CN107581068A - 一种去除单轴类兰花内生菌的方法及在香荚兰组织培养快速繁殖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种去除单轴类兰花内生菌的方法及在香荚兰组织培养快速繁殖中的应用。本发明是使用利福平处理结合茎顶培养，去除单轴类兰花组织培养过程中外植体材料存在的内生菌，并将该方法与香荚兰组织培养快速繁殖相结合。本发明将特定浓度的、具有广谱杀菌能力的利福平添加至单轴类兰花培养基中，既可发挥其高效的杀菌、抑菌作用，继代4次即可彻底消除培养材料的内生菌，同时避免高浓度利福平对单轴类兰花的毒副作用；本发明还通过培养基中各种成分的合理搭配，促进单轴类兰花的大量繁殖。本发明成功解决香荚兰等单轴类兰花组培苗生产过程中内生菌难以去除的瓶颈问题，为其组织培养快速繁殖奠定基础，具有良好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养快繁技术领域，更具体地说，本发明涉及一种彻底去除单轴类兰花内生菌的方法，并将该方法应用于香荚兰组织培养快速繁殖中。
背景技术
香荚兰(Vanilla)又名香草兰，属多年生热带藤本香料作物，分布于全球热带地区，南北纬27°以内，全世界有近110种，目前在我国发现有4种，分布在广西、贵州、云南、海南、广东以及台湾等地潮湿的热带山沟谷林下。商业栽培的香荚兰主要是墨西哥香荚兰(Vanilla planifolia Ames)，以生产芳香的豆荚而著称。香荚兰是名贵的多年生热带藤本香料植物，主要用作食品工业的配香原料，也可用于化妆品和医药业，随着食品工业和医药及香料工业的发展，国内外对天然香料的需求量不断增加。此外，香荚兰具有人工合成香兰素所不及的优点，深受消费者的欢迎，所以，利用我国热带自然条件发展香荚兰生产、对促进食品和香料工业的发展、减少外汇支出具有重要的意义。
我国的海南和西双版纳有较大规模的栽培。扦插法是香荚兰的常规繁殖方法，该方法有繁殖系数低，茎蔓用量大的缺点。如按此法繁殖良种，新品种推广甚慢，远不能满足生产的需要。因此，应用组织培养法快速繁殖良种是生产上亟待解决的课题。若采用组织培养繁殖法取代之，可在短期内获得大量种苗，是快速繁殖的有效手段之一，繁殖系数比扦插繁殖高15万倍，周期短，可加快优良新品种的开发，但是单轴类兰花固有的内生菌问题给其外植体消毒带来很大的难度，甚至因为无法获得无内生菌的繁殖材料，导致无法进行组培苗生产，甚至停产等问题。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有单轴类兰花固有的内生菌难以彻底去除，进而影响组培苗生产等问题，提供一种利用利福平彻底去除单轴类兰花内生菌的方法，并将该方法用于香荚兰组织培养快速繁殖中。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种去除单轴类兰花内生菌的方法，其是使用利福平处理结合茎顶培养，去除单轴类兰花组织培养过程中外植体材料存在的内生菌；其中，所述利福平的配制方法是：用甲醇将医用的利福平粉剂配制成25～50mg/L浓度的利福平溶液装进已消毒灭菌的容器中，于4℃条件下保存待用。
作为本发明的一种优选技术方案，所述单轴类兰花为香荚兰。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种香荚兰组织培养快速繁殖方法，其包括如下步骤：
(1)无菌利福平溶液的配制：用甲醇将医用的利福平粉剂配制成25～50mg/L浓度的利福平溶液装进已消毒灭菌的容器中，于4℃条件下保存待用；
(2)外植体的选择、处理和培养：选取健康香荚兰株系，以当年新萌生长的顶芽作为外植体，洗净后剪去叶片和气生根，在70％酒精中浸泡30s，用0.1％升汞溶液消毒5～10min，无菌水冲洗4～5次，切取高1～2cm带节的顶芽，接种于顶芽促长培养基中，然后将步骤(1)所述25～50mg/L浓度的利福平溶液3～5ml加至所述顶芽促长培养基中，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养；
(3)切顶、继代培养：步骤(2)所述顶芽培养45天后，无菌条件下将所述顶芽的基部茎段切除，保留高1～2cm的顶芽插植到顶芽促长培养基中，将步骤(1)所述25～50mg/L浓度的利福平溶液3～5ml加至所述顶芽促长培养基中，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养45天，然后重复继代培养2次，得到无菌的顶芽；
(4)不定芽增殖培养：将步骤(3)所得无菌的顶芽转接至增殖培养基中，在(26±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养，得到不定芽；
(5)不定根诱导及壮苗培养：经过步骤(3)～(4)共计4代的增殖培养，把步骤(4)所得高3～4cm的不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基中，在(28±2)℃、光照度2000～3000lx、光照12h/天条件下进行培养60天，得到苗高5～7cm、根数3～5条、生根率为95％以上的试管苗；
(6)移栽：将步骤(5)培养得到的试管苗在强光照下炼苗7天，取出试管苗，洗净附着的培养基，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，以水苔为种植基质、注意保持适宜的湿度和温度，于阴凉通风处对试管苗进行栽培，成活率达95％以上；
其中，步骤(2)和步骤(3)中，所述顶芽促长培养基的pH为5.4～5.6，每升包括如下组分：花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、七水硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁50～100mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基腺嘌呤0.1～0.5mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g；
步骤(4)中，所述增殖培养基的pH为5.4～5.6，每升包括如下组分：花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、七水硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁100～150mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基腺嘌呤3.0～5.0mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g；
