CN114805271A - 一种具有抗炎活性的吡喃酮类化合物的制备和应用 - Google Patents

一种具有抗炎活性的吡喃酮类化合物的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种具有抗炎活性的吡喃酮类化合物的制备和应用，本发明通过合成生物学的手段，通过异源表达海鞘来源真菌Amphichorda felina SYSU‑MS7908的核心基因和甲基转移酶后修饰基因，成功分离得到3个吡喃酮类天然产物1～3，其中1和2具有显著的抗炎活性，通过MTT法发现化合物1、2对正常细胞RAW264.7没有细胞毒活性，但对LPS诱导的炎症细胞RAW264.7具有显著的细胞毒活性。相比于化学合成的药物，天然药物具有药理活性高、毒副作用小等优势，因此本发明的吡喃酮类化合物具有重要的抗炎药物研究价值。

Description

一种具有抗炎活性的吡喃酮类化合物的制备和应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种具有抗炎活性的吡喃酮类化合物的制备和应用。
背景技术
炎症是机体受微生物感染，组织损伤和心机梗塞等因素刺激后产生的一种防御反应，常见的炎症症状有红、肿、热、痛和功能障碍。适度的炎症反应对机体起到保护作用，而过度的炎症反应则会造成机体免疫系统功能紊乱，导致免疫细胞产生过量的细胞因子(细胞因子风暴)，进而对机体产生致命的伤害，甚至会使机体器官衰竭，导致死亡。因此，炎症反应对机体有着不可轻视的作用。
目前，现有的抗炎药物大多是人工合成的化学药物(比如专利CN109674790A公开的噻唑并吡喃酮类似物)，副作用大，易产生抗药性、药物依赖性、损害机体功能等不良反应，如阿司匹林能直接损害胃肠道粘膜，塞来昔布能引起心血管血栓和心肌梗塞，罗非昔布有恶心、胃灼热、腹泻等不良反应。
次级代谢产物是植物或者微生物产生的具有良好活性的天然小分子化合物，这类化合物具有药理活性高、毒副作用小、方便获取、环境友好等优势，一直以来是药物研发的热点。因此，从次级代谢产物中寻找一种低毒性和药效高的天然抗炎药物显得尤为重要。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种吡喃酮类化合物。
本发明的第二个目的是提供上述吡喃酮类化合物的制备方法。通过异源表达Amphichorda felina SYSU-MS7908的核心基因和甲基转移酶，得到3个吡喃酮类的天然化合物。
本发明的第三个目的是提供上述吡喃酮类化合物的抗炎应用。化合物1和2具有良好的抗炎活性，可用于抗炎药物的研发。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：
一种吡喃酮类化合物，所述吡喃酮类化合物选自式(1)、式(2)和式(3)所示结构式中的至少一种：
Figure BDA0003555368790000021
(简称化合物1、化合物2、化合物3)。
本发明对一株海鞘来源真菌Amphichorda felina SYSU-MS7908进行全基因组测序，发现一个在常规培养条件下沉默的生物合成基因簇，通过异源表达核心基因和后修饰的甲基转移酶基因，成功分离得到3个吡喃酮类的化合物1～3，其中化合物1和2为新化合物。所述海鞘来源真菌为Amphichorda felina SYSU-MS7908，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2020年07月24日，保藏号：GDMCC NO：61059。
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：
所述的吡喃酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、将Amphichorda felina SYSU-MS7908的核心基因和甲基转移酶后修饰基因转染至的四缺陷的米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1的原生质体中，经筛选培养基传代后得到转化子AO1，所述Amphichorda felina SYSU-MS7908的保藏号为GDMCC NO：61059，所述核心基因和甲基转移酶后修饰基因的序列号分别为OL906412和OL906413；
S2、通过DPY培养基对转化子AO1进行培养后得到种子液，然后将种子液转移至CD-淀粉培养基中进行诱导表达；
S3、诱导后用乙酸乙酯萃取培养基，回收溶剂后得到总浸膏，总浸膏与硅胶拌样后湿法上柱，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，得到Fr1和Fr2总共2个馏分，对Fr2馏分进行分离纯化后得到式(1)所示的化合物和式(3)所示的化合物，对Fr1馏分进行分离纯化后得到式(2)所示的化合物。
