CN111388683B - Anxa6表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种ANXA6表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。本发明研究发现：ANXA6表达受抑制后，肺癌细胞的增殖受到显著抑制，肺癌细胞的集落形成能力受到抑制，肺癌细胞的皮下成瘤能力显著下降，且肿瘤的生长速度受到显著抑制。本发明还提供一种治疗肺癌的药物，该药物利用CRISPR基因编辑原理对肺癌细胞中的ANXA6基因进行敲除，进而对肺癌起到治疗作用。

Description

ANXA6表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种ANXA6表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。
背景技术
CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌对抗外源DNA入侵的一种防御系统，可将入侵的外源核酸序列切除。CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和引导RNA(Guide RNA，gRNA或small-guide RNA，sgRNA)两种分子组成，其中Cas9蛋白是一种依赖于sgRNA的核酸切割酶，只有和sgRNA共同作用时才能激活自身识别和切割基因组DNA的过程。而sgRNA通过与靶基因组DNA反向互补的序列，引导Cas9切割靶向序列，造成双链DNA断裂，在没有模板的条件下，发生DNA碱基的插入或缺失，从而造成移码突变达到基因敲除或引入基因片段的目的。与锌指核酸酶技术(Zinc Finger Nucleas，ZFN)和TALEN(Transcription Activator-likeEffector Nucleases)相比，CRISPR/Cas9技术能够快速高效的靶向任意一个或多个基因，并且具有操作简便，可以高通量制备以及成本低等优势，已经广泛用于各种生物体的特定核苷酸的缺失和改变以及特定基因的转录调控等。
人膜联蛋白A6(annexin A6，ANXA6)基因由26个外显子组成，约6000bp，位于染色体5q32-q34上，是高度保守的Ca2+依赖性膜结合蛋白，主要存在于质膜和内体腔室，其在细胞发育和分化中具有多种功能，除参与细胞增殖、分化、炎症、膜修复和病毒感染等过程外，研究显示，ANXA6与多种肿瘤密切相关，并且在不同类型的肿瘤中ANXA6发挥的功能也不相同，这些功能经常与Ras、Ras/MAPK和FAK/PI3K等信号转导活性的改变有关，并且具有“双向调控”的特点：在黑色素瘤、上皮癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和慢性粒细胞白血病中，具有肿瘤抑制作用，它的下调可能促进了这些癌症的发展并增强了此类癌症的侵袭和转移；另外，ANXA6可以促进乳腺癌细胞粘附、运动、侵袭，也可以促进急性淋巴细胞白血病进展、淋巴瘤粘连以及骨髓瘤细胞中的分泌过程，同时在宫颈癌中表达上调。这种“双向调控”机制目前并不清楚。
目前，ANXA6在肺癌发生、迁移和侵袭中的功能未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ANXA6表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。
为实现以上目的，本发明首先提供一种ANXA6表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用；
优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。
可选的，所述ANXA6表达抑制剂包括下述至少一种：
特异性抑制ANXA6表达的化合物；
特异性干扰ANXA6表达的干扰分子；
特异性与ANXA6蛋白结合的抗体或配体；
ANXA6基因敲除试剂，所述ANXA6基因敲除试剂为特异性敲除ANXA6的基因编辑试剂。
可选的，所述干扰分子为miRNA或siRNA。
本发明一些实施例中，所述ANXA6基因敲除试剂包括一种表达载体，所述表达载体包括一种sgRNA片段的DNA编码序列，所述sgRNA片段的靶基因为ANXA6基因；
