CN114752546A - 一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，包括以下步骤：对八角种子进行处理，将处理好的八角种子接种于愈伤组织诱导的培养基中进行诱导培养，诱导产生愈伤组织；通过建立八角愈伤组织诱导技术体系、八角愈伤组织的继代培养以及建立悬浮细胞培养体系，可以对八角种子的愈伤组织进行完整的离体快繁，不仅实现了八角种子愈伤组织的诱导方法，而且还补充了从八角愈伤组织中产生莽草酸研究方法的空白，从而满足了莽草酸长期稳定的工业化生产，解决当前生产中存在的原料短缺问题，还能减少对八角果实产量的依赖性，通过愈伤组织或悬浮培养对于以获取植物代谢产物为目的的医药工业生产和化学工业生产而言具有特殊的重要意义。

Description

一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法
技术领域
本发明涉及利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的技术领域，具体为一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法。
背景技术
八角茴香属木兰科八角属植物，是一种“药食同源”的经济作物，其八角中含有的莽草酸是合成治疗禽流感特效药的主要成分，八角茴香是莽草酸的主要工业来源，其籽粒中含有一定莽草酸，通过对愈伤组织或悬浮细胞的大量培养可直接产生莽草酸是工业化开发八角的一个新方向，利用植物愈伤组织和悬浮培养细胞获取植物次生代谢产物，以获取植物细胞中有效成分，分离提取所需的各种代谢产物，由于细胞代谢产物的获得可越过植物栽培、管理、采收以及加工等大田生产环节，通过愈伤组织或悬浮培养对于以获取植物代谢产物为目的的医药工业生产和化学工业生产而言，无疑具有特殊的重要意义。
获取八角种子愈伤组织，首先就要能成功诱导出愈伤组织，再者是培养的愈伤组织含有一定的目标成分，目前八角离体快繁技术的研究主要存在的问题：一是仍未形成完整的离体快繁技术方法；二是未有八角种子愈伤组织的诱导方法；三是缺乏从八角愈伤组织中产生莽草酸的研究方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，包括以下步骤：
S1、对八角种子进行处理，将处理好的八角种子接种于愈伤组织诱导的培养基中进行诱导培养，诱导产生愈伤组织；
S2、通过基本培养基和生长调节剂建立八角愈伤组织诱导技术体系；
S3、将诱导出的八角愈伤组织进行继代培养；
S4、通过细胞悬浮培养建立悬浮细胞培养体系；
S5、利用液相色谱串联质谱的方法进行目标物的检测。
作为优选，所述S1中对八角种子处理包括以下步骤：
A1、在八角果实成熟期采摘新鲜的八角果实，并去除果柄，然后用自来水清洗果实表面，清除果实表面的灰尘及杂物；
A2、在超净工作台上首先使用酒精消毒对八角果实进行消毒，并用无菌水清洗3-5次；
A3、使用升汞对清洗后的八角果实进行二次消毒，并通过无菌水对汞消毒后的八角果实再次清洗3-5次；
A4、将消毒好的八角果实利用解剖刀切开果壳取出种子，在八角种子的外壳端切开一个开口，并确保开口切到八角种子的乳白的胚乳处。
作为优选，所述A2中对八角果实消毒的酒精浓度为75％，且消毒时间为1-2分钟；所述A3中升汞的浓度为0.1％，且升汞对八角果实消毒的时间为15-20分钟；所述A4中对八角种子切口的尺寸为0.2mmX0.4mm。
作为优选，所述S2中的基本培养基为MS培养基，所述生长调节剂为6-苄氨基嘌呤、萘乙酸，其它成分为蔗糖、活性炭和琼脂粉，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为1.8-2.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.5-0.6mg/L，所述蔗糖的浓度为25-30g/L，所述活性炭的浓度为0.4-0.5g/L，所述琼脂粉的浓度为6-8g/L，所述MS培养基的pH值为5.8-6.0，且培养温度控制在25士2℃，其中愈伤组织诱导为暗培养。
作为优选，所述S3中继代培养的方法包括以下步骤：
B1、培养基的制备，MS培养基中添加适量生长调节剂，并将培养基的pH值调节至5.6-6.0，培养基121℃灭菌30分钟。