步骤(5)中，所述不定根诱导和壮苗培养基的pH为5.4～5.6，每升包括如下组分：花宝1号1～2g、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种顶芽促长培养基，其pH为5.4～5.6，每升所述顶芽促长培养基包括如下组分：花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、七水硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁50～100mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基腺嘌呤0.1～0.5mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种增殖培养基，其pH为5.4～5.6，每升所述增殖培养基包括如下组分：花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、七水硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁100～150mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基腺嘌呤3.0～5.0mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种不定根诱导和壮苗培养基，其pH为5.4～5.6，每升所述不定根诱导和壮苗培养基包括如下组分：花宝1号1～2g、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g。
本发明上述顶芽促长培养基、增殖培养基和不定根诱导和壮苗培养基可用于香荚兰组织培养快速繁殖中。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将25～50mg/mL浓度的、具有广谱杀菌能力的利福平添加至单轴类兰花培养基中，既可发挥其高效的杀菌、抑菌作用，同时避免高浓度利福平对单轴类兰花的毒副作用。
(2)本发明通过将顶芽促长培养基、增殖培养基和不定根诱导和壮苗培养基中的各种成分与利福平合理搭配，可以促进离体培养的香荚兰顶芽能快速伸长生长，再结合继代培养切掉顶芽的基部，保留新生长的顶芽部分，继代4次后可以彻底消除香荚兰培养材料的内生菌，获得无菌的、生活力强的顶芽用于大量繁殖。本发明成功解决香荚兰等单轴类兰花组培苗生产过程中内生菌难以去除的瓶颈问题，为其组织培养快速繁殖奠定基础，具有良好的应用价值。
(3)通过本发明香荚兰组织培养快速繁殖的方法，香荚兰组培苗的成活率可达95％以上。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
1.材料：从海南省三亚地区收集野生越南香荚兰(V.annamica)种植于中国科学院华南植物园兰花种质资源圃。
2.无菌利福平溶液配制
购买医用的利福平粉剂，选用带吸管的250ml滴瓶以，晾干后用报纸将其包装好后于1.06kg/cm2(121℃)条件下灭菌20min，另用500ml的甲醇将利福平配制成25～50mg/L浓度的溶液装进兰花瓶。将以上的药品、器具、一次性细菌过滤器放置于超净工作台上，无菌条件下将利福平溶液过滤至无菌的滴瓶中，配制成25～50mg/L浓度的无菌的利福平溶液，用无菌牛皮纸将滴瓶的于瓶颈部密封后放置4℃冰箱条件下保存待用。
3.培养基配制
根据培养材料组培苗生产的要求，配制顶芽促长培养基V1：每升含花宝1号1～2g，花宝2号1～2g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)20～40g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)2～4g，蛋白胨0.5～2g，椰子汁50～100mL，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.05～0.2mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.4～0.8mg，烟酸0.4～0.8mg，6-苄基腺嘌呤0.1～0.5mg，萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg，蔗糖15～30g，琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；配制培养基时按以下程序添加药品或母液：糖——无离子水——铁盐母液——大量元素母液——微量元素母液——维生素母液——甘氨酸母液——肌醇母液——植物生长调节剂母液——琼脂，调整pH至5.4～5.6，添加植物生长调节剂包括6-苄基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，将培养基分装玻璃培养瓶(300ml)中，每瓶分装25-30ml培养基，于1.06kg/cm2(121℃)条件下灭菌20min，冷却凝固待用。
4.外植体选择及其表面消毒、接种、培养
于香荚兰种质资源圃中选取生长健壮、结果率高、抗逆性、抗病虫害强的健康越南香荚兰株系，选取其当年新萌发生长的顶芽为外植体，在自来水下冲洗干净后剪去叶片、气生根，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒5～10分钟，无菌水冲洗4～5次，切取高1～2厘米带节的顶芽，接种到顶芽促长培养基V1；接着于培养基表面滴加25～50mg/ml浓度的无菌的利福平溶液3～5ml，盖上瓶盖后将材料放置培养室中培养，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12h/d。
5.切顶、继代培养三次
顶芽在培养基V1培养45天后能伸长生长1～2厘米，同时顶芽基部有细菌的生长；于超净工作台上无菌条件下将顶芽的基部茎段切除，保留高1～2厘米的顶芽插植到新的促长培养基V1上，接着于培养基表面滴加25～50mg/L浓度的无菌的利福平溶液3～5ml，盖上瓶盖后将材料放置培养室中培养，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12h/d。