优选的，所述sgRNA片段的序列如SEQ.ID.NO.1～2所示；
优选的，所述表达载体为质粒载体或病毒载体。
本发明一些实施例中，所述表达载体还包括Cas9蛋白的DNA编码序列。
本发明一些实施例中，所述ANXA6基因敲除试剂包括一种sgRNA片段，所述sgRNA片段的靶基因为ANXA6基因；
优选的，所述sgRNA片段的序列如SEQ.ID.NO.1～2所示；
优选的，所述ANXA6基因敲除试剂还包括Cas9蛋白。
本发明还提供一种治疗肺癌的药物，包括一种ANXA6基因敲除试剂，所述ANXA6基因敲除试剂包括一种表达载体，所述表达载体包括一种sgRNA片段的DNA编码序列，所述sgRNA片段的靶基因为ANXA6基因；
优选的，所述sgRNA片段的序列如SEQ.ID.NO.1～2所示；
优选的，所述表达载体为质粒载体或病毒载体；
优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。
本发明一些实施例中，所述表达载体还包括Cas9蛋白的DNA编码序列。
本发明还提供一种治疗肺癌的药物，包括一种ANXA6基因敲除试剂，所述ANXA6基因敲除试剂包括一种sgRNA片段，所述sgRNA片段的靶基因为ANXA6基因；
优选的，所述sgRNA片段的序列如SEQ.ID.NO.1～2所示；
优选的，所述ANXA6基因敲除试剂还包括Cas9蛋白；
优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。
本发明还提供一种筛选治疗肺癌的药物的方法，所述方法包括：
将候选药物用于肺癌模型；
定量检测用药前后肺癌模型的ANXA6蛋白；
用药后相比于用药前，所述肺癌模型的ANXA6蛋白的表达水平降低，表明所述候选药物为目标药物；
优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。
本发明还提供一种试剂在制备试剂盒中的应用，所述试剂用于定量检测ANXA6蛋白表达水平，所述试剂盒用于判断药物治疗肺癌的有效性；
优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。
本发明的有益效果：本发明提供一种ANXA6表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。本发明研究发现：ANXA6表达受抑制后，肺癌细胞的增殖受到显著抑制，肺癌细胞的集落形成能力受到抑制，肺癌细胞的皮下成瘤能力显著下降，且肿瘤的生长速度受到显著抑制。本发明还提供一种治疗肺癌的药物，该药物利用CRISPR基因编辑原理对肺癌细胞中的ANXA6基因进行敲除，进而对肺癌起到治疗作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为801D细胞和H1299细胞中两条sgRNA(sgRNA#2和sgRNA#3)敲除ANXA6基因表达情况。注：Ctrl-sgRNA组为感染含有无关sgRNA序列病毒载体后的801D或H1299细胞；ANXA6-sgRNA#1组为感染含有无效序列sgRNA病毒载体后的801D或H1299细胞；ANXA6-sgRNA#2组为感染含有如SEQ.ID.NO.1所示的sgRNA病毒载体后的801D或H1299细胞；ANXA6-sgRNA#3组为感染含有如SEQ.ID.NO.2所示的sgRNA病毒载体后的801D或H1299细胞。
图2为801D细胞和H1299细胞中筛选敲除ANXA6基因表达的单克隆细胞中ANXA6基因的表达情况。注：ANXA6-sgRNA#2-D11/G4为感染含有如SEQ.ID.NO.1所示的sgRNA病毒载体后的801D细胞所筛选出的两株单克隆细胞；ANXA6-sgRNA#3-E3为感染含有如SEQ.ID.NO.2所示的sgRNA病毒载体后的801D细胞所筛选出的单克隆细胞株；ANXA6-sgRNA#2-B11为感染含有如SEQ.ID.NO.1所示的sgRNA病毒载体后的H1299细胞所筛选出的单克隆细胞株；ANXA6-sgRNA#3-E8为感染含有如SEQ.ID.NO.2所示的sgRNA病毒载体后的H1299细胞所筛选出的单克隆细胞株。
