CN114793895B - 小太阳瓶子草组织培养方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小太阳瓶子草组织培养方法及应用，步骤包括：外植体消毒：选取太阳瓶子草花序轴，洗净后进行消毒；丛生芽诱导：消毒好外植体，接种在丛生芽诱导培养基上；丛生芽增殖：诱导出丛生芽切成具2～3“瓶子”的小芽，接种在丛生芽增殖培养基上；丛生芽生根：诱导或增殖获得的丛生芽，接种在生根培养基上。本发明是利用现代生物技术进行小太阳瓶子草种苗的生产，属于工业化生产，不受天气、季节等影响，增殖周期为1.5～2个月，一年即可繁殖5～6代，可在短期内进行批量生产。

Description

小太阳瓶子草组织培养方法及应用
技术领域
本发明涉及食虫植物组织培养技术领域，具体来说是小太阳瓶子草组织培养方法及其应用。
背景技术
小太阳瓶子草(Heliamphora minor)为瓶子草科太阳瓶子草属多年生草本植物，是委内瑞拉奥杨山和驰曼山的特有种，它们生长在平顶山的山坡低地地区，夏季不耐高温，在栽培上较难易养。小太阳瓶子草是一种相对体型较大气质高雅的食虫植物，叶子呈瓶状直立或侧卧，颜色鲜艳，有绚丽斑点或网纹，外观形态和猪笼草的笼子类似，能分泌蜜汁和消化液，受引诱的昆虫失足掉落瓶中，瓶内的消化液就会把昆虫消化吸收。
21世纪，引种至我国进行栽培，一般成熟的小太阳瓶子草有多个顶芽和小植株，是我国引种初期最开始的繁殖方式，亦是我国小太阳瓶子草目前的最主要繁殖方法，但养成一株成熟植株需要2～4年，而每次分株只能分3～8株，分株繁殖率低，繁殖周期长。随着引种时间的积累，我国栽培技术越来越成熟，各引种地陆续开始出现开花结籽，但一颗种子从播种开始到长出第一个瓶子需要2～4年，再到可以开花结籽的成熟植株，大约需要6～8年。同时，小太阳瓶子草自花授粉种子质量极差，一般很难发芽，而异花授粉虽可形成高质量种子，但种子发芽率整体较低。目前小太阳瓶子草仍是以分株繁殖为主，低繁殖率、长繁殖周期导致小太阳瓶子草价格一直居高不下，而较难的种植条件使得普通的兴趣爱好者望而却步。
目前，国内已有部分单位及个人进行了瓶子草科瓶子草属的组培生物技术研究，如吴子平申请的《一种猩红瓶子草的组培快繁方法》(CN106258954A)专利，浙江省农科院申请的《一种瓶子草无菌播种和组培快繁方法》(CN101518207A)，陈春满，蒋雄辉等发表的《瓶子草的组织培养与快速繁殖》([J]，植物生理学通讯，2008，44(1)：113～113)等，都详细的描述及记载了瓶子草科瓶子草属部分种的组培繁育技术，但在太阳瓶子草属目前无相关研究报道。
发明内容
本发明针对小太阳瓶子草现有繁殖技术的不足，提供一种利用组织培养技术进行小太阳瓶子草繁殖方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：小太阳瓶子草组织培养方法，步骤包括：
1.外植体选择与清洁：选择小太阳瓶子草的花序轴，去花后用软毛刷蘸取饱和肥皂水刷洗6～8次，后用自来水冲淋至无肥皂水残留；
2.外植体消毒：洗净后的外植体转移至超净台上，剪成长约3～4cm段，用75％酒精溶液消毒15～20s，无菌水涮洗3～4次，再用0.4％新洁尔灭溶液消毒20～25min，无菌水涮洗3～4次，最后用0.05％升汞溶液消毒2～3min，无菌水涮洗6～7次；
