CN114848678A

CN114848678A - 龟板在制备治疗脑衰老联合骨衰老的药物中的应用

Info

Publication number: CN114848678A
Application number: CN202210472035.XA
Authority: CN
Inventors: 任辉; 尚奇; 江晓兵; 沈耿杨; 陈桂锋; 余富勇; 张鹏; 陈弘林; 招文华; 余翔; 张志达; 刘慧雯
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2042-04-29
Also published as: CN114848678B

Abstract

本发明提供了龟板在制备抗脑衰老和骨衰老的药物中的应用。龟板可以提高自然衰老小鼠的探索能力和空间记忆力，有效延缓海马体的衰老、增加海马体CA3区尼氏体的数量，改善自然衰老小鼠骨微细结构和骨组织形态学。因此，龟板可用于治疗脑衰老和骨衰老共病相关疾病，如骨质疏松症联合阿尔茨海默病，实现单味药物治疗脑衰老联合骨衰老的效果。

Description

龟板在制备治疗脑衰老联合骨衰老的药物中的应用

技术领域

本发明属于中医药技术领域，具体涉及龟板在制备治疗脑衰老联合骨衰老的药物中的应用。

背景技术

脑衰老和骨衰老共病相关疾病(如骨质疏松症联合阿尔茨海默病等)给患者、家庭和社会经济带来了巨大的负担。目前尚未有同时特异性逆转脑衰老和骨衰老的药物，因此探索脑衰老和骨衰老共病的治疗药物迫在眉睫。海马作为下丘脑-垂体-性腺(Hypothalamus-pituitary-gonad，HPG)轴的高位调节中枢，通过调控HPG轴释放性激素在骨稳态中发挥重要作用，这是脑衰老和骨衰老共病的生理基础。

龟板为龟科动物的腹甲及背甲，目前尚未有龟板改善自然衰老小鼠(22月龄小鼠)骨衰老的报道，亦未见单味药龟板同时治疗脑衰老和骨衰老共病的报道。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供龟板在制备治疗脑衰老联合骨衰老的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。

龟板在制备抗衰老的药物中的应用，所述药物可以抗脑衰老和骨衰老。

在一些实施例中，所述药物可以抗海马体衰老。

在一些实施例中，所述药物可以增加海马体CA3区尼氏体的数量。

在一些实施例中，所述药物可以提高探索能力。

在一些实施例中，所述药物可以提高空间记忆力。

在一些实施例中，所述药物可以提高骨体积分数、增加骨小量数量、降低骨小梁分离度。

在一些实施例中，所述药物可以改善骨组织形态。

本发明还提供了龟板在制备治疗骨质疏松症联合阿尔茨海默病的药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗脑衰老联合骨衰老的药物，所述药物包含龟板和药物学上可接受的载体。

本发明经过研究发现，龟板具有改善脑衰老和骨衰老的双重作用，龟板可以明显提高自然衰老小鼠的探索能力和空间记忆力，有效延缓海马体的衰老、增加海马体CA3区尼氏体的数量。同时，龟板还可以提高自然衰老小鼠的骨体积分数、增加骨小量数量、降低骨小梁分离度以及改善骨组织形态。因此，龟板能有效抗脑衰老和骨衰老，可用于治疗脑衰老和骨衰老共病相关疾病，如骨质疏松症联合阿尔茨海默病，实现单味药物治疗脑衰老联合骨衰老的效果。

附图说明

图1为各组小鼠旷场实验检测结果。

图2为各组小鼠水迷宫实验检测结果；其中，A.各组小鼠水迷宫空间探索实验轨迹图；B.各组小鼠水迷宫空间探索实验穿越站台次数；与SOP比较，*P<0.05；C.小鼠水迷宫定位航行实验逃避潜伏期时间；与SOP比较，**P<0.01。

