CN115417919A - 一种ascc3多肽构建及其抗肝癌活性应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ASCC3多肽的构建及其抑制Wnt/β‑catenin通路及肝癌细胞增殖的活性；其中，一种ASCC3多肽的构建的序列，其包括，其编码蛋白序列SEQID NO:1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2；一种ASCC3多肽的构建方法，其包括，人工合成并ASCC3多肽编码序列与pCMV‑Flag真核表达载体在T4连接酶作用下连接，获得重组质粒；将所述重组质粒转染肝癌细胞。本发明利用多种功能手段分析其对肝癌中Wnt/β‑catenin通路及癌细胞增殖的拮抗作用。在细胞生物学层面证明了此ASCC3多肽具有拮抗Wnt/β‑catenin通路并抑制肝癌细胞增殖的潜能。

Description

一种ASCC3多肽构建及其抗肝癌活性应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，涉及ASCC3多肽的构建及其抗原发性肝癌的活性，具体是明确一种拮抗ASCC3多肽及其应用于原发性肝癌的靶向治疗。

背景技术

原发性肝癌(简称肝癌)是世界范围内高发的恶性肿瘤，在所有肿瘤中发病率居第6位，其相关死亡率则高居第3位。由于病毒性肝炎的流行和黄曲霉素污染等原因，肝癌在我国尤为高发，发病率和死亡率在所有肿瘤中分居第5和2位，严重影响我国国民的健康。肝癌的临床治疗目前主要依赖于传统的手术治疗结合放疗和化疗，患者一旦在治疗后发生复发，由于缺乏更多的治疗措施，通常预后显著不良。因此，开发新的肝癌治疗手段，对改善肝癌患者的愈后及生存质量具有重要的意义。肝癌的进程和转移存在复杂的分子调控机制，其中Wnt/β-catenin作为重要的促癌信号通路，在肝癌的发生发展中发挥举足轻重的地位，目前大量研究表明Wnt/β-catenin通路的过度活化与肝癌的生长、干细胞性、转移和耐药均存在密切联系。因此，靶向Wnt/β-catenin通路对肝癌的靶向治疗具有举足轻重的价值。

Wnt/β-catenin通路对肝癌的促进作用与β-catenin介导的转录和基因表达存在密切联系。β-catenin在结合下游癌基因启动子区域后，需要募集多种表观遗传相关蛋白以打开上述基因区域的结构，促使RNA聚合酶等蛋白结合和信使RNA(mRNA)的转录。因此，靶向β-catenin关键转录调控蛋白可以作为一种替代靶向措施抑制β-catenin介导的转录。我们近期通过研究发现ASCC3是一个重要的β-catenin促肝癌发生转录活化基因。ASCC3具有DNA解旋酶活性，可以收β-catenin募集后结合DNA并诱导DNA的解旋和松散，促进基因的转录。基于此，我们发明了一种干扰ASCC3与β-catenin结合的多肽，并发现此多肽可以抑制ASCC3与β-catenin靶基因启动子区域的结果，从而拮抗β-catenin靶基因的转录，抑制肝癌的进程。该ASCC3多肽具有特异性抑制肿瘤中β-catenin转录活性的功能，具有良好的肿瘤特异性和靶向性，在肝癌的临床靶向治疗中具有广阔的应用开发前景。

发明内容

作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种ASCC3多肽的构建的序列，其编码蛋白序列SEQID NO:1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2；一种ASCC3多肽的构建方法，其包括，人工合成并ASCC3多肽编码序列与pCMV-Flag真核表达载体在T4连接酶作用下连接，获得重组质粒；将所述重组质粒转染肝癌细胞。本发明利用多种功能手段分析其对肝癌中Wnt/β-catenin通路及癌细胞增殖的拮抗作用。在细胞生物学层面证明了此ASCC3多肽具有拮抗Wnt/β-catenin通路并抑制肝癌细胞增殖的潜能。

具体为：一种ASCC3多肽的构建序列，其cDNA序列和表达的多肽氨基酸序列：

编码cDNA序列：

此外，本发明提供了一种ASCC3多肽的克隆构建及表达方法，包括合成拮抗多肽的编码核酸序列，并以HindIII和KpnI限制性内切酶切割处理后，与经相同限制性内切酶线性化处理的pCMV-Flag表达载体混合，加入T4 DNA连接酶缓冲液和1μl T4 DNA连接酶，25℃孵育2h获得重组表达载体，经PCR和测序验证后，利用脂质体将重组的表达载体导入肝细胞癌细胞中，检测ASCC3多肽的表达及其对对肝癌细胞增殖的拮抗作用。