优选地，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱时，石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为10:1,0:1。
本发明通过对Amphichorda felina SYSU-MS7908全基因组测序，并运用真菌次级代谢产物antiSMASH网址分析，并通过一系列的生物信息学分析，找到一个沉默的生物合成基因簇，利用四缺陷的米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1作为异源表达宿主，构建了包含核心基因和甲基转移酶的转染菌株AO1。将转染菌株AO1用含有淀粉的液体CD培养基大规模培养发酵后，用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到总浸膏，总浸膏与硅胶拌样，湿法上柱，石油醚乙酸乙酯梯度洗脱(10:1,0:1)，得到Fr1和Fr2总共2个馏分，利用空白Aspergillusoryzae NSAR1作为对照，将Fr2馏分用反相HPLC和体积比为60:40的甲醇-水为流动相进行分析，相比于空白Aspergillus oryzae NSAR1，Fr2馏分明显多了一个紫外吸收峰，通过多次分离纯化，得到化合物1和3。对Fr1馏分用反相HPLC和体积比为70:30的甲醇-水为流动相进行分析，相比于空白Aspergillus oryzae NSAR1，Fr1馏分明显多了一个紫外吸收峰，通过多次分离纯化，得到化合物2。
经过实验验证，化合物1和2具有显著的抗炎活性，IC50值分别为18.09±4.83，7.18±0.93μM。因此该类化合物在抗炎药物的研发中具有良好的开发前景，同时，通过异源表达等合成生物学的手段，可以持续的获得该类化合物，可保证后续的药物临床前研究的供给，无原材料后顾之忧，同时又不会破坏生态平衡、易实现产业化，是具开发前景的可再生性药物资源，为研究与开发海洋微生物制品和海洋微生物药物提供了重要的方法。
优选地，首先利用PCR体外扩增的方法分别将核心基因和甲基转移酶后修饰基因构建在载体pTAex3和pUSA上，再将它们转染至的四缺陷的米曲霉Aspergillus oryzaeNSAR1的原生质体中。
进一步地，核心基因的扩增引物分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，甲基转移酶后修饰基因的扩增引物分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。
优选地，所述筛选培养基传代为先在M筛选培养基上28℃培养6天，再将所得的转化子在不含山梨醇的M培养基上再传代3次后得到最终的转化子AO1，所述M筛选培养基包括0.2％NH4Cl,0.1％(NH4)2SO4,0.05％KCl,0.05％NaCl,0.1％KH2PO4,0.05％MgSO4.7H2O,0.002％FeSO4.7H2O,2％glucose,1.2M山梨醇,0.01％adenine，1.2％Agar。
优选地，所述种子液的制备方法为：将转化子AO1接至DPY培养基中，28℃下培养3天，再将所得培养液转移至DPY培养基中，28℃下再培养2天，所述DPY培养基包括2％糊精，1％多价蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％KH2PO4，0.05％MgSO4.7H2O。
优选地，所述诱导表达为将种子液转移至CD-淀粉培养基中，8℃下诱导表达6天，所述CD-淀粉培养基包括0.3％NaNO3，0.2％KCl，0.05％MgSO4.7H2O,0.1％KH2PO4，0.002％FeSO4.7H2O，1％polypeptide，2％starch，pH 5.5。
优选地，四缺陷的米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1的原生质粒的制备方法为：利用含1％Yatalase，0.6M(NH4)2SO4,50mM马来酸，且pH为5.5的培养基对米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1在30℃下孵育4小时。
优选地，所述硅胶的大小为100-200目，所述硅胶与总浸膏的质量比为1:1。
优选地，所述转染利用PEG-4000介导的方法实现。
本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：
吡喃酮类化合物在制备预防和/或治疗由炎症介导的疾病的药物中的应用，所述吡喃酮类化合物选自式(1)和式(2)所示结构式中的至少一种：
Figure BDA0003555368790000041