图3为801D细胞及筛选的单克隆细胞增殖情况的生长曲线。注：48小时处801D细胞及Ctrl-sgRNA细胞与ANXA6-sgRNA#3-D11细胞存在显著差异，72小时和96小时处801D细胞及Ctrl-sgRNA细胞与ANXA6-sgRNA#3-D11/G4/E3细胞存在显著差异；**p＜0.01。
图4为H1299细胞及其ANXA6敲除的单克隆细胞增殖情况的生长曲线。注：48小时处H1299细胞及Ctrl-sgRNA细胞与ANXA6-sgRNA#3-E8细胞存在显著差异，72小时和96小时处H1299细胞及Ctrl-sgRNA细胞与ANXA6-sgRNA#3-B11/E8细胞存在显著差异；**p＜0.01。
图5为801D细胞及其ANXA6敲除的单克隆细胞的集落形成情况。
图6为H1299细胞及其ANXA6敲除的单克隆细胞的集落形成情况。
图7为801D细胞及其ANXA6敲除的单克隆细胞集落形成情况。注：**p＜0.01。
图8为H1299细胞及其ANXA6敲除的单克隆细胞集落形成情况。注：**p＜0.01。
图9为801D细胞及其ANXA6敲除的单克隆细胞裸鼠皮下移植瘤生长情况。
图10为H1299细胞及对应ANXA6敲除的单克隆细胞裸鼠皮下移植瘤生长情况。
图11为801D细胞及其ANXA6敲除的单克隆细胞裸鼠皮下移植瘤生长曲线。注：**801D细胞和ANXA6-sgRNA#2-D11/G4/E3细胞存在显著差异，p＜0.01。
图12为H1299细胞及对应ANXA6敲除的单克隆细胞裸鼠皮下皮下移植瘤生长曲线。注：**H1299细胞和Ctrl-sgRNA细胞与ANXA6-sgRNA#2-B11细胞存在显著差异，p＜0.01。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请实施例中空白对照组、阴性对照组、实验组设计如下：
空白对照组：未感染病毒载体的正常801D或H1299细胞。
阴性对照组：Ctrl-sgRNA组，其中，Ctrl-sgRNA组为感染含有无关sgRNA序列病毒载体后的801D或H1299细胞。
实验组：ANXA6-sgRNA#1组、ANXA6-sgRNA#2组与ANXA6-sgRNA#3组，其中，ANXA6-sgRNA#1组为感染含有无效sgRNA序列病毒载体后的801D或H1299细胞，ANXA6-sgRNA#2组为感染含有如SEQ.ID.NO.1所示的sgRNA病毒载体后的801D或H1299细胞，ANXA6-sgRNA#3组为感染含有如SEQ.ID.NO.2所示的sgRNA病毒载体后的801D或H1299细胞。
实验组与阴性对照组中，病毒载体均为慢病毒GV392，病毒载体中元件顺序均为：U6-sgRNA*-EF1a-Cas9-FLAG-P2A-puro，其中：
Ctrl-sgRNA组中，sgRNA*为无关sgRNA序列(DNA序列为：CGCTTCCGCGGCCCGTTCAA)，不具有靶向效果；
ANXA6-sgRNA#1组中，sgRNA*为无效sgRNA序列，实际效果不具有靶向作用；
ANXA6-sgRNA#2组中，sgRNA*的RNA序列如SEQ.ID.NO.1所示，DNA编码序列如SEQ.ID.NO.3所示，所述sgRNA*具有靶向效果；
ANXA6-sgRNA#3组中，sgRNA*的RNA序列如SEQ.ID.NO.2所示，DNA编码序列如SEQ.ID.NO.4所示，所述sgRNA*具有靶向效果。
SEQ.ID.NO.1：CACCGUACACUGCCAUGAAGGGCUU
SEQ.ID.NO.2：CACCGGAAGUGCCUCAUUGAGAUCU
SEQ.ID.NO.3：CACCGTACACTGCCATGAAGGGCTT
SEQ.ID.NO.4：CACCGGAAGTGCCTCATTGAGATCT
具体的，病毒载体的构建方法为：
针对目的基因靶位点序列，设计sgRNA，由引物合成公司合成单链DNA oligo(PAGE纯化)，其两端含酶切位点粘端，经退火处理形成双链DNA连入Lenti-CAS9-sgRNA-tag载体(由于标签不同，有Puromycin和EGFP两种载体，本实验选择Puromycin)。将连接好的产物使用TOP10感受态转化，菌落PCR得到阳性克隆后测序，从而得到序列正确的表达sgRNA的过表达慢病毒质粒。获取质粒后，转染293T细胞，48-72小时后离心收集细胞上清液，离心后对上清液进行0.45μm过滤，并超速离心去除杂质，获得目的病毒。最后对病毒进行物理状态检测、无菌检测和滴度检测。