本发明利用生物工程技术，将ASCC3多肽编码核酸序列克隆至pCMV-Flag真核表达载体中。以PCR和DNA测序鉴定重组克隆的构建，并将此真核表达质粒利用脂质体导入到肝癌细胞中，利用免疫印迹验证ASCC3多肽在肝癌细胞中的表达，通过实时定量PCR明确β-catenin下游靶基因的表达，利用CCK-8和EdU核苷掺入实验分析细胞增殖能力的变化。本研究在分子水平和细胞层面验证了ASCC3多肽可特异性抑制β-catenin靶基因的表达，并拮抗肝癌细胞的增殖，具有靶向拮抗肝癌进程的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为ASCC3多肽重组载体的PCR鉴定；

图2为ASCC3多肽在肝癌细胞中的表达；

图3为ASCC3多肽可抑制β-catenin靶基因表达；

图4为ASCC3多肽可拮抗肝癌细胞的增殖；

图5为ASCC3多肽可抑制肝癌细胞中的核苷掺入。

具体实施方式

图1ASCC3多肽重组载体的PCR鉴定

在上海英潍捷基公司利用全基因技术合成ASCC3多肽的编码DNA序列，并构建限制性内切酶反应体系：4μg合成的ASCC3多肽的编码DNA，4μl 10×酶切缓冲液及1μl HindIII和KpnI限制性内切酶，补充无菌水至40μl，37℃孵育4h，并利用PCR回收试剂盒将限制性内切酶处理后的DNA片段纯化，将上述DNA片段200ng加入400ng的线性化后的pCMV-Flag载体，并加入4μl 10×连接缓冲液及1μl T4 DNA连接酶，室温连接30min。进而将4μl的连接产物转化入100μl DH5α感受态细菌中，将转化后的细菌涂布在抗Amp抗生素的LB琼脂培养皿中，37℃孵育过夜。次日，从LB琼脂培养皿中挑取单克隆并置于Amp抗性的LB液培中，摇菌12-16h，进行菌液PCR：2μl 5μM引物(5’-ACTTCAACCCGGTACAGACTC-3’和5’-AGTCCGACAATCCTAACTGGC-3’),1μl细菌菌液，20μl 2*PCR mixture(Takara)和17μl dH₂O；PCR循环采用，95℃5min预变形，30循环(95℃30s，55℃30s，72℃40s)，72℃10min。PCR结束后，将样品上样至2％琼脂糖凝胶电泳中进行电泳分析。结果表明，多个挑取的细菌克隆中均有ASCC3多肽编码核酸的插入(图1)。

图2ASCC3多肽在肝癌细胞中的表达；

以DMEM基础培养基添加10％胎牛血清FBS和100μg/ml双抗培养HepG2肝癌细胞，将1×10⁶细胞接种于6孔板中并过夜孵育。次日，利用脂质体lipofectamine 2000转染重组的ASCC3多肽表达载体入肝癌细胞中：

1.将2μg的质粒加入100μl的opti-mem基础培养基中；

2.将8μl的脂质体lipofectamine 2000和100μl的opti-mem培养基混匀，孵育5min；

3.将质粒及脂质体样品混合，用移液器吹打6-8下，孵育15min；

4.将上述复合物均匀加入细胞培养基中，混匀并继续孵育6h；

5.孵育6h后，将培养基更换为新鲜的完全培养基继续培养30h；

待质粒转染36h后，收集细胞样品并加入200μl SDS上样缓冲液，水浴煮沸5min，13000g室温离心10min，以20μl样品上样至12％SDS-PAGE中，120V电泳1h后，将蛋白样品转膜至PVDF膜中，以含5％脱脂牛奶的TBST溶液封闭1h，并加入1:5000的Flag抗体孵育过夜。第二天，以TBST洗涤3次，每次5min，加入1:10000的HRP标记的山羊抗鼠IgG(中杉金桥)孵育2h，以ECL发光法显影目的条带。结果表明，ASCC3多肽可以高水平表达于肝癌细胞中(图2)。

图3ASCC3多肽可抑制β-catenin靶基因表达

在转染空载和ASCC3多肽的HepG2细胞中，加入1ml Trizol裂解细胞并提取总RNA，取1μg总RNA利用RevertAid逆转录试剂盒逆转录mRNA成cDNA，继而进行实时定量PCR分析β-catenin下游靶基因Axin2、c-Myc、ASCL2和LGR5的表达。

实时定量PCR的引物如下：

实时定量PCR的反应体系：0.5μl cDNA，1μl引物(5μM)，3.5μl dH2O，5μl 2×SYBRPCRmix；将上述体系在实时定量PCR仪中反应，共进行40循环(95℃15s，60℃30s)。PCR结束后，利用^△△Ct法明确β-catenin靶基因的表达变化。结果表明，ASCC3多肽可显著降低β-catenin靶基因的表达(图3)。

