CN114729027A - Dap10/dap12融合多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含DNAX‑活化蛋白10(DAP10)多肽和DNAX‑活化蛋白12(DAP12)多肽的融合多肽。本发明还涉及包含所述融合蛋白的细胞及其在治疗癌症中的用途。

Description

DAP10/DAP12融合多肽
技术领域
本发明涉及包含DNAX-活化蛋白10(DAP10)多肽和DNAX-活化蛋白12(DAP12)多肽的融合多肽。本发明还涉及包含所述融合多肽的细胞及其在治疗癌症中的用途。
背景技术
已证明使用嵌合抗原受体(CAR)工程T细胞的免疫疗法在治疗B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤方面具有变革性的作用。然而，由于缺乏肿瘤选择性靶标，这种技术在实体瘤免疫治疗中的应用受到了阻碍。大多数肿瘤抗原在细胞内，所以CAR-T细胞不容易识别它们。因此，在肿瘤细胞中，目前正在开发的导向CAR的大多数实体瘤所涉及的靶点都是上调的，但在正常组织中的含量却较低。
NKG2D配体是表现出高度肿瘤选择性的少数靶标群体之一。在人类中，这些配体包括一组8个应激诱导蛋白(MICA、MICB、ULBP1-6)，这些蛋白几乎在所有的肿瘤细胞类型上都有异常表达。此外，NKG2D配体也存在于肿瘤相关的基质元件上，如内皮细胞、调节性T细胞和骨髓衍生的抑制细胞(Parihar,R.,et al.,2019,Cancer Immunol.Res.7(3):363-375；Schmiedel&Mandelboim,2018,Front.Immunol.(9)2040)。遗传上缺乏NKG2D的小鼠对上皮性和淋巴性恶性肿瘤都表现为免疫监视功能受损。在健康组织中没有发现NKG2D配体的事实证明NKG2D配体是安全的治疗靶标。此外，未在正在进行的涉及NKG2D靶向CAR的临床试验中发现明显的安全问题，即使结合氟达拉滨(fludarabi ne)/环磷酰胺淋巴消融化疗(见https://www.celyad.com/en/news/celyad-presents-update-o n-autologous-allogeneic-nkg2d-based-car-t-therapies-in-solid-tumors)。
NKG2D受体由自然杀伤细胞(NK)和一些T细胞群自然表达。每个NKG2D同源二聚体通过质膜内互补的带电氨基酸与两个同源二聚体DAP10衔接子分子结合。这种相互作用对NKG2D的细胞表面表达和功能是必需的。DAP10通过磷脂酰肌醇3-激酶提供共刺激的能力与CD28相似，但重要的是，它缺乏p56lck结合基序来促进调节性T细胞不需要的招募(Kofler,et al.,2011,Mol.Ther.19:760-767)。DAP10共刺激的效力因其内化后继续发出信号的能力而得到强化。然而，由于DAP10缺乏基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，NKG2D的参与并不能导致T细胞的完全活化。
已经开发了多种CAR，它们利用不同的方法，除了提供ITAM依赖性信号1外，还提供共刺激(也称为信号2)，因为这两种信号类型都是引起T细胞完全活化所必需的。第一个NKG2D靶向CAR是由Sentman等人开发的，其由NKG2D与CD3ζ的融合组成(Zhang等人，2005，Blood 106:1544-1551)。虽然名义上是第一代CAR，但它与T细胞中的内源性DAP10相关联，意味着同时提供信号1和2。这种CAR目前正由Celyad S.A.作为Cyad-01进行临床开发。最近，Chang等人(2013年，Cancer Res.73:1777-1786)设计了NK细胞，其除了共表达外源性DAP10外，还共同表达了一种相同的CAR。另外两个NKG2D CAR也描述为结合了4-1BB(Song等，2013，Hum.Gene Ther.24:295-305)或CD28(Lehner等，2012，PLoS One 7:e31210)用来提供替代形式的共刺激，而非由DAP10提供。所有这些CAR都能使T细胞介导的肿瘤细胞被杀死，并伴有细胞因子的产生，而Chang等人描述的CAR也显示了短暂的体内抗肿瘤活性。
发明概述
在NK细胞中发现的小鼠NKG2D的一种异构体可以与DAP10和DAP12(其包含单个ITAM)反式结合，从而有可能为T细胞的活化提供信号1和信号2。基于这一观察，我们设计了一种包括DAP10和DAP12的融合多肽。当与NKG2D共表达时，融合多肽和NKG2D通过互补的带电氨基酸残基在质膜上共同结合，形成一个基于紧密衔接子的小型CAR，驱动T细胞完全活化。
因此，本发明提供的融合多肽包括(i)DNAX-活化蛋白10(DAP10)多肽，或其功能变体和(ii)DNAX-活化蛋白12(DAP12)多肽，或其功能变体。所述DAP10多肽(或其功能变体)和所述DAP12多肽(或其功能变体)可以直接融合在一起，也可以通过连接子连接。所述融合多肽可进一步包括N端或C端氨基酸序列，例如，用于协助检测或纯化，用于改善表达或增加半衰期。
在一个实施方案中，本发明提供了融合多肽，其具有以下通式，从N端到C端：A-B-C-D-E，
其中，
A＝一种任选的N端序列；
B＝一种DAP10多肽或其功能变体；
C＝一种任选的连接子序列；
D＝一种DAP12多肽或其功能变体；
E＝一种任选的C端序列。
在一个实施方案中，所述融合多肽不包括或不由WO 2019/182425的SEQ ID NO:1(在此称为SEQ ID NO:84)组成。在一些实施方案中，所述融合多肽不包括抗EpCAM肽。在一些实施方案中，所述融合多肽不包括EpCAM特异性抗原受体。在一些实施方案中，所述融合多肽不包括或不由WO 2019/182425的SEQ ID NO:9(在此称为SEQ ID NO:85)组成。在一些实施方案中，所述DAP10多肽或其功能变体不包括或不由SEQ ID NO:85组成。在一些实施方案中，所述融合多肽不包括或不由WO 2019/182425的SEQ ID NO:11(在此称为SEQ ID NO:86)组成。在一些实施方案中，所述DAP12多肽或其功能变体不包括或不由SEQ ID NO:86组成。在一些实施方案中，所述融合多肽不包括或不由SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86两者组成。
在其他方面，本发明涉及一种编码本发明文所述的融合多肽的核酸分子(例如，分离的核酸分子)，其包括DNA和RNA分子。这种核酸分子也可以任选地编码NKG2D多肽或其功能变体。
本发明还公开了包含本发明核酸分子的载体，尤其是表达载体。
本发明还提供了包含编码本文所述融合多肽的核酸和/或载体的宿主细胞。本发明还提供了包含本发明的融合多肽的宿主细胞。
本发明还提供了一种制备本发明所述的融合多肽的方法，其包括在适合表达所述核酸的条件下维持本发明的宿主细胞，以此表达重组核酸并产生融合多肽。
本发明还提供了一种药物组合物，其包括本发明的融合多肽、核酸分子、载体或宿主细胞，任选地，进一步包括药学或生理学上可接受的载体。
本发明还提供了一种治疗患有病理性疾病的患者的方法，包括将包含本发明的融合多肽的融合多肽、核酸分子、载体或宿主细胞施用于有需要的患者。
