CN109675040A - 治疗乳腺癌的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种治疗乳腺癌的组合物，所述组合物包括Aurora激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂。在本发明中发现Aurora激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂联合治疗乳腺癌特别是三阴性乳腺癌治疗比各自分别治疗的疗效显著，两者具有明显协同作用。

Description

治疗乳腺癌的组合物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种治疗乳腺癌的组合物及其应用。
背景技术
免疫检查点抑制是治疗癌症的研究热点。虽然，免疫检查点治疗极大的鼓舞了人类抗肿瘤的信心，但是大多数实体肿瘤对免疫检查点抑制剂治疗存在较低的客观缓解率(ORR)，特别是具有高度侵袭性的癌症，如三阴性乳腺癌(TNBC)，客观缓解率低至10％。目前有些观点认为三阴乳腺癌的低客观缓解率是由于肿瘤微环境缺少效应T细胞的浸润，研究人员越来越关注这种所谓的肿瘤免疫表型(TIP)，例如，根据免疫细胞浸润的程度，可以将肿瘤分类为“冷”(非炎性)或“热”(炎性)肿瘤。免疫细胞浸润受到肿瘤内在癌基因和表观遗传因子的调控，免疫抑制细胞对T细胞浸润有负面影响。现有的一些科学研究确定了一些与“冷”肿瘤或“热”肿瘤相关的特异性基因，其中广泛被认可的“热”肿瘤相关基因包括Th1型趋化因子如CXCL9，CXCL10和CXCL11，能够促进免疫效应细胞(例如，CD8+T细胞，Th1细胞，Th17细胞)的浸润。有基础研究表明，表观小分子抑制剂可以改变表观遗对Th1趋化因子的沉默，从而增加肿瘤微环境免疫细胞的浸润，增强抗卵巢癌和结肠癌的治疗效果。因此，发现一种小分化合物能将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤的方法，也许会增加免疫疗法的客观缓解率，从而提高疗效。
乳腺癌是最常见的女性癌症，2012年全球新发病例为170万，死亡人数超过52万。三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一个亚型，占乳腺癌的15％～20％，临床上具有复发高、转移早和预后差等特点。因其雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体(HER2)表达均阴性，所以靶向治疗很难。迄今为此尚无批准的靶向治疗。TNBC患者对大多数治疗，包括免疫疗法不敏感，客观缓解率极低，预后很差。所以，探寻有效的治疗TNBC的方法十分迫切。
ENMD-2076是一种口服活性的乙烯基嘧啶基化合物，选择性地抑制靶点极光激酶A(Aurora A)；其对Src、cKit、FAK和VEGFR2等分子也有抑制作用。对临床前SCID小鼠的肿瘤模型中，ENMD-2076可以有效抑制多种肿瘤的生长。TAK-901是一种衍生自新型氮杂环鸟苷激酶铰链结合的化合物，是利用Aurora A激酶复合物的结构信息通过基于结构的药物设计进行的优化结构。TAK-901在生化检测中是Aurora激酶的有效抑制剂，并且除了对AuroraA/B有抑制作用以外还能抑制FLT3和FGFR2等激酶。在小鼠异种肿瘤移植模型中，TAK-901对多种人的移植瘤实体瘤显示出强大的活性，并且在卵巢癌A2780模型中完全使肿瘤消退。TAK-901分别以0.021和0.015μmol/L的IC50抑制Aurora A/TXP2和Aurora B/INCENP，并且在没有它们的辅活化剂的情况下也以相当的效力抑制Aurora A、B和C激酶。
发明内容
本发明提供一种治疗乳腺癌的组合物，所述组合物包括：Aurora激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂。Aurora激酶抑制剂是能抑制Aurora激酶的化合物。
在一种实施方式中，所述Aurora激酶抑制剂是抑制STAT3的化合物。STAT(Signaltransducers and activators of transcription)(信号传导及转录激活因子)，含有SH2和SH3结构域，可与特定的含磷酸化酪氨酸的肽段结合。当STAT被磷酸化后，发生聚合成为同源或异源二聚体形式的活化的转录激活因子，进入胞核内与靶基因启动子序列的特定位点结合，促进其转录。已克隆成功4种JAK(JAK13和Tyk2)与7种STAT(STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b，STAT6)。
在一种实施方式中，所述Aurora激酶抑制剂是抑制STAT3磷酸化的化合物。
在一种实施方式中，所述Aurora激酶抑制剂是ENMD-2076、TAK-901或其药学上可接受的盐。
这些盐包括存在的酸性质子能够与无机或有机碱反应时形成的盐。通常用包含合适的阳离子的过量的碱性试剂例如氢氧化物、碳酸盐或醇盐处理母体化合物。阳离子例如Na+、K+、Ca2+、Mg2+和NH4+是存在于药学可接受的盐中的阳离子的实例。因此合适的无机碱包括氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠和氢氧化钠。还可利用有机碱制备盐，例如下列胺的盐：伯胺、仲胺和叔胺，包括天然取代胺在内的取代胺以及环胺，其包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨乙醇、氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴青霉素、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶等。在合适的溶剂中以标准方法从母体化合物和过量的酸制备所述化合物的酸加成盐，所述酸例如盐酸、氢溴酸、磺酸(得到硫酸盐和硫酸氢盐)、柠檬酸、磷酸等，以及有机酸例如乙酸、丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、水杨酸、4-甲苯磺酸、己酸、庚酸、环戊基丙酸、乳酸、2-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙二磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、葡糖酸、4′4-亚甲基双(3-羟基-2-萘)酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖醛酸、谷氨酸、3-羟基-2-萘酸、硬脂酸、粘康酸等。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗(Pembrolizumab)、纳武单抗(Nivoluma)、阿特朱单抗(Atezolizumab)、巴文西亚单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是百时美施贵宝(BMS)的PD1抗体Opdivo，默沙东(MSD)的PD1抗体Keytruda，罗氏的PD-L1抗体Tecentriq，辉瑞和默沙东的PD-L1抗体Bavencio，阿里斯康的PD-L1抗体Imfinzi；信达生物的信迪单抗和君实生物的特瑞普利单抗请；以及恒瑞医药的SHR-1210，百济神舟的BGB-A317，誉衡药业和药明康德的GLS-010，康宁杰瑞和思路迪的KN035。