培养周期45天，接着同样的操作，继代培养2次后即可获得彻底消除内生菌的无菌的生活力强的顶芽用于不定芽的大量增殖培养。
6.不定芽增殖培养
将获得的无菌的生活力强的顶芽转接至增殖培养基为V2：每升含花宝1号1～2g，花宝2号1～2g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)2～4g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)2～4g，蛋白胨0.5～2g，椰子汁100～150mL，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.05～0.2mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.4～0.8mg，烟酸0.4～0.8mg，6-苄基腺嘌呤3.0～5.0mg，萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg，蔗糖15～30g，琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；不定芽增殖培养条件为培养温度为(26±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12h/d。
7.不定根诱导及壮苗培养
经过4代的不定芽增殖培养，把高3～4厘米的不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基V3：每升含花宝1号1～2g，蛋白胨0.5～2g，土豆泥40～80g，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.05～0.2mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.4～0.8mg，烟酸0.4～0.8mg，萘乙酸(NAA)0.2～0.5mg，蔗糖15～30g，琼脂6～7g，pH 5.4-5.6，培养60天时，苗高可达到5～7厘米，根数3～5条，生根率为95％以上。生根壮苗阶段的培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照12h/d。
8.移栽
将生根培养60天左右的试管苗在强光照下炼苗7天后出瓶。移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，种植基质采用水苔，注意保持适宜湿度和温度，置于阴凉通风处栽培，成活率可达95％以上。
实施例2
1.材料：从海南省三亚地区收集野生大香荚兰(V.siamensis)种植于中国科学院华南植物园兰花种质资源圃。
2.无菌利福平溶液配制
购买医用的利福平粉剂，选用带吸管的250ml滴瓶以，晾干后用报纸将其包装好后于1.06kg/cm2(121℃)条件下灭菌20min，另用500ml的甲醇将利福平配制成25～50mg/L浓度的溶液装进兰花瓶。将以上的药品、器具、一次性细菌过滤器放置于超净工作台上，无菌条件下将利福平溶液过滤至无菌的滴瓶中，配制成25～50mg/ml浓度的无菌的利福平溶液，用无菌牛皮纸将滴瓶的于瓶颈部密封后放置4℃冰箱条件下保存待用。
3.培养基配制
根据培养材料组培苗生产的要求，配制其顶芽促长培养基V1(同实施例1)，将培养基分装玻璃培养瓶(300ml)中，每瓶分装25-30ml培养基，于1.06kg/cm2(121℃)条件下灭菌20min，冷却凝固待用。
4.外植体选择及其表面消毒、接种、培养
于香荚兰种质资源圃中选取生长健壮、结果率高、抗逆性、抗病虫害强的健康野生大香荚兰株系，选取其当年新萌发生长的顶芽为外植体，在自来水下冲洗干净后剪去叶片、气生根，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒5～10分钟，无菌水冲洗4～5次，切取高1～2厘米带节的顶芽，接种到顶芽促长培养基V1；接着于培养基表面滴加25～50mg/ml浓度的无菌的利福平溶液3～5ml，盖上瓶盖后将材料放置培养室中培养，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12h/d。
5.切顶、继代培养三次
顶芽在培养基V1培养45天后能伸长生长1～2厘米，同时顶芽基部有细菌的生长；于超净工作台上无菌条件下将顶芽的基部茎段切除，保留高1～2厘米的顶芽插植到新的促长培养基V1上，接着于培养基表面滴加25～50mg/ml浓度的无菌的利福平溶液3～5ml，盖上瓶盖后将材料放置培养室中培养，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12h/d。
培养周期45天，接着同样的操作，继代培养2次后即可获得彻底消除内生菌的无菌的生活力强的顶芽用于不定芽的大量增殖培养。
6.不定芽增殖培养
将获得的无菌的生活力强的顶芽转接至增殖培养基为V2(同实施例1)；不定芽增殖培养条件为培养温度为(26±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12h/d。
7.不定根诱导及壮苗培养
经过4代的不定芽增殖培养，把高3～4厘米的不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基V3(同实施例1)，培养60天时，苗高可达到5～7厘米，根数3～5条，生根率为95％以上。生根壮苗阶段的培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照12h/d。
8.移栽
将生根培养60天左右的试管苗在强光照下炼苗7天后出瓶。移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，种植基质采用水苔，注意保持适宜湿度和温度，置于阴凉通风处栽培，成活率可达95％以上。
根据上述说明书的揭示，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (7)
1.一种去除单轴类兰花内生菌的方法，其特征在于，所述方法是使用利福平处理结合茎顶培养，去除单轴类兰花组织培养过程中外植体材料存在的内生菌；
其中，所述利福平的配制方法是：用甲醇将医用的利福平粉剂配制成25～50mg/L浓度的利福平溶液装进已消毒灭菌的容器中，于4℃条件下保存待用。