实施例1、细胞培养与慢病毒感染
细胞培养条件均为：37℃、5％CO2静置培养。
实施例中所用的基础培养基为：取无血清RPMI-1640培养基，加入胎牛血清至浓度为10％v/v，加入青霉素至浓度为100U/ml，加入链霉素至浓度为0.1mg/ml。
一、细胞培养、传代与接种
1、801D细胞和H1299细胞接种于基础培养基中。
2、将生长90％汇合的细胞进行传代，加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。
3、加入基础培养基吹打混匀，混匀后用Muse细胞计数仪进行计数。
4、在96孔板中接种801D细胞和H1299细胞，每孔细胞数为4000个，每种细胞接种12孔。
5、37℃、5％CO2静置培养过夜。
二、目的细胞慢病毒感染
1、96孔板接种细胞第二天进行观察，细胞汇合度约为30％。
2、吸掉各孔中上清液，取MOI值为10，加入适宜量的病毒及感染增强液。每种细胞分为三组，即空白对照组(正常801D细胞和H1299细胞)、阴性对照组(Ctrl-sgRNA组)及实验组(ANXA6-sgRNA#2和ANXA6-sgRNA#3组)，每组三孔。
3、感染16h后换回基础培养基，过程中观察细胞形态。
4、感染24h后加入2μg/ml的Puromycin(嘌呤霉素)筛选3天，筛选出成功感染慢病毒的细胞。
实施例2、检测ANXA6基因敲除效果
一、细胞总蛋白提取
1、感染过病毒并经过Puromycin筛选的细胞培养在基础培养基中，培养至70％到80％汇合度。
2、收集两组细胞，进行胰酶消化，离心后弃上清。
3、用预冷的生理盐水清洗细胞3次，洗去残余培养基，最后一次离心后尽量吸净上清。
4、配置细胞裂解液:1ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂(Cocktail)+1μl二硫苏糖醇(DTT)+7μl PMSF，混匀后置于冰上。
5、步骤3中收集到的细胞，按照每100万个细胞加100μl细胞裂解液，在冰上裂解10-30min，每隔5分钟混匀一次。
6、低温高速离心机离心，离心条件为：13000rpm，4℃，10min。
7、分装上清，-80℃保存。
二、蛋白电泳(Western Blot)检测ANXA6蛋白表达情况
1、按照比例配制聚丙烯酰胺凝胶的分离胶和积层胶。
2、10×电泳缓冲液100ml稀释至1L，10×转膜印迹液100ml稀释至800ml后加入200ml甲醇，混匀备用。
3、样品上样前准备：20μl蛋白样品中加入5μl 5×loading buffer，100℃金属浴10min，冰上冷却。
4、上样，每孔上样量20μl。
5、电泳：80V，20min，然后120V约90min。
6、转膜：将硝酸纤维素薄膜和凝胶夹在滤纸和海绵之间，其中硝酸纤维素薄膜朝正极，凝胶朝负极。65V，180min。
7、转膜完成后丽春红预染10s，去离子水冲洗，根据丽春红染液显示出的区域裁膜，减去膜上没有蛋白的部分区域。
8、5g脱脂奶粉+100ml 1×TBST配置封闭液，摇床上室温封闭薄膜1h。
9、abcam公司购买的ANXA6抗体，按照1：1000的比例进行稀释。将薄膜放入封口膜中，同时放入适量的ANXA6抗体稀释液，挤出气泡后封口，摇床上4℃孵育过夜，第二天摇床上室温孵育1h。
10、1×TBST洗膜，每次10min，洗三次。
11、abcam公司购买的羊抗兔二抗，按照1：2000的比例进行稀释，摇床上室温孵育薄膜3h。
12、重复步骤10。
13、显影：Engreen公司购买的ECL发光液A、B液1：1比例混合后，均匀覆盖整张薄膜，使用Alpha Innotech公司的化学发光成像仪进行成像，结果如图1所示。
14、去离子水冲洗，洗去显影液，封闭液摇床上室温封闭薄膜30min-1h。
15、abcam公司购买的标记有辣根过氧化物酶(HRP)的GAPDH抗体，按照1：2000的比例进行稀释。将薄膜放入封口膜中，同时放入适量的GAPDH抗体稀释液，挤出气泡后封口，摇床上4℃孵育过夜。
16、重复步骤10。
17、显影：Engreen公司购买的ECL发光液A、B液1：1比例混合后，均匀覆盖整张薄膜，使用Alpha Innotech公司的化学发光成像仪进行成像，结果如图1所示。