在一种实施方式中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
本发明还提供上述组合物在治疗乳腺癌中的应用。
在本发明中发现Aurora激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂联合治疗乳腺癌特别是三阴性乳腺癌治疗中比各自分别治疗的疗效显著，两者具有明显协同作用。另外，本发明进一步研究发现，Aurora激酶抑制剂治疗乳腺癌通过影响了STAT3信号通路中多个基因的表达实现，STAT3多个靶基因受到Aurora激酶抑制剂化合物的上调，其中包括Th1趋化因子。STAT3作为转录因子，受到Aurora激酶的调控，从而影响Th1趋化因子的表达。Aurora激酶抑制剂化合物明显抑制STAT3的磷酸化，而Aurora激酶抑制剂化合物对其他STAT家族成员如STAT1，STAT5或STAT6的表达水平或磷酸化状态几乎没有影响。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是化合物ENMD-2076和TAK901与PD1联用抑制三阴乳腺癌肿瘤生长结果图，其中图1a是用药25天连续多个时间点的肿瘤测量结果图；图1b是用药第25天的肿瘤测量的结果图。
图2是化合物ENMD-2076和TAK901与PD1联用活化CD8+T细胞结果图，其中图2a是免疫组化结果图，图2b是每个样本每低倍视野的CD8阳性细胞数量结果图。
图3是化合物ENMD-2076和TAK901与PD1联用对促进肿瘤微环境中CD8+细胞的效应结果图，其中图3a是药物处理后肿瘤微环境的CD8+T细胞流式结果图；图3b是对3a的流式结果进行统计。
图4是ENMD-2076和TAK901增加乳腺癌细胞趋化因子CXCL10和CXCL11的表达结果图，其中图4a是化合物ENMD-2076作用于MDA-MB-231细胞后趋化因子相对表达量结果图4a；图4b和4c分别是ENMD-2076和TAK901对趋化因子CXCL10和CXCL11的影响呈浓度依赖关系结果图。
图5是化合物ENMD-2076作用于人和小鼠肿瘤细胞系后趋化因子的变化图；图5a是人前列腺癌细胞系结果图，图5b是小鼠结肠癌细胞系结果图，图5c是小鼠黑色素瘤细胞系结果图，和图5d是小鼠结肠癌细胞结果图。
图6是AURKA敲低增加乳腺癌细胞趋化因子基因水平表达情况图，其中图6a是AURKA敲低前后AURKA相对表达量图；图6b是AURKA敲低前后CXCL10相对表达量图；和图6c是AURKA敲低前后CXCL11相对表达量图。
图7是AURKA过表达降低乳腺癌细胞趋化因子基因表达水平情况，其中图7a是AURKA过表达的Westernblot结果图；图7b是AURKA过表达CXCL10相对表达量；图7c是AURKA过表达前后CXCL11相对表达量。
图8是AURKA在肿瘤病人中表达与病人的预后关系情况图。
图9是AURKA高表达的三阴乳腺癌患者中CXCL10和CXCL11表达情况图。
图10是非三阴乳腺癌患者中，AURKA与CXCL10/CXCL11呈现负相关的表达情况图。
图11是临床乳腺肿瘤数据的基因表达相关性分析中，STAT3表达与CXCL10和CXCL11的表达相关性图，图11a是STAT3表达与CXCL10的表达显著负相关图，图11b是STAT3表达与CXCL11的表达显著负相关图。
图12是STAT3的表达与乳腺癌患者的总生存率(OS)Kaplan-Meier相关性的情况图。
图13是STAT3在肿瘤组织中的表达与预后及趋化因子CXCL10/CXCL11表达的关系情况图，其中图13a用PLKO-STAT3对STAT3的敲低情况图，图13b和图13c敲除STAT3导致CXCL10和CXCL11表达显着增加情况图。
图14是化合物ENMD-2076对STAT家族及磷酸化状态影响情况图，其中图14a是化合物处理后STAT3的免疫印迹图，图14b是化合物处理后STAT1的免疫印迹图和图14c是化合物处理后STAT5和STAT6的免疫印迹图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例一化合物ENMD-2076和TAK901与PD1联用活化CD8+T细胞，抑制三阴乳腺癌肿瘤生长
将5周龄的雌性BALB/c小鼠分为6组(每组10只),随机分为：IgG注射对照组，anti-PD1抗体组，ENMD-2076组，TAK901组，ENMD-2076联用anti-PD1抗体组，TAK901联用anti-PD1抗体组。构建小鼠乳房垫肿瘤模型：用1.2％的动物麻醉剂avertin以每10g体重200μL的剂量麻醉小鼠，待动物完全麻醉后，在超净工作台中以仰卧位固定小鼠，碘伏消毒，在小鼠右侧第四对乳房上方用眼科剪剪开0.5cm的小口，用棉签翻开皮肤暴露出乳房垫，将无血清的40μL 5×105 4T1细胞注射在乳房垫上。小鼠分笼饲养，待肿瘤生长至约100mm3，开始药物和对照溶剂处理，并记为实验为第0天，并在第3，7，10，14，17，21天给药(IgG对照组每只小鼠按10mg/kg IgG注射腹腔，anti-PD1抗体组每只小鼠按10mg/kg抗体注射腹腔，ENMD-2076组每只小鼠按100mg/kg灌胃，TAK901组每只小鼠按30mg/kg腹腔注射，ENMD-2076联用anti-PD1抗体组每只小鼠按100mg/kg灌胃同时10mg/kg抗体注射腹腔，TAK901联用anti-PD1抗体组每只小鼠按30mg/kg腹腔注射同时10mg/kg抗体注射另一侧腹腔)。每5天测量一次肿瘤大小，并记录。25天后，取出肿瘤，进行流式细胞检测、免疫组化染色。
结果：第25天各实验组肿瘤的体积为：IgG注射对照组(909.35±197.88)mm3，anti-PD1抗体组(820.96±278.88)mm3，ENMD-2076组(479.13±158.11)mm3，TAK901组(360.19±102.89)mm3，ENMD-2076联用anti-PD1抗体组(254.70±147.64)mm3，TAK901联用anti-PD1抗体组(297.81±90.67)mm3，ENMD-2076和TAK901这两个化合物单用与PD1抗体单用相比，分别可以抑制(41.64±19.26)％,(56.13±12.53)％肿瘤生长；小分子化合物分别和PD1单抗联用抑制肿瘤生长的效果更显著，分别可以抑制(68.98±17.98)％,(63.72±11.04)％,见图1a，1b；图1a是用药25天连续多个时间点的肿瘤测量结果图；图1b是用药第25天的肿瘤测量的结果图。