经研究发现，本发明的吡喃酮类化合物1～3对正常的RAW264.7细胞是没有细胞毒性的，因此该类化合物的抗炎作用并不是通过细胞毒性而实现的，证明该类化合物在细胞层面是无毒、安全可靠的。其中，化合物1、2对LPS诱导的RAW264.7细胞具有显著的NO抑制效果，而化合物2能显著抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的NO过量释放，并且能能够有效抑制iNOS、COX-2酶的表达，进而抑制NO的释放，此外，化合物2也可以显著下调炎症因子TNF-α,IL-6和IL-1β的表达，说明化合物1和2具有良好的抗炎活性，因此化合物1，尤其是化合物2可用于抗炎药物的研发。
一种抗炎药物，所述抗炎药物以吡喃酮类化合物为主要活性成分，所述吡喃酮类化合物选自式(1)和式(2)所示结构式中的至少一种：
Figure BDA0003555368790000051
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
目前的抗炎药物大多是人工合成的化学药物，其副作用大，易产生抗药性、药物依赖性、损害机体功能等不良反应，如阿司匹林能直接损害胃肠道粘膜，塞来昔布能引起心血管血栓和心肌梗塞，罗非昔布有恶心、胃灼热、腹泻等不良反应。
为此，本发明通过合成生物学的手段，通过异源表达海鞘来源真菌Amphichordafelina SYSU-MS7908的核心基因和甲基转移酶后修饰基因，成功分离得到3个吡喃酮类天然产物1～3，其中1和2具有显著的抗炎活性，通过MTT法发现化合物1、2对正常细胞RAW264.7没有细胞毒活性，但对LPS诱导的炎症细胞RAW264.7具有显著的细胞毒活性。相比于化学合成的药物，天然药物具有药理活性高、毒副作用小等优势，因此本发明的吡喃酮类化合物具有重要的抗炎药物研究价值。
附图说明
图1为化合物1-3的HPLC图谱；
图2为化合物1的紫外吸收图谱；
图3为化合物2的紫外吸收图谱；
图4为化合物3的紫外吸收图谱；
图5为化合物2对iNOS、COX-2及炎症因子TNF-α,IL-6和IL-1β的抑制作用。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
载体pTAex3和pUSA参照文献“Jie J F,Jun-Ichi M,Rao J P,et al.Developmentof a novel quadruple auxotrophic host transformation system by argB genedisruption using adeA gene and exploiting adenine auxotrophy in Aspergillusoryzae[J].Fems Microbiology Letters(1):79-85.”中记载的方法构建得到。
实施例1吡喃酮类生物合成基因簇的鉴定及其异源表达菌株的构建
对海鞘来源真菌Amphichorda felina SYSU-MS7908(2020年07月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：61059)进行全基因组二代测序之后，将测序结果(核心基因聚酮合酶和甲基转移酶基因序列已经上传至GenBank数据库，序列号分别为OL906412和OL906413)上传至AntiSMASH网址(https://fungismash.secondarymetabolites.org/#！/start)进行分析，通过前期系统的化学分离可知，该菌株主要产萜类和环肽类的小分子化合物，再经生信分析，找到一个生物合成基因簇，其核心基因聚酮合酶和已报道的吡喃酮类化合物solanapyrone D的核心基因具有67.5％的蛋白相似度，提示该基因簇有可能产吡喃酮类化合物，且该基因簇在常规的培养条件下是不表达的，是一个沉默基因簇。
为此，采用四缺陷的米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1为异源表达的宿主来激活沉默基因簇，首先利用PCR体外扩增的方法【上下游引物分别为F(SEQ ID NO：1):agctccgaattcgagctcggtaccatcgtcagtcgtcaaagcgaag,R(SEQ ID NO：2):cacgagctactacagatccccgggcaatcatcgaaagctttttggctca】，将核心基因(序列号为OL906412)构建在载体pTAex3上。将后修饰基因甲基转移酶(序列号为OL906413)构建在载体pUSA上【上下游的引物为F(SEQID NO：3):caagctgaattcgagctcggtacctactgcctcaagattcgctggt,R(SEQ ID NO：4)：cacgagctactacagatccccgggctgcgagccgatgtgacccc】。然后利用含1％Yatalase，0.6M(NH4)2SO4,50mM马来酸，且pH为5.5的培养基在30℃下孵育4小时来制备米曲霉Aspergillus oryzaeNSAR1的原生质体。将携带核心基因和后修饰基因甲基转移酶的质粒pTAex3和pUSA利用PEG-4000介导的方法一起转染至的四缺陷的米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1的原生质粒中。最后在M筛选培养基(0.2％NH4Cl,0.1％(NH4)2SO4,0.05％KCl,0.05％NaCl,0.1％KH2PO4,0.05％MgSO4.7H2O,0.002％FeSO4.7H2O,2％glucose,1.2M山梨醇,0.01％adenine，1.2％Agar)上28℃培养6天，将所得的转化子在不含山梨醇的M培养基上再传代3次后，提取基因组DNA验证，得到转化子AO1(即吡喃酮类生物合成基因簇的异源表达菌株)。