结果显示ANXA6-sgRNA#2和ANXA6-sgRNA#3可以显著抑制ANXA6基因的表达。
实施例3、检测ANXA6敲除后对细胞增殖的影响
一、单克隆细胞筛选
1、敲除ANXA6基因的801D和H1299细胞培养在基础培养基中，培养至70％到80％汇合度。
2、加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。加入基础培养基，混匀，离心后弃上清。用基础培养基重悬，重悬后用Muse细胞计数仪进行计数。
3、根据计数结果进行稀释，最终稀释为10个细胞/ml。
4、混匀后接种96孔板，每孔细胞悬液100μl。
5、37℃、5％CO2静置培养，一周后观察。
6、根据单克隆细胞生长情况进行传代和扩增。
7、按照实施例2所示的检测方法检测单克隆细胞ANXA6敲除情况，筛选出ANXA6完全敲除的单克隆细胞，结果如图2所示。
结果显示在801D组单克隆细胞中，ANXA6-sgRNA#2-D11、ANXA6-sgRNA#3-G4和ANXA6-sgRNA#3-E3细胞是ANXA6低表达的细胞株；在H1299组单克隆细胞中，ANXA6-sgRNA#2-B11和ANXA6-sgRNA#3-E8是ANXA6低表达的细胞株。
二、生长曲线实验
1、正常801D和H1299细胞以及其对应的阴性对照组细胞和筛选出的ANXA6敲除的单克隆细胞培养在基础培养基中，培养至70％到80％汇合度。
2、加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。加入基础培养基，混匀，离心后弃上清。用基础培养基重悬，重悬后用Muse细胞计数仪进行计数。
3、根据计数结果进行稀释，最终稀释为3万个细胞/ml。
4、混匀后接种96孔板，801D和H1299两组细胞，每组细胞接种5板，每板上每种细胞5孔，每孔细胞悬液100μl。
5、37℃、5％CO2静置培养。
6、分别在37℃、5％CO2静置培养0h、24h、48h、72h和96h后，用CCK8检测细胞浓度：其中0h时每孔直接加入10μl CCK8，37℃孵育两小时后，酶标仪测定450nm处的吸光度；其余四个时间段按照100μl基础培养基加入10μl CCK8的比例配制工作液，吸去细胞上清液，加入混匀后的工作液110μl，37℃孵育两小时后，酶标仪测定450nm处的吸光度。
7、根据5个时间点的吸光度值绘制细胞生长曲线，结果如图3和图4所示。
结果显示，与正常801D细胞、H1299细胞和阴性对照组细胞相比，801D组中ANXA6-sgRNA#2-D11、ANXA6-sgRNA#3-G4、ANXA6-sgRNA#3-E3和H1299组中ANXA6-sgRNA#2-B11、ANXA6-sgRNA#3-E8的细胞增殖均受到了显著抑制(p＜0.01)。
三、集落形成实验
1、正常801D和H1299细胞以及其对应的阴性对照组细胞和筛选出的ANXA6敲除的单克隆细胞培养在基础培养基中，培养至70％到80％汇合度。
2、加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。加入基础培养基，混匀，离心后弃上清。用基础培养基重悬，重悬后用Muse细胞计数仪进行计数。
3、根据计数结果进行稀释，最终稀释为5000个细胞/ml。
4、混匀后接种于6孔板，每种细胞三孔，含有基础培养基2ml及步骤3中细胞悬液100μl，混匀。
5、37℃、5％CO2静置培养，7天到9天后观察。
6、显微镜下观察正常801D和H1299细胞，当其出现肉眼可见的集落且集落间没有相互融合时，终止培养。弃去细胞培养上清，加入2ml含有2％(体积百分比)甲醇的龙胆紫染液，染色30min。
7、自来水缓慢冲洗，洗去龙胆紫染液，空气干燥，如图5和图6所示。
8、显微镜下对大于50个细胞的集落进行计数，根据计数结果进行分析，如图7和图8所示。
结果显示，与正常801D细胞、H1299细胞和阴性对照组细胞相比，801D组中ANXA6-sgRNA#2-D11、ANXA6-sgRNA#3-G4、ANXA6-sgRNA#3-E3和H1299组中ANXA6-sgRNA#2-B11、ANXA6-sgRNA#3-E8的集落形成能力均受到了不同程度的抑制(p＜0.01)。
四、BALB/c裸鼠皮下成瘤实验
1、正常801D和H1299细胞以及其筛选出的ANXA6敲除的单克隆细胞培养在基础培养基中，培养并扩增，培养至70％到80％汇合度。