接着，我们对肿瘤模型的石蜡切片进行CD8marker的免疫组化染色，观察化合物处理后肿瘤微环境中CD8+T细胞的趋化情况。实验步骤：石蜡切片常规脱蜡至水；用pH9.0Tris/EDTA缓冲液进行抗原修复；PBS缓冲液洗3次，5min/次；为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，用过氧化氢孵育5分钟；流水缓慢冲洗，PBS缓冲液洗3次，5min/次；滴加一抗工作液4℃孵育过夜；PBS缓冲液洗3次，5min/次；滴加抗体增强剂，在室温下孵育20分钟；PBS缓冲液洗3次，5min/次；滴加酶标二抗(HRP Polymer)，室温孵育30分钟；PBS缓冲液洗3次5min/次；将混匀的DAB滴加到切片上，孵育3-5分钟，根据染色深浅终止反应；自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
结果：各实验组CD8阳性的T细胞统计为：IgG注射对照组(240.33±44.00)个细胞/低倍视野，anti-PD1抗体组(287.00±14.00)个细胞/低倍视野，ENMD-2076组(775.33±97.00)个细胞/低倍视野，TAK901组(572.33±45.00)个细胞/低倍视野，ENMD-2076联用anti-PD1抗体组(254.70±147.64)个细胞/低倍视野，TAK901联用anti-PD1抗体组(673.33±110.00)个细胞/低倍视野。ENMD-2076和TAK901这两个化合物单用可以增加肿瘤微环境中CD8+淋巴细胞的浸润，ENMD-2076和TAK901与PD1单抗联用对促进肿瘤微环境中CD8+细胞的效应更显著。图2a是免疫组化结果，标尺为50mm，图2b是每个样本每低倍视野的CD8阳性细胞数(n＝3)。NS表示P>0.05，统计学无显著性；*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001；****P<0.0001。
同时我们也用流式检测了肿瘤中CD8+T细胞的数量。具体步骤：使用美天旎试剂盒分离肿瘤细胞，将2.35mL DMEM，100μL酶D，50μL酶R和12.5μL酶A加入MACS C管中来制备酶混合物；肿瘤样本中去除脂肪，纤维和坏死区域；将肿瘤切成2-4毫米的小块；将组织转移到含有酶混合物的温和MACS C管中；拧紧C管并将其倒置在温和的MACS Dissociator的套管上；选择m_impTumor_02程序运行；程序终止后，从MACS Dissociator上拆下C管，使用MACSmixTM Tube Rotator在37℃下连续旋转孵育样品40分钟；将4mL RPMI 1640或DMEM加入C管中，将管插入MACS Dissociator的套管上，运行程序m_impTumor_01。将得到的细胞悬液置于15mL管上的MACS SmartStrainer；用10mL RPMI 1640或DMEM洗涤细胞MACSSmartStrainer；以300×g离心细胞悬浮液7分钟，吸出上清液；请使用红细胞裂解液去除红细胞，流式抗体染色待检。收集、清洗细胞，并用冰冷的PBS、10％FCS调节细胞悬液浓度至5x106细胞/mL；细胞离心除去上清液并保证细胞损失最小；添加0.1μg/mL偶联一抗，在4℃下避光孵育30分钟；清洗细胞3次，400g离心5分钟，重悬于200μL的PBS中，用于流式分析。
结果动物模型各组肿瘤样本中CD8阳性T细胞的百分比统计：IgG注射对照组(15.40±5.91)％，anti-PD1抗体组(18.15±5.18)％，ENMD-2076组(21.76±8.24)％，TAK901组(24.16±7.46)％，ENMD-2076联用anti-PD1抗体组(29.94±6.55)％，TAK901联用anti-PD1抗体组(32.19±3.92)％。ENMD-2076和TAK901这两个化合物单用可以增加肿瘤微环境中CD8+淋巴细胞的浸润，这两种化合物和PD1单抗联用对促进肿瘤微环境中CD8+细胞的效应更显著，见图3a和图3b；图3a是药物处理后肿瘤微环境的CD8+T细胞流式结果图；图3b是对3a的流式结果进行统计。
实施例二Auror激酶抑制剂ENMD-2076和TAK901增加乳腺癌细胞趋化因子CXCL10和CXCL11的表达。
将ENMD-2076和TAK901利用qPCR验证其对乳腺癌细胞趋化因子CXCL10和CXCL11表达的影响。
具体实验步骤如下：将MDA-MB-231细胞，以每孔2x105细胞接种到6孔板，每孔加2mL完全培养基(DMEM+10％FBS)，放置到5％CO2，37℃培养箱培养24小时；换无血清培养基，每孔2mL，加入5μM ENMD-2076和2μM TAK901，对照组加DMSO，处理细胞24小时，每个处理条件做三个生物平行；接下来用Trizol提取RNA(弃细胞培养基，冰浴PBS洗2次，每个孔加入400μL trizol，吹打细胞，收集至EP管中；然后加入80μL氯仿，剧烈震荡，室温静置5min，4℃13000rpm离心15min，吸取约100μL上清至新EP管；加入100μL上清的异丙醇，混匀室温静置5min，于4℃ 13000rpm离心15min；弃上清，加入500μL 70％乙醇，7500rpm 4℃离心5min，并重复该步骤1次；弃上清，待沉淀透明，加入30μL水溶解RNA)；用Nanodrop对提取的RNA进行浓度测定；用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行cDNA反转，每个反应在20μL体系中反转3μg RNA；将反转后的cDNA稀释9倍，用于qPCR反应(qPCR程序如下：95°10min；95°15s，60°45s，35个循环)。
qPCR反应体系见下表1：
2xSYBR混合液 5μL
上游引物(FP)1μM 1μL
下游引物(RP)1μM 1μL
cDNA 3μL
总体系 10μL
qPCR引物见下表2：
序列名称 序列号 序列
CXCL10 FP SEQ ID NO:1 CTCCAGTCTCAGCACCATGA
CXCL10 RP SEQ ID NO:2 GCTCCCCTCTGGTTTTAAGG
CXCL11 FP SEQ ID NO:3 CCTTGGCTGTGATATTGTGTGCTA
CXCL11 RP SEQ ID NO:4 CCTATGCAAAGACAGCGTCCTC
CXCL2 FP SEQ ID NO:5 GGCAGAAAGCTTGTCTCAACCC
CXCL2 RP SEQ ID NO:6 CTCCTTCAGGAACAGCCACCAA
CXCR4 FP SEQ ID NO:7 CTCCTCTTTGTCATCACGCTTCC
CXCR4 RP SEQ ID NO:8 GGATGAGGACACTGCTGTAGAG
CCL20 FP SEQ ID NO:9 AAGTTGTCTGTGTGCGCAAATCC
CCL20 RP SEQ ID NO:10 CCATTCCAGAAAAGCCACAGTTTT
CCL2 FP SEQ ID NO:11 AGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC
CCL2 RP SEQ ID NO:12 TCCTGAACCCACTTCTGCTTGG
CXCL1 FP SEQ ID NO:13 AGCTTGCCTCAATCCTGCATCC
CXCL1 RP SEQ ID NO:14 TCCTTCAGGAACAGCCACCAGT