图3为各组小鼠股骨micro-CT骨微细结构及参数比较结果；其中，A-B.各组小鼠micro-CT股骨松质骨微细结构及参数，BV/TV，骨体积分数；Tb.Th，骨小梁厚度；Tb.N，骨小梁数量；Tb.Sp，骨小梁分离度；与SOP比较，*P<0.05，**P<0.01。C-D.各组小鼠micro-CT股骨皮质骨微细结构及参数，Ct.BMD，皮质骨密度；Ct.BV/TV，皮质骨体积分数；Ct.Tb.Th，皮质骨厚度；Porosity，皮质骨孔隙率。

图4为各组小鼠股骨组织形态学及参数比较结果；其中，A-B.各组小鼠股骨HE染色及参数，比例尺：左侧图片，5×，500μm；右侧图片，20×，100μm；Tr.B，骨小梁；黄色箭头为成骨细胞；Ob.S/BS，成骨细胞表面/骨表面；Ob.N/BS，成骨细胞数量/骨表面；与SOP比较，*P<0.05，**P<0.01；C-D.各组小鼠股骨TRAP染色及参数，黑色箭头为破骨细胞；Oc.S/BS，破骨细胞表面/骨表面；Oc.N/BS，破骨细胞数量/骨表面；与SOP比较，*P<0.05，**P<0.01。

图5为各组小鼠海马组织形态学及参数检测结果；其中，A-B.各组小鼠海马HE染色与尼氏染色，比例尺：第1列图片，8×，200μm；第2-4列图片，40×，50μm；C.各组小鼠海马CA1、CA3、DG区尼氏体数量；与SOP比较，*P<0.05。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

本实施例使用自然衰老小鼠进行实验，研究龟板对脑衰老联合骨衰老的治疗作用。

一、材料

1.动物：2月龄雌性C57BL/6小鼠(18-22g)购自广州中医药大学实验动物中心(许可证号：SCXK(粤)2018-0034)，饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF级动物房(许可证号：SYXK(粤)2018-0092)，饲养至22月龄制作自然衰老小鼠模型(体重为27-33g)，即为经典SOP模型，实验经广州中医药大学第一附属医院伦理委员会批准。

2.药品、试剂与仪器：龟板(广州中医药大学第一附属医院，批号：KG37243537)；HE染液(赛维尔生物，货号：G1005)；TRAP染色液(赛维尔生物，货号：G1050)；尼氏染液(赛维尔生物，货号：G1036)。旷场实验与水迷宫行为学系统(上海欣软，SuperMaze3.0)；Micro-CT扫描系统(Bruker 1172)；酶标仪(赛默飞，Multiscan1510)；倒置显微镜(奥林巴斯，IX73)；数字病理切片扫描系统(3D HISTEC,Pannoramic MIDI)。

二、方法

1.建立小鼠SOP模型

22月龄C57/BL6雌性自然衰老小鼠随机分为模型组(SOP)，龟板干预组(PT+SOP)，分别给予生理盐水或者龟板干预8周。取材前一周行旷场和水迷宫实验，然后取小鼠大脑、股骨组织，检测相关指标。

2.龟板冻干粉的制备与干预

100g龟板粉碎后，加1L纯水，加热微沸1h获取提取液，剩余药渣加入800ml纯水，重复提取2次；3次提取液混合后经旋转蒸发仪浓缩至无液滴滴出，冷冻干燥后得龟板冻干粉。龟板动物实验灌胃浓度采用实验探索的最佳浓度4g/kg，灌胃剂量为0.2ml/只/d。

3.旷场实验和水迷宫实验

提前2h运送小鼠至实验房间适应环境。将实验动物迅速放置于旷场实验箱的中央区域。运用SuperMaze软件自动记录动物在箱体内的活动，实验时间5min。旷场实验结束后，进行水迷宫实验，将小鼠面向水迷宫池壁从四个象限入水点分别放入水池，记录小鼠从入水到找到水下隐蔽平台所需时间，作为逃避潜伏期。每天四个象限，共计5d，此为定位航行实验。第6d撤去平台，从平台对侧象限入水，时间60s，此为空间探索实验。