B2、将诱导出的愈伤组织进行继续培养，扩大八角愈伤组织量，将色泽为乳白的愈伤组织切割为0.6mmX0.6mm大小并接种于MS培养基中，培养温度控制为25士2℃，其中继代为暗培养，继代周期为30天。
作为优选，所述B2中组织切片的直径为0.6mm；所述B1中的生长调节剂为6-苄氨基嘌呤、萘乙酸，其它成分为蔗糖、活性炭和琼脂粉，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为1.8-2.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.5-0.6mg/L，所述蔗糖的浓度为25-30g/L，所述活性炭的浓度为0.4-0.5g/L，所述琼脂粉的浓度为6-8g/L。
作为优选，所述S4中悬浮细胞培养的方法包括以下步骤：
C1、挑选经种子诱导的生长快，质地相似、色泽乳白，且脆散性好的愈伤组织进行细胞悬浮培养；
C2、分别称取愈伤组5g，接种于装有100ml液体培养基的三角瓶中进行悬浮培养，其中基本培养基同为MS培养基，且MS培养基pH值为5.5-6.0，培养温度控制在28士2℃；
C3、通过恒温震荡器对三角瓶中的愈伤组织和液体培养基进行振动培养，悬浮培养30天。
作为优选，所述C2中的生长调节剂为6-苄氨基嘌呤、萘乙酸，其它成分为蔗糖、活性炭和琼脂粉，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为1.8-2.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.5-0.6mg/L，所述蔗糖的浓度为25-30g/L，所述C3中对愈伤组织和液体培养基振动培养的转速为190转/min。
作为优选，所述S5中对目标物的检测方法包括以下步骤：
D1、对样品研磨、提取、振荡并提取上清液，然后将上清液进行上机检测；
D2、对所有样本进行定量分析，将检测到的所有样本的积分峰面积代入标准曲线线性方程进行计算。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过建立八角愈伤组织诱导技术体系、八角愈伤组织的继代培养以及建立悬浮细胞培养体系，可以对八角种子的愈伤组织进行完整的离体快繁，不仅实现了八角种子愈伤组织的诱导方法，而且还补充了从八角愈伤组织中产生莽草酸研究方法的空白，从而满足了莽草酸长期稳定的工业化生产，解决当前生产中存在的原料短缺问题，还能减少对八角果实产量的依赖性，通过愈伤组织或悬浮培养对于以获取植物代谢产物为目的的医药工业生产和化学工业生产而言具有特殊的重要意义。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，包括以下步骤：
S1、对八角种子进行处理，将处理好的八角种子接种于愈伤组织诱导的培养基中进行诱导培养，诱导产生愈伤组织；
S2、通过基本培养基和生长调节剂建立八角愈伤组织诱导技术体系；
S3、将诱导出的八角愈伤组织进行继代培养；
S4、通过细胞悬浮培养建立悬浮细胞培养体系；
S5、利用液相色谱串联质谱的方法进行目标物的检测。
其中，所述S1中对八角种子处理包括以下步骤：
A1、在八角果实成熟期采摘新鲜的八角果实，并去除果柄，然后用自来水清洗果实表面，清除果实表面的灰尘及杂物，可以对八角果实进行初级清理，从而避免八角果实外部的灰尘对种子造成污染；
A2、在超净工作台上首先使用酒精消毒对八角果实进行消毒，并用无菌水清洗3-5次，可以对八角果实进行第一次消毒，并通过无菌水对酒精进行稀释；
A3、使用升汞对清洗后的八角果实进行二次消毒，并通过无菌水对汞消毒后的八角果实再次清洗3-5次，通过升汞可以对八角果实进行深度消毒，能保证八角果实外部的无菌效果；
A4、将消毒好的八角果实利用解剖刀切开果壳取出种子，在八角种子的外壳端切开一个开口，并确保开口切到八角种子的乳白的胚乳处，可以使八角种子中的胚乳快速与培养基以及生长调节剂接触，能加速诱导的速度。
其中，所述A2中对八角果实消毒的酒精浓度为75％，且消毒时间为1-2分钟；所述A3中升汞的浓度为0.1％，且升汞对八角果实消毒的时间为15-20分钟；所述A4中对八角种子切口的尺寸为0.2mmX0.4mm。