本发明还提供了根据本发明的融合多肽、核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物(i)用于治疗和(ii)用于制备治疗本发明的疾病或病症的药物。
附图说明
图1显示了已形成的每个构建体结构的示意图。N1012包括由外源性人NKG2D蛋白和根据本发明的融合外源性DAP10/12同源二聚体组成的复合物。N1012包括如SEQ ID NO:64所示的序列，其描述见表2。NKG2D复合物包括外源性的人NKG2D蛋白，其与已经存在于细胞中的内源性DAP10相互作用，并提供仅用于比较目的。
图2显示了与未转染(UT)的293T细胞比较，转染了表达N1012的逆转录病毒质粒(如图1所示)或NKG2D三天后，NKG2D在293T细胞表面和细胞内(ICS)的表达情况。
图3显示了用单独编码NKG2D或N1012的逆转录病毒载体转导至活化的未分化人T细胞后，细胞表面NKG2D表达的转导百分比(图3的A)和荧光强度中值(MFI-图3的B)。提供UTT细胞中的表达和MFI作为对比。
图4显示了经转导用来表达N1012、NKG2D或对照的活化未分化T细胞的CD4+和CD8+亚群中细胞表面NKG2D的代表性表达模式。提供NKG2D在UT T细胞内的表达作为对比。
图5显示了11种不同肿瘤细胞系与N1012+、NKG2D+或UT T细胞以不同的CAR T细胞:靶细胞比例共培养后的存活率。72小时后，使用MTT法评估肿瘤细胞的存活率，并以在没有T细胞共培养的情况下观察到的百分比表示。
图6显示了N1012、NKG2D和UT T细胞与8个不同的肿瘤细胞系以1:1的CAR T细胞:靶细胞比例进行共培养时分泌的细胞因子(IFN-γ(图6A)和IL-2(图6B))的水平。72小时后除去共培养的上清液，用酶联免疫吸附法(ELISA)评估细胞因子的存在。
图7显示了与N1012+、NKG2D+或UT T细胞以不同的CAR T细胞:靶细胞比例共培养后的肿瘤和胰腺星状细胞PS1的存活率。图7的A显示了与N1012+、NKG2D+或UT T细胞以不同的CAR T细胞:靶细胞比例共培养后，胰腺星状细胞PS1的存活率。当以1:1的CAR T细胞:靶细胞比例加入时，N1012+T细胞也能有效溶解细胞PS1和BxPC3细胞以1:1的比例一起生长的单分子层(图7的B)。这与加入NKG2D+或UT T细胞后观察到的缺乏效力形成对比。在这两种情况下，靶细胞的存活率在48小时后通过MTT试验进行评估，并以没有T细胞共培养时观察到的百分比表示。图7的C(BxPC3_LT+PS1)和图7的D(PaTU+PS1)显示了与N1012+、NKG2D+或UT T细胞以1:1的CAR T细胞:靶细胞比例共培养后的肿瘤细胞和基质细胞单分子层的存活率。虽然与N1012+T细胞培养时观察到肿瘤和基质细胞的有效裂解，但当与NKG2D或UT T细胞(图7C-D)共培养时，观察到靶细胞的存活率轻微下降。图7的E和图7的F显示了与N1012+、A2028z+、NKG2D+或UT T细胞以1:1的CAR T细胞:靶细胞比例共培养后，肿瘤细胞和基质细胞单分子层的存活率(在多达5次重复刺激后)。图7G和H显示了N1012+、A2028z+、NKG2D+和UT T细胞在上述共培养期间分泌的IFN-γ的水平。单独从肿瘤中分泌的IFN-γ的水平作为阴性对照。图7的I和J显示了与N1012+、NKG2D+或UT T细胞共培养后，肿瘤球状体的存活率。图7的K显示了与肿瘤球状体共培养期间N1012+、UT T细胞和肿瘤单独分泌的IFN-γ的水平。
图8显示了与UT T细胞或单独表达NKG2D的T细胞相比，表达N1012的T细胞能够进行多轮重复刺激(“再刺激”)的能力。表达N1012的T细胞能够通过多轮刺激(图8B)介导间皮瘤(Ju77)细胞和头颈部(HN3_LUC)细胞(图8A)的裂解，此期间，它们表现出大量的增殖(图8C)和T细胞的倍数扩增(图8D)。图8B和8D还显示，表达N1012的T细胞可以进行反复的循环刺激，并在与Ren或BxP3_LT细胞培养时表现出大量增殖。相反，UT T细胞或那些单独表达NKG2D的T细胞表现出最少的靶细胞裂解或增殖。
图9显示了逆转录病毒转导CAR T细胞的工程化在荷瘤小鼠体内的评估。图9A显示了用N1012或NKG2D转导后的CD4+和CD8+T细胞表面的NKG2D表达。与同一供体表达泛ErbB靶向CAR、T4的T细胞进行了比较(如Davies等人，2012，Mol.Med.18:565-576)。还使用了第二种泛ErbB靶向CAR，命名为TMY，其缺乏T4中包含的4αβ域，且具有一个略微改变的CD28铰链(其中MYPPPY序列由10个氨基酸的线性myc标签序列取代)。图9B显示了残留的T细胞在转移到小鼠后对所述肿瘤细胞系的体外细胞毒性功能。
图10显示了ffLUC标记的BxPC3细胞在NSG小鼠体内的生长情况，由生物发光成像(BLI)确定。图10A显示了汇总的每组小鼠的BLI发射。图10B显示了个别小鼠的连续生物发光发射。图10C显示小鼠的体重。图10D显示了第88天肿瘤再激发后个别小鼠的连续生物发光发射。图10E为在145天后结束的实验的生存曲线。
图11显示了另一个实验的结果，显示ffLUC标记的BxPC3细胞在NSG小鼠体内的生长情况，由生物发光成像(BLI)确定。图11A显示了每个治疗组的BLI平均总通量(光子/秒)，图11B显示了每只小鼠的BLI总通量(光子/秒)。在第41天(T细胞输注后29天)无肿瘤的小鼠重新用ffLUC标记的BxPC3细胞进行静脉注射(虚线显示)。
图12显示了用N1012+T细胞治疗后NSG小鼠体内ffLUC标记的H226恶性间皮瘤细胞的生长情况，由生物发光成像(BLI)确定。图12A显示了每个治疗组的BLI平均总通量(光子/秒)，图12B显示了每只老鼠的BLI总通量(光子/秒)。为了确认T细胞的持久性和功能的保持情况，所有无肿瘤小鼠在最初的肿瘤接种后91天，再接种1×106ffLUC标记的H226细胞，再激发在图中用虚线显示。
图13显示了NKG2D、N1012和CYAD-01在CD4+T细胞中表达时的表面表达情况。
图14比较了N1012+T细胞与BxPC3-LT、Ren或Ju77细胞共培养时对CYAD-01T细胞和NKG2D T细胞的再刺激(图14的A)和增殖潜力(图14的B)。
图15A显示了与N1012+，CYAD-01或UT T细胞共培养后的肿瘤球状体的存活率。图15B显示了与肿瘤球状体共培养期间T细胞的增殖水平。
发明详述
DAP10多肽及其功能变体
本文所述融合多肽中使用的DAP10多肽可以是哺乳动物，例如人类。野生型人DAP10由UniProt登录号Q9UBK5(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列编码。其为一种93个氨基酸的多肽。前18个氨基酸被认为是信号/引导序列，19-48个氨基酸是胞外结构域，49-69个氨基酸是跨膜结构域，70-93个氨基酸是细胞质/胞内结构域。
在一个实施方案中，用于本发明融合多肽中的DAP10多肽包括与如SEQ ID NO:1所示的DAP10多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，用于本发明融合多肽中的DAP10多肽包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，用于本发明融合多肽中的功能变体DAP10多肽可包括一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)点突变，所述点突变增加、缺失或取代DAP10氨基酸(例如野生型人DAP10(SEQ ID NO:1)的氨基酸)中的的任意氨基酸。