GAPDH FP SEQ ID NO:15 GAGTCAACGGATTTGGTCGT
GAPDH RP SEQ ID NO:16 TTGATTTTGGAGGGATCTCG
结果化合物ENMD-2076作用于MDA-MB-231细胞后趋化因子相对表达量分别为：CXCL10(9.39±1.11)倍，CXCL11(6.77±0.84)倍，CXCL1(0.41±0.05)倍，CXCL2(0.43±0.07)倍，CCL2(0.79±0.36)倍，CCL20(2.16±0.40)倍，CXCR4(0.74±0.12)倍，见图4a。并且ENMD-2076和TAK901对趋化因子CXCL10和CXCL11的影响呈浓度依赖关系，见图4b和4c。
实施例三Aurora激酶抑制剂ENMD-2076和TAK901对非乳腺癌细胞趋化因子CXCL10和CXCL11的影响。
为了确定候选化合物ENMD-2076和TAK901对乳腺癌细胞系趋化因子升高的现象是否具有细胞的特异性，发明人对非乳腺癌的肿瘤细胞系(LNCaP-Abl是人前列腺癌细胞系，MC38是小鼠结肠癌细胞系，B16F10是小鼠黑色素瘤细胞系，CT26是小鼠结肠癌细胞)进行qPCR的验证。
具体实验步骤如下：将肿瘤细胞，以每孔2x105细胞接种到6孔板，每孔加2mL完全培养基(DMEM+10％FBS)，放置到5％CO2，37℃培养箱培养24小时；换无血清培养基，每孔2mL，加入5μM ENMD-2076和2μM TAK901，对照组加DMSO，处理细胞24小时，每个处理条件做三个生物平行；接下来用Trizol提取RNA(弃细胞培养基，冰浴PBS洗2次，每个孔加入400ultrizol，吹打细胞，收集至EP管中；然后加入80uL氯仿，剧烈震荡，室温静置5min，4℃13000rpm离心15min，吸取约100uL上清至新EP管；加入100uL上清的异丙醇，混匀室温静置5min，于4℃ 13000rpm离心15min；弃上清，加入500uL 70％乙醇，7500rpm 4℃离心5min，并重复该步骤1次；弃上清，待沉淀透明，加入30ul水溶解RNA)；用Nanodrop对提取的RNA进行浓度测定；用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行cDNA反转，每个反应在20uL体系中反转3ug RNA；将反转后的cDNA稀释9倍，用于qPCR反应(qPCR程序如下：95°10min；95°15s，60°45s，35个循环)。
qPCR反应体系见下表3：
2xSYBR混合液 5uL
上游引物(FP)1μM 1uL
下游引物(RP)1μM 1uL
cDNA 3uL
总体系 10uL
qPCR引物见下表4：
序列名称 序列号 序列
CXCL10 FP SEQ ID NO:1 CTCCAGTCTCAGCACCATGA
CXCL10 RP SEQ ID NO:2 GCTCCCCTCTGGTTTTAAGG
CXCL11 FP SEQ ID NO:3 CCTTGGCTGTGATATTGTGTGCTA
CXCL11 RP SEQ ID NO:4 CCTATGCAAAGACAGCGTCCTC
GAPDH FP SEQ ID NO:15 GAGTCAACGGATTTGGTCGT
GAPDH RP SEQ ID NO:16 TTGATTTTGGAGGGATCTCG
结果：化合物ENMD-2076作用于人和小鼠肿瘤细胞系后趋化因子的变化见图5；LNCaP-Abl是人前列腺癌细胞系(图5a)，MC38是小鼠结肠癌细胞系(图5b)，B16F10是小鼠黑色素瘤细胞系(图5c)，CT26是小鼠结肠癌细胞(图5d)，以上细胞系用不同浓度小分化合物ENMD-2076处理以后，趋化因子均不升高。因此，化合物ENMD-2076对乳腺癌细胞系趋化因子的影响具有细胞特异性，而对测试的其他肿瘤细胞趋化因子的变化没有影响。化合物TAK901具有类似于化合物ENMD-2076作用。
实施例四AURKA敲低增加乳腺癌细胞趋化因子基因水平表达。
为了检测在三阴乳腺癌中AURKA是否影响趋化因子的表达，首先用shRNA序列对三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞系AURKA进行敲低。发明人对AURKA设计shRNA序列5′-CCGGCCTGTCTTACTGTCATTCGAACTCGAGTTCGAATGACAGTAAGACAGGTTTT-3′进行验证，PLKO-NC序列来源清华大学测试平台shRNA文库，(质粒结构可以查询网站：http://www.sigmaaldrich.com/ china-mainland/zh/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/library- information/vector-map.htmL)，进行病毒包装。步骤如下：第0天铺293T细胞；第1天待293T细胞密度达到70％左右，将构建好的PLKO-NC、PLKO-AURKA载体取10ug分别与10ugPsPAX2和5ug PMD2.G一起混合，用康为DNA转染试剂DNA fect转染293T细胞，8小时后换液；48小时和72小时分别收病毒，用0.45um滤膜进行过滤，分装放于-80°进行保存；铺MDA-MB-231细胞于6孔板中，待细胞密度长到70％左右，感染病毒，每个孔2mL病毒加0.5mL新鲜培养基(DMEM+10％FBS)，每组做三个生物平行，八小时后换液；换液后48小时，给细胞换新鲜培养基，同时加入嘌呤霉素，至终浓度为2ug/mL；嘌呤霉素筛选48小时后，trizol处理细胞，提取RNA。RNA提取步骤如下:弃细胞培养基，每个孔加入400μL trizol，吹打重悬细胞，置于EP管中；混匀重悬起的细胞，加入80μL氯仿，剧烈震荡，放于室温5min；4℃ 13000rpm离心15min，小心吸取上层液体，于新的EP管；加入等体积的异丙醇，混匀室温静置5min，于13000rpm4°离心15min；去除上清，加入750μL 70％乙醇，颠倒混匀，8000rpm 4°离心5min；重复1次；去除上清，待乙醇挥发，加入20μL水溶解RNA。RNA溶解后用Nanodrop进行浓度测定，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行反转，每个反应加入3ug RNA，每个反应20μL反应体系；反转完成后，将cDNA稀释9倍，用于qPCR反应。
每个孔10μL反应体系，按照下表配置反应体系：
qPCR引物序列表5:
序列名称 序列号 序列
AURKA FP SEQ ID NO:17 TTCAGGACCTGTTAAGGCTACA
AURKA RP SEQ ID NO:18 ATTTGAAGGACACAAGACCCG
GAPDH FP SEQ ID NO:15 AGCCCCACCAGGTAGAACTT
GAPDH RP SEQ ID NO:16 AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC
qPCR程序如下：
95°10min；
95°15s，60°45s，35个循环；
得到qPCR原始数据如下表：