实施例2异源表达菌株的发酵和吡喃酮类化合物的分离制备
将转化子AO1接至10mL的DPY培养基(2％糊精，1％多价蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％KH2PO4，0.05％MgSO4.7H2O)中，28℃、180rpm下培养3天后，将上述培养液转移至200mLDPY培养基中，28℃、180rpm下再培养2天作为种子液。将上述种子液转移至CD-淀粉培养基(0.3％NaNO3，0.2％KCl，0.05％MgSO4.7H2O,0.1％KH2PO4，0.002％FeSO4.7H2O，1％polypeptide，2％starch，pH 5.5)中，8℃、220rpm下诱导表达6天。然后用乙酸乙酯萃取培养基3次，减压回收溶剂，得到总浸膏2g。将总浸膏与100-200目硅胶按1:1的质量比拌样，湿法上柱，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱(10:1,0:1)，得到Fr1和Fr2总共2个馏分。之后利用Aspergillus oryzae NSAR1作为空白对照，对Fr2馏分以体积比为60:40的甲醇-水为流动相进行反相HPLC分析，相比于空白Aspergillus oryzae NSAR1，Fr2馏分明显多了一个紫外吸收峰，通过HPLC富集得到化合物1(10mg)和化合物3(8mg)。同时，对Fr1馏分以体积比为70:30的甲醇-水为流动相进行反相HPLC分析，相比于空白Aspergillus oryzae NSAR1，Fr1馏分明显多了一个紫外吸收峰，通过HPLC富集得到化合物2(9mg)。化合物1-3的结构式分别如下所示：
Figure BDA0003555368790000081
化合物1-3的HPLC图谱和紫外吸收图谱分别如图1-4所示。对所得化合物1～3进行结构核磁分析，得到的理化性质数据如下：
化合物1：即AmphichopyroneA(1)，白色固体；UV(MeOH)λmax(logε)326(1.82),222.6(4.52)nm；IR(KBr)vmax 3545,1668,1568cm-1；HR-ESIMS m/z 181.0860[M+H]+(calcdfor C11H13O3,181.0859)；1H NMR(acetone-d6,400MHz)和13C NMR(acetone-d6,100MHz)数据见表1。
化合物2：即AmphichopyroneB(2)，白色固体；UV(MeOH)λmax(logε)332(1.82),227(4.11)nm；IR(KBr)vmax 3394,1668,1568cm-1；HR-ESIMS m/z 195.1019[M+H]+(calcd forC11H15O3,195.1016)；1H NMR(acetone-d6,400MHz)和13C NMR(acetone-d6,100MHz)数据见表1。
化合物3：即UdagawanoneA(3)，白色固体；UV(MeOH)λmax(logε)334.2(1.17),227(4.02)nm；IR(KBr)vmax 3454,1670,1625,1450,1010cm-1；HR-ESIMS m/z 233.0785[M+Na]+(calcd for C11H14O4Na,233.0781)；1H NMR(acetone-d6,400MHz)和13C NMR(acetone-d6,100MHz)数据见表1。
表1化合物1-3的1H NMR和13C NMR数据
Figure BDA0003555368790000082
Figure BDA0003555368790000091
实施例3吡喃酮类化合物抗炎活性的评价
(1)化合物1～3对正常RAW264.7细胞的毒性及对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的抑制作用
使用的DMEM培养基通过MTT法检测吡喃酮类似物(化合物1～3)对RAW264.7细胞的毒性实验。实验中使用的细胞系为小鼠巨噬细胞RAW264.7，通过MTT法检测化合物1～3对RAW264.7细胞的毒性情况。不同浓度(3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM)吡喃酮类似物对RAW264.7细胞在完全培养基(DMEM+10％胎牛血清)作用24小时后的细胞存活率结果见表2。
