CN114867487A - 用于眼内新生血管的长效vegf抑制剂 - Google Patents

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Abstract

用于治疗有需要的受试者的VEGF相关眼科病症的组合物和方法，其包括向所述受试者玻璃体内施用治疗有效量的抗VEGF剂，其包含与Fc‑IgG可操作地连接的VEGF结合部分，其中所述VEGF结合部分包含至少一个VEGF结合结构域，所述VEGF结合结构域为VEGFR‑1的IgG样结构域2。

Description

用于眼内新生血管的长效VEGF抑制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年11月25日提交的美国临时申请号62/939,756的优先权权益，该申请通过引用并入本文。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并特此通过引用整体并入。创建于2020年11月19日的所述ASCII版本名为24978-0595_SL.txt，并且大小为54,480字节。
技术领域
本发明涉及用于眼内新生血管的新型长效VEGF抑制剂。
背景技术
新生血管供应或血管生成的发展起到至关重要的稳态作用，因为血管将营养物质运送到组织和器官并去除分解代谢产物1。然而，不受控制的血管生长可能会促进或推动许多疾病过程，包括肿瘤和眼内血管病症1。尽管最初鉴定和表征了许多血管生成因子2，但许多实验室中进行的工作已将VEGF确立为正常和病理性血管生成以及血管通透性的关键调节因子3 4。可变外显子剪接导致产生多种同种型，包括VEGF121、VEGF165和VEGF189，它们的肝素亲和力不同。VEGF121缺乏显著的肝素结合。虽然VEGF165具有单个外显子7编码的肝素结合结构域，但VEGF189具有由外显子6和外显子7编码的两个肝素结合结构域5 6。许多实验证据记录了肝素结合VEGF同种型在建立血管生成所需的生化梯度中的关键作用7-9。VEGF是基因家族的成员，该家族还包括P1GF、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。据报道，三种相关的受体酪氨酸激酶(RTK)结合VEGF配体：VEGFR110、VEGFR211和VEGFR312。VEGF结合VEGFR1和VEGFR2二者，而PlGF和VEGF-B与VEGFR1选择性相互作用。VEGFR3结合VEGF-C和VEGF-D，它们与淋巴管生成有关13 14。该RTK类的每个成员在胞外部分均有七个免疫球蛋白(Ig)样结构域15。一致认为VEGFR-2是VEGF的主要信号传导受体14，尽管VEGFR1与VEGF结合的亲和力显著高于VEGFR215。
VEGF抑制剂已成为多种肿瘤的治疗标准，并改变了眼内新生血管病症的治疗，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)、增生性糖尿病性视网膜病变和视网膜静脉阻塞的新生血管形式，该病症是严重视力丧失和法定盲的主要原因16 3 17。目前，三种抗VEGF药物在美国广泛用于眼科适应症：贝伐单抗(bevacizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)和阿柏西普(aflibercept)3。贝伐单抗是一种靶向VEGF的全长IgG抗体18。尽管贝伐单抗不是针对眼科适应症开发的，但由于其低成本，它被广泛标签外使用。雷珠单抗是一种亲和力成熟的抗VEGF Fab19。阿柏西普是一种IgG-Fc融合蛋白20，其具有来自VEGFR1和VEGFR2的元素，结合VEGF、PIGF和VEGF-B21。重要的是，在使用雷珠单抗或贝伐单抗治疗五年后，大约一半的新生血管AMD患者视力良好，即视敏度20/40或更好，这是在抗VEGF剂可用之前不可能实现的结果22。然而，在现实生活中的临床环境中，与临床试验相比，许多患者接受的抗VEGF注射更少，并且假设这与不太令人满意的视觉结果相关23。因此，需要开发在眼内注射后持续时间更长的药剂，从而减少注射频率，并且为此已经尝试了许多方法24 25。基于临床试验批准阿柏西普(艾力雅(EYLEA))，所述临床试验表明每8周一次施用2mg的剂量可以与每月一次雷珠单抗(0.5mg)的功效相匹配。然而，尽管预测改用阿柏西普会减少玻璃体内注射的次数，但最近的研究表明情况并非如此26。因此，对于具有改善的半衰期的玻璃体内抗VEGF剂仍然存在未满足的医疗需求。
在1996年，在旨在鉴定VEGFR1中的VEGF结合元素的结构-功能研究过程中，我们发现缺失Ig样结构域(D)2而非其它D，消除了VEGF或PIGF结合27。用VEGFR1D2替换VEGFR3的D2赋予VEGFR3 VEGFR127的配体特异性。随后的研究通过X射线晶体学记录了D2和VEGF(或PlGF)之间的相互作用28-30。然而，D3对于最佳VEGF结合是重要的27 28。这些初步研究导致设计了一种构建体，该构建体包含与Fc-lgG融合的VEGFR1的前三个lg样D(Flt-1-3-IgG)27。Flt-1-3-lgG在生理和病理血管生成的体外和几种体内模型中显示出有效的中和VEGF的能力31-34 35 36。然而，该分子在全身施用后的半衰期相对短，因为D3中存在碱性残基簇，导致与硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)结合并在各种组织中螯合。
在2002年，Holash等人21描述了包含VEGFR1 D2和VEGFR2 D3的IgG融合构建体，其具有比VEGFR1 D3低得多的肝素亲和力。该分子，如今称为阿柏西普、ziv-阿柏西普或艾力雅，据报道具有比Flt-(1-3-lgG)显著更长的全身半衰期21。这些PK特征，与对VEGF的高结合亲和力和结合PlGF和VEGF-B的能力相结合，导致预测阿柏西普将是比其它VEGF抑制剂更有效的抗肿瘤药剂21 37。然而，阿柏西普仅获得FDA批准用于结直肠癌的二线治疗，而贝伐单抗和抗VEGFR2抗体雷莫芦单抗(ramucirumab)在多种癌症类型中获得了多项FDA批准3 17，这表明上述特征并未提供治疗优势。显然，阿柏西普作为眼血管病症的玻璃体内治疗已经产生了主要的临床影响。
发明内容
本发明提供用于抑制血管生成和用于治疗VEGF相关的病况如眼病的组合物和方法，所述眼病包括但不限于年龄相关性黄斑变性、增生性糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、继发于近视的脉络膜新生血管、早产儿视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、息肉状脉络膜血管病变，所述方法包括施用抑制VEGF活性并且同时具有强肝素结合特性的抗VEGF剂，由此提供优异的药代动力学，即在玻璃体内施用后具有更长的治疗剂半衰期。
在实施例中，本发明提供了用于治疗有需要的受试者的VEGF相关的眼科病症的组合物和方法，其包含向受试者玻璃体内施用第一治疗有效量的抗VEGF剂，和在较早施用的10周至30周内向受试者玻璃体内施用第二治疗有效量的抗VEGF剂。在实施例中，抗VEGF剂包含与Fc-IgG可操作地连接的VEGF结合部分，其中VEGF结合部分包含至少一个VEGF结合结构域，所述VEGF结合结构域为VEGFR-1的IgG样结构域2。
在实施例中，在较早施用的16周至24周内玻璃体内施用第二治疗有效量的抗VEGF剂。在实施例中，该方法包括在先前施用的10周至30周内玻璃体内施用治疗有效量的抗VEGF剂的后续施用，持续至少一年的时段。
在实施例中，抗VEGF剂的治疗有效量为约1mg至10mg。在实施例中，抗VEGF剂的治疗有效量为约3mg至6mg。在实施例中，第一、第二和后续治疗有效量是相同的。在实施例中，第一、第二和后续治疗有效量是不同的。
在实施例中，本发明提供一种抗VEGF剂，其中抗VEGF剂为融合具有VEGF结合特性的结构域和结合肝素蛋白多糖的结构域的Fc-IgG构建体。在实施例中，本发明提供抗VEGF剂，其中抗VEGF剂为具有结合肝素的能力的Fc-IgG构建体并且含有具有VEGF结合特性的一个或多个结构域。在实施例中，本发明提供一种抗VEGF剂，其中抗VEGF剂为具有改善的结合到VEGF和肝素的功效的融合蛋白。在实施例中，本发明提供一种抗VEGF剂，其中抗VEGF剂为具有极低内毒素水平的融合蛋白。
在实施例中，本发明提供一种抗VEGF剂，其中抗VEGF剂为包含VEGF受体元素的IgG嵌合蛋白。在实施例中，本发明提供一种IgG嵌合蛋白，其中IgG嵌合蛋白包含在VEGF酪氨酸激酶受体的胞外部分中的七个免疫球蛋白(Ig)样结构域的一个或多个片段。在实施例中，本发明提供一种IgG嵌合蛋白，其中IgG嵌合蛋白包含与Fc-IgG融合的VEGFR-1的一个或多个胞外结构域片段。在实施例中，本发明提供一种IgG嵌合蛋白，其包含至少一个VEGF结合结构域VEGFR-1结构域2和至少一个另外的VEGFR-1结构域1或3，并且不包括结构域4。在实施例中，本发明提供一种IgG嵌合蛋白，其中IgG嵌合蛋白包含与Fc-IgG融合的VEGFR-2的一个或多个胞外结构域片段。在实施例中，本发明提供IgG嵌合蛋白，其中IgG嵌合蛋白包含与Fc-IgG融合的VEGFR-1和VEGFR-2的一个或多个胞外结构域片段。
在实施例中，本发明提供一种包含可操作地连接到Fc-IgG的VEGF结合部分的抗VEGF剂，其中VEGF结合部分包含至少一个VEGF结合结构域，所述VEGF结合结构域为VEGFR-1的IgG样结构域2，并且其中抗VEGF剂具有比阿柏西普更高的VEGF刺激的有丝分裂发生抑制能力。在实施例中，本发明提供抗VEGF剂具有比阿柏西普更高的玻璃体结合能力。在实施例中，本发明提供抗VEGF剂具有比阿柏西普更高的玻璃体结合VEGF刺激的内皮细胞增殖抑制能力。在实施例中，本发明提供与阿柏西普相比，药剂在体内具有增加的半衰期。
在实施例中，本发明提供VEGF结合部分主要由VEGFR-1的IgG样结构域1、2和3(V1-2-3)组成。
在实施例中，本发明提供VEGF结合部分主要由VEGFR-1的IgG样结构域2和3(V2-3)组成。
在实施例中，本发明提供VEGF结合部分主要由VEGFR-1的IgG样结构域1、2、3和3(V1-2-3-3)组成。
在实施例中，本发明提供VEGF结合部分主要由VEGFR-1的IgG样结构域2、3和3(V2-3-3)组成。
在实施例中，本发明提供包含治疗有效量的如权利要求所定义的抗VEGF剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在实施例中，本发明提供治疗有需要的受试者的VEGF相关病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如所定义的抗VEGF剂。可将抗VEGF剂直接注射到受影响的组织或器官如眼睛中。
在实施例中，本发明提供一种治疗眼部疾病的方法，其中以对应于与VEGF相比为2:1的摩尔比的剂量将抗VEGF剂局部施用至眼睛。在实施例中，本发明提供一种用于治疗眼部疾病的方法，其中通过玻璃体内注射施用抗VEGF剂。
在实施例中，本发明提供一种治疗眼部疾病的方法，其中每10周-30周一次玻璃体内施用抗VEGF剂。在实施例中，每16周至24周一次玻璃体内施用抗VEGF剂。在实施例中，治疗持续至少一年的时段。
根据一个实施例，本发明提供一种用于治疗眼部疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的抗VEGF剂局部施用到眼睛中，其中治疗可有效治疗隐性最小典型和主要典型形式的湿性黄斑变性，其中药剂为融合蛋白。
在实施例中，本发明可用于治疗多种VEGF相关病症，包括新生血管年龄相关性黄斑变性、继发于近视的脉络膜新生血管、增生性糖尿病性视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、视网膜血管阻塞如视网膜静脉阻塞、眼部肿瘤、希佩尔-林道综合征、早产儿视网膜病变、息肉状脉络膜血管病变或受益于抗VEGF疗法的非肿瘤性病症。
根据另一个方面，本发明提供一种药物制剂，所述药物制剂包含在用于局部施用(如到眼睛中)的药学上可接受的载体制剂中的抗VEGF剂。
在实施例中，本发明公开新颖的构建体，其中构建体强有力地中和VEGF活性而同时具有强肝素结合特性。
附图说明
图1显示VEGFR1和我们研究中设计的Fc融合构建体的免疫球蛋白(Ig)样结构域(D)组织。红色标签表示肝素结合结构域。D2是VEGF和PlGF不可或缺的结合元素，负责配体特异性27。D3在结合亲和力和稳定性方面起重要作用27 28 30。VEGFR1的D3而非VEGFR2的D3是主要的肝素结合位点。V23和阿柏西普(艾力雅)仅在D3中有所不同，其来自阿柏西普中的VEGFR2。D4也是肝素结合位点，涉及受体二聚化和同型相互作用30。为简单起见，每个构建体均显示为单体，但由于Fc施加的强制二聚化，重组蛋白是二聚体。
图2A-2B显示纯化重组蛋白的表征。图2A显示了我们纯化的重组融合蛋白和艾力雅的银染SDS/PAGE(4％-20％Tris)。使200ng的每种蛋白质在还原条件下经历电泳。通过SilverQuest银染试剂盒(英杰公司(Invitrogen))进行染色。图2B显示了V23、V233、V1233和艾力雅的分析尺寸排阻色谱(SEC)，每种25μg。Y轴代表以毫吸光度为单位的吸光度强度(A280)，并且X轴代表以分钟计的洗脱时间。
图3显示抑制剂的IC50值。牛脉络膜内皮细胞如在测定方法中所述保持，细胞以低密度铺板。然后以如图所示的不同浓度加入抑制剂。以10ng/ml的最终浓度加入VEGF。5天后评价细胞密度。使用GraphPad Prism 5(GraphPad软件(GraphPad Software)，加利福尼亚州)计算IC50值。显示的数据基于使用高度纯化的蛋白质获得的两个独立实验，并且与许多先前的测定一致。
图4显示与牛玻璃体的结合。
图5A-5D显示对照IgG、艾力雅或VEGFR1 Fc融合蛋白对成年小鼠中激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)的影响。图5A显示在激光治疗前一天以2.5μg的剂量向小鼠玻璃体内注射每种蛋白质。还以25μg测试艾力雅。星号表示与适当的IgG对照组相比的显著差异(学生t检验)(**p<0.01，*p<0.05)。数据基于每组至少5只小鼠的三个独立实验。注意到艾力雅的功效与同一模型中已发表的文献一致。图5B显示损伤前注射时间对CNV区域的影响。2.5μg剂量的艾力雅仅在第-1天注射时显著减少。相反，相同剂量的V1233甚至在注射前7天或14天注射时也显著减少CNV面积。左图显示代表性的CD31免疫荧光图像。星号表示与适当的IgG对照组相比的显著差异(学生t检验)(**p<0.01，*p<0.05)。n＝5。在两个独立的实验中获得了类似的结果。图5C显示以等摩尔剂量测试的V23、V233和V1233(4.8μg的艾力雅和V23，6.3μg的V233和7.2μg的V1233)与艾力雅相比显示出更大的功效。所有药剂均在激光治疗前14天施用。七天后，收获眼睛并分析数据。星号表示与适当的IgG对照组相比的显著差异(学生t检验)(**p<0.01，*p<0.05)。图5D显示玻璃体内注射后不同时间点小鼠中艾力雅、V23、V233或V1233的血清水平。每种分子以等摩尔量注射到双眼中：2.4mg的艾力雅和V23，3.15mg的V233和3.6mg的V1233。1天、3天、7天、14天和21天后，从尾静脉采集外周血。通过ELISA测量人Fc水平。显示的值是平均值±SEM。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。n＝8/点。
图6A-6C显示V1233的玻璃体内注射抑制OIR模型中的新生血管。图6A显示使用阿柏西普、V1233和对照(IgG)在P7时在C57BL/6j小鼠中进行玻璃体内注射。剂量为12.5μg、2.5μg或1.25μg的0.5pl体积的阿柏西普(E)相对于剂量为3.25μg的对照IgG注射到对侧眼睛中。同窝仔鼠注射有V1233(3.8μg或1.65pg)和对照。IgG对照、阿柏西普2.5μg和V12333.8μg的浓度是等摩尔的(也参见图10图例)。然后从P7到P12将动物暴露于75％的氧气中，然后返回室内空气。在P17处，将动物灌注固定，并摘除眼睛，解剖，用BSL-FITC染色并平装。图6B显示使用Xiao等人描述的自动化软件分析血管闭塞和新生血管(参考文献116)。血管闭塞区域以黄色显示，并且新生血管簇以红色显示。图6C显示新生血管的量化显示出相对于对照，V1233(3.8pg和1.65pg)或高剂量阿柏西普(12.5μg)使新生血管显著减少(p<0.05t检验与Welch校正)，但2.5μg或1.25μg阿柏西普不能使新生血管显著减少。
图7显示融合蛋白对VEGF165或VEGF121刺激的BCEC增殖的抑制作用。结果表示为相对于对照的VEGF刺激增殖的抑制百分比。细胞数由相对荧光单位(RFU)530/590(激发/发射)(三次重复的平均值)确定。