AURKA在PLKO-NC、PLKO-AURKA样品中的ct值，见表6:
2-△△t方法进行数据分析，得到下表7：
根据2-△△t方法计算出的PLKO-AURKA敲低效率和趋化因子的表达
基因 样品名 平均数 标准差
AURKA PLKO-NC 1 0.106894363
AURKA PLKO-AURKA 0.134920069 0.03852749
CXCL10 PLKO-NC 1 0.214399379
CXCL10 PLKO-AURKA 3.286477815 1.044965483
CXCL11 PLKO-NC 1 0.18807446
CXCL11 PLKO-AURKA 3.879227899 1.154747698
由此表可知，PLKO-AURKA对AURKA的敲低效率达到80％以上，AURKA敲低后趋化因子的相对表达量分别为：CXCL10(3.29±1.045)倍，CXCL11(3.88±1.15)倍，用GraphPadPrism作图，如图6，其中图6a是AURKA敲低前后AURKA相对表达量；图6b是AURKA敲低前后CXCL10相对表达量；图6c是AURKA敲低前后CXCL11相对表达量。
实施例五AURKA过表达降低乳腺癌细胞趋化因子基因表达水平
ENMD-2076和TAK-901都是已知的AURKA激酶抑制剂，我们接下来试图确定AURKA激酶在化合物诱导的Th1型趋化因子激活中是否具有直接。为了证明化合物是通AURKA影响趋化因子的表达，发明人又做过表达了AURKA，检测过表达该基因和趋化因子的关联。AURKA在染色体上的位置为:hg38chr20:56,369,390-56,392,337，转录本编号为ENST00000395913.7，转录本全长2169nt，转录出RNA的CDS(coding sequence)序列如下(SEQ ID NO:19)：CTTAAACGCGACTCAAGGCGTCGGGTTTGTTGTCAACCAATCACAAGGCAGCCTCGCTCGAGCGCAGGCCAATCGGCTTTCTAGCTAGAGGGTTTAACTCCTATTTAAAAAGAAGAACCTTTGAATTCTAACGGCTGAGCTCTTGGAAGACTTGGGTCCTTGGGTCGCAGGTGGGAGCCGACGGGCATCATGGACCGATCTAAAGAAAACTGCATTTCAGGACCTGTTAAGGCTACAGCTCCAGTTGGAGGTCCAAAACGTGTTCTCGTGACTCAGCAATTTCCTTGTCAGAATCCATTACCTGTAAATAGTGGCCAGGCTCAGCGGGTCTTGTGTCCTTCAAATTCTTCCCAGCGCATTCCTTTGCAAGCACAAAAGCTTGTCTCCAGTCACAAGCCGGTTCAGAATCAGAAGCAGAAGCAATTGCAGGCAACCAGTGTACCTCATCCTGTCTCCAGGCCACTGAATAACACCCAAAAGAGCAAGCAGCCCCTGCCATCGGCACCTGAAAATAATCCTGAGGAGGAACTGGCATCAAAACAGAAAAATGAAGAATCAAAAAAGAGGCAGTGGGCTTTGGAAGACTTTGAAATTGGTCGCCCTCTGGGTAAAGGAAAGTTTGGTAATGTTTATTTGGCAAGAGAAAAGCAAAGCAAGTTTATTCTGGCTCTTAAAGTGTTATTTAAAGCTCAGCTGGAGAAAGCCGGAGTGGAGCATCAGCTCAGAAGAGAAGTAGAAATACAGTCCCACCTTCGGCATCCTAATATTCTTAGACTGTATGGTTATTTCCATGATGCTACCAGAGTCTACCTAATTCTGGAATATGCACCACTTGGAACAGTTTATAGAGAACTTCAGAAACTTTCAAAGTTTGATGAGCAGAGAACTGCTACTTATATAACAGAATTGGCAAATGCCCTGTCTTACTGTCATTCGAAGAGAGTTATTCATAGAGACATTAAGCCAGAGAACTTACTTCTTGGATCAGCTGGAGAGCTTAAAATTGCAGATTTTGGGTGGTCAGTACATGCTCCATCTTCCAGGAGGACCACTCTCTGTGGCACCCTGGACTACCTGCCCCCTGAAATGATTGAAGGTCGGATGCATGATGAGAAGGTGGATCTCTGGAGCCTTGGAGTTCTTTGCTATGAATTTTTAGTTGGGAAGCCTCCTTTTGAGGCAAACACATACCAAGAGACCTACAAAAGAATATCACGGGTTGAATTCACATTCCCTGACTTTGTAACAGAGGGAGCCAGGGACCTCATTTCAAGACTGTTGAAGCATAATCCCAGCCAGAGGCCAATGCTCAGAGAAGTACTTGAACACCCCTGGATCACAGCAAATTCATCAAAACCATCAAATTGCCAAAACAAAGAATCAGCTAGCAAACAGTCTTAGGAATCGTGCAGGGGGAGAAATCCTTGAGCCAGGGCTGCCATATAACCTGACAGGAACATGCTACTGAAGTTTATTTTACCATTGACTGCTGCCCTCAATCTAGAACGCTACACAAGAAATATTTGTTTTACTCAGCAGGTGTGCCTTAACCTCCCTATTCAGAAAGCTCCACATCAATAAACATGACACTCTGAAGTGAAAGTAGCCACGAGAATTGTGCTACTTATACTGGTTCATAATCTGGAGGCAAGGTTCGACTGCAGCCGCCCCGTCAGCCTGTGCTAGGCATGGTGTCTTCACAGGAGGCAAATCCAGAGCCTGGCTGTGGGGAAAGTGACCACTCTGCCCTGACCCCGATCAGTTAAGGAGCTGTGCAATAACCTTCCTAGTACCTGAGTGAGTGTGTAACTTATTGGGTTGGCGAAGCCTGGTAAAGCTGTTGGAATGAGTATGTGATTCTTTTTAAGTATGAAAATAAAGATATATGTACAGACTTGTATTTTTTCTCTGGTGGCATTCCTTTAGGAATGCTGTGTGTCTGTCCGGCACCCCGGTAGGCCTGATTGGGTTTCTAGTCCTCCTTAACCACTTATCTCCCATATGAGAGTGTGAAAAATAGGAACACGTGCTCTACCTCCATTTAGGGATTTGCTTGGGATACAGAAGAGGCCATGTGTCTCAGAGCTGTTAAGGGCTTATTTTTTTAAAACATTGGAGTCATAGCATGTGTGTAAACTTTAAATATGCAAATAAATAAGTATCTATGTC