图4ASCC3多肽可拮抗肝癌细胞的增殖

将转染空载和ASCC3多肽的HepG2细胞分别接种至96孔板中，每孔5000细胞，待接种12h后，进行CCK8细胞增殖实验，以10μl CCK-8试剂+100μl DMEM培养基孵育细胞2h，孵育结束后，检测细胞在450nm的吸收峰。每24h检测CCK-8吸收值一次，绘制细胞的生长曲线，结果显示ASCC3多肽表达可显著抑制肝癌细胞的生长(图4)。

图5ASCC3多肽可抑制肝癌细胞中的核苷掺入

将转染空载和ASCC3多肽的HepG2细胞接种入24孔板中，每孔细胞为2×10⁴细胞。过夜孵育后，更换培养基为含100μM EdU的DMEM完全培养基，培养箱中孵育4h。孵育结束后，加入3.7％多聚甲醛至培养基中固定细胞30min，之后弃去培养基并加入0.5％Triton X-100通透细胞，利用EdU染色试剂盒(锐博生物)对EdU进行染色，染色结束后，以5μg/ml的DAPI进行复染核，将细胞以封片剂封片并在高倍倒置显微镜下观察，统计各组中EdU掺入的比例。结果表明，ASCC3多肽可显著抑制肝癌细胞中核苷的掺入水平，提示其可以抑制肝癌细胞的增殖(图5)。

Claims (8)

1.一种ASCC3多肽，其特征在于，其cDNA序列和表达的多肽氨基酸序列为：

1 LYNFSHFNPV QTQIFHTLYH

21 TDCNVLLGAP TGSGKTVAAE

41 LAIFRVFNKY PTSKAVYIAP

61 LKALVRERMD DWKVRIEEKL

81 GKKVIELTGD VTPDMKSIAK

101 ADLIVTTPEK WDGVSRSWQN

121 RNYVQQVTIL IIDEIHLLGE

141 ERGPVLEVIV SRTNFISSHT

161 EKPVRIVGLS TALANARDLA

181 DWLNIKQMGL FNFRPSVRPV

201 PLEVHIQGFP。

2.根据权利要求1所述的一种ASCC3多肽，其特征在于，其编码cDNA序列为：

1 CTTTATAACT TCAGCCACTT CAACCCGGTA CAGACTCAGA TATTCCATAC ACTTTACCAT

61 ACCGACTGCA ATGTCCTGCT TGGAGCACCG ACCGGGAGTG GAAAAACTGT CGCCGCCGAA

121 TTGGCGATAT TCCGAGTCTT CAATAAATAT CCAACTAGTA AGGCGGTTTA TATTGCGCCC

181 TTGAAAGCTC TGGTACGCGA AAGAATGGAC GACTGGAAAG TCAGAATCGA GGAGAAGCTG

241 GGGAAGAAAG TGATTGAGTT GACTGGAGAT GTGACGCCTG ACATGAAATC TATAGCCAAG

301 GCAGACCTCA TTGTGACAAC GCCAGAGAAA TGGGACGGAG TTTCCAGATC CTGGCAAAAT

361 AGAAACTATG TGCAGCAAGT AACTATATTG ATTATCGACG AAATTCACCT GCTTGGTGAA

421 GAGAGAGGAC CTGTCTTGGA AGTAATAGTC AGCAGGACCA ATTTTATTTC TTCCCACACT

481 GAAAAGCCAG TTAGGATTGT CGGACTGAGT ACCGCTCTCG CAAACGCCCG AGACCTTGCT

541 GACTGGCTTA ATATTAAGCA GATGGGTCTG TTTAATTTTA GGCCTAGCGT CCGCCCCGTA

601 CCTCTGGAAG TACACATACA AGGATTCCCG。

3.一种如权利要求1所述ASCC3多肽的克隆构建及表达方法，其特征在于，包括合成拮抗多肽的编码核酸序列，并以限制性内切酶切割处理后，与表达载体混合，加入连接酶缓冲液和连接酶，孵育后获得重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的克隆构建及表达方法，其特征在于，所述限制性内切酶包括HindIII和KpnI。

5.根据权利要求3所述的克隆构建及表达方法，其特征在于，所述表达载体为pCMV-Flag。

6.根据权利要求3所述的克隆构建及表达方法，其特征在于，所述表达载体经与所述编码核酸序列相同限制性内切酶线性化处理。

7.根据权利要求3所述的克隆构建及表达方法，其特征在于，所述连接酶缓冲液和连接酶分别为T4 DNA连接酶缓冲液和T4 DNA连接酶。

8.权利要求1所述ASCC3多肽在抗肝癌活性中的应用。

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