DAP10多肽的截短变体也可用于本发明的融合多肽中。例如，DAP10的截短变体只包括如SEQ ID NO:1所示的19-93个氨基酸(即缺少1-18个氨基酸，信号/引导序列)，也可用于本发明的融合多肽中。该序列在此称为SEQ ID NO:2。其他截短变体可包括SEQ ID NO:1的19-69个氨基酸，这样的序列仅包括DAP10的胞外和跨膜结构域，在此称为SEQ ID NO:3。本发明中使用的DAP10的进一步截短变体可包括SEQ ID NO:1的1-71个氨基酸(即信号/引导序列、胞外结构域、跨膜结构域和细胞质/胞内结构域的2个氨基酸)，在此称为SEQ IDNO:4。本发明中使用的DAP10的进一步截短变体可包括SEQ ID NO：1的19-71个氨基酸(即胞外结构域、跨膜结构域和来自细胞质/胞内结构域的2个氨基酸)，在此称为SEQ ID NO:5。本发明中使用的DAP10的进一步截短变体可包括SEQ ID NO:1的70-93个氨基酸(即胞内结构域)，在此称为SEQ ID NO:6。本发明中使用的DAP10的进一步截短变体可包括SEQ ID NO:1的49-93个氨基酸(即跨膜和细胞质/细胞内结构域)，在此称为SEQ ID NO:7。本发明中使用的DAP10的进一步截短变体可包括SEQ ID NO:1的49-69个氨基酸(即跨膜结构域)，在此称为SEQ ID NO:8。
DAP10多肽的其他突变版本或截短变体也适合用于本发明的内容。在一些实施方案中，使用的这种突变版本或截短变体作为本发明DAP10多肽的功能变体保留了如SEQ IDNO:1中所示的野生型多肽的活性。
在一个实施方案中，本发明DAP10多肽的功能变体保留了如SEQ ID NO:1所示的野生型多肽的至少10％(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或以上)的活性。在一个实施方案中，可以通过评估DAP10的酪氨酸磷酸化和/或磷脂酰肌醇3-激酶的p85亚基和下游的抗凋亡激酶AKT的招募和活化来测量活性。
DAP12多肽及其功能变体
本文所述融合多肽中使用的DAP12多肽可以为哺乳动物，例如人类。野生型人DAP12是由UniProt登录号：O43914(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列编码的。前21个氨基酸被认为是信号/引导序列，22-40个氨基酸为胞外结构域，41-61个氨基酸为跨膜结构域，62-113个氨基酸为胞质/胞内结构域。
在一个实施方案中，用于本发明融合多肽中的DAP12多肽包括与如SEQ ID NO:9所示的DAP12多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，用于本发明融合多肽中的DAP12多肽包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，用于本发明融合多肽中的功能变体DAP12多肽可包括一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)点突变，这些点突变增加、缺失或取代DAP12氨基酸(如野生型人DAP12(SEQ ID NO:9)的氨基酸)中任一氨基酸。
DAP12多肽的截短变体也可用于本发明的融合多肽中。例如，DAP1的截短变体只包括SEQ ID NO:9中的22-113个氨基酸(即缺少1-21个氨基酸，信号/引导序列)，其可用于本发明融合多肽中。这样的序列在此称为SEQ ID NO:10。其他截短变体可包括SEQ ID NO:9中的62-113个氨基酸，这样的序列仅包括DAP12的细胞质/胞内结构域，并在此称为SEQ IDNO:11。其他截短变体可包括SEQ ID NO:9的41-61个氨基酸(即跨膜结构域)，在此称为SEQID NO:12。另一个截短变体可包括SEQ ID NO:9的22-61个氨基酸(即胞外和跨膜结构域)，在此称为SEQ ID NO:13。
DAP12多肽的其他突变体或截短变体也适合用于本发明的内容。在本发明中用作DAP12多肽功能变体的突变体或截短变体可以保留如SEQ ID NO:9所示的野生型多肽的活性。
在一个实施方案中，本发明DAP12多肽的功能性变体保留了如SEQ ID NO:9所示的野生型多肽的至少10％(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)的活性。在一个实施方案中，可使用功能性实验，例如MTT和通过ELISA测量细胞因子的分泌来测定活性。
与本发明的融合多肽结合的多肽
本发明的融合多肽可与其他多肽结合。这种结合可能是由于静电作用，例如由互补的带电氨基酸提供的静电作用。
可与本发明的融合多肽结合的这种多肽实例是NKG2D多肽(Wu et al.,2000,J.Exp.Med.,192(7):1059-1067and Rosen et al.,2004,J.Immunol.,173(4):2470-2478)。
在一个实施方案中，这种多肽可以作为与编码本发明融合多肽的基因的连续嵌合构建体的一部分进行基因编码。然后，融合多肽和其他多肽可以在翻译过程中(例如使用核糖体跳跃肽)或通过翻译后裂解(例如使用福林蛋白酶(furin)裂解位点)进行分离。因此，所述融合多肽和其他多肽可以通过一个可选的连接子连接。这样的连接子可以包括一个裂解位点用以促进裂解。
NKG2D多肽及其功能变体
本文所述嵌合多肽中使用的NKG2D多肽可以为哺乳动物，例如人类。野生型人NKG2D由UniProt登录号：P26718(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列编码。该多肽被认为包括一个胞质结构域(氨基酸1-51)，一个跨膜结构域(氨基酸52-72)和一个胞外结构域(氨基酸73-216)。
在一个实施方案中，用于本发明的NKG2D多肽包括与如SEQ ID NO:14所示的NKG2D多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，用于本发明的NKG2D多肽包括SEQID NO:14的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，用于本发明的功能性变体NKG2D多肽可包括一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)点突变，这些点突变增加、缺失或取代NKG2D氨基酸(如野生型人NKG2D(SEQ ID NO:14)的氨基酸)中的任意氨基酸。
NKG2D多肽的截短变体也可用于本发明的多肽中。例如，NKG2D的截短变体只包括SEQ ID NO:14中的73-216个氨基酸(即胞外结构域)，可用于本发明。这样的序列在此称为SEQ ID NO:15。其他截短变体可包括SEQ ID NO:14的82-216个氨基酸，这样的序列包括NKG2D的部分胞外结构域，在此称为SEQ ID NO:16。另一个截短变体包括SEQ ID NO:14的52-216个氨基酸(即跨膜和胞外结构域)，在此称为SEQ ID NO:17。