慢病毒过表达质粒载体的构建，具体步骤：设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真酶Prime star)从反转的cDNA模板中调取目的基因CDS区，将CDS区组装到慢病毒过表达质粒载体菌株大肠杆菌菌株DH5α；扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒(PMD2G和PSPAX2质粒)；用高纯度无内毒素质粒抽提试剂盒提取3种质粒；3种质粒共转染293T细胞，转染后6小时，更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液48小时和72小时分别收病毒，用0.45um滤膜进行过滤，分装放于-80°进行保存；铺MDA-MB-231细胞于6孔板中，待细胞密度长到70％左右，感染病毒，每个孔2mL病毒加0.5mL新鲜培养基(DMEM+10％FBS)，每组做三个生物平行，八小时后换液；换液后48小时，给细胞换新鲜培养基，同时加入嘌呤霉素，至终浓度为2ug/mL；嘌呤霉素筛选48小时后，trizol处理细胞，提取RNA。RNA提取步骤如下:弃细胞培养基，每个孔加入400μL trizol，吹打重悬细胞，置于EP管中；混匀重悬起的细胞，加入80μL氯仿，剧烈震荡，放于室温5min；4℃13000rpm离心15min，小心吸取上层液体，于新的EP管；加入等体积的异丙醇，混匀室温静置5min，于13000rpm 4°离心15min；去除上清，加入750μL 70％乙醇，颠倒混匀，8000rpm 4°离心5min；重复1次；去除上清，待乙醇挥发，加入20μL水溶解RNA。RNA溶解后用Nanodrop进行浓度测定，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行反转，每个反应加入3ug RNA，每个反应20μL反应体系；反转完成后，将cDNA稀释9倍，用于qPCR反应。
结果：AURKA在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中过表达，减少趋化因子基因水平表达，其相对表达量分别为：CXCL10(0.23±0.005)倍，CXCL11(0.14±0.003)倍，见图7，其中图7a是AURKA过表达的免疫印迹结果；图7b是AURKA过表达CXCL10相对表达量；图7c是AURKA过表达前后CXCL11相对表达量。结合实施例四的结论AURKA敲低能够增加趋化因子的表达水平，说明AURKA是影响三阴乳腺癌细胞趋化因子的充分必要条件。
实施例六AURKA在肿瘤样本数据库中，其表达与预后情况及趋化因子CXCL10/CXCL11之间的关系。
我们接下来希望在肿瘤数据库中确定AURKA的表达和Th1型趋化因子的表达是否具有关联。对METABRIC数据库中2,509名乳腺癌患者的基因组数据的分析显示，ARUKA在大多数乳腺癌患者中有扩增，而趋化因子CXCL10和CXCL11的表达相对较低。此外，死亡风险分析发现AURKA在高死亡风险评分和较短的存活时间的乳腺癌患者中往往高表达。ARUKA的表达与乳腺癌患者的总生存率(OS)Kaplan-Meier相关性的进一步表明，肿瘤中高AURKA表达与乳腺癌患者预后不良显着相关(数据进行了对数秩检验的统计学检验)，见图12。此外，我们观察到CXCL10和CXCL11的表达水平与乳腺癌患者中的AURKA呈负相关，尤其是在三阴乳腺癌患者中这种负相关具有统计学意义。
临床数据结果：AURKA在肿瘤病人中高表达，与病人的预后不良相关。反之，病人的预后较好，如图8所示。AURKA高表达的三阴乳腺癌患者中，CXCL10和CXCL11水平相对较低，呈现出负相关的联系，如图9所示。而在非三阴乳腺癌患者中，AURKA与CXCL10/CXCL11呈现负相关的比例较三阴乳腺癌患者比例低，如图10所示。这些数据从一定程度上说明在三阴乳腺癌患者中AURKA和CXCL10/CXCL11表达呈现负相关的关系。
实施例七STAT3在肿瘤组织中的表达与预后及趋化因子CXCL10/CXCL11表达的关系
我们结合ENMD-2076和TAK-901处理的乳腺癌细胞的RNA-seq分析和已发表STAT3ChIP-seq的数据进行生物信息学分析，结果显示ENMD-2076和TAK-901影响了STAT3信号通路中多个基因的表达，STAT3多个靶基因受到化合物的上调，其中包括Th1趋化因子。在本研究中我们推测STAT3作为转录因子，受到AURKA激酶的调控，从而影响Th1趋化因子的表达。因此，接下来我们研究了STAT3和趋化因子CXCL10和CXCL11的关系。
为了通过实验确定化合物ENMD-2076抑制CXCL10和CXCL11表达的是否由STAT3介导，我们使用两条shRNA来敲低MDA-MB-231细胞中的STAT3表达。两条shRNA序列：shRNA-1序列5′-CCGGGCTGACCAACAATCCCAAGAACTCGAGTTCTTGGGATTGTTGGTCAGCTTTTT-3′，shRNA-2序列5′-CCGGGCTGACCAACAATCCCAAGAACTCGAGTTCTTGGGATTGTTGGTCAGCTTTTT-3′，PLKO-NC序列均来源清华大学测试平台shRNA文库，(质粒结构可以查询网站：http://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/zh/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/library-information/vector-map.htmL)。按照质粒提取试剂盒说明提取质粒，进行病毒包装，具体步骤如下：第0天铺293T细胞；第1天待293T细胞密度达到70％左右，将构建好的PLKO-NC、PLKO-AURKA载体取10ug分别与10ug PsPAX2和5ug PMD2.G一起混合，用康为DNA转染试剂DNA fect转染293T细胞，8小时后换液；48小时和72小时分别收病毒，用0.45um滤膜进行过滤，分装放于-80°保存；铺MDA-MB-231细胞于6孔板中，待细胞密度长到70％左右，感染病毒，每个孔2mL病毒加0.5mL新鲜培养基(DMEM+10％FBS)，8小时后换液；换液后48小时，给细胞换新鲜培养基，同时加入嘌呤霉素，至终浓度为2ug/mL；嘌呤霉素筛选48小时后，trizol处理细胞，提取RNA。RNA用Nanodrop进行浓度测定，用Thermo ScientificRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行反转，每个反应加入3ug RNA，每个反应20μL反应体系；反转完成后，将cDNA稀释9倍，用于qPCR反应。
每个孔10μL反应体系，按照下表配置反应体系：
qPCR引物序列表8
序列名称 序列号 序列
STAT3 FP SEQ ID NO:19 GGCCCCTCGTCATCAAGA
STAT3 RP SEQ ID NO:20 TTTGACCAGCAACCTGACTTTAGT
GAPDH FP SEQ ID NO:15 AGCCCCACCAGGTAGAACTT
GAPDH RP SEQ ID NO:16 AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC
qPCR程序如下：
95°10min；
95°15s，60°45s，35个循环；
得到qPCR原始数据如下表9：
STAT3、CXCL10和CXCL11在PLKO-NC、PLKO-STAT3样品中的ct值