图8显示重组VEGF受体Fc融合蛋白对HUVEC增殖的抑制作用。将V123、V1233、V233、V23或艾力雅(10ng/ml-2000ng/ml)与VEGFI65(10ng/ml)一起添加，持续3天，并确定细胞活力。结果表示为相对于对照的VEGF刺激增殖的抑制百分比。细胞数由相对荧光单位(RFU)530/590(激发/发射)(三次重复的平均值)确定。通过GraphPad Prism软件中的双向ANOVA进行统计分析。统计显著性*p<0.001，**p<0.0001通过与单独的VEGF比较计算。
图9显示VEGF/VEGFR2复合物(3V2A)的晶体结构叠加在VEGF/VEGFR1复合物(5T89)的晶体结构上。标记可能与VEGF相互作用并且在VEGFR1和VEGFR2之间有所不同的VEGFR1残基。黄色和蓝色灰度：VEGF。绿色灰度：VEGFR1 D2。白色：VEGFR1 D3。分析指出，与VEGFR2 D3相比，VEGF和VEGFR1 D3之间的相互作用更广泛。
图10显示V1233对牛内皮细胞增殖的影响。将牛脉络膜微血管内皮细胞(BCEC，VEC科技(VEC Technologies))接种在补充有10％小牛血清的低葡萄糖DMEM的96孔板中，并在存在10ng/ml hVEGF165(研发系统(R&D system))的情况下与V1233(第1批和第2批)和艾力雅(再生元制药(Regeneron Pharmaceuticals))的系列稀释液一起孵育。5天或6天后，将细胞与Alamar Blue一起孵育4小时。在530nm激发波长和590nm发射波长下测量荧光。
图11显示了在Promega VEGF中VEGF诱导的VEGFR2活化的抑制。Promega VEGF生物测定(GA2001，普洛麦格(Promega))用于测量V1233抑制KDR/NFAT-RE中VEGF165诱导的刺激的能力。在20ng/ml hVEGF165存在下将HEK293细胞与V1233(第1批和第2批)、艾力雅和人IgG1(BE0297，BioXcell)的系列稀释液一起孵育。孵育6小时后，加入Bio-Glo80试剂，并使用SpectraMax M5酶标仪定量荧光。使用GraphPad Prism软件将数据拟合到
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曲线。
图12显示肝素对CHO细胞培养基中VEGFR1构建体浓度的影响。将合并细胞(V123、V1233、V233和V23)分装到含或不含100μg/ml肝素(#H3149，西格玛(Sigma))的CD FortiCHO培养基中，并在37℃和含5％CO2的湿润气氛和125rpm下孵育96小时。收集培养基并通过ELISA评价VEGFR1 ECD的表达。
图13显示CHO表达的V1233在小鼠CNV模型中完全活跃。使用6周-8周雄性C57/Bl6小鼠(n＝6)。激光诱导后，将约5μg CHO细胞来源和293细胞来源的V1233玻璃体内注射(1μl)到每只眼睛。10天后，收获并固定脉络膜巩膜复合体。新生血管区域由CD31免疫荧光全胚胎染色指示。该图显示了每组中的三个具有代表性的新生血管区域。
图14描绘构建体V1-2-3的完整人IgG1-Fc片段和VEGFR-1结构域的氨基酸序列和核酸序列。分别为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2。如所述，图中提供了VEGFR-1的IgG样结构域的氨基酸序列和核酸序列。V1的氨基酸序列为SEQ ID No:15，构建体V2的氨基酸序列为SEQ IDNo:16，并且构建体V3的氨基酸序列为SEQ ID No:17。
图15描绘构建体V2-3的完整人IgG1-Fc片段和VEGFR-1结构域的氨基酸序列和核酸序列。分别为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4。如所述，图中提供了VEGFR-1的IgG样结构域的氨基酸序列和核酸序列。V2的氨基酸序列为SEQ ID No:16，并且V3的氨基酸序列为SEQ ID No:17。
图16描绘构建体V1-2-3-3的完整人IgG1-Fc片段和VEGFR-1结构域的氨基酸序列和核酸序列。分别为SEQ ID No:5和SEQ ID No:6。如所述，图中提供了VEGFR-1的IgG样结构域的氨基酸序列和核酸序列。V1的氨基酸序列为SEQ ID No:15，V2的氨基酸序列为SEQ ID No:16，并且V3的氨基酸序列为SEQ ID No:17。
图17描绘构建体V2-3-3的完整人IgG1-Fc片段和VEGFR-1结构域的氨基酸序列和核酸序列。分别为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8。如所述，图中提供了VEGFR-1的IgG样结构域的氨基酸序列和核酸序列。V2的氨基酸序列为SEQ ID No:16，并且V3的氨基酸序列为SEQ IDNo:17。
图18描绘构建体V1-2-3-3-4的完整人IgG1-Fc片段和VEGFR-1结构域的氨基酸序列和核酸序列。分别为SEQ ID No:9和SEQ ID No:10。如所述，图中提供了VEGFR-1的IgG样结构域的氨基酸序列和核酸序列。V1的氨基酸序列为SEQ ID No:15，V2的氨基酸序列为SEQ IDNo:16，V3的氨基酸序列为SEQ ID No:17，并且V4的氨基酸序列为SEQ ID No:18。
图19描绘构建体V2-3-4的完整人IgG1-Fc片段和VEGFR-1结构域的氨基酸序列和核酸序列。分别为SEQ ID No:11和SEQ ID No:12。V2的氨基酸序列为SEQ ID No:16，V3的氨基酸序列为SEQ ID No:17，并且V4的氨基酸序列为SEQ ID No:18。
图20描绘构建体V2-4的完整人IgG1-Fc片段和VEGFR-1结构域的氨基酸序列和核酸序列。分别为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14。V2的氨基酸序列为SEQ ID No:16，并且V4的氨基酸序列为SEQ ID No:18。
具体实施方式
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，达到如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示通过引用并入的相同的程度。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语和任何首字母缩写具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然可以在本发明的实践中使用与本文所描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但是本文中描述了示例性方法、装置和材料。
除非另有指示，否则本发明的实践将采用在本领域技术范围内的常规分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。此类技术在诸如以下的文献中有充分解释：《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,第2版编辑.(Sambrook等人,1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编辑,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编辑,1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.))；《分子生物学中的当前协议(Current Protocols in MolecularBiology)》(F.M.Ausubel等人编辑,1987和定期更新)；《PCR：聚合酶链式反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编辑,1994)；《雷明顿：药学科学与实践(Remington,The Science and Practice of Pharmacy)》,第20版编辑,(威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins)2003)和雷明顿：药学科学与实践》,第22版编辑,(英国医药出版社(Pharmaceutical Press)和费城科学大学药学院(Philadelphia College ofPharmacy at University of the Sciences)2012)。
如本文所使用的，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”“含有(contains)”、“含有(containing)”、“特征在于”或其任何其它变体旨在涵盖所列举的组分的非排他性包括，经受以其它方式明确指出的任何限制。例如，融合蛋白、药物组合物和/或“包含”元素列表(例如，组分、特征或步骤)的方法不一定仅限于那些元素(或组分或步骤)，而是可以包括融合蛋白、药物组成和/或方法未明确列出或固有的其它元素(或组分或步骤)。
如本文所使用的，过渡短语“由……组成(consists of)”和“由……组成(consisting of)”不包含未指定的任何元素、步骤或组分。例如，权利要求中使用的“由……组成(consists of)”或“由……组成(consisting of)”将权利要求限制到权利要求中具体列举的组分、材料或步骤，除了通常与其相关的杂质(即，给定组分内的杂质)之外。当短语“由……组成(consists of)”或“由……组成(consisting of)”出现在权利要求主体的条款中，而不是紧接在序言之后时，短语“由……组成(consists of)”或“由……组成(consisting of)”仅限制所述条款中阐述的元素(或组分或步骤)；其它元素(或组分)作为整体未被排除在权利要求之外。
如本文所使用的，过渡短语“基本上由……组成(consists essentially of)”和“基本上由……组成(consisting essentially of)”用于定义融合蛋白、药物组合物和/或方法包括除了那些字面上公开的之外的材料、步骤、特征、组分或元素，条件是这些另外的材料、步骤、特征、组分或元素不会实质性地影响所要求保护的发明的基本和新颖的特性。术语“基本上由……组成”占据介于“包含”与“由……组成”之间的中间地带。
当介绍本发明或其优选的实施例的元素时，冠词“一个(a)”、“一种(an)”、“该(the)”和“所述(said)”旨在表示存在元素中的一个或多个元素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在具有包容性，并表示可能存在除所列元素之外的其它元素。
当用于两个或更多个项的列表中时，术语“和/或”意指所列项中的任何一项可以单独使用或与所列项中的任何一项或多项组合使用。例如，表达“A和/或B”旨在表示A和B中的一个或两个，即单独的A、单独的B或组合的A和B。表达“A、B和/或C”旨在意指单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合、或A、B和C的组合。
应理解，本文所述的本发明的方面和实施例包括“由方面和实施例组成”和/或“基本上由方面和实施例组成”。
应当理解的是，采用范围格式的描述仅仅是为了方便和清楚，而不应被理解为对本发明范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个单独数值。例如，如1到6的范围的描述应该认为是已经确切地公开了子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及所述范围内的单独数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。在本文中，值或范围还可以表达为“约”，从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表达这类值或范围时，公开的其它实施例包含所列举的特定值、从一个特定值和/或到其它特定值。类似地，当值表示为近似值时，通过使用先行词“约”，将理解特定值形成另一个实施例。将进一步理解，其中公开了多个值，并且每个值在本文还被公开为除了值本身之外的“约”所述特定值。在实施例中，“约”可用于表示例如在列举值的10％以内、在列举值的5％以内、或在列举值的2％以内。
如本文所使用的，“患者”或“受试者”是指待治疗的人或动物。
如本文所用，术语“药物组合物”是指药学上可接受的组合物，其中该组合物包括药物活性剂，并且在一些实施例中进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施例中，药物组合物可以是药物活性剂和载体的组合。
术语“组合”是指采用一种剂量单位形式的固定组合或用于组合施用的成套试剂盒，其中一种或多种活性化合物和组合配偶体(例如，如下所述的另一种药物，也称为“治疗剂”或“辅剂”)可以同时或单独地在时间间隔内独立施用。在一些情况下，组合配偶体表现出协作性，例如协同效应。如本文所使用的，术语“共同施用”或“组合施用”等意指涵盖向有需要的单个受试者(例如，患者)施用所选组合配偶体，并且旨在包含其中不一定通过相同的施用途径或同时施用药剂的治疗方案。如本文所使用的，术语“药物组合物”意指由多于一种活性成分混合或组合而成的产物，并且包含活性成分的固定和非固定组合两者。术语“固定组合”意指活性成分，例如化合物和组合配偶体，均以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指活性成分，例如化合物和组合配偶体，均作为单独的实体同时、并发或顺序地施用于患者，没有特定的时间限制，其中此类施用在患者体内提供了治疗有效水平的两种化合物。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或更多种活性成分。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的”意指除可安全用于动物并且更具体地可用于人和/或非人哺乳动物的其它制剂之外由联邦或州政府的监管机构批准或列于美国药典、其它公认的药典中。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指与去甲基化化合物一起施用的赋形剂、稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或媒剂。此类载体可以是无菌液体，如水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂。抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠等；螯合剂，如乙二胺四乙酸等；以及如氯化钠或右旋糖等用于调节张力的药剂，还可以是载体。本领域技术人员已知用于产生与载体组合的组合物的方法。在一些实施例中，语言“药学上可接受的载体”旨在包含与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、等渗剂以及吸收延迟剂等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是所属领域熟知的。参见例如：雷明顿：药学科学与实践》,第20版编辑,(威尔金斯出版公司2003)。除了任何常规介质或药剂与活性化合物不相容的情况之外，设想此类介质或药剂在组合物中的用途。
如本文所用，“治疗有效量”是指足以治疗或改善或以某种方式减轻与疾病和医学病况相关的症状的药物活性化合物的量。当参考方法使用时，所述方法足以有效治疗或改善、或以某种方式减轻与疾病或病状相关的症状。例如，关于疾病的有效量是足以阻断或预防发作的量；或者如果疾病病理已经开始，则缓解、改善、稳定、逆转或减缓疾病的进展、或以其它方式减少疾病的病理后果。在任何情况下，有效量可以单剂量或分开的剂量给定。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括至少改善与患者的疾病相关的症状，其中改善在广义上用于指至少降低参数的大小，例如与正在治疗的疾病或病况相关的症状。因此，“治疗”还包括其中疾病、病症或病理状况或至少与其相关的症状被完全抑制(例如阻止发生)或停止(例如终止)以使患者不再遭受该病况或至少表征该病况的症状的状况。
如本文所使用的，除非另有说明，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指预防疾病或病症或其一种或多种症状发作、复发或扩散。在某些实施例中，所述术语是指在症状发作之前，使用具有或不具有一种或多种其它另外的活性剂的本文所提供的化合物或剂型进行治疗或具体地向有风险患有本文所提供的疾病或病症的受试者施用所述化合物或剂型。这些术语涵盖抑制或减少特定疾病的症状。在某些实施例中，具有家族疾病史的受试者是预防方案的潜在候选者。在某些实施例中，具有复发症状史的受试者也是预防的潜在候选者。在这方面，术语“预防”可以与术语“预防性治疗”互换使用。