3.丛生芽诱导：消毒好的外植体用无菌纸吸去表面水分，剪去两端伤口，同时再将其剪成1cm长的小段，将其接种于MS+NAA 0.1～0.15mg/L+IBA0.05～0.1mg/L+CPPU 0.2～0.3mg/L+ZT 0.1～0.3mg+活性炭0.5g/L的丛生芽诱导培养基上，在温度为25±2℃的环境下，前15天全黑暗培养，后再以光照强度2000～3000Lux，日照光12h的光暗交替下培养90～120天；
4.丛生芽增殖：诱导出的丛生芽，沿基部切成具2～3“瓶子”的小芽，接种在改良B5+IBA0.1～0.15mg/L+TDZ 0.5～0.8mg/L+BR 0.05～0.08mg/L+CH 40～60mg/L+牛肉膏0.2～0.4％的丛生芽增殖培养基上，在温度为25±2℃，光照强度2000～3000Lux，日照光12h的光暗交替下培养50～70天；
5.丛生芽生根：增殖获得的丛生芽，沿基部切成具2～3“瓶子”的小芽，接种在改良B5+IBA1.0～1.5mg/L+CH 15～20mg/L+椰汁50～80ml/L+活性炭0.2g/L的生根培养基上，在温度为25±2℃，光照强度2000～3000Lux，日照光12h的光暗交替下培养40～50天；
所述改良B5培养基为在原B5配方的基础上，将其中的硝酸钾调整为1400mg/L，硫酸镁调整为120mg/L，氯化钙180mg/L，烟酸调整为1.8mg/L，盐酸吡哆醇调整为1.5mg/L，其余元素不变。
本发明在选择外植体时，未采用具有极强分化能力的顶芽而采用花序轴，主要是因顶芽消毒极难控制，当采用低剂量消毒时，不会造成顶芽大量死亡，且能顺利萌发，但能全部污染，而当升高消毒剂量会延长消毒时间时，污染率下降至可接受范围，但顶芽大量死亡，而未被消毒致死且未污染的，完全丧失了生长活性，使其不能发芽，后选择了叶、根、茎及花梗，发现花梗在消毒污染率及消毒死亡率都在可接受范围，同时，还有较大几率的诱导出丛生芽。
本发明的有益技术效果是：
1.本发明是利用现代生物技术进行小太阳瓶子草种苗的生产，属于工业化生产，不受天气、季节等影响，增殖周期为1.5～2个月，一年即可繁殖5～6代，可在短期内进行批量生产。
2.本发明在增殖时采用IBA、TDZ、BR三种植物生长调节剂的有效浓度搭配，有利于丛生芽的分化，从而在增殖培养时获得更多的增殖芽，同时在增殖培养基中添加一定浓度的CH以及牛肉膏，能有效促进芽的萌发及生长，使其在短期内获得大量可分切的丛生芽。
3.本发明在丛生芽生根培养基中，使用IBA即能促使小太阳瓶子草生根，同时，添加一定浓度的CH及椰汁，能有效促进生根时小太阳瓶子草“瓶子”的快速生长，减少了太阳瓶子草出瓶后的驯化栽植为商品苗周期。
4.本发明在增殖及生根培养基均以改良B5培养基为基本培养基，减少了小太阳瓶子草在增殖及生根培养过程中常见的叶片枯黄及枯白现象，从而减少了“瓶子”的损失，一方面增加了增殖过程中的增殖系数，另一方面减少了商品苗的损失。
附图说明
图1本发明方法实施例1小太阳瓶子草组织培养丛生芽增殖图；
图2本发明方法实施例1小太阳瓶子草组织培养丛生芽生根图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种小太阳瓶子草组织培养方法，步骤包括：
1.外植体的选择与清洁：选择小太阳瓶子草的花序轴，去花后用软毛刷蘸取饱和肥皂水刷洗6次，后用自来水冲淋至无肥皂水残留。
2.外植体消毒：将洗净后的外植体，转移至超净台上，剪成长3cm段，用75％(v/v)酒精溶液消毒15s，无菌水涮洗3次，再用0.4％新洁尔灭溶液消毒20min，无菌水涮洗3次，最后用0.05％升汞溶液消毒2min，无菌水涮洗6次，消毒污染率76.8％，消毒死亡率34.3％。