NKG2D多肽的其他突变体或截短变体也适合用于本发明的内容。当然，在本发明中使用的任何这样的突变体或截短变体作为NKG2D多肽的功能变体最好保留如SEQ ID NO:14中所示的野生型多肽的活性。
在一个实施方案中，本公开的NKG2D多肽的功能变体保留了如SEQ ID NO:14所示的野生型多肽的至少10％(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或以上)的活性。在一个实施方案中，可使用流式细胞仪测量活性，用以确认与NKG2D配体的持续结合，并通过各种细胞培养试验(如MTT和ELISA)，旨在确认靶细胞裂解、细胞因子分泌和共刺激。
连接子
本声明中所述的DAP10和DAP12分子可以在一条连续的多肽链中直接相互结合，也可以通过合适的连接子间接地相互结合。所述连接子可以是肽连接子。肽连接子通常用于融合多肽，选择或设计连接子的方法为众所周知的。(例如，见Chen X等人，2013，Adv.DrugDeliv.Rev.65(10):135701369和Wriggers W等人，2005，Biopolymers 80:736-746)。如上所述，连接子也可用于将本发明融合多肽与另一个多肽(如NKG2D多肽)连接在嵌合构建体中。
肽连接子一般分为i)柔性连接子，ii)形成螺旋的连接子，和iii)可裂解的连接子，每种类型的实例在本领域是已知的。在一个实例中，本文所述的融合多肽中包括一个柔性连接子。柔性连接子可包含大部分无立体阻碍的氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸。亲水性氨基酸Ser也习惯性地用于柔性连接子中。柔性连接体的实例包括但不限于：聚甘氨酸(例如，(Gly)4和(Gly)5)、聚丙氨酸聚(Gly-Ala)和聚(Gly-Ser)(例如，(Glyn-Sern)n或(Sern-Glyn)n，其中每个n独立为等于或大于1的整数)。
肽连接子可以有合适的长度。肽连接子序列可以为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多的氨基酸残基的长度。例如，肽连接子的长度可以为约5至约50个氨基酸；约10至约40个氨基酸；约15至约30个氨基酸；或约1 5至约20个氨基酸的长度。肽连接子长度的变化可以保留或增强活性，在活性研究中产生卓越的功效。肽连接子序列可由天然或非天然的氨基酸组成，或由天然和非天然的氨基酸混合组成。
在某些方面，氨基酸甘氨酸和丝氨酸包括连接子序列内的氨基酸。在某些方面，连接区包括甘氨酸重复序列组(GSG3)n(SEQ ID NO:18)，其中n为等于或大于1的正整数(例如1至约20)。更具体地，连接子序列可以为GSGGG(SEQ ID NO:19)。连接子序列可以为GSGG(SEQID NO:20)。在某些其他方面，连接区方向包括甘氨酸重复序列组(SerGly3)n，其中n为等于或大于1的正整数(例如1到约20)(SEQ ID NO:21)。
在其他的实施方案中，连接子可以随机或重复的包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)。例如，连接子可以为(GGGGS)n(SEQ ID NO:22)，其中n为1至20的整数，例如1至4。在一个特定的实施例中，n为4，连接子为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23)。在另一个特定的实施例中，n为3，连接子为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:24)。
在其他实施方案中，连接子可随机或重复的包含甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和脯氨酸(P)。例如，连接子可以为(GPGS)n，其中n为1-20的整数，例如1-4。在一个特定的实施例中，n为1，连接子为GPGS(SEQ ID NO:25)。
一般来说，连接子在病人(如人类)体内施用时没有免疫原性。因此，可以选择连接子，由于他们具有低免疫原性或被认为具有低免疫原性。
此处描述的连接子是示例性的，如果需要，连接子可以包括其他氨基酸，如Glu和Lys。如果需要，肽连接子可以包括例如(G3S)(SEQ ID NO:26)、(G4S)(SEQ ID NO:27)、(GYS)(SEQ ID NO:28)和/或(GlySer)(SEQ ID NO:29)的多次重复。在某些方面，肽连接子可以包括例如(SG4)(SEQ ID NO:30)、(SG3)(SEQ ID NO:31)、(SG2)(SEQ ID NO:32)、(SG)2(SEQ IDNO:33)或(SerGly)(SEQ ID NO:34)的多次重复。
在其他方面，肽连接子可包括重复氨基酸序列单元的组合和倍数，例如(G3S)+(G4S)+(GlySer)(SEQ ID NO:26+SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:29)。在其他方面，Ser可以用Ala代替，例如，(G4A)(SEQ ID NO:35)或(G3A)(SEQ ID NO:36)。在其他方面，所述连接子包括(EAAK)n，其中n为等于或大于1的正整数，例如1至约20(SEQ ID NO:37)。在某些方面，肽连接子还可以包括可裂解的连接子。
所述连接子可进一步包括结构域和/或特征，如呋喃酶裂解位点(RRKR)(SEQ IDNO:38)、P2A核糖体跳跃肽(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)(SEQ ID NO:39)和/或T2A核糖体跳肽(EGRGSLLTCGDVEENPGP)(SEQ ID NO:40)。包含这些结构域的连接子的实施例包括SGSG+P2A核糖体跳跃肽(SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)(SEQ ID NO:41)，SGSG+T2A核糖体跳跃肽(SGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP)(SEQ ID NO:42)，以及还包括弗林蛋白酶裂解位点的版本，即弗林蛋白酶裂解位点+SGSG+P2A核糖体跳跃肽(RRKRSGSGAT NFSLLKQAGDVEENPGP)(SEQ IDNO:43)和弗林蛋白酶裂解位点+SGSG+T2A核糖体跳跃肽(RRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP)(SEQ ID NO:44)。可用于本发明的替代性核糖体跳跃肽包括F2A(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP)(SEQ ID NO:45)和E2A(QCTNYALLKLAGDVESNPGP)(SEQ ID NO:46)。
N端序列和C端序列
各种序列可以连接到本公开的融合多肽的N端或C端，或连接到本发明的NKG2D多肽上。这些序列可以是功能性的，如信号肽、纯化标签/序列或半衰期延长分子，或者也可以仅仅包括间隔序列。另外，它们也可以包括一种功能，如T细胞刺激功能。
纯化标签和标记