如本文所使用的，并且除非另有说明，否则化合物的“预防有效量”是足以预防疾病或病症或防止其复发的量。预防有效量的化合物是指在疾病预防中提供预防性益处的治疗剂单独或与一种或多种其它药剂组合的量。术语“预防有效量”可以涵盖改善总体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。
如本文所用，术语“治疗剂”、“抗VEGF剂”、“融合蛋白”、“嵌合蛋白”或“重组蛋白”包含可操作地连接到第二多肽的第一多肽，其中“治疗剂”、“抗VEGF剂”、“融合蛋白”、“嵌合蛋白”或“重组蛋白”抑制VEGF的活性。嵌合蛋白可以任选地包括与第一多肽或第二多肽可操作地连接的第三多肽、第四多肽或第五多肽或其它多肽。嵌合蛋白可以包括两种或更多种不同的多肽。嵌合蛋白可以包括相同多肽的多个拷贝。嵌合蛋白还可以包括一种或多种多肽中的一种或多种突变。用于制备嵌合蛋白的方法在本领域中是众所周知的。在一些实施例中，术语“治疗剂”、“融合蛋白”、“嵌合蛋白”或“重组蛋白”是指表达或合成的任何构建体，其包括但不限于将VEGFR-1和/或VEGFR-2的一个或多个Ig样结构域或结构域片段与Fc-IgG可操作地连接的肽或蛋白。
术语“Ig样结构域”是指VEGFR-1和VEGFR-2的Ig样结构域1-7。术语“Ig样结构域片段”包括全长结构域的一部分，通常是肝素和/或其VEGF结合或可变区。结构域片段的实例包括氨基酸序列，其包括具有100％序列同一性的全长结构域的至少75％、更优选至少80％、90％、95％和最优选99％的区段及其变体。融合蛋白的氨基酸序列的变体被认为包括在本公开中，条件是氨基酸序列的变体保持至少75％，更优选至少80％、90％、95％，并且最优选99％。包括介于两者之间的某些百分比，例如75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性。具体地，考虑保守性氨基酸替代。保守性替代为在其侧链相关的氨基酸家族内进行的那些。遗传编码的氨基酸一般分为几个家族：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，和(4)不带电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙胺酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其它氨基酸家族包括(i)丝氨酸和苏氨酸，它们是脂族羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，它们是含酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，它们是脂族家族；和(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，它们是芳族家族。例如，合理期望用异亮氨酸或缬氨酸独立代替亮氨酸、用谷氨酸独立代替天冬氨酸、用丝氨酸独立代替苏氨酸，或用结构相关氨基酸类似代替氨基酸将对所得分子的结合或特性没有重大作用，尤其是如果代替不涉及构架位点内的氨基酸。通过测定融合蛋白衍生物的比活性，可容易地确定氨基酸改变是否导致功能性融合蛋白。融合蛋白的片段或类似物可由所属领域普通技术人员容易地制备。片段或类似物的优选的氨基和羧基末端出现在功能性结构域的边界附近。
如本文所用，“分离的”或“纯化的”融合蛋白是指融合蛋白是存在的主要物种(即，以摩尔计，它比组合物中的任何其它单个物种更丰富)，并且优选地，基本上纯化的级分是一种组合物，其中融合蛋白占存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔计)。通常，纯化的组合物将占组合物中存在的所有大分子物质的多于约80％，更优选多于约85％、90％、95％和99％。最优选地，将融合蛋白纯化到基本均质(通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物物种)，其中组合物基本上由单个大分子物种组成。
在一个方面，本发明公开一种包含治疗剂的组合物，其中治疗剂包含VEGFR-1或VEGFR-2的一个或多个肝素结合结构域，和一个或多个VEGF结合结构域，由此抑制VEGF结合到其同源受体。在实施例中，抗VEGF剂包含与Fc-IgG可操作地连接的VEGF结合部分，其中VEGF结合部分包含至少一个VEGF结合结构域，所述VEGF结合结构域为VEGFR-1的IgG样结构域2。
在实施例中，本发明提供了用于治疗有需要的受试者的VEGF相关的眼科病症的组合物和方法，其包括向受试者玻璃体内施用第一治疗有效量的抗VEGF剂，和在较早施用的超过8周内或10周至30周内向受试者玻璃体内施用第二治疗有效量的抗VEGF剂。在实施例中，在较早施用的16周至24周内玻璃体内施用第二治疗有效量的抗VEGF剂。在实施例中，该方法包括在先前施用的10周至30周内玻璃体内施用治疗有效量的的抗VEGF剂的后续施用，持续至少一年的时段。本发明提供了给药方案，诸如有此需要的任何特定个体受试者可能需要的给药方案，其中由于肝素结合效率高于阿柏西普，因此第二和后续施用频率低于等摩尔量的阿柏西普所需的频率。本发明进一步提供在眼内施用后，个体中抗VEGF剂的血浆水平低于在眼内施用等摩尔量的阿柏西普后个体中阿柏西普的血浆水平，这避免了不希望的全身效应，例如有害的神经发育效果。
在实施例中，抗VEGF剂的治疗有效量为约1mg至10mg。在实施例中，抗VEGF剂的治疗有效量为约3mg至6mg。在实施例中，第一、第二和后续的治疗有效量是相同的。在实施例中，第一、第二和后续的治疗有效量是不同的。本发明为有此需要的任何特定个体受试者提供了治疗有效量的剂量，诸如任何特定抗VEGF剂可能需要的剂量。
在实施例中，本发明提供一种包含可操作地连接到Fc-IgG的VEGF结合部分的抗VEGF剂，其中VEGF结合部分包含至少一个VEGF结合结构域，所述VEGF结合结构域为VEGFR-1的IgG样结构域2，并且其中抗VEGF剂具有比阿柏西普更高的VEGF刺激的有丝分裂发生抑制能力。在实施例中，本发明提供抗VEGF剂具有比阿柏西普更高的玻璃体结合能力。在实施例中，本发明提供抗VEGF剂具有比阿柏西普更高的玻璃体结合VEGF刺激的内皮细胞增殖抑制能力。在实施例中，本发明提供与阿柏西普相比，药剂在体内具有增加的半衰期。
VEGFR VEGF结合结构域是本领域众所周知的。图14-20分别提供了VEGFR-1的IgG样结构域V1、V2、V3和V4的示例性氨基酸序列和核酸序列，其呈现完整人IgG1-Fc片段和VEGFR-1结构域，如所述。VEGFR-1的个体人IgG样结构域V1、V2、V3和V4的氨基酸序列也分别单独地提供在SEQ ID No:15-18中。V1的氨基酸序列是SEQ ID No:15(图14中的黄色灰度氨基酸序列，其在SEQ ID No:1内)。V2的氨基酸序列是SEQ ID No:16(图14中的蓝色灰度氨基酸序列，其在SEQ ID No:1内)。V3的氨基酸序列是SEQ ID No:17(图14中的灰色灰度氨基酸序列，其在SEQ ID No:1内)。V4的氨基酸序列是SEQ ID No:18(图18中的绿色灰度氨基酸序列，其在SEQ ID No:9内)
在实施例中，本发明提供VEGF结合部分基本上由VEGFR-1的IgG样结构域1、2和3(V1-2-3)组成。在实施例中，抗VEGF剂包含如SEQ ID No:1中定义的氨基酸序列。
在实施例中，本发明提供VEGF结合部分基本上由VEGFR-1的IgG样结构域2和3(V2-3)组成。在实施例中，抗VEGF剂包含如SEQ ID No:3中定义的氨基酸序列。
在实施例中，本发明提供VEGF结合部分基本上由VEGFR-1的IgG样结构域1、2、3和3(V1-2-3-3)组成。在实施例中，抗VEGF剂包含如SEQ ID NO:5中定义的氨基酸序列。
在实施例中，本发明提供VEGF结合部分基本上由VEGFR-1的IgG样结构域2、3和3(V2-3-3)组成。在实施例中，抗VEGF剂包含如SEQ ID NO:7中定义的氨基酸序列。
在实施例中，本发明提供了一种用于治疗有需要的受试者的VEGF相关眼科病症的药物组合物，其中所述抗VEGF剂如本文所定义。在实施例中，本发明提供包含治疗有效量的如权利要求所定义的抗VEGF剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在实施例中，本发明提供治疗有需要的受试者的VEGF相关病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如所定义的抗VEGF剂。可将抗VEGF剂直接注射到受影响的组织或器官如眼睛中。
在实施例中，本发明提供一种用于治疗眼部疾病的方法，其中每16周超过一次玻璃体内施用抗VEGF剂。在实施例中，每16周至24周超过一次玻璃体内施用抗VEGF剂。在实施例中，治疗持续至少一年的时段。在实施例中，抗VEGF剂的治疗有效量为约1mg至10mg。在实施例中，抗VEGF剂的治疗有效量为约3mg至6mg。
在实施例中，本发明可用于治疗多种VEGF相关病症，包括新生血管年龄相关性黄斑变性、继发于近视的脉络膜新生血管、增生性糖尿病性视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、视网膜血管阻塞如视网膜静脉阻塞、眼部肿瘤、希佩尔-林道综合征、早产儿视网膜病变、息肉状脉络膜血管病变或受益于抗VEGF疗法的非肿瘤性病症。
在一些实施例中，治疗剂为可施用的剂型，其包含治疗剂和额外的赋形剂、载体、佐剂、溶剂或稀释剂。
在一些实施例中，本发明公开一种适用于治疗和/或预防性治疗受试者的药物组合物，其中以有效实现其预期目的的量含有抗VEGF剂。
在一些实施例中，本文公开的治疗剂或组合物通过注射施用。在某些实施例中，组合物或治疗剂直接注射到患病的器官或组织中。在一些实施例中，治疗剂可局部施用，例如通过贴片或直接施用到患病器官或组织，或通过电离子透入疗法。治疗剂可以以持续释放组合物的形式提供，诸如在例如美国专利号5,672,659和5,595,760中描述的那些。立即或持续释放组合物的使用取决于所治疗病况的性质。如果病况由急性或过度急性病症组成，那么与延长释放组合物相比，优选立即释放形式的治疗。或者，对于某些预防性或长期治疗，持续释放组合物可能是合适的。
还可以使用植入物递送抗VEGF剂，例如但不限于眼内植入物。此类植入物可以是可生物降解的和/或生物相容的植入物，或者可以是不可生物降解的植入物。植入物对于活性剂可为可渗透的或不可渗透的。用于递送治疗剂的具体植入物取决于受影响的组织或器官以及所治疗的病况的性质。此类植入物的使用在本领域中是众所周知的。
本发明中描述的抗VEGF剂可以配制成纳米颗粒或其它药物制剂，以提供对特定组织的精确递送并且还提供控制释放疗法。
本申请中描述的抗VEGF剂不仅可以作为纯化的重组蛋白递送，而且可以通过基因治疗方法递送。重组腺相关载体(rAAV)或其它合适的载体可用于通过视网膜下或玻璃体内递送来递送VEGF抑制剂43,44。
在一个相关方面，本发明提供一种用于治疗受试者的VEGF相关或新生血管病症的方法，其中该方法包括向受试者施用：(a)有效量的能够结合肝素并减少或防止不期望的新血管系统发展的融合蛋白。融合蛋白可以与其它抗VEGF剂组合，包括但不限于：对VEGF具有特异性的抗体或抗体片段；对VEGF受体具有特异性的抗体；抑制、管理和/或调节酪氨酸激酶信号转导的化合物；VEGF多肽；在核酸水平方面抑制VEGF表达的寡核苷酸，例如反义RNA；以及各种有机化合物和其它具有血管生成抑制活性的药剂。
本发明提供由VEGFR1的D3(或其它Ig样结构域)介导的肝素结合28，虽然对全身施用不利，但可以赋予玻璃体内(或其它局部)施用的重要优势。事实上，结合HGPSG(胞外基质的关键组分29)的能力促进了玻璃体中的积累以及视网膜渗透30。本发明提供一系列具有与HSPG相互作用的差别能力的VEGFR-1Fc融合构建体。这使得能够选择在眼睛中具有不同持续时间/半衰期的VEGF抑制剂，这在不同的临床条件下是有用的。
现在将在以下描述优选的技术和实验结果的实例中更具体地描述和指出本发明的特征和其它细节。实例出于说明本发明的目的提供，并且不应被理解为限制。
实例
为了确定用于眼内使用的更有效和更持久的VEGF抑制剂，研究了VEGFR1 D中肝素结合的多样性。为此，设计了八种具有差别肝素结合的VEGFR1-Fc融合构建体，从而提供HPSG亲和力谱。图1说明了这些蛋白质的结构域结构并突出显示了肝素结合结构域。所有蛋白质均包括D2，它是配体特异性的关键决定因素27。两个构建体(V1233和V233)具有重复的D3。还显示了阿柏西普的结构域结构。
在最初的实验中，几个构建体的表达水平低；在条件培养基中可检测到低水平的V1234、V1233、V234和V124。有趣的是，较早的研究表明，对肝素具有高亲和力的VEGF同种型(VEGF189或VEGF206)在转染细胞的条件培养基中几乎无法检测到，它们主要与细胞表面或胞外基质结合38 9。然而，它们可以通过添加肝素或肝素酶以可溶形式释放，表明结合位点由HSPG组成38 9。因此，确定添加肝素是否也可能影响重组VEGFR-1融合蛋白的水平。实际上，将肝素添加到转染细胞的培养基中会导致培养基中重组蛋白浓度的剂量依赖性增加(数据未显示)。
尝试简单地通过常规蛋白A(PA)亲和色谱法纯化重组蛋白。然而，该方法产生了预期质量的主要条带和许多其它次要条带，这可能反映了强碱性、肝素结合的重组蛋白与宿主细胞衍生的HSPG和其它阴离子分子的相互作用。因此，如方法中所述，开发了一种去除此类杂质的方案。在高pH(9.2)下，在1.2M NaCl存在下进行洗涤，同时蛋白质与PA结合，导致大量污染物的释放。下一步，阴离子交换色谱法，在去除大部分污染物和聚集体方面非常有效，而纯化的蛋白质在流通中。最终纯化制剂中的LPS水平<0.1EU/mg(范围为0.02-0.08)，这是与临床前研究兼容的极低水平39。如图2A所示，重组蛋白的纯度>95％，如通过银染SDS/PAGE所评估的，并与FDA批准的药物艾力雅的纯度相似。图2B显示了艾力雅旁边的三个最有希望的候选物V23、V1233和V233的分析SEC概况。与艾力雅类似，这三种蛋白质在预期的保留时间以单峰形式洗脱，而没有显著的聚集。
测试了重组蛋白在BCEC中抑制由VEGF165(10ng/ml)诱导的有丝分裂发生的能力。如图所示，它们具有抑制作用，IC50值在约1nM的范围内，除了V124和V24，它们的效力较低(图3)。我们还记录了它们抑制由VEGF121刺激的BCEC有丝分裂发生的能力(图7)。有趣的是，艾力雅在几乎所有进行的实验(>10)中都是有效的，在低浓度下具有活性，IC50为约1nM，但即使在测试的最高浓度下也抑制不超过约80％的VEGF刺激的增殖。使用HUVEC增殖测定获得了类似的结果(图8)。相反，VEGFR1构建体(V124和V24除外)完全阻断了VEGF诱导的增殖。检测此类差异的能力可能反映了我们的BCEC增殖测定响应VEGF刺激的较高动态范围(增加约4倍)。VEGFR1 D3可提供比VEGFR2的D3更好的交互表面，尤其是考虑到VEGFR1比VEGFR2显著更有效地结合VEGF40 41。为了检验这一假设，对VEGFR1/VEGF复合物(5T89)30和VEGFR2/VEGF复合物(3V2A)42的蛋白质数据库文件进行了比较并叠加来自每个受体的D2-D3。这一分析支持了该假设。例如，VEGFR1-D3中的Arg280与VEGF Phe36的侧链相互作用，而VEGFR2在那里有Asp。同样，在VEGFR1中，Arg261和Asn290均与VEGF Glu64相互作用；在VEGFR2中，Arg261被Gly替代，并且因此在VEGFR2中，只有替代Asn290的Lys可以与VEGF Glu64相互作用。图9说明了可能与VEGF相互作用并且在VEGFR1和VEGFR2之间有所不同的VEGFR1残基。
为了进一步确定治疗相关的相互作用，评估重组蛋白是否在体外结合牛玻璃体。如图4所示，虽然艾力雅、对照IgG或贝伐单抗有很少或几乎没有结合，但我们的蛋白质显示出显著的结合。最强的结合剂是V1233、V233和V1234，其次是V123。V23具有介于艾力雅(或对照IgG)和V1233之间的中间结合特性。肝素以剂量依赖性方式替代玻璃体结合。
在小鼠CNV模型中测试重组蛋白并与对照IgG或艾力雅进行比较。大量文献记录了该模型中抗VEGF剂抑制新生血管的能力43 44 45。选择相对低的剂量进行概念验证研究，最适合揭示各种蛋白质之间的效力和持久性差异。此外，据报道，玻璃体内施用高剂量的IgG1同种型抗体可能具有脱靶血管抑制作用，该作用由通过FcgRI和c-Cbl的Fc信号传导介导，导致巨噬细胞迁移受损46。这些作用可能会混淆数据的解释。使用的剂量是有效的，并且同时应该避免此类脱靶作用。最初，在激光治疗前一天以2.5μg的剂量玻璃体内注射每种蛋白质。艾力雅也在25μg下进行了测试。如图5A所示，艾力雅在2.5μg的剂量下产生约30％的抑制，并且在25μg的剂量下产生约50％的抑制。这些发现与已公布的文献基本一致。例如，Saishin等人报道了玻璃体内注射约5μg阿柏西普导致小鼠CNV区域约30％的抑制44。事实上，通常使用40μg的剂量来实现阿柏西普在小鼠CNV模型中的最大抑制作用47。