2.根据权利要求1所述的去除单轴类兰花内生菌的方法，其特征在于，所述单轴类兰花为香荚兰。
3.一种香荚兰组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)无菌利福平溶液的配制：用甲醇将医用的利福平粉剂配制成25～50mg/L浓度的利福平溶液装进已消毒灭菌的容器中，于4℃条件下保存待用；
(2)外植体的选择、处理和培养：选取健康香荚兰株系，以当年新萌生长的顶芽作为外植体，洗净后剪去叶片和气生根，在70％酒精中浸泡30s，用0.1％升汞溶液消毒5～10min，无菌水冲洗4～5次，切取高1～2cm带节的顶芽，接种于顶芽促长培养基中，然后将步骤(1)所述25～50mg/L浓度的利福平溶液3～5ml加至所述顶芽促长培养基中，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养；
(3)切顶、继代培养：步骤(2)所述顶芽培养45天后，无菌条件下将所述顶芽的基部茎段切除，保留高1～2cm的顶芽插植到顶芽促长培养基中，将步骤(1)所述25～50mg/L浓度的利福平溶液3～5ml加至所述顶芽促长培养基中，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养45天，然后重复继代培养2次，得到无菌的顶芽；
(4)不定芽增殖培养：将步骤(3)所得无菌的顶芽转接至增殖培养基中，在(26±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养，得到不定芽；
(5)不定根诱导及壮苗培养：把步骤(4)所得高3～4cm的不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基中，在(28±2)℃、光照度2000～3000lx、光照12h/天条件下进行培养60天，得到试管苗；
(6)移栽：将步骤(5)培养得到的试管苗在强光照下炼苗7天，取出试管苗，洗净附着的培养基，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，以水苔为种植基质、于阴凉通风处对试管苗进行栽培；
其中，步骤(2)和步骤(3)中，所述顶芽促长培养基的pH为5.4～5.6，每升包括如下组分：花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、七水硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁50～100mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基腺嘌呤0.1～0.5mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g；
步骤(4)中，所述增殖培养基的pH为5.4～5.6，每升包括如下组分：花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、七水硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁100～150mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基腺嘌呤3.0～5.0mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g；
步骤(5)中，所述不定根诱导和壮苗培养基的pH为5.4～5.6，每升包括如下组分：花宝1号1～2g、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g。
4.一种顶芽促长培养基，其特征在于，其pH为5.4～5.6，每升所述顶芽促长培养基包括如下组分：花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、七水硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁50～100mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基腺嘌呤0.1～0.5mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g。
5.一种增殖培养基，其特征在于，其pH为5.4～5.6，每升所述增殖培养基包括如下组分：花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、七水硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁100～150mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基腺嘌呤3.0～5.0mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g。
6.一种不定根诱导和壮苗培养基，其特征在于，其pH为5.4～5.6，每升所述不定根诱导和壮苗培养基包括如下组分：花宝1号1～2g、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g。
7.权利要求4所述顶芽促长培养基、权利要求5所述增殖培养基和权利要求6所述不定根诱导和壮苗培养基在香荚兰组织培养快速繁殖中的应用。
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| CN112655557A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-16 | 杭州师范大学 | 一种抑制离体培养吊瓜苗内生菌的方法 |
| CN113854155A (zh) * | 2021-11-09 | 2021-12-31 | 中国热带农业科学院香料饮料研究所 | 一种香草兰脱毒种苗的高通量繁育方法 |
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| CN102613076A (zh) * | 2012-03-26 | 2012-08-01 | 吴海红 | 一种蝴蝶兰的无性繁殖方法 |
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