各种标签或标记可以连接到本发明的融合多肽的N端或C端，用于协助纯化。任何亲和标签都可以与本发明的融合多肽结合用于帮助纯化。这种亲和标签的实施例为His-标签、FLAG-标签、Arg-标签、T7-标签、Strep-标签、S-标签、适配子-标签、V5标签、AviTagTM、myc表位标签或这些标签的任何组合。在一个实施方案中，亲和标签为His-标签(通常包括5-10个组氨酸残基)，例如6His标签(即HHHHH)(SEQ ID NO:47)。在另一个实施方案中，亲和标签为FLAG标签(即DYKDDDDK)(SEQ ID NO:48)。在另一个实施方案中，亲和标签为AviTagTM(即GLNDIFEAQKIEWHE)(SEQ ID NO:49)。
在另一个实施方案中，亲和标签为V5标签(GKPIPNPLLGLDST)(SEQ ID NO:50)或(IPNPLLGLD)(SEQ ID NO:51)。在另一个实施方案中，亲和标签为由9e10抗体识别的myc表位标签(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO:52)。用于本发明的各种其他标签在本领域中为众所周知的。
也可以使用这种亲和标签的组合，包括N端一个或多个标签，C端一个或多个标签，或N端和C端各一个或多个标签。这种组合的实施例包括His标签(H)与Avi标签(A)相结合，或His标签(H)与Avi标签(A)和FLAG标签(F)相结合。标签可以位于任意方向，因此Avi标签/His标签可以有N-AH-C或N-HA-C方向，而Avi/His/FLAG标签可以有N-AHF-C、N-FHA-C方向等等。
在一个实施方案中，根据本发明的融合多肽包括具有“GLNDIFEAQKIEWHEGGHHHHDYKDDK”序列的“AHF”标签(SEQ ID NO:53)。在另一个实施方案中，根据本发明的融合多肽包括具有“DYKDDDDKHHHHHHGGGLNDIFEAQKIEWHE”序列的“F HA”标签(SEQ ID NO:54)。
CD8α引导序列(UniProt.P01732的1-21个氨基酸或包括1-18个氨基酸的缩短衍生物)是常用的T细胞序列，在此称为SEQ ID NO:55。P01732或由氨基酸1-18组成的缩短衍生物为一种常用的T细胞序列，在此称为SEQ ID NO:55。
共刺激序列
在先前设计的CAR-T细胞的工作中已知各种T细胞共刺激活性序列。这些序列也可以添加到本发明融合多肽中。
4-1BB胞内结构域(UniProt:Q07011的214-255氨基酸)也可作为N端或C端序列。4-1BB胞内结构域在此称为SEQ ID NO:56。4-1BB胞内结构域可作为一个共刺激结构域。
CD27胞内结构域(UniProt:P26842的213-260氨基酸)也可作为N端或C端序列。CD27胞内结构域在此称为SEQ ID NO:57。CD27胞内结构域可以作为一个共刺激结构域。
人IgG1铰链(UniProt:P0DOX5的218-229氨基酸)也可作为N或C端序列使用。人IgG1铰链称为SEQ ID NO:58。
截短CD8α铰链(Uniprot:P01732的138-182氨基酸)也可作为N端或C端序列使用。截短的CD8α铰链称为SEQ ID NO:59。
示例性的构建体
本发明在表1中提供了以下示例性的融合多肽构建体。
表1：示例性的DAP10/DAP12融合多肽构建体
Figure BDA0003645901330000121
此外，如上所述，本发明的融合多肽可以作为单一的嵌合构建体结合NKG2D多肽表达，进行翻译相关或翻译后裂解。在这样的构建体中，在表达之后，翻译后的多肽裂解形成独立的多肽，然后自我结合，形成CAR。在一个实施方案中，本发明的融合多肽是由NKG2D多肽裂解而成。这种构建体的实施例见表2。
表2：示例性嵌合构建体
Figure BDA0003645901330000131
Figure BDA0003645901330000141
Figure BDA0003645901330000151
编码本发明的融合多肽的核酸分子
本发明另一个方面涉及编码本发明融合多肽或嵌合构建体的核酸分子。该核酸分子可以为DNA或RNA。除非在此特别限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，这种类似物具有与参考核酸类似的性质，并以与天然核苷酸类似的方式进行代谢。这种类似物的实施例包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺、甲基膦酸盐、手性甲基磷酸盐、2-O-甲基核糖核酸、肽-核酸(PNAs)。除非另有说明，一个特定的核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体来说，如下文所详述的，简并密码子替换可以通过合成序列实现，其中一个或多个选定的(或所有的)密码子的第三位由混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batze r et al.,1991,Nucleic AcidRes.19:5081；Ohtsuka et al.,1985,J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Rossolini et al.,1994,Mol.cell.Probes 8:91-98)。
因此，本发明还提供了一种核酸，包括编码SEQ ID NO:60-69中任意一个或多个的多肽序列的核苷酸序列。
本发明进一步提供了一种核酸，包括与编码SEQ ID NO：60-69中任意核酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。序列同一性通常是通过参考序列的全长判定的。
本发明进一步提供了一种核酸，包括与SEQ ID NO:70-79中任一个具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。
本发明还提供了一种包含SEQ ID NO:70-79中任一个的核苷酸序列的核酸。本发明还提供了由SEQ ID NO:70-79中任一个的核苷酸序列组成的核酸。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过对现有序列的PCR诱变产生(例如下面实施例中描述的序列)。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法完成，例如Narang et al.,1979,Meth.Enzymol.68:90中的磷酸酯法；Brown et al.,1979,Meth.Enzymol.68:109中的磷酸二酯法；Beaucage et al.,1981,Tetra.Lett.,22:1859中的二乙基磷酰胺法，以及U.S.Pat.No.4,458,066.中固相支撑法。通过PCR将突变引入多核苷酸序列可以按照例如《PCR技术》中的描述进行：Principles and Applications for DNAAmplification,H.A.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications,Innis et al.(Ed.),Academic Press,San Diego,Calif,1990；Mattila et al.,1991,Nucleic Acids Res.19:967；and Eckert et al.,1991,PCR Methods and Applications 1:17.