2-△△t方法进行数据分析，得到下表10：
根据2-△△t方法计算出的PLKO-STAT3敲低效率和趋化因子的表达
结果：临床乳腺肿瘤数据(METABRIC)的基因表达相关性分析显示，如图11所示，STAT3表达与CXCL10和CXCL11的表达显着负相关，具体见图11a和11b。STAT3的表达与乳腺癌患者的总生存率(OS)Kaplan-Meier相关性的进一步表明，肿瘤中高STAT3表达与乳腺癌患者预后不良显着相关(数据进行了对数秩检验的统计学检验)，见图12。我们用PLKO-STAT3对STAT3的敲低效率达到80％以上，用GraphPad Prism作图，见图13。敲除STAT3导致CXCL10和CXCL11表达显着增加。shSTAT3-1对STTAT3敲除后，趋化因子的相对表达量分别为：CXCL10(2.33±0.002)倍，CXCL11(2.17±0.002)倍，shSTAT3-2对STTAT3敲除后，趋化因子的相对表达量分别为：CXCL10(4.14±0.067)倍，CXCL11(4.87±0.047)倍，分别见图13a、13b和13c。以上结果说明STAT3在化合物ENMD-2076增加趋化因子表达中发挥了重要的作用，STAT3的高表达降低了趋化因子的表达水平，反之增加趋化因子的表达。
实施例七化合物ENMD-2076对STAT家族及磷酸化状态影响
我们用蛋白印记的方法检测化合物ENMD-2076对STAT家族及磷酸化水平的变化。具体步骤：用ENMD-2076(5μM)或IFN-γ处理MDA-MB-231细胞24小时；使用细胞裂解液RIPA对细胞进行裂解，收集蛋白样品；然后测定蛋白样品的浓度；在收集的蛋白样品中加入浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，95℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白；冷却后将样品上样到SDS-PAGE胶孔内；恒压电泳，80V 30分钟，120V 60分钟。有PVDF膜在冰浴中转膜，转膜电流为400mA，转膜时间为90分钟；转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的PBST缓冲液中，漂洗1-2分钟；加入5％的BSA封闭，室温在摇床上缓慢摇动60分钟；加入一抗孵育，4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜；加入PBST缓冲液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，共洗涤3次；加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1小时；加入PBST缓冲液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，共洗涤3次；使用SuperSignal West Pico试剂(ThermoFisher Scientific)使条带可视化。
结果：ENMD-2076处理明显抑制STAT3的磷酸化。ENMD-2076处理对其他STAT家族成员如STAT1，STAT5或STAT6的表达水平或磷酸化状态几乎没有影响。这些结果表明，STAT3的磷酸化状态的改变AURKA抑制剂诱导对TNBC细胞中Th1型趋化因子的活化。如图14，图14a是化合物处理后STAT3的免疫印迹图，图14b是化合物处理后STAT1的免疫印迹图和图14c是化合物处理后STAT5和STAT6的免疫印迹图。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 清华大学
<120> 治疗乳腺癌的组合物及其应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctccagtctc agcaccatga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctcccctct ggttttaagg 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccttggctgt gatattgtgt gcta 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctatgcaaa gacagcgtcc tc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcagaaagc ttgtctcaac cc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctccttcagg aacagccacc aa 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcctctttg tcatcacgct tcc 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggatgaggac actgctgtag ag 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagttgtctg tgtgcgcaaa tcc 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccattccaga aaagccacag tttt 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agaatcacca gcagcaagtg tcc 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcctgaaccc acttctgctt gg 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcttgcctc aatcctgcat cc 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tccttcagga acagccacca gt 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagtcaacgg atttggtcgt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttgattttgg agggatctcg 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttcaggacct gttaaggcta ca 22
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atttgaagga cacaagaccc g 21
<210> 19
<211> 2169
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