表2的MTT结果显示，化合物1和2各个浓度作用24小时后对RAW264.7细胞均无明显的细胞毒性，表明化合物1和2在细胞层面是安全无毒的。
表2化合物1、2的NO抑制率及对RAW264.7细胞毒性的影响
Figure BDA0003555368790000092
Figure BDA0003555368790000101
接下来，运用Griess法进一步检测化合物1和2对LPS诱导(具体诱导方法参照“周静,王轶楠,柳忠辉,等.脂多糖诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞的活化凋亡作用[J].中国生物制品学杂志,2009,22(2):3.”)小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的抑制情况。实验中使用的细胞系为小鼠巨噬细胞RAW264.7，在给药浓度分别为12.5μM、25μM、50μM，作用24小时后，使用等量Griess试剂和完全培养液(DMEM培养基，含10％血清)上清混合，于540nm波长下检测吸光值，每组实验设置三次重复，对产生NO的抑制率结果见表2。
表2的Griess结果显示，化合物1、2对NO具有显著的抑制效果，并且化合物2在给药浓度为50μM的情况下具有100％的抑制率。因此，进一步将给药浓度调整为3.125μM、6.25μM，重复实验三次，结果显示，在低浓度下化合物2对NO的释放仍具有较好的抑制效果。
(2)化合物2对LPS诱导的RAW264.7细胞表达COX-2、TNF-α、iNOS、IL-6、IL-1β的抑制作用
在96孔板内培养细胞，利用100ng/mL的LPS刺激活化小鼠RAW264.7巨噬细胞，并同时加入不同浓度(6.25μM，12.5μM，25μM)的化合物2作用24h，然后提取RNA，逆转录得cDNA，然后利用实时荧光定量PCR检测COX-2、TNF-α、iNOS、IL-6和IL-1β的表达情况，每组实验重复三次，实验中以没有LPS刺激及添加0.5％DMSO为空白对照(Control)组，以添加LPS及0.5％DMSO为模型(LPS)组，以吲哚美辛(50μM)为阳性对照(INDO)组，具体结果见图5所示。
图5的结果表明，化合物2作用之后能显著的够抑制COX-2、TNF-α、iNOS、IL-6、IL-1β的表达，说明化合物2能够有效抑制iNOS、COX-2酶的表达，进而抑制NO的释放，也可以显著下调炎症因子TNF-α,IL-6和IL-1β的表达，从而起到抗炎的作用。
综上所述，本发明通过异源表达海鞘来源真菌Amphichorda felina SYSU-MS7908的核心基因和甲基转移酶后修饰基因，成功分离得到3个吡喃酮类的化合物1～3，且该三种化合物的抗炎作用并不是通过细胞毒性而实现的，证明该类化合物在细胞层面是无毒、安全可靠的。其中，化合物1、2对LPS诱导的RAW264.7细胞具有显著的NO抑制效果，而化合物2能显著抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的NO过量释放，并且能能够有效抑制iNOS、COX-2酶的表达，进而抑制NO的释放，此外，化合物2也可以显著下调炎症因子TNF-α,IL-6和IL-1β的表达，说明化合物1和2具有良好的抗炎活性，因此化合物1，尤其是化合物2可用于抗炎药物的研发。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种具有抗炎活性的吡喃酮类化合物的制备和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> F(人工序列)
<400> 1
agctccgaat tcgagctcgg taccatcgtc agtcgtcaaa gcgaag 46
<210> 2
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> R(人工序列)
<400> 2
cacgagctac tacagatccc cgggcaatca tcgaaagctt tttggctca 49
<210> 3
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> F(人工序列)
<400> 3
caagctgaat tcgagctcgg tacctactgc ctcaagattc gctggt 46
<210> 4
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> R(人工序列)
<400> 4
cacgagctac tacagatccc cgggctgcga gccgatgtga cccc 44