其中，所述S2中的基本培养基为MS培养基，所述生长调节剂为6-苄氨基嘌呤、萘乙酸，其它成分为蔗糖、活性炭和琼脂粉，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为1.8-2.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.5-0.6mg/L，所述蔗糖的浓度为25-30g/L，所述活性炭的浓度为0.4-0.5g/L，所述琼脂粉的浓度为6-8g/L，所述MS培养基的pH值为5.8-6.0，且培养温度控制在25士2℃，其中愈伤组织诱导为暗培养，可以防止愈伤组织迅速分裂的愈伤细胞老化，能保证愈伤组织的活性。
其中，所述S3中继代培养的方法包括以下步骤：
B1、将诱导出的愈伤组织进行继续培养，扩大八角愈伤组织量，将色泽为乳白的愈伤组织切并接种于MS培养基中。
B2、MS培养基中添加适量生长调节剂，并将培养基的pH值调节至5.6-6.0，控制培养温度控制为25士2℃，其中继代为暗培养，继代周期为30天，可形成群体优势，有利于增殖。
其中，所述B1中组织切片的直径为0.6mm；所述B2中的生长调节剂为6-苄氨基嘌呤、萘乙酸，其它成分为蔗糖、活性炭和琼脂粉，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为1.8-2.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.5-0.6mg/L，所述蔗糖的浓度为25-30g/L，所述活性炭的浓度为0.4-0.5g/L，所述琼脂粉的浓度为6-8g/L。
其中，所述S4中悬浮细胞培养的方法包括以下步骤：
C1、挑选经种子诱导的生长快，质地相似、色泽乳白，且脆散性好的愈伤组织进行细胞悬浮培养；
C2、分别称取愈伤组5g，接种于装有100ml液体培养基的三角瓶中进行悬浮培养，其中基本培养基同为MS培养基，且MS培养基pH值为5.5-6.0，培养温度控制在28士2℃；
C3、通过恒温震荡器对三角瓶中的愈伤组织和液体培养基进行振动培养，悬浮培养30天，可以培养愈伤组织中单细胞及小细胞团，能高表达细胞株的获得以及个性化培养基的研发。
其中，所述C2中的生长调节剂为6-苄氨基嘌呤、萘乙酸，其它成分为蔗糖、活性炭和琼脂粉，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为1.8-2.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.5-0.6mg/L，所述蔗糖的浓度为25-30g/L，所述C3中对愈伤组织和液体培养基振动培养的转速为190转/min，不仅可以避免愈伤组织在液体培养基中沉淀，而且还可以加速愈伤组织在液体培养基中的培养速度。
其中，所述S5中对目标物的检测方法包括以下步骤：
D1、对样品研磨、提取、振荡并提取上清液，然后将上清液进行上机检测；
D2、对所有样本进行定量分析，将检测到的所有样本的积分峰面积代入标准曲线线性方程进行计算。
实施例1、包括以下步骤：
S1、在八角果实成熟期采摘新鲜的八角果实，并去除果柄，然后用自来水清洗果实表面，清除果实表面的灰尘及杂物；在超净工作台上首先使用酒精75％消毒对八角果实进行消毒1分钟，并用无菌水清洗3-5次，使用0.1％升汞对清洗后的八角果实进行二次消毒15分钟，并通过无菌水对汞消毒后的八角果实再次清洗3-5次，将消毒好的八角果实利用解剖刀切开果壳取出种子，在八角种子的外壳端切开一个尺寸为0.2mmX0.4mm开口，并确保开口切到八角种子的乳白的胚乳处，将处理好的八角种子接种于愈伤组织诱导的培养基中进行诱导培养，诱导产生愈伤组织；
S2、通过基本培养基和生长调节剂建立八角愈伤组织诱导技术体系，其中基本培养基为MS培养基，其中生长调节剂6-苄氨基嘌呤的浓度为2.0mg/L，萘乙酸的浓度为0.5mg/L，其它成分中蔗糖浓度为30g/L，活性炭的浓度为0.5g/L，琼脂粉的浓度为6g/L，所述MS培养基的pH值为5.8-6.0，且培养温度控制在25℃，其中愈伤组织诱导为暗培养；
S3、将诱导出的愈伤组织进行继续培养，扩大八角愈伤组织量，将愈伤组织切割为直径0.6mm色泽为乳白的组织切片并接种于MS培养基中，MS培养基中添加浓度为1.9mg/L的6-苄氨基嘌呤，浓度为0.6mg/L的萘乙酸，浓度为25g/L的蔗糖，浓度为0.4g/L的活性炭和浓度为8g/L的琼脂粉制备成，并将培养基的pH值调节至5.6-6.0，控制培养温度控制为25℃，其中继代为暗培养，继代周期为30天；