出乎意料的发现是一些构建体的效力更强：V123、V23、V1233和V233。在损伤前一天施用2.5μg的这些蛋白质，匹配或甚至超过用25μg艾力雅所达到的抑制水平。然而，没有一个包括D4的构建体显示出显著的CNV抑制(图5A)。
为了确定单次施用后肝素结合是否可以持久的治疗效果转化，在激光诱导损伤前1天、7天或14天玻璃体内注射(2.5μg)V1233、艾力雅或对照IgG。如图5B所示，艾力雅仅在损伤前1天施用时才产生显著的抑制。相反，当在损伤前7天或14天施用时，V1233也产生显著的抑制。
在后续研究中，在损伤前14天施用等摩尔量的艾力雅、V23、V1233和V233(4.8μg的艾力雅和V23，6.3μg的V233和7.2μg的V1233)。图5C显示，在测试的剂量下，艾力雅对CNV的影响非常小。相反，V23、V1233和V233导致显著的CNV抑制。该假设的预测是，与艾力雅相比，具有强肝素结合特性的抑制剂将具有较低的全身暴露。向双眼玻璃体内注射等摩尔量的艾力雅、V23、V233或V1233，并在玻璃体内施用后长达21天的不同时间点测量人Fc血清水平，如图5D所示。艾力雅施用导致整个实验中的最高血清水平。具有单个肝素结合结构域的V23导致血清水平低于艾力雅，但趋向于高于V1233或V233。
最后，我们在OIR模型中比较了多个剂量的V1233和艾力雅。与CNV模型中的发现一致，V1233在抑制新生血管方面比艾力雅更有效(图6)。
图7显示融合蛋白对VEGF165或VEGF121刺激的BCEC增殖的抑制作用。结果表示为相对于对照的VEGF刺激增殖的抑制百分比。细胞数由相对荧光单位(RFU)530/590(激发/发射)(三次重复的平均值)确定。
图8显示重组VEGF受体Fc融合蛋白对HUVEC增殖的抑制作用。将V123、V1233、V233、V23或艾力雅(10ng/ml-2000ng/ml)与VEGFI65(10ng/ml)一起添加，持续3天，并确定细胞活力。结果表示为相对于对照的VEGF刺激增殖的抑制百分比。细胞数由相对荧光单位(RFU)530/590(激发/发射)(三次重复的平均值)确定。通过GraphPad Prism软件中的双向ANOVA进行统计分析。统计显著性*p<0.001，**p<0.0001通过与单独的VEGF比较计算。
图9显示VEGF/VEGFR2复合物(3V2A)的晶体结构叠加在VEGF/VEGFR1复合物(5T89)的晶体结构上。标记可能与VEGF相互作用并且在VEGFR1和VEGFR2之间有所不同的VEGFR1残基。黄色和蓝色灰度：VEGF。绿色灰度：VEGFR1 D2。白色：VEGFR1 D3。分析指出，与VEGFR2 D3相比，VEGF和VEGFR1 D3之间的相互作用更广泛。
在两个独立的生物测定中测试纯化的CHO表达的V1233的活性：BCEC增殖(图10)和Promega VEGF生物测定(图11)。两种测定均显示，纯化V1233的两个独立批次以与艾力雅相似(如果不是更高)的效力抑制VEGF刺激的生长或受体活化。
还确定，与293细胞(Expi-293系统)相比，在CHO细胞中，构建体的表达不依赖于向培养基中添加肝素(图12)，这是一个相当大的优势。此外，我们确定CHO衍生的V1233在小鼠CNV模型中具有完全活性，并且其效力不低于293表达的V1233(图13)。
讨论
长期以来，D3与HPSG的相互作用一直被认为是基于VEGFR1的抗VEGF策略的限制，因为它在各种组织中螯合，导致全身半衰期减少。为了克服此类问题，Holash等人用VEGFR2D3代替VEGFR1 D321。为了同样的目标，Lee等人最近在VEGFR1 D3中引入了糖基化位点，有效地中和正电荷，从而消除D3介导的HSPG结合48。在这两种情况下，相对于原始VEGFR1构建体，系统半衰期均增加了21 48。
本研究设计了一系列具有与HSPG相互作用的差异能力的VEGFR-1Fc融合构建体。前提是，由VEGFR1 D3(或其它Ig样D，如D449)介导的肝素结合虽然不利于全身治疗，但可能赋予用于玻璃体内施用的VEGF抑制剂独特的优势，因为a)它应将抑制剂锚定在眼睛玻璃体或其它结构中的HPSG或其它阴离子分子上，从而增加其半衰期；b)此类抑制剂不需要均匀分布或深入渗透到眼睛结构中以有效结合和阻断VEGF。各种研究表明，VEGF可以响应于由HPSG确定的生化梯度或脉管系统或其它位点的受体分布扩散到距其产生部位相当远的地方50 8 9。例如，尽管VEGF是由肿瘤细胞产生的，即使在距脉管系统显著远的地方，由于其对VEGF受体的高亲和力，它在血管中扩散和积聚51-53。因此，玻璃体结合的VEGFR1变体预计会产生强梯度，其能够吸引并中和VEGF。
鉴于使用传感器平台如SPR与非常紧密的结合剂(Kd<100pm)54获得准确的亲和力测量存在挑战，关于阿柏西普与其它VEGF抑制剂的亲和力的相互矛盾的数据21 55以及VEGF和其它靶点的中和抗体中结合亲和力和治疗效力/功效之间的相关性差56 57，本研究选择关注生物学IC50数据，这在生理学上更相关。如图4所示，重组蛋白具有抑制作用，IC50值在约1nM范围内，除了V124和V24，它们的效力显著较低。
这些蛋白质与牛玻璃体结合。最强的结合剂是V1233、V1234，其次是V123。V23具有显著但较低的玻璃体结合。相反，对照IgG、艾力雅或安维汀(AVASTIN)具有最小结合。
我们研究的一个意外发现是一些构建体的效力更强：V123、V23、V1233和V233。在损伤前一天施用2.5μg这些构建体匹配或甚至超过使用25μg艾力雅实现的抑制水平。在损伤前7天或14天施用时，V1233而非艾力雅在预防CNV方面具有显著效果的发现证明了效果的持久性和治疗价值。
此外，发现这些肝素结合蛋白的玻璃体内注射导致比艾力雅低得多的全身水平。这种特性可能特别有用，例如，对于ROP的治疗，因为据报道，使用具有显著全身暴露的抗VEGF剂治疗可能具有有害的神经发育影响58 59。
有趣的是，尽管有这些分子(V2-4除外)证明了在体外抑制VEGF刺激的有丝分裂发生的能力的事实，但是含有D4(V1234、V234、V124、V24)的构建体均没有导致体内显著抑制(至少在测试剂量下)。然而，所有这些构建体均显示出形成寡聚体或聚集体的倾向，如通过非还原条件下的SDS/PAGE和尺寸排阻色谱法所评估的(数据未显示)。尽管早期的工作60将D4(与D7一起)确定为VEGFR-1二聚化的必要条件，但已知此类效应是配体依赖性的。晶体结构研究揭示了D4中的环负责此类同型相互作用30。可以想象，高浓度和/或Fc构建体施加的强制二聚化可能导致配体非依赖性相互作用，从而导致聚集。无论如何，考虑到炎症和免疫原性的可能性，聚集体不是理想的药物61,62。重要的是，缺乏我们的包括D4的蛋白质的显著功效反对污染物可能对观察到的功效负责的可能性，因为所有蛋白质均通过相同的方法纯化，并且具有强肝素结合特性。
总之，阿柏西普被设计成消除肝素结合肝素结构域，以便改善肿瘤适应症的全身半衰期。相反，本研究中描述的构建体被设计为促进在玻璃体中的结合和保留，以确保更持续和治疗相关的相互作用。
在使用CHO细胞作为表达系统的实验中，向转染细胞的培养基中添加肝素的需求大大减少，使得向培养基中添加肝素导致重组蛋白浓度的增加非常小。这可能是由于293和CHO细胞之间HSPG组成/浓度的差异造成的。
方法
为了构建VEGFR-Fc表达质粒，由金斯瑞美国公司(GenScript USA Inc.)合成编码VEGRF127(基因ID：2321)的信号肽和一至四个胞外Ig样结构域的组合的核酸片段。制备了以下构建体：V123，D1、D2和D3；V23，D2和D3；V1233，D1、D2、D3和D3；V233，D2、D3和D3；V1234，D1、D2、D3和D4；V234，D2、D3和D4；V124，D1、D2和D4；V24，D2和D4。将合成的片段插入到pFUSE-hIgG1-Fc1载体(InvivoGen,#pfuse-hgifc1)的EcoRI和BgIII位点中，生成含有各种VEGFR1 ECD的质粒。然后，使用PrimeSTAR突变基础试剂盒(大连宝生物(Takara)，R046A)，去除ECD和Fc片段之间的间隔氨基酸R和S(BgIII位点)，生成表达VEGFR1 ECD与227氨基酸人IgG1-Fc的融合蛋白的质粒。
转染和条件培养基制备
根据制造商的说明，使用Expi293表达系统(生命技术(Life technologies)，A14524)生成用于纯化的条件培养基。简而言之，使Expi293FTM细胞(赛默飞世尔(ThermoFisher))在Expi293TM表达培养基中在37℃下在含8％CO2的湿润气氛中进行悬浮培养。当细胞密度达到250万/ml时，将质粒DNA和ExpiFectamineTM 293试剂混合，孵育5分钟并添加至细胞中。DNA和转染试剂的最终浓度分别为每毫升1μg和2.7μl。转染后五小时，将100μg/ml肝素(西格玛，H3149)和蛋白酶抑制剂混合物1:400(西格玛，P1860)添加到细胞中。在转染后16小时，添加增强剂1和2。在转染后九十六小时，收获条件培养基。根据制造商的说明，使用人Fc ELISA试剂盒(悉德实验室(Syd Labs)，EK000095-HUFC-2)测试等分试样的Fc融合蛋白浓度。将蛋白酶抑制剂添加(1:500)到主体中，将其储存在-80℃直至进一步使用。
重组蛋白的纯化
采用无热原试剂。使用前，通过暴露于0.5N NaOH对柱和设备(Akta Explorer系统)进行消毒。将来自转染细胞的条件培养基调整为PBS，0.01％聚山梨醇酯(PS)20。在所有步骤中将PS20添加到缓冲液中。以20,000xg离心30分钟后，使用Hi-Trap MabSelect SuRe(5ml，通用电气医疗集团(GE Healthcare))对上清液进行蛋白A(PA)亲和色谱法。加载后，用20mM二乙醇胺，pH 9.2，1.2M NaCl洗涤柱，然后用0.1M柠檬酸，pH 3.0洗脱，立即中和。然后将PA洗脱池在20mM二乙醇胺，pH 9.2中稀释，并应用于Hi-TrapQ(通用电气医疗集团)阴离子交换柱。结合材料用NaCl梯度洗脱。立即将含有纯化的重组蛋白的流通液调节到20mMTris，pH 6.8，并且然后通过结合到肝素-琼脂糖(Hi-TrapTM-HS)浓缩。用0.2M-0.45M NaCl(取决于构建体)洗涤后，用1M NaCl洗脱重组VEGFR1融合蛋白。最后的精制步骤由尺寸排阻色谱法(SEC)组成。最后，通过透析将蛋白质的缓冲液更换为10mM Tris，pH 6.8，10mM组氨酸，5％-7％海藻糖，40mM NaCl，0.01％PS20。目标是获得接近等渗的制剂(约300mOsm)。为了确定内毒素水平，根据制造商的方案使用ToxinSensor Chromogenic LAL内毒素测定试剂盒(金斯瑞，L00350)。
细胞增殖测定
内皮细胞增殖测定基本上如前所述进行63 64。将原代牛脉络膜内皮细胞(BCEC)(代数<10)(VEC科技伦斯勒理工学院(VEC Technologies Rensselaer)，纽约，类别#BCME-4)用胰蛋白酶消化，重新悬浮并接种于补充有10％小牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素的低葡萄糖DMEM的96孔板(无涂层)中，密度为200μl体积中每孔1000个细胞。以10ng/ml的浓度添加rhVEGF165(研发系统，类别#293-VE-010)或rhVEGF121(研发系统，类别#4644-VS010)。阿柏西普(艾力雅)购自药店。将抑制剂在如图所示的各种浓度下添加到细胞中，然后添加配体。5天或6天后，将细胞与Alamar Blue一起孵育4小时。在530nm激发波长和590nm发射波长下测量荧光。
在EGM-2内皮细胞生长培养基(龙沙(Lonza))中的0.1％明胶涂布板上培养来自合并供体(龙沙，类别#C2519A)的第5-9代的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。使细胞在37℃下在含5％CO2的湿润气氛中保持。为了测量细胞增殖，将悬浮在200ul含有0.5％FBS的内皮基底生长培养基EBM-2(龙沙)中的1800个HUVEC接种在96孔板中。四小时后，将浓度为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml和2000ng/ml的重组Fc融合蛋白和艾力雅与10ng/ml VEGF165一起添加到细胞中。将细胞培养3天，并按照制造商的说明，用alamarBlue细胞活力试剂(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))确定细胞活力。
体外结合牛玻璃体
将牛玻璃体样本(InVision BioResource，西雅图，华盛顿州)在4℃下解冻，然后用PBS 1:1稀释，通过0.22pm过滤器过滤，分装并在-80℃下储存。通过Pierce BCA蛋白测定测量总蛋白浓度。Costar 96孔EIA/RIA stripwell在室温下用玻璃体(1pg/孔)涂布4小时，然后用PBS-0.1％吐温20(PBS-T)洗涤一次。向每个孔中添加50pl体积的0.08nM至10nM嵌合VEGF受体蛋白，并在4℃下孵育过夜。然后用PBS-T洗涤板，并在室温下与AP缀合的山羊抗人Fc(1:2000，英杰公司，#A18832)一起孵育1小时。在1步PNPP底物(赛默科技(ThermoScientific)，罗克福德，伊利诺伊州，#37621)之前，在室温下用PBS-T洗涤板15分钟-30分钟。将在405nm处测量吸光度。S
激光诱发的脉络膜新生血管(CNV)
在激光治疗前用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉雄性C57BL/6J小鼠(6周-8周)。CNV病变是通过使用二极管激光器(IRIDEX，Oculight GL)和裂隙灯(蔡司(Zeiss))进行激光光凝诱发，其斑点尺寸为50um，功率为180mW，并且暴露持续时间为100ms。47 , 65。通常在每只眼睛的视盘周围的3点钟、6点钟、9点钟和12点钟位置诱导四次激光烧伤。玻璃体内注射不同的构建体或IgG同种型对照，剂量为每只眼睛2.5μg，体积为1pl。2.5μg或25μg的艾力雅用作阳性对照。注射后一天，进行激光治疗，并在激光治疗后7天将眼睛摘除并在4％多聚甲醛(PFA)中固定15分钟。在另一组研究中，在激光治疗前1天、7天或14天注射一次选择的构建体。分离脉络膜-巩膜络合物和视网膜，并且进行抗CD31免疫荧光(IF)，以通过对视网膜和脉络膜组织进行全胚胎染色来证明脉管系统。对于CD31 IF，大鼠抗小鼠抗体BD 550274以1:100稀释并在4℃下孵育过夜。在与继发性抗大鼠抗体(生命技术A11006)一起孵育4小时后，将全胚胎在488nm处成像。通过Image J对病变区域的新生血管和视网膜中的血管密度进行量化。通过学生t检验评估P值(显著变化，p<0.05)。
氧诱导视网膜病变模型
氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型是一种得到确认的方法，其已证明可用于描绘缺血性血管性眼疾病的分子变化66 67。通过使用封闭室，新生小鼠从出生后第7天(P7)起就暴露在75％氧气中直到P12，然后返回21％氧气(室内空气)。这种高氧暴露导致中央视网膜的血管退化和正常的径向血管生长停止，模拟缺血性血管病变的血管闭塞期。返回室内空气后，视网膜的无血管区域变得缺氧68 69。这种缺氧诱导血管生成因子、尤其是VEGF70的表达，导致血管和无血管视网膜连接处异常视网膜新生血管的生长。为了测试抑制剂的效果，将在暴露于高氧之前进行玻璃体内注射，以试图测试新生血管阶段的抑制。在P7时野生型C57BL/6j小鼠将使用流过啮齿动物面罩的异氟醚麻醉。将使用Vannas显微解剖剪刀打开眼睑并向后拉以露出眼睛。接下来，将使用连接到picospritzer III(派克汉尼汾(ParkerHannifin))的拉花玻璃微量吸液管将0.5pl溶液注射到玻璃体腔中。注射后针头将留在眼睛中30秒，并缓慢拔出以最小化泄漏。该程序将在对侧眼中重复，其中注射等摩尔人IgG1作为对照(Bio X Cell，West Labanon，新罕布什尔州)。将与各种剂量的对照IgG1相比测试各种艾力雅构建体。眼睑被抗生素软膏覆盖。然后在P7-P12将一窝动物放在75％高氧室中以产生OIR表型。在P17，即新生血管的峰值时间，动物将被处死，并且眼睛将被摘除，解剖，并且血管将用BSL-FITC染色。视网膜被平装并通过共聚焦显微镜成像。通过测量视网膜前血管芽的体积来量化新生血管的程度67 70-72。如所述，使用自动化软件分析血管闭塞和新生血管73。
CHO细胞研究
质粒构建和表达