载体
本发明还提供了包括一个或多个本发明的核酸分子的载体。
为了在宿主细胞中表达，编码融合多肽的核酸可以存在于合适的载体中，在引入到合适的宿主中后，可以根据本领域已知的标准克隆和表达技术(例如，如Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd,ed.,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989)，表达该序列以产生编码的融合多肽。本发明还涉及包含本发明的核酸序列的此类载体。
可以采用各种表达载体来表达编码本发明的融合多肽的多核苷酸。基于病毒的和非病毒的表达载体都可用在宿主细胞(如哺乳动物宿主细胞)中产生融合多肽。非病毒载体和系统包括质粒、游离型载体(通常带有表达蛋白或RNA的表达盒)和人类人工染色体(参考；例如Harrington et al.,1997,Nat Genet.15:345)。例如，对在哺乳动物(例如人类)细胞中表达本发明融合多肽的多核苷酸和多肽有用的非病毒载体包括pThioHis A、B和C，pcDNA3.1/His，pEBVHis A、B和C，(Invitrogen，San Diego,Calif.)，MPS V载体，以及本领域中已知用于表达其他蛋白的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP Epstein Barr病毒的载体，疫苗病毒载体和Semliki Forest病毒(SFV)。见Brent et al.,supra；Smith,1995,Annu.Rev.Microbiol.49:807和Rosenfeld et al.,1992,Cell 68:143。特别地，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体通常在T细胞中表达。这类载体的实施例包括SFG逆转录病毒表达载体(见Riviere et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)92:6733-6737)。在一个实施方案中，使用了慢病毒载体，这些载体包括自失活的慢病毒载体(称为SIN载体)。
表达载体的选择取决于载体进行表达的预期宿主细胞。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见例如Queen,et al.,1986,Immunol.Rev.89:49-68)，以及必要的信息处理位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止序列。这些表达载体通常含有来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成性的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调节或可调控的。有用的启动子包括但不限于：金属硫蛋白启动子、构成性腺病毒主要后期启动子、地塞米松诱导的MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、构成性MPS V启动子、四环素诱导的CMV启动子(如人类即时早期CMV启动子)、构成性CMV启动子、EF1 alpha启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和本领域已知的启动子增强剂组合。
转化生物体的培养可以在非诱导条件下扩增，而不偏向于其表达产物能被宿主细胞更好地耐受的编码序列的群体。除了启动子之外，还可能需要或期望其他调节元件来高效表达本发明的抗体或其片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近的核糖体结合位点或其他序列。此外，表达的效率可以通过加入适合细胞系统使用的增强子来提高(例如，见Scharf et al.,1994,Results Probl.Cell Differ.20:125；and Bittner et al.,1987,Meth.Enzymol.,153:516)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
本发明提供了一种克隆或表达载体，包括核酸，所述核酸包括与编码SEQ ID NO:60-69中任意的核酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的核苷酸序列。此外，本发明提供了一种克隆或表达载体，包括编码SEQ ID NO:60-69中一个或多个的核酸。本发明提供了一种克隆或表达载体，包括SEQ IDNO:70-79中任一个的核酸序列。
宿主细胞
本发明提供的宿主细胞包含本发明的多肽、本发明的核酸、本发明的载体、或其一种或两种的组合。此类细胞通常用于表达本发明的融合多肽。
所述核酸或载体可以通过标准技术转染到宿主细胞中。
术语“转染”的各种形式旨在包括各种常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。
另外，所述核酸或载体可以通过转导传递到宿主细胞中。例如，如上文所披露的病毒载体，可用于传递所述核酸或载体。
在原核或真核宿主细胞中表达本发明的融合多肽是可能的。代表性的宿主细胞包括多种大肠杆菌菌株；哺乳动物细胞系，如CHO、CHO-K1和HEK293；昆虫细胞，如Sf9细胞；以及酵母细胞，如S.cerevisiae和P.pastoris。在一个实施方案中，宿主细胞为免疫应答细胞，如NK细胞(原代NK细胞，或NK细胞系)或T细胞(原代T细胞或T细胞系)。其他类型的宿主细胞包括巨噬细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、中性粒细胞和不变的NKT(iNKT)细胞。所述T细胞可以为CD4+或CD8+T细胞。在一个实施方案中，宿主细胞为一种人细胞。在一个实施方案中，宿主细胞为人T细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞为原代人T细胞。可使用的细胞系包括NK细胞系NK-92。
用于表达本发明的融合多肽的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，如Urlaub and Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中描述，使用DH FR可选择标记，例如，如R.J.Kaufman and P.A.Sharp,1982,Mol.Biol.159:601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在一个实施方案中，宿主细胞为CHO K1PD细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞为NSO1细胞。特别地，用于使用NSO骨髓瘤细胞，另一个表达系统为WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中所示的GS基因表达系统。当编码融合多肽的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞时，融合多肽可通过培养宿主细胞一段时间，使其足以在宿主细胞中表达融合多肽或将融合多肽分泌到宿主细胞生长的培养基中而产生。融合多肽可以用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收。
制备方法