S4、通过细胞悬浮培养，快速培养高质量的愈伤组织，挑选经种子诱导的生长快，质地相似、色泽乳白，且脆散性好的愈伤组织进行细胞悬浮培养，分别称取愈伤组织5g，接种于装有100ml液体培养基的三角瓶中进行悬浮培养，6-苄氨基嘌呤的浓度为1.8mg/L，萘乙酸的浓度为0.6mg/L，蔗糖为30g/L，其中基本培养基同为MS培养基，且MS培养基pH值为5.5-6.0，培养温度控制在28℃，并通过转速为190转/min的恒温震荡器对三角瓶中的愈伤组织和液体培养基进行振动培养，悬浮培养30天；
S5、对样品研磨、提取、振荡并提取上清液，然后将上清液进行上机检测，对所有样本进行定量分析，将检测到的所有样本的积分峰面积代入标准曲线线性方程进行计算，利用液相色谱串联质谱的方法进行目标物的检测。
实施例2、一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，包括以下步骤：
S1、在八角果实成熟期采摘新鲜的八角果实，并去除果柄，然后用自来水清洗果实表面，清除果实表面的灰尘及杂物；在超净工作台上首先使用酒精75％消毒对八角果实进行消毒2分钟，并用无菌水清洗3-5次，使用0.1％升汞对清洗后的八角果实进行二次消毒20分钟，并通过无菌水对汞消毒后的八角果实再次清洗3-5次，将消毒好的八角果实利用解剖刀切开果壳取出种子，在八角种子的外壳端切开一个尺寸为0.2mmX0.4mm开口，并确保开口切到八角种子的乳白的胚乳处，将处理好的八角种子接种于愈伤组织诱导的培养基中进行诱导培养，诱导产生愈伤组织；
S2、通过基本培养基和生长调节剂建立八角愈伤组织诱导技术体系，其中基本培养基为MS培养基，其中生长调节剂6-苄氨基嘌呤的浓度为1.95mg/L，萘乙酸的浓度为0.55mg/L，其它成分中蔗糖的浓度为28g/L，活性炭的浓度为0.45g/L和琼脂粉的浓度为7g/L，所述MS培养基的pH值为5.8-6.0，且培养温度控制在27℃，其中愈伤组织诱导为暗培养；
S3、将诱导出的愈伤组织进行继续培养，扩大八角愈伤组织量，将愈伤组织切割为直径0.6mm色泽为乳白的组织切片并接种于MS培养基中，MS培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度为1.85mg/L，萘乙酸的浓度为0.57mg/L，浓度蔗糖浓度为26g/L，活性炭的浓度为0.45g/L，琼脂粉的浓度为6.9g/L，并将培养基的pH值调节至5.6-6.0，控制培养温度控制为26℃，其中继代为暗培养，继代周期为30天；
S4、通过细胞悬浮培养，快速培养高质量的愈伤组织，挑选经种子诱导的生长快，质地相似、色泽乳白，且脆散性好的愈伤组织进行细胞悬浮培养，分别称取愈伤组织5g，接种于装有100ml液体培养基的三角瓶中进行悬浮培养，生长调节剂6-苄氨基嘌呤的浓度为1.92mg/L，萘乙酸的浓度为0.56mg/L，蔗糖浓度为30g/L，其中基本培养基同为MS培养基，且MS培养基pH值为5.5-6.0，培养温度控制在29℃，并通过转速为190转/min的恒温震荡器对三角瓶中的愈伤组织和液体培养基进行振动培养，悬浮培养30天；
S5、对样品研磨、提取、振荡并提取上清液，然后将上清液进行上机检测，对所有样本进行定量分析，将检测到的所有样本的积分峰面积代入标准曲线线性方程进行计算，利用液相色谱串联质谱的方法进行目标物的检测。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、对八角种子进行处理，将处理好的八角种子接种于愈伤组织诱导的培养基中进行诱导培养，诱导产生愈伤组织；
S2、通过基本培养基和生长调节剂建立八角愈伤组织诱导技术体系；
S3、将诱导出的八角愈伤组织进行继代培养；
S4、通过细胞悬浮培养建立悬浮细胞培养体系；
S5、利用液相色谱串联质谱的方法进行目标物的检测。
2.根据权利要求1所述的一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，其特征在于：所述S1中对八角种子处理包括以下步骤：
A1、在八角果实成熟期采摘新鲜的八角果实，并去除果柄，然后用自来水清洗果实表面，清除果实表面的灰尘及杂物；
A2、在超净工作台上首先使用酒精消毒对八角果实进行消毒，并用无菌水清洗3-5次；
A3、使用升汞对清洗后的八角果实进行二次消毒，并通过无菌水对汞消毒后的八角果实再次清洗3-5次；