Claims (10)

1.一种吡喃酮类化合物，其特征在于，所述吡喃酮类化合物选自式(1)、式(2)和式(3)所示结构式中的至少一种：
Figure FDA0003555368780000011
2.权利要求1所述的吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将Amphichordafelina SYSU-MS7908的核心基因和甲基转移酶后修饰基因转染至四缺陷米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1的原生质体中，经筛选培养基传代后得到转化子AO1，所述Amphichordafelina SYSU-MS7908的保藏号为GDMCC NO：61059，所述核心基因和甲基转移酶后修饰基因的序列号分别为OL906412和OL906413；
S2、通过DPY培养基对转化子AO1进行培养后得到种子液，然后将种子液转移至CD-淀粉培养基中进行诱导表达；
S3、诱导后用乙酸乙酯萃取培养基，回收溶剂后得到总浸膏，总浸膏与硅胶拌样后湿法上柱，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，得到Fr1和Fr2总共2个馏分，对Fr2馏分进行分离纯化后得到式(1)所示的化合物和式(3)所示的化合物，对Fr1馏分进行分离纯化后得到式(2)所示的化合物。
3.权利要求2所述的吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于，首先利用PCR体外扩增的方法分别将核心基因和甲基转移酶后修饰基因构建在载体pTAex3和pUSA上，再将它们转染至的四缺陷的米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1的原生质体中。
4.权利要求3所述的吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于，核心基因的扩增引物分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，甲基转移酶后修饰基因的扩增引物分别如SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示。
5.权利要求2所述的吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述筛选培养基传代为先在M筛选培养基上28℃培养6天，再将所得的转化子在不含山梨醇的M培养基上再传代3次后得到最终的转化子AO1，所述M筛选培养基包括0.2％NH4Cl,0.1％(NH4)2SO4,0.05％KCl,0.05％NaCl,0.1％KH2PO4,0.05％MgSO4.7H2O,0.002％FeSO4.7H2O,2％glucose,1.2M山梨醇,0.01％adenine，1.2％Agar。
6.权利要求2所述的吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述种子液的制备方法为：将转化子AO1接至DPY培养基中，28℃下培养3天，再将所得培养液转移至DPY培养基中，28℃下再培养2天，所述DPY培养基包括2％糊精，1％多价蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％KH2PO4，0.05％MgSO4.7H2O。
7.权利要求2所述的吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述诱导表达为将种子液转移至CD-淀粉培养基中，8℃下诱导表达6天，所述CD-淀粉培养基包括0.3％NaNO3，0.2％KCl，0.05％MgSO4+7H2O,0.1％KH2PO4，0.002％FeSO4+7H2O，1％polypeptide，2％starch，pH 5.5。
8.权利要求2所述的吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱时，石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为10:1,0:1。
9.吡喃酮类化合物在制备预防和/或治疗由炎症介导的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述吡喃酮类化合物选自式(1)和式(2)所示结构式中的至少一种：
Figure FDA0003555368780000021
10.一种抗炎药物，其特征在于，所述抗炎药物以吡喃酮类化合物为主要活性成分，所述吡喃酮类化合物选自式(1)和式(2)所示结构式中的至少一种：
Figure FDA0003555368780000022
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