本发明还提供了生产包含本发明融合多肽的免疫应答细胞的方法。这种方法可包括用转导编码本发明融合多肽的核酸或载体至细胞。所述方法可进一步包括培养细胞，使融合多肽表达并与NKG2D多肽结合形成CAR。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备免疫应答细胞的方法，其包括以下步骤：(i)将编码本发明融合多肽的核酸或载体转入所述免疫应答细胞，和(ii)培养所述免疫应答细胞，使融合多肽表达并与NKG2D多肽结合形成CAR。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，包括：(i)从患者身上获得T细胞和/或NK细胞，(ii)将编码本发明融合多肽的核酸或载体转入所述T细胞和/或NK细胞，以及(iii)培养所述T细胞和/或NK细胞，使融合多肽表达并与NKG2D多肽结合形成CAR。
在本领域，用于培养免疫应答细胞的各种方法为众所周知的。例如，见Parente-Pereira AC et al.2014,J.Biol.Methods 1(2):e7，Ghassemi S et al.2018,CancerImmunol Res6(9):1100-110，和Denman CJ et al.2012,PLoS One 7(1):e30264。
组合物
本发明还提供了包含本发明所述融合多肽、核酸、载体或宿主细胞的药物组合物。此类药物组合物可包括药学或生理学上可接受的稀释剂和/或载体。所述载体通常被选择为适合预期的给药方式，并可包括用于改变、维持或保存例如组合物的pH值、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、味道、无菌性、稳定性、溶解或释放率、吸附性或渗透性的药剂。通常，这些载体包括水溶液或酒精/水溶液；乳剂或悬浮液，包括盐水和/或缓冲介质。
适用于药物组合物的药剂包括但不限于：氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗菌剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)、膨松剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填充剂、单糖、二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(如游离血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐的抗衡离子(如钠)、防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、苯甲酸甲酯、苯甲酸丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(如多聚物；PEG；山梨醇酯；聚山梨酯，如聚山梨酯20或聚山梨酯80；Triton；色胺；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))，稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)，弹性增强剂(如碱金属卤化物，如氯化钠或氯化钾，或甘露醇山梨醇)，输送载体，稀释剂，赋形剂和/或药物佐剂。
肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏(Ringer's)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸林格氏。可包括适当的生理上可接受的增稠剂，如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐。静脉注射剂包括液体和营养物质补充剂和电解质补充剂，如那些基于林格氏葡萄糖的补充剂。在某些情况下，载体可能包括调整组合物弹性的药剂，例如糖类；多元醇如甘露醇、山梨醇；或药物组合物中的氯化钠。例如，在许多情况下，希望该组合物基本上为等渗的。组合物也可以含有防腐剂和其他添加剂，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。精确的配方由给药途径决定。其他相关的制药配方的原理、方法和成分是众所周知的(例如，见Allen,Loyd V.Ed,(2012)Remington's Pharmaceutical Sciences,22nd Edition)。
本发明的药物组合物可以通过一种或多种给药途径，使用本领域已知的各种方法中的一种或多种给药。正如本领域技术人员所熟知的，给药途径和/或方式将根据所需结果而变化。本发明的药物组合物的给药途径包括静脉注射、肌肉注射、皮内注射、腹膜内注射、皮下注射、脊髓注射或其他肠外给药途径，例如注射或输注。本文所用的“肠外给药”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常是通过注射完成，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸腔内注射和输注。在一个实施方案中，所述药物组合物为在瘤内给药。当考虑到肠外给药时，药物组合物通常以无菌、无热原、肠外可接受的组合物形式出现。特别适合于肠外注射的载体是无菌的、等渗的、适当保存的溶液。所述药物组合物可以是冻干物的形式，如冻干饼。
另外，本文所述的药物组合物可以通过非肠道途径给药，如局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。
在某些实施方案中，所述药物组合物用于皮下给药。本领域已知用于多肽治疗剂(如抗体、融合多肽等)皮下给药的合适的制剂成分和方法，例如见US2011/0044977、US8465739和US8476239。通常，用于皮下给药的药物组合物含有合适的稳定剂(如氨基酸，如蛋氨酸和或糖类；如蔗糖)、缓冲剂和补强剂。
通常，在细胞治疗中，通过静脉注射将包含宿主细胞的组合物给予患者。
用途和方法
本发明的融合多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物可以给受试者服用，并可用于疾病的治疗、预防和/或延缓疾病症状的发生。
因此，本发明提供了本发明融合多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物在治疗或作为药物中的用途。本发明进一步提供了本发明融合多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物用于治疗病理性疾病。本发明还提供了本发明融合多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物在制备治疗病理性疾病的药物中的应用。本发明进一步提供了一种治疗患有病理性疾病的患者的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的融合多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物。
如本文所用，术语“病理性疾病”包括癌症，包括但不限于固体肿瘤癌；软组织肿瘤；转移性病变和血液癌；例如，所述癌症可为肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、结肠癌、肾癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌症、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金(Hodgkin's)病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺的癌症、甲状旁腺的癌症、肾上腺的癌症、软组织的肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病，儿童实体肿瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、血管生成肿瘤、脊柱轴瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏(Kaposi's)肉瘤、表皮癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓性白血病-慢性期(CMLCP)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、肝细胞癌(HCC)、胃肠道间质瘤(GIST)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈鳞细胞癌(SCCHN)；环境诱发的癌症，包括由石棉诱发的癌症；以及上述癌症的组合。特别地，所述癌症可以为乳腺癌，如雌激素受体阳性(ERpos)的乳腺癌和/或乳腺癌的转移形式。