3.丛生芽诱导：将消毒好外植体，用无菌纸吸去表面水分，剪去两端伤口，同时再将其剪成1cm长的小段，将其接种于MS+NAA0.1mg/L+IBA0.05mg/L+CPPU 0.2mg/L+ZT 0.1mg+活性炭0.5g/L的丛生芽诱导培养基上，在温度为25℃的环境下，前15天全黑暗培养，后再以光照强度2000Lux，日照光12h的光暗交替下培养120天，诱导率76.9％。
4.丛生芽增殖：将诱导出的丛生芽，沿基部切成具2“瓶子”的小芽，接种在改良B5+IBA0.1mg/L+TDZ 0.5mg/L+BR 0.05mg/L+CH 40mg/L+牛肉膏0.2％的丛生芽增殖培养基上，在温度为25℃，光照强度2000Lux，日照光12h的光暗交替下培养60天，增殖系数4.9(如图1所示)。
5.丛生芽生根：将通过诱导或增殖获得的丛生芽，沿基部切成具2“瓶子”的小芽，接种在改良B5+IBA 1.0mg/L+CH 15mg/L+椰汁50ml/L+活性炭0.2g/L的生根培养基上，在温度为25℃，光照强度2000Lux，日照光12h的光暗交替下培养40天，生根率100％(如图2所示)。
其中，改良B5培养基为在原B5配方的基础上，将其中的硝酸钾调整为1400mg/L，硫酸镁调整为120mg/L，氯化钙180mg/L，烟酸调整为1.8mg/L，盐酸吡哆醇调整为1.5mg/L，其余元素不变。
实施例2
一种小太阳瓶子草组织培养方法，步骤包括：
1.外植体的选择与清洁：选择小太阳瓶子草的花序轴，去花后用软毛刷蘸取饱和肥皂水刷洗8次，后用自来水冲淋至无肥皂水残留。
2.外植体消毒：将洗净后的外植体，转移至超净台上，剪成长4cm段，用75％(v/v)酒精溶液消毒20s，无菌水涮洗4次，再用0.4％新洁尔灭溶液消毒25min，无菌水涮洗4次，最后用0.05％升汞溶液消毒3min，无菌水涮洗7次，消毒污染率63.4％，消毒死亡率54.6％。
3.丛生芽诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，剪去两端伤口，同时再将其剪成1cm长的小段，将其接种于MS+NAA0.15mg/L+IBA0.1mg/L+CPPU 0.3mg/L+ZT0.3mg+活性炭0.5g/L的丛生芽诱导培养基上，在温度为23℃的环境下，前15天全黑暗培养，后再以光照强度3000Lux，日照光12h的光暗交替下培养120天，诱导率72.8％。
4.丛生芽增殖：将诱导出的丛生芽，沿基部切成具3“瓶子”的小芽，接种在改良B5+IBA 0.15mg/L+TDZ 0.8mg/L+BR 0.08mg/L+CH 60mg/L+牛肉膏0.2～0.4％的丛生芽增殖培养基上，在温度为23℃，光照强度3000Lux，日照光12h的光暗交替下培养70天，增殖系数5.2。
5.丛生芽生根：将通过诱导或增殖获得的丛生芽，沿基部切成具3“瓶子”的小芽，接种在改良B5+IBA 1.5mg/L+CH 20mg/L+椰汁80ml/L+活性炭0.2g/L的生根培养基上，在温度为23℃，光照强度3000Lux，日照光12h的光暗交替下培养50天，生根率100％。
其中，改良B5培养基为在原B5配方的基础上，将其中的硝酸钾调整为1400mg/L，硫酸镁调整为120mg/L，氯化钙180mg/L，烟酸调整为1.8mg/L，盐酸吡哆醇调整为1.5mg/L，其余元素不变。
对比例1
选用太阳瓶子草花序轴为外植体，照陈春满，蒋雄辉等，《瓶子草的组织培养与快速繁殖》[J]，《植物生理学通讯》，2008，44(1)：113～113。最佳实施方法进行实施。