4.Micro-CT检测

小鼠股骨4％多聚甲醛固定24h后，使用Micro-CT成像系统(80kV电压、100mA电流和5μm分辨率)扫描股骨。采用DataViewer、CTAn、CTvox软件分别对股骨图像进行校正、分析和重建。

5.股骨组织形态学检测

股骨置于乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙溶液中3-5周后，依次进行梯度酒精脱水和二甲苯透明，石蜡包埋并切成5μm的薄片，HE和TRAP染色液染色。采用3D HISTEC数字病理切片扫描系统进行扫描分析。

6.海马组织形态学检测

完整取出大脑半球，4％多聚甲醛固定48h后石蜡包埋，5μm正中矢状面切至海马位置，分别采用HE和尼氏染液进行染色。3D HISTEC数字病理切片扫描系统进行扫描分析。

7.统计学方法

采用Graphpad Prism 7.0软件分析数据，计量资料检验后均符合正态分布，采用均数±标准差

表示，方差齐性检验中方差齐使用独立样本T检验，方差不齐使用校正T检验，P＜0.05具有统计学差异。水迷宫实验数据(图2C)采用双因素方差分析。

三、实验结果

1.龟板改善自然衰老小鼠探索能力

各组小鼠旷场实验参数比较见图1。与对照组比较，龟板干预组小鼠旷场实验中运动总距离上升(P<0.05)，四周运动时间和静止时间下降(P<0.05)。说明龟板可以有效提高自然衰老模型小鼠的探索能力。

2.龟板改善自然衰老小鼠空间记忆能力

各组小鼠水迷宫实验比较见图2。与对照组比较，龟板干预组小鼠水迷宫穿越站台次数上升(P<0.05)，逃避潜伏期时间缩短(P<0.01)。说明龟板可以有效提高自然衰老模型小鼠的空间记忆能力。

3.龟板改善自然衰老小鼠骨微细结构

各组小鼠股骨micro-CT骨微细结构及参数比较见图3。与对照组比较，龟板干预组小鼠股骨松质骨中BV/TV上升(P<0.05)，Tb.N上升(P<0.05)，Tb.Sp下降(P<0.01)。

4.龟板改善小鼠骨组织形态学

各组小鼠股骨组织形态学及参数比较见图4。HE染色中，龟板干预组骨小梁厚度较对照组增粗，Ob.S/BS(P<0.01)上升，Ob.N/BS(P<0.05)上升。TRAP染色中，龟板干预组Oc.S/BS(P<0.01)上升，Oc.N/BS(P<0.05)上升。

5.龟板改善小鼠海马体衰老

各组小鼠海马组织形态学及参数比较见图5。HE染色中，SOP组神经元分布较散乱，数目较少；龟板干预组海马神经元分布较紧密，数目较多。在小鼠海马尼氏染色中，与SOP组相比，龟板干预组尼氏体较为清晰，排列紧密，CA3区数量增多(P<0.05)。

上述结果表明，龟板可用于治疗脑衰老和骨衰老共病相关疾病，如骨质疏松症联合阿尔茨海默病，实现单味药物治疗脑衰老联合骨衰老的效果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.龟板在制备抗衰老的药物中的应用，其特征在于，所述药物可以抗脑衰老和骨衰老。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物可以抗海马体衰老。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物可以增加海马体CA3区尼氏体的数量。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物可以提高探索能力。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物可以提高空间记忆力。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物可以提高骨体积分数、增加骨小量数量、降低骨小梁分离度。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物可以改善骨组织形态。

8.龟板在制备治疗骨质疏松症联合阿尔茨海默病的药物中的应用。

9.一种治疗脑衰老联合骨衰老的药物，其特征在于，所述药物包含龟板和药物学上可接受的载体。