47D为未进行过表达的T47D细胞的检测结果，a为实施例4 AURKA过表达细胞的检测结果，b为实施例5 AURKA过表达细胞的检测结果，c为实施例6 AURKA过表达细胞的检测结果，d为实施例7 AURKA过表达细胞的检测结果，e为实施例8 AURKA过表达细胞的检测结果，f为实施例9 AURKA过表达细胞的检测结果，g为实施例10 AURKA过表达细胞的检测结果，h为实施例11 AURKA过表达细胞的检测结果。
图1可见，将实施例4-7中的AURKA过表达细胞与筛选临床样本得到的AURKA低表达T47D细胞的检测结果进行对比，可知实施例4-7中的AURKA过表达细胞中AURKA表达量明显增加，其中实施例5中的AURKA过表达细胞中AURKA表达量增加最多，实施例4、6中的AURKA过表达细胞中AURKA表达量接近，实施例7中的AURKA过表达细胞中AURKA表达量低于实施例4、6；说明本发明使用的sgRNA以及CRISPRa系统能够有效过表达T47D中的AURKA基因，并且，筛选时使用含有5,5-二甲基海因和D-半乳糖的培养基能够筛选出AURKA表达量更高的细胞。将实施例8-11中的AURKA过表达细胞与T47D细胞的检测结果进行对比，同样能得出上述结论，说明本发明使用的sgRNA以及CRISPRa系统在AURKA低表达以及正常T47D细胞中均有效。
2、使用Western blot检测AURKA表达情况
取未进行过表达的T47D细胞与实施例4-11中制得的AURKA过表达细胞1，裂解后离心取上清；使用BCA定量试剂盒（购自艾博抗（上海）贸易有限公司）按说明书操作对上清进行定量后，取等量的样品进行Western blot检测：将上清与缓冲液混合煮沸后进行电泳，电泳的上样量为每孔20μg蛋白；电泳后使用PVDF膜进行转膜，转膜后使用脱脂牛奶封闭，加一抗（ab52973，购自艾博抗（上海）贸易有限公司），4℃进行孵育12h；孵育后使用TBST进行洗涤，加入二抗（羊抗鼠IgG，购自艾博抗（上海）贸易有限公司），室温孵育1h后进行观察；内参为β-actin；
结果如图2所示，仅展示实施例4-7的检测结果；图中，低表达为筛选临床样本得到的AURKA低表达T47D细胞的检测结果，T47D为未进行过表达的T47D细胞的检测结果，a为实施例4 AURKA过表达细胞1的检测结果，b为实施例5 AURKA过表达细胞1的检测结果，c为实施例6 AURKA过表达细胞1的检测结果，d为实施例7 AURKA过表达细胞1的检测结果。
图2可见，将实施例4-7中的AURKA过表达细胞与筛选临床样本得到的AURKA低表达T47D细胞的检测结果进行对比，可知实施例4-7中的AURKA过表达细胞中AURKA表达量明显增加，其中实施例5中的AURKA过表达细胞1中AURKA表达量增加最多，实施例4、6中的AURKA过表达细胞1中AURKA表达量接近，实施例7中的AURKA过表达细胞1中AURKA表达量低于实施例4、6；说明本发明使用的sgRNA以及CRISPRa系统能够有效过表达T47D中的AURKA基因，并且，筛选时使用含有5,5-二甲基海因和D-半乳糖的培养基能够筛选出AURKA表达量更高的细胞。将实施例8-11中的AURKA过表达细胞1与T47D细胞的检测结果进行对比，同样能得出上述结论，在此不再赘述；说明本发明使用的sgRNA以及CRISPRa系统在AURKA低表达以及正常T47D细胞中均有效。
试验例2
以下检测针对实施例4-7中制得的AURKA过表达细胞2
检测方法同试验例1，荧光定量PCR检测结果如图3所示，低表达为筛选临床样本得到的AURKA低表达T47D细胞的检测结果，T47D为未进行过表达的T47D细胞的检测结果，a为实施例4 AURKA过表达细胞2的检测结果，b为实施例5 AURKA过表达细胞2的检测结果，c为实施例6 AURKA过表达细胞2的检测结果，d为实施例7 AURKA过表达细胞2的检测结果。
Western blot检测结果如图4所示，低表达为筛选临床样本得到的AURKA低表达T47D细胞的检测结果，T47D为未进行过表达的T47D细胞的检测结果，a为实施例4 AURKA过表达细胞2的检测结果，b为实施例5 AURKA过表达细胞2的检测结果，c为实施例6 AURKA过表达细胞2的检测结果，d为实施例7 AURKA过表达细胞2的检测结果。
观察图3和图4可知sgRNA2与sgRNA1结果类似，同样能够有效促使靶细胞中AURKA过表达，所得结果不再赘述。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江省肿瘤医院
<120> 一种过表达AURKA基因质粒及其构建方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
taaacgcgac tcaaggcgtc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
acgccttgag tcgcgtttaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
gtgcatgctc catcttccag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
agtctcctgg tacgtgtgtg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
tcgtgcgtga cattaaggag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
atgccagggt acatggtggt 20

Claims (9)

1.一种用于CRISPRa系统的过表达靶细胞内AURKA基因的sgRNA序列，包括SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的sgRNA。
2.如权利要求1所述的序列，其特征在于，所述sgRNA的序列还包括SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的反向互补序列。
3.一种用于CRISPRa系统的过表达靶细胞内AURKA基因的质粒，其特征在于，所述质粒包括SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的sgRNA。
4.一种用于CRISPRa系统的过表达靶细胞内AURKA基因的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒包括权利要求3所述的质粒。
5.一种过表达靶细胞内AURKA基因的方法，包括使用权利要求4所述的慢病毒感染靶细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
sgRNA的设计；sgRNA质粒的构建；sgRNA慢病毒的构建；AURKA基因的过表达。
7.权利要求1所述sgRNA在过表达靶细胞内AURKA基因中的用途。
8.权利要求3所述质粒在过表达靶细胞内AURKA基因中的用途。
9.权利要求4所述慢病毒在过表达靶细胞内AURKA基因中的用途。
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