由金斯瑞美国公司合成编码VEGFR1(基因ID：2321)的一至三个胞外Ig样结构域(ECD)与信号肽和人IgG1 Fc结构域(基因ID：3500)的核酸片段。该片段被插入pD2535nt-HDP双EF1a启动子载体(ATUM)的XbaI和ECoR1位点，生成表达VEGFR1ECD与227氨基酸人IgG1-Fc的融合蛋白的质粒。VEGFR1 ECD构建体如下：V123含有ECD1、2和3；V1233含有ECD1、2、3和3；V233含有ECD 2、3和3，并且V23含有ECD 2和3。所有构建体的真实性通过序列分析验证。
使用CHO K1谷氨酰胺合成酶(GS)裸细胞(HD-BIOP3，Horizon)进行稳定表达，并使用NeonTM转染系统(#MPK10096，赛默飞世尔)进行转染。简而言之，根据Horizon Discovery提供的方案，通过电穿孔将线性化构建体DNA转染到HD-BIOP3细胞中，然后在37℃和5％CO2的湿润气氛中在含有4mM L-谷氨酰胺(#25030081，赛默飞世尔)的CD FortiCHO培养基(#A1148301，赛默飞世尔)中培养细胞48小时。2天恢复后，更换培养基为选择培养基，含有50μM MSX(#76078，西格玛)的CD FortiCHO。对于长达20天的培养，选择并储存四个VEGFR1 ECD池。通过人Fc ELISA试剂盒(EK000095-HUFC-2，悉德实验室公司)和用抗人IgG1 Fc抗体(A-10648，英杰公司)进行的western质印迹评价培养基中VEGFR1融合蛋白的表达。四个池的表达水平为每100万个细胞1.9μg至13μg(平均地，V123为7.1，V1233为1.98，V233为4.7，并且V23为12.7)。
对于单细胞克隆筛选，根据方案(Horizon)稀释和选择池细胞。约60天的培养后，总共选择并储存了39个克隆，其中V123 8个，V1233 11个，V233 9个，并且V23 11个。通过ELISA和western印迹评价每个克隆的培养基中VEGFR1融合蛋白的表达。表达水平为每100万个细胞3.0μg至18.3μg(平均地，V123为12，V1233为3.7，V233为6.5，并且V23为13)。
对于大规模培养基制备，将细胞(单细胞克隆)以0.5×106/ml的密度接种到旋转瓶中，并在37℃和含5％CO2的湿润气氛下以及125rpm(25mm轨道的轨道振荡器)下，在补充有1:1000抗结块剂(#0010057AE，赛默飞世尔)和1:200蛋白酶抑制剂混合物(p1860，西格玛)的CD FortiCHO培养基中培养。每天监测细胞活力和密度，并在5-7天孵育后收集培养基(细胞密度为7.0-10×106/ml，活力＞90％)。克隆V1233-26、V233-52/67和V23-5用于大型培养基制备。通过ELISA和western印迹验证培养基中VEGFR1融合蛋白的表达，并将培养基储存在-80℃以用于进一步纯化。表达水平为20μg/ml至115μg/ml(平均地，V1233为23μg/ml，V233为47μg/ml，并且V23为105μg/ml)。
纯化
使表达更高水平的V1233蛋白(20ug/ml-30ug/ml)克隆14、26、44和46的HorizonDiscovery(HD)-BIOP3 CHO细胞经历纯化。所有四个克隆均产生了相似的最终产物，因此我们使用克隆26进行后续纯化。相当于约10mg V1233-26的条件培养基如下进行：将在37℃下解冻的条件培养基调整为5％PBS和0.01％(v/v)吐温20，并在4℃下以20,000g离心30分钟。将澄清的提取物施加到在1xPBS和0.01％吐温20中平衡的蛋白A柱(HiTrapTM MabSelectTMSure 5ml)(通用电气医疗集团)。用高pH、高盐缓冲液(5CV：20mM乙醇胺，pH 9.2，1.2MNaCl，0.01％吐温20)洗涤柱，并用0.1M柠檬酸、pH 3.0洗脱结合的蛋白质并立即通过添加1/5体积的1M Tris，pH 9.5中和。将含有Flt1蛋白的级分合并，在20mM乙醇胺，pH 9.2，0.01％吐温20中稀释10倍，并施加至HiTrapTM Q HP 5ml(通用电气医疗集团)阴离子交换柱。通过添加10％v/v 0.5M Tris，pH 6.8将流通中存在的Flt1蛋白调节至pH 6.8，并施加至在20mM Tris，pH 6.8，0.01％吐温20中平衡的HiTrapTM Heparin HP 1ml柱。用0.45MNaCl在缓冲液中洗涤柱，然后以1MNaCl进行最终洗脱。将Flt1阳性级分合并，并在HiLoadSuperdex 16x600柱(通用电气医疗集团)中在10mM Tris，pH 7.2，0.4M NaCl，0.01％吐温20中进行凝胶过滤色谱法。合并不包括高分子量聚集体的级分，在与HiTrapTM Heparin HP1ml柱结合后浓缩，然后如前所述进行1M NaCl洗脱。
使用Float-A-LyzerR G2透析装置，MWCO 100kD或50kD(光谱实验室(SpectrumLaboratories))透析洗脱的蛋白质，并使用Amicon离心过滤器UltraCel 50k浓缩。
对于大规模纯化(相当于50mg蛋白质的条件培养基)，方法修改如下；使用HiTrapPrismA 5ml柱进行蛋白A色谱法，其中使用缓冲液1(50mM Tris，pH 8.5，1.2MNaCl，0.5M精氨酸，0.01％吐温20)和缓冲液2(25mM磷酸钠，pH 6.5，200mM NaCl，0.01％吐温20)进行两个洗涤步骤，然后在0.1M柠檬酸中进行最终洗脱。HiTrapQ使用20mM Tris，pH 8.5进行，并使用稍高的盐(0.55M)洗涤HiTrap肝素柱。在缓冲液10mM组氨酸，pH 6.0，80mM NaCl，0.01％吐温20中，在更宽的柱(HiLoad 26x600)中进行凝胶过滤步骤。代替透析，PD10柱用于缓冲液更换，并且最终蛋白质储存在10mM乙酸钠，pH 5.0，7％海藻糖和0.01％吐温20中。
在FPLC系统AKTA Avant(通用电气医疗集团)中进行色谱法。每次运行前用0.5NNaOH对柱和仪器进行消毒(在适当位置清洗)。每个步骤后通过SDS-PAGE和银染确定蛋白质的纯度。通过分析型凝胶过滤确定最终蛋白质制剂的质量。
通过蛋白质测定染料试剂(伯乐(Bio-Rad))和人Fc蛋白和人IgG的Fc ELISA试剂盒(悉德实验室)进行总蛋白质估计。总体蛋白质回收率约为10％，并且最终蛋白质实现的内毒素水平为约0.004EU/mg，和HCP为150ng/mg。
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<220>
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<400> 1
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro
20 25 30
Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr
35 40 45
Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro
50 55 60
Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala
65 70 75 80
Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr
85 90 95
Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val
100 105 110
Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile
115 120 125
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
130 135 140
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
145 150 155 160
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
165 170 175
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
180 185 190
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
195 200 205
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
210 215 220
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val
225 230 235 240
Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr
245 250 255
Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys
260 265 270
Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His
275 280 285
Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys
290 295 300
Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys
305 310 315 320
Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Asp Lys Thr His Thr
325 330 335
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
340 345 350
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
355 360 365
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
370 375 380
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
385 390 395 400
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
405 410 415
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
420 425 430
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
435 440 445
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
450 455 460
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
465 470 475 480
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
485 490 495
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
500 505 510
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
515 520 525
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
530 535 540
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550 555
<210> 2
<211> 1674
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 2
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatcta gttcaggttc aaaattaaaa gatcctgaac tgagtttaaa aggcacccag 120
cacatcatgc aagcaggcca gacactgcat ctccaatgca ggggggaagc agcccataaa 180
tggtctttgc ctgaaatggt gagtaaggaa agcgaaaggc tgagcataac taaatctgcc 240
tgtggaagaa atggcaaaca attctgcagt actttaacct tgaacacagc tcaagcaaac 300
cacactggct tctacagctg caaatatcta gctgtaccta cttcaaagaa gaaggaaaca 360
gaatctgcaa tctatatatt tattagtgat acaggtagac ctttcgtaga gatgtacagt 420
gaaatccccg aaattataca catgactgaa ggaagggagc tcgtcattcc ctgccgggtt 480
acgtcaccta acatcactgt tactttaaaa aagtttccac ttgacacttt gatccctgat 540
ggaaaacgca taatctggga cagtagaaag ggcttcatca tatcaaatgc aacgtacaaa 600
gaaatagggc ttctgacctg tgaagcaaca gtcaatgggc atttgtataa gacaaactat 660
ctcacacatc gacaaaccaa tacaatcata gatgtccaaa taagcacacc acgcccagtc 720
aaattactta gaggccatac tcttgtcctc aattgtactg ctaccactcc cttgaacacg 780
agagttcaaa tgacctggag ttaccctgat gaaaaaaata agagagcttc cgtaaggcga 840
cgaattgacc aaagcaattc ccatgccaac atattctaca gtgttcttac tattgacaaa 900
atgcagaaca aagacaaagg actttatact tgtcgtgtaa ggagtggacc atcattcaaa 960
tctgttaaca cctcagtgca tatatatgat aaagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1020
ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 1080
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1140
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1200
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1260
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1320
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1380
accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1440
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1500
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1560
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gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1674
<210> 3
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 3
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ile Phe Ile Ser Asp Thr
20 25 30
Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
35 40 45
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
50 55 60
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
65 70 75 80
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