消毒污染率为72.8％，消毒死亡率为89.3％，丛生芽诱导周期为160天，诱导率为10.2％，丛生芽增殖周期为120天，增殖过程中有约16％瓶子枯黄及枯白，增殖系数为1.3，生根周期为40天，生根率为100％，“瓶子”较小，且生根过程中有约12％的因苗枯黄枯白导致的损失。
对比例2
选用太阳瓶子草花序轴为外植体，照专利《一种猩红瓶子草的组培快繁方法》(CN106258954A)中的实施例1进行实施。
消毒污染率为79.4％，消毒死亡率为94.9％，不能诱导丛生芽。
对比例3
选用太阳瓶子草花序轴为外植体，照专利《一种紫色瓶子草的组培快繁方法》(CN106069783A)中的实施例1进行实施。
消毒污染率为42.8％，消毒死亡率为100％。
对比例4
选用太阳瓶子草花序轴为外植体，按本发明中实施例1进行消毒，照专利《一种紫色瓶子草的组培快繁方法》(CN106069783A)中的实施例1进行实施。
消毒污染率为74.9％，消毒死亡率为35.1％，丛生芽诱导周期为140天，诱导率为18.4％，丛生芽增殖周期为110天，增殖系数为1.7，增殖过程中有约27％左右的枯黄或枯白，生根周期为50天，生根率为42.3％，且苗矮小，生根苗中有约26％的因枯黄枯白导致的损失。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.小太阳瓶子草组织培养方法，其特征在于，步骤包括：
（1）外植体消毒：选取太阳瓶子草花序轴，洗净后在超净台上进行消毒；
（2）丛生芽诱导：将消毒好的外植体，接种在丛生芽诱导培养基上；在温度为25±2℃的环境下，前15天全黑暗培养，后再以光照强度2000～3000Lux，日照光12h的光暗交替下培养90～120天；
所述诱导培养基的配方为：MS+NAA 0.1～0.15mg/L+IBA 0.05～0.1mg/L+CPPU 0.2～0.3mg/L+ZT 0.1～0.3mg+活性炭0.5g/L；
（3）丛生芽增殖：诱导出的丛生芽，切成具2～3“瓶子”的小芽，接种在丛生芽增殖培养基上，在温度为25±2℃、光照强度2000～3000Lux，日照光12h的光暗交替下培养50～70天；
所述增殖培养基的配方为：改良B5+IBA 0.1～0.15mg/L+TDZ 0.5～0.8mg/L+BR 0.05～0.08mg/L+CH 40～60mg/L+牛肉膏0.2～0.4%；
（4）丛生芽生根：增殖获得的丛生芽，接种在生根培养基上，在温度为25±2 ℃，光照强度2000～3000Lux，日照光12h的光暗交替下培养40～50天；
所述生根培养基的配方为：改良B5+IBA 1.0～1.5mg/L+CH 15～20mg/L+椰汁 50～80mL/L+活性炭 0.2g/L；
所述改良B5的培养基配方为在原B5配方的基础上，将其中的硝酸钾调整为1400mg/L，硫酸镁调整为120mg/L，氯化钙180mg/L，烟酸调整为1.8mg/L，盐酸吡哆醇调整为1.5mg/L，其余元素不变。
2.根据权利要求1所述小太阳瓶子草组织培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述消毒的方法为：依次用75%酒精溶液消毒15～20s，0.4%新洁尔灭溶液消毒20～25min，0.05%升汞溶液消毒2～3min。
3.根据权利要求1～2任一项所述小太阳瓶子草组织培养方法在小太阳瓶子草组织培养中的应用。
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