2、加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。加入基础培养基，混匀，离心后弃上清。用基础培养基重悬，重悬后用Muse细胞计数仪进行计数。
3、根据计数结果进行稀释，最终稀释为一千万个细胞/ml。
4、准备相应数量的BALB/c裸鼠，周龄4～6周。
5、细胞悬液混匀后，接种于裸鼠两侧腋下，每个部位注射细胞悬液0.2ml，每种细胞接种6只。
6、每隔3天或4天观察裸鼠腋下成瘤情况，并测量其体积。
7、当皮下瘤块体积接近1000mm3时，对小鼠采用脱颈致死后，解剖出瘤块，进行称重和拍照，如图9和图10所示。
8、根据肿瘤体积和瘤重进行数据分析，如图11、图12和表1、表2所示。
表1 ANXA6基因敲除后801D细胞裸鼠皮下成瘤实验
Figure BDA0002459250570000141
注：**p＜0.01。
表2 ANXA6基因敲除后H1299细胞裸鼠皮下成瘤实验
Figure BDA0002459250570000142
注：**p＜0.01。
裸鼠皮下成瘤的实验结果显示与正常801D细胞相比，801D组中ANXA6-sgRNA#2-D11、ANXA6-sgRNA#3-G4和ANXA6-sgRNA#3-E3三种细胞的皮下成瘤能力均显著下降(p＜0.01)，且肿瘤的生长速度也受到了显著抑制(p＜0.01)。而与正常H1299细胞相比，ANXA6-sgRNA#2-B11皮下成瘤能力显著下降(p＜0.01)，且肿瘤的生长速度也受到了显著抑制(p＜0.01)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院
北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120> ANXA6表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccguacac ugccaugaag ggcuu 25
<210> 2
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccggaagu gccucauuga gaucu 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgtacac tgccatgaag ggctt 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccggaagt gcctcattga gatct 25

Claims (6)

1.ANXA6表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述肺癌为非小细胞肺癌；
所述ANXA6表达抑制剂包括ANXA6基因敲除试剂，所述ANXA6基因敲除试剂为特异性敲除ANXA6的基因编辑试剂；
所述ANXA6基因敲除试剂包括一种表达载体，所述表达载体包括一种sgRNA片段的 DNA编码序列，所述sgRNA片段的靶基因为ANXA6基因；
所述表达载体为质粒载体或病毒载体；
所述表达载体还包括Cas9蛋白的DNA编码序列。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述sgRNA片段的序列如SEQ.ID.NO.1~2任一所示。
3.一种筛选治疗肺癌的药物的方法，其特征在于，所述方法包括：
将候选药物用于肺癌模型；
定量检测用药前后肺癌模型的ANXA6蛋白；
用药后相比于用药前，所述肺癌模型的ANXA6蛋白的表达水平降低，表明所述候选药物为目标药物。
4.如权利要求3所述的筛选治疗肺癌的药物的方法，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。
5.试剂在制备试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂用于定量检测ANXA6蛋白表达水平，所述试剂盒用于判断药物治疗肺癌的有效性。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。
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