cttaaacgcg actcaaggcg tcgggtttgt tgtcaaccaa tcacaaggca gcctcgctcg 60
agcgcaggcc aatcggcttt ctagctagag ggtttaactc ctatttaaaa agaagaacct 120
ttgaattcta acggctgagc tcttggaaga cttgggtcct tgggtcgcag gtgggagccg 180
acgggcatca tggaccgatc taaagaaaac tgcatttcag gacctgttaa ggctacagct 240
ccagttggag gtccaaaacg tgttctcgtg actcagcaat ttccttgtca gaatccatta 300
cctgtaaata gtggccaggc tcagcgggtc ttgtgtcctt caaattcttc ccagcgcatt 360
cctttgcaag cacaaaagct tgtctccagt cacaagccgg ttcagaatca gaagcagaag 420
caattgcagg caaccagtgt acctcatcct gtctccaggc cactgaataa cacccaaaag 480
agcaagcagc ccctgccatc ggcacctgaa aataatcctg aggaggaact ggcatcaaaa 540
cagaaaaatg aagaatcaaa aaagaggcag tgggctttgg aagactttga aattggtcgc 600
cctctgggta aaggaaagtt tggtaatgtt tatttggcaa gagaaaagca aagcaagttt 660
attctggctc ttaaagtgtt atttaaagct cagctggaga aagccggagt ggagcatcag 720
ctcagaagag aagtagaaat acagtcccac cttcggcatc ctaatattct tagactgtat 780
ggttatttcc atgatgctac cagagtctac ctaattctgg aatatgcacc acttggaaca 840
gtttatagag aacttcagaa actttcaaag tttgatgagc agagaactgc tacttatata 900
acagaattgg caaatgccct gtcttactgt cattcgaaga gagttattca tagagacatt 960
aagccagaga acttacttct tggatcagct ggagagctta aaattgcaga ttttgggtgg 1020
tcagtacatg ctccatcttc caggaggacc actctctgtg gcaccctgga ctacctgccc 1080
cctgaaatga ttgaaggtcg gatgcatgat gagaaggtgg atctctggag ccttggagtt 1140
ctttgctatg aatttttagt tgggaagcct ccttttgagg caaacacata ccaagagacc 1200
tacaaaagaa tatcacgggt tgaattcaca ttccctgact ttgtaacaga gggagccagg 1260
gacctcattt caagactgtt gaagcataat cccagccaga ggccaatgct cagagaagta 1320
cttgaacacc cctggatcac agcaaattca tcaaaaccat caaattgcca aaacaaagaa 1380
tcagctagca aacagtctta ggaatcgtgc agggggagaa atccttgagc cagggctgcc 1440
atataacctg acaggaacat gctactgaag tttattttac cattgactgc tgccctcaat 1500
ctagaacgct acacaagaaa tatttgtttt actcagcagg tgtgccttaa cctccctatt 1560
cagaaagctc cacatcaata aacatgacac tctgaagtga aagtagccac gagaattgtg 1620
ctacttatac tggttcataa tctggaggca aggttcgact gcagccgccc cgtcagcctg 1680
tgctaggcat ggtgtcttca caggaggcaa atccagagcc tggctgtggg gaaagtgacc 1740
actctgccct gaccccgatc agttaaggag ctgtgcaata accttcctag tacctgagtg 1800
agtgtgtaac ttattgggtt ggcgaagcct ggtaaagctg ttggaatgag tatgtgattc 1860
tttttaagta tgaaaataaa gatatatgta cagacttgta ttttttctct ggtggcattc 1920
ctttaggaat gctgtgtgtc tgtccggcac cccggtaggc ctgattgggt ttctagtcct 1980
ccttaaccac ttatctccca tatgagagtg tgaaaaatag gaacacgtgc tctacctcca 2040
tttagggatt tgcttgggat acagaagagg ccatgtgtct cagagctgtt aagggcttat 2100
ttttttaaaa cattggagtc atagcatgtg tgtaaacttt aaatatgcaa ataaataagt 2160
atctatgtc 2169

Claims (9)

1.一种治疗乳腺癌的组合物，其特征在于，所述组合物包括Aurora激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述Aurora激酶抑制剂是抑制STAT3的化合物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述Aurora激酶抑制剂是抑制STAT3磷酸化的化合物。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述Aurora激酶抑制剂是ENMD-2076、TAK-901或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、阿特朱单抗、巴文西亚单抗、德瓦鲁单抗和伊匹单抗中的一种或多种。
7.根据权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
8.根据权利要求1-7任一所述的组合物在治疗乳腺癌中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
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