A4、将消毒好的八角果实利用解剖刀切开果壳取出种子，在八角种子的外壳端切开一个开口，并确保开口切到八角种子的乳白的胚乳处。
3.根据权利要求2所述的一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，其特征在于：所述A2中对八角果实消毒的酒精浓度为75％，且消毒时间为1-2分钟；所述A3中升汞的浓度为0.1％，且升汞对八角果实消毒的时间为15-20分钟；所述A4中对八角种子切口的尺寸为0.2mmX0.4mm。
4.根据权利要求1所述的一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，其特征在于：所述S2中的基本培养基为MS培养基，所述生长调节剂为6-苄氨基嘌呤、萘乙酸，碳源为蔗糖、另添加活性炭和琼脂粉，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为1.8-2.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.5-0.6mg/L，所述蔗糖的浓度为25-30g/L，所述活性炭的浓度为0.4-0.5g/L，所述琼脂粉的浓度为6-8g/L，所述MS培养基的pH值为5.8-6.0，且培养温度控制在25士2℃，其中愈伤组织诱导为暗培养。
5.根据权利要求1所述的一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，其特征在于：所述S3中继代培养的方法包括以下步骤：
B1、培养基的制备，MS培养基中添加适量生长调节剂，并将培养基的pH值调节至5.6-6.0，培养基121℃灭菌30分钟。
B2、将诱导出的愈伤组织进行继续培养，扩大八角愈伤组织量，将色泽为乳白的愈伤组织切割为0.6mmX0.6mm大小并接种于MS培养基中，培养温度控制为25士2℃，其中继代为暗培养，继代周期为30天。
6.根据权利要求5所述的一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，其特征在于：所述B2中组织切片的直径为0.6mm；所述B1中的生长调节剂由6-苄氨基嘌呤、萘乙酸制备而成，其它成分为蔗糖、活性炭和琼脂粉，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为1.8-2.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.5-0.6mg/L，所述蔗糖的浓度为25-30g/L，所述活性炭的浓度为0.4-0.5g/L，所述琼脂粉的浓度为6-8g/L。
7.根据权利要求1所述的一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，其特征在于：所述S4中悬浮细胞培养的方法包括以下步骤：
C1、挑选经种子诱导的生长快，质地相似、色泽乳白，且脆散性好的愈伤组织进行细胞悬浮培养；
C2、分别称取愈伤组织5g，接种于装有100ml液体培养基的三角瓶中进行悬浮培养，其中基本培养基同为MS培养基，且MS培养基pH值为5.5-6.0，培养温度控制在28士2℃；
C3、通过恒温震荡器对三角瓶中的愈伤组织和液体培养基进行振动培养，悬浮培养30天。
8.根据权利要求7所述的一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，其特征在于：所述C2中的生长调节剂由6-苄氨基嘌呤、萘乙酸制备而成，其它成分为蔗糖、活性炭和琼脂粉，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为1.8-2.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.5-0.6mg/L，所述蔗糖的浓度为25-30g/L，所述C3中对愈伤组织和液体培养基振动培养的转速为190转/min。
9.根据权利要求1所述的一种利用八角种子诱导愈伤组织产生莽草酸的方法，其特征在于：所述S5中对目标物的检测方法包括以下步骤：
D1、对样品研磨、提取、振荡并提取上清液，然后将上清液进行上机检测；
D2、对所有样本进行定量分析，将检测到的所有样本的积分峰面积代入标准曲线线性方程进行计算。
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