85 90 95
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
100 105 110
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
115 120 125
Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu
130 135 140
Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn
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Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg
165 170 175
Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile
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Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly
195 200 205
Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn
210 215 220
Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225 230 235 240
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245 250 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260 265 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
275 280 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290 295 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325 330 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340 345 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
355 360 365
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385 390 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420 425 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 4
<211> 1377
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 4
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatcta gttcaggtat atttattagt gatacaggta gacctttcgt agagatgtac 120
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gttacgtcac ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct 240
gatggaaaac gcataatctg ggacagtaga aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac 300
aaagaaatag ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac 360
tatctcacac atcgacaaac caatacaatc atagatgtcc aaataagcac accacgccca 420
gtcaaattac ttagaggcca tactcttgtc ctcaattgta ctgctaccac tcccttgaac 480
acgagagttc aaatgacctg gagttaccct gatgaaaaaa ataagagagc ttccgtaagg 540
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<210> 5
<211> 659
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 5
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro
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Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr
35 40 45
Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro
50 55 60
Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala
65 70 75 80
Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr
85 90 95
Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val
100 105 110
Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile
115 120 125
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
130 135 140
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
145 150 155 160
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
165 170 175
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
180 185 190
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
195 200 205
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
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Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val
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Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr
245 250 255
Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys
260 265 270
Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His
275 280 285
Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys
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Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys
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Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Val Gln Ile Ser
325 330 335
Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn
340 345 350
Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser
355 360 365
Tyr Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp
370 375 380
Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp
385 390 395 400
Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser
405 410 415
Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys
420 425 430
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
435 440 445
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
450 455 460
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
485 490 495
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
500 505 510
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
515 520 525
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Pro Gly Lys
<210> 6
<211> 1977
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 7
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ile Phe Ile Ser Asp Thr
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Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
35 40 45
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
50 55 60
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
65 70 75 80
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
85 90 95
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
100 105 110
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
115 120 125
Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu
130 135 140
Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn
145 150 155 160
Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg
165 170 175
Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile
180 185 190
Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly
195 200 205
Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn
210 215 220
Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg
225 230 235 240
Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala
245 250 255
Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp
260 265 270
Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn
275 280 285
Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln
290 295 300
Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser
305 310 315 320
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325 330 335
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
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385 390 395 400
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
405 410 415
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
420 425 430
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
435 440 445
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
450 455 460
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
465 470 475 480
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
485 490 495
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500 505 510
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
515 520 525
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
530 535 540
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545 550 555 560
<210> 8
<211> 1680
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 8
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatcta gttcaggtat atttattagt gatacaggta gacctttcgt agagatgtac 120
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cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1200
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<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 9
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro
20 25 30
Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr
35 40 45
Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro
50 55 60
Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala
65 70 75 80
Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr
85 90 95
Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val
100 105 110
Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile
115 120 125
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
130 135 140
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
145 150 155 160
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
165 170 175
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
180 185 190
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
195 200 205
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
210 215 220
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val
225 230 235 240
Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr
245 250 255
Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys
260 265 270
Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His
275 280 285
Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys
290 295 300
Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys
305 310 315 320
Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val
325 330 335
Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser
340 345 350
Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val
355 360 365
Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu
370 375 380
Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala
385 390 395 400
Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys
405 410 415
Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Asp Lys Thr His
420 425 430
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
435 440 445
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
450 455 460
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
465 470 475 480
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
485 490 495
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
500 505 510
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
515 520 525
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
530 535 540
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
545 550 555 560
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
565 570 575
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
580 585 590
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
595 600 605
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
610 615 620
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
625 630 635 640
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
645 650 655
<210> 10
<211> 1965
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 10
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatcta gttcaggttc aaaattaaaa gatcctgaac tgagtttaaa aggcacccag 120
cacatcatgc aagcaggcca gacactgcat ctccaatgca ggggggaagc agcccataaa 180
tggtctttgc ctgaaatggt gagtaaggaa agcgaaaggc tgagcataac taaatctgcc 240
tgtggaagaa atggcaaaca attctgcagt actttaacct tgaacacagc tcaagcaaac 300
cacactggct tctacagctg caaatatcta gctgtaccta cttcaaagaa gaaggaaaca 360
gaatctgcaa tctatatatt tattagtgat acaggtagac ctttcgtaga gatgtacagt 420
gaaatccccg aaattataca catgactgaa ggaagggagc tcgtcattcc ctgccgggtt 480
acgtcaccta acatcactgt tactttaaaa aagtttccac ttgacacttt gatccctgat 540
ggaaaacgca taatctggga cagtagaaag ggcttcatca tatcaaatgc aacgtacaaa 600
gaaatagggc ttctgacctg tgaagcaaca gtcaatgggc atttgtataa gacaaactat 660
ctcacacatc gacaaaccaa tacaatcata gatgtccaaa taagcacacc acgcccagtc 720
aaattactta gaggccatac tcttgtcctc aattgtactg ctaccactcc cttgaacacg 780
agagttcaaa tgacctggag ttaccctgat gaaaaaaata agagagcttc cgtaaggcga 840
cgaattgacc aaagcaattc ccatgccaac atattctaca gtgttcttac tattgacaaa 900
atgcagaaca aagacaaagg actttatact tgtcgtgtaa ggagtggacc atcattcaaa 960
tctgttaaca cctcagtgca tatatatgat aaagcattca tcactgtgaa acatcgaaaa 1020
cagcaggtgc ttgaaaccgt agctggcaag cggtcttacc ggctctctat gaaagtgaag 1080
gcatttccct cgccggaagt tgtatggtta aaagatgggt tacctgcgac tgagaaatct 1140
gctcgctatt tgactcgtgg ctactcgtta attatcaagg acgtaactga agaggatgca 1200
gggaattata caatcttgct gagcataaaa cagtcaaatg tgtttaaaaa cctcactgcc 1260
actctaattg tcaatgtgaa acccgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 1320
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 1380
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 1440
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1500
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1560
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1620
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1680
ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1740
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1800
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1860
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca cgaggctctg 1920
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaa 1965
<210> 11
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 11
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ile Phe Ile Ser Asp Thr
20 25 30
Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
35 40 45
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
50 55 60
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
65 70 75 80
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
85 90 95
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
100 105 110
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
115 120 125
Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu
130 135 140
Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn
145 150 155 160
Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg
165 170 175
Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile
180 185 190
Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly
195 200 205
Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn
210 215 220
Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val Lys His Arg
225 230 235 240
Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser Tyr Arg Leu
245 250 255
Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val Trp Leu Lys
260 265 270
Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu Thr Arg Gly
275 280 285
Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala Gly Asn Tyr
290 295 300
Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys Asn Leu Thr
305 310 315 320
Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
325 330 335
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
340 345 350
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
355 360 365
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
370 375 380
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
385 390 395 400
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
405 410 415
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
420 425 430
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
435 440 445
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
450 455 460
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
465 470 475 480
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
485 490 495
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
500 505 510
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
515 520 525
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
530 535 540
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550 555
<210> 12
<211> 1668
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 12
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatcta gttcaggtat atttattagt gatacaggta gacctttcgt agagatgtac 120
agtgaaatcc ccgaaattat acacatgact gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg 180
gttacgtcac ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct 240
gatggaaaac gcataatctg ggacagtaga aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac 300
aaagaaatag ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac 360
tatctcacac atcgacaaac caatacaatc atagatgtcc aaataagcac accacgccca 420
gtcaaattac ttagaggcca tactcttgtc ctcaattgta ctgctaccac tcccttgaac 480
acgagagttc aaatgacctg gagttaccct gatgaaaaaa ataagagagc ttccgtaagg 540
cgacgaattg accaaagcaa ttcccatgcc aacatattct acagtgttct tactattgac 600
aaaatgcaga acaaagacaa aggactttat acttgtcgtg taaggagtgg accatcattc 660
aaatctgtta acacctcagt gcatatatat gataaagcat tcatcactgt gaaacatcga 720
aaacagcagg tgcttgaaac cgtagctggc aagcggtctt accggctctc tatgaaagtg 780
aaggcatttc cctcgccgga agttgtatgg ttaaaagatg ggttacctgc gactgagaaa 840
tctgctcgct atttgactcg tggctactcg ttaattatca aggacgtaac tgaagaggat 900
gcagggaatt atacaatctt gctgagcata aaacagtcaa atgtgtttaa aaacctcact 960
gccactctaa ttgtcaatgt gaaacccgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1020
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 1080
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 1140
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1200
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1260
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1320
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1380
cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1440
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1500
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1560
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcacgaggct 1620
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1668
<210> 13
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 13
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ile Phe Ile Ser Asp Thr
20 25 30
Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
35 40 45
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
50 55 60
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
65 70 75 80
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
85 90 95
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
100 105 110
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
115 120 125
Thr Ile Ile Asp Val Phe Ile Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln Val
130 135 140
Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val
145 150 155 160
Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro
165 170 175
Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile
180 185 190
Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu
195 200 205
Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile
210 215 220
Val Asn Val Lys Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 14
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 14
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatcta gttcaggtat atttattagt gatacaggta gacctttcgt agagatgtac 120
agtgaaatcc ccgaaattat acacatgact gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg 180
gttacgtcac ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct 240
gatggaaaac gcataatctg ggacagtaga aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac 300
aaagaaatag ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac 360
tatctcacac atcgacaaac caatacaatc atagatgtct tcatcactgt gaaacatcga 420
aaacagcagg tgcttgaaac cgtagctggc aagcggtctt accggctctc tatgaaagtg 480
aaggcatttc cctcgccgga agttgtatgg ttaaaagatg ggttacctgc gactgagaaa 540
tctgctcgct atttgactcg tggctactcg ttaattatca aggacgtaac tgaagaggat 600
gcagggaatt atacaatctt gctgagcata aaacagtcaa atgtgtttaa aaacctcact 660
gccactctaa ttgtcaatgt gaaacccgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080
cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1260
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcacgaggct 1320
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1368
<210> 15
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Pro Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln
1 5 10 15
Thr Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu
20 25 30
Pro Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser
35 40 45
Ala Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn
50 55 60
Thr Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala
65 70 75 80
Val Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe
85 90 95
Ile
<210> 16
<211> 93
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr
1 5 10 15
Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile
20 25 30
Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly
35 40 45
Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala
50 55 60
Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly
65 70 75 80
His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr
85 90
<210> 17
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr
1 5 10 15
Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln
20 25 30
Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg
35 40 45
Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val
50 55 60
Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys
65 70 75 80
Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val His
85 90 95
Ile Tyr Asp Lys
100
<210> 18
<211> 96
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Phe Ile Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala
1 5 10 15
Gly Lys Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser
20 25 30
Pro Glu Val Val Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser
35 40 45
Ala Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr
50 55 60
Glu Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser
65 70 75 80
Asn Val Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro
85 90 95

Claims (15)

1.一种治疗有需要的受试者的VEGF相关眼科病症的方法，其包括向所述受试者玻璃体内施用第一治疗有效量的抗VEGF剂，和在较早施用的10周至30周内向所述受试者玻璃体内施用第二治疗有效量的所述抗VEGF剂，其中所述抗VEGF剂包含与Fc-IgG可操作地连接的VEGF结合部分，其中所述VEGF结合部分包含至少一个VEGF结合结构域，所述VEGF结合结构域为VEGFR-1的IgG样结构域2。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述较早施用的16周至24周内玻璃体内施用所述第二治疗有效量的所述抗VEGF剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在先前施用的10周至30周内玻璃体内施用所述治疗有效量的所述抗VEGF剂的后续施用，持续至少一年的时段。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗VEGF剂具有比阿柏西普更高的玻璃体结合能力。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗VEGF剂具有比阿柏西普更高的玻璃体结合VEGF刺激的内皮细胞增殖抑制能力。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗VEGF剂具有比阿柏西普更高的VEGF刺激的有丝分裂发生抑制能力。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述VEGF结合部分基本上由VEGFR-1的IgG样结构域1、2和3(V1-2-3)组成。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述VEGF结合部分基本上由VEGFR-1的IgG样结构域2和3(V2-3)组成。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述VEGF结合部分基本上由VEGFR-1的IgG样结构域1、2、3和3(V1-2-3-3)组成。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述VEGF结合部分基本上由VEGFR-1的IgG样结构域2、3和3(V2-3-3)组成。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗VEGF剂的所述治疗有效量为约1mg至10mg。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗VEGF剂的所述治疗有效量为约3mg至6mg。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述VEGF相关眼科病症选自包含以下的群组：新生血管年龄相关性黄斑变性、继发于近视的脉络膜新生血管、增生性糖尿病性视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、视网膜血管阻塞如视网膜静脉阻塞、眼部肿瘤、希佩尔-林道综合征、早产儿视网膜病变和息肉状脉络膜血管病变。
14.一种促进有需要的受试者的眼内新生血管的方法，其包括向所述受试者玻璃体内施用第一治疗有效量的抗VEGF剂，和在较早施用的10周至30周内向所述受试者玻璃体内施用第二治疗有效量的所述抗VEGF剂，其中所述抗VEGF剂包含与Fc-IgG可操作地连接的VEGF结合部分，其中所述VEGF结合部分包含至少一个VEGF结合结构域，所述VEGF结合结构域为VEGFR-1的IgG样结构域2。
15.一种用于治疗有需要的受试者的VEGF相关眼科病症的药物组合物，其中所述抗VEGF剂如权利要求1至13中任一项所定义。
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