在一个实施方案中，癌症是一种实体瘤癌症。在一个实施方案中，病理性疾病的治疗涉及针对非肿瘤细胞，如肿瘤相关的基质细胞。这种肿瘤相关基质细胞的实施例类型包括胰腺基质细胞。其他可作为目标的非肿瘤细胞类型包括巨噬细胞、调节性T细胞和骨髓源性抑制细胞。
在一个实施方案中，病人已经用化疗药物进行了预处理。
在一个实施方案中，与未经治疗的肿瘤相比，向患者施用宿主细胞可使肿瘤大小减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％。
给予专利的宿主细胞的数量应考虑到给药途径、所治疗的癌症、病人的体重和/或病人的年龄。一般来说，约1×106至约1×1011细胞施用于病人。在一个实施方案中，约1×107至约1×1010细胞，或约1×108至约1×109细胞施用于病人。
常规
序列同一性可以通过标准方法确定，这些方法通常用于比较两个多肽的氨基酸位置的相似性。使用如BLAST、FASTA或Clustal Omega的计算机程序对两个多肽进行比对，以实现其各自氨基酸的最佳匹配(沿着一个或两个序列的全长或沿着一个或两个序列的预定部分)。这些程序提供了一个默认的缺口罚分和一个默认的间隙罚分，以及一个评分矩阵，如PAM 250[一个标准的评分矩阵；见Dayhoff et al.,in Atlas of Protein SequenceandStructure,vol.5,supp.3(1978)]可以和计算机程序一起使用。例如，同一性的百分比可以计算为：相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配的跨度内较长序列的长度和为了对齐两个序列而引入较长序列的空隙数之和。
在本说明书的整体描述和权利要求中，“包括”和“包含”以及这些词的变化，例如“包含”意味着“包括但不限于”，并且不排除其他成分、整数或步骤。此外，除非上下文另有要求，否则单数包括复数：特别是在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则本说明书应理解为考虑到多数和单数。
与数值x有关的术语“约”是指，例如，x+5％。
本发明的每个方面的特征可如描述为与其他任何方面有关。在本申请的范围内，明确表示前面各段、权利要求书和/或以下描述和附图中列出的各方面、实施方案、实施例和备选方案，特别是其各个特征，可以独立或以任何方式组合。也就是说，所有的实施方案和/或任何实施方案的特征可以以任何方式组合和/或结合，除非这些特征不相容。
具体实施方案
常规方法
T细胞的分离和逆转录病毒的转导
通过密度介导的离心法从健康志愿者的血样中分离出外周血单核细胞(PBMCs)。使用抗CD3和抗CD28涂层顺磁珠以1:2的T细胞:磁珠比率活化T细胞48小时。将1×106T细胞接种于经3mL逆转录病毒上清液预处理的逆转录酶结合蛋白涂层板上。随后用3mL新鲜病毒上清液和100IU/mL IL-2处理每个孔。用稳定的长臂猿白血病病毒(GALV)假型93TVec稳定包装细胞产生的病毒颗粒进行逆转录病毒转导。此后，T细胞以100IU/mL的量在RPMI1640培养基+5％正常人AB血清中培养，每周三次提供新鲜培养基和IL-2(100IU/mL)。
流式细胞术
通过流式细胞术对293T细胞的T细胞转导和转染进行评估，并与合适的同型对照进行比较。为了评估基于NKG2D的构建体的表达，用小鼠抗人CD4-FITC、小鼠抗人NKG2D-PE和小鼠抗人CD8-APC对细胞进行染色，并进行适当补偿。由于内源性NKG2D在CD8+T细胞中的高水平表达，因此与未转导的CD4+T细胞中的NKG2D表达进行了转导效率的比较。使用生物素化山羊抗人EGF和PE结合链霉亲和素评估panErbB特异性T4和TMY CAR的表达。通过与使用相同试剂染色的N1012+T细胞进行比较，计算转导效率。在使用之前，通过将未转化T细胞的必要比例增加，使构建体之间的转导效率正常化。这确保了CAR+T细胞总数和总T细胞浓度的所有条件都是相同的。
为了进行细胞内染色，在室温下将转染的293T细胞固定在4％甲醛中10分钟，然后在渗透溶液(PBS+0.5％BSA+0.1％皂甙)中洗涤两次。随后，在100μL渗透溶液存在下，用500ng PE结合抗人NKG2D或合适的同型对照对细胞进行染色。在流式细胞仪分析之前，在渗透溶液中进一步洗涤细胞两次。
剂量反应分析
以每孔(100μL)将1×104肿瘤细胞接种在96孔板上，并在37℃和5％CO2下培养过夜。24小时后，以1:1至1:64的对数CAR T细胞：肿瘤细胞比率添加T细胞。72小时后，移除T细胞并添加100μL MTT溶液(500μg/mL)，然后在37℃和5％CO2下培养平板约1小时。去除MTT溶液后，将所得的福尔马赞晶体溶解在DMSO(100μL/孔)中，并在560nm处测量吸光度。肿瘤细胞活性的计算如下：(含T细胞单层的吸光度/不含T细胞单层的吸光度)*100。
再刺激试验
将1×105肿瘤细胞置于24孔板的三个孔中，并在37℃和5％CO2下培养24小时。24小时后，每孔加入1mL含1×105CAR+T细胞。72小时后，轻轻移除T细胞，并用1mL PBS清洗孔。去除PBS后，向每个孔中加入1mL MTT(最终浓度为500μg/mL)，并在37℃和5％CO2下培养平板约1小时。在560nm处的测量合适的孔中的吸光度，并按照“剂量反应”部分的详细说明计算肿瘤细胞存活率。如果肿瘤细胞存活率低于50％，则认为再刺激是成功的。
将从培养皿中取出的T细胞在400×g下离心5分钟，并去除上清液。将该沉淀重新悬浮于3.2mL R5培养基中，并将1mL以一式三份的形式添加到每孔新鲜肿瘤单层(24孔板的，每孔1×105个肿瘤细胞)中。通过对剩余200μL一小部分进行台盼蓝拒染法(trypanblue exclusion)来评估T细胞总数。
ELISA
分别使用Duo-set和Ready-Staddy-Go ELISA试剂盒，在共培养开始24小时后去除的上清液中评估T细胞分泌IFN-γ和IL-2的情况。
肿瘤球状体生成
为了生成肿瘤球状体，在超低亲和力96孔板的每个孔中加入1×103肿瘤细胞和1×103PS1星状细胞，并在37℃和5％CO2下培养72小时。通过标准光学显微镜观察确认球状体的生成。
体内
将1×105萤火虫荧光素酶(ffLUC)标记的B×PC3细胞注射到NSG小鼠腹腔内。肿瘤接种12天后，小鼠(每组5只)腹腔注射PBS、4×106(N1012+(N1012(lo))、T4+或TMY+CAR T细胞)或1×107(N1012(hi)或NKG2D)CAR+T细胞。或者，NSG小鼠腹腔接种1×106ffLUC标记的H226恶性间皮瘤细胞。肿瘤接种8天后，小鼠接受PBS或4×106N1012+T细胞治疗。作为对照，一组小鼠单独用表达NKG2D的4×106T细胞治疗。
BLI监测肿瘤生长，所有数据以每次治疗的总流量(光子/秒)或平均总流量(光子/秒)表示。对小鼠进行密切监测，每周称重三次，以确定其健康状况不佳的迹象。
实施例1：在293T细胞中表达NKG2D和DAP10/12融合蛋白
2293T细胞转染含有DAP10/12融合蛋白N1012或NKG2D表达盒的SFG逆转录病毒质粒骨架。N1012(SEQ ID NO:64)包含含有根据本发明的外源性人NKG2D蛋白和融合外源性DAP10/12同源二聚体的复合物。N1012质粒包含SEQ ID NO:74，其编码如SEQ ID NO:64所示的序列。72小时后通过流式细胞术检测NKG2D的表面表达。尽管在转染N1012质粒的293T细胞表面很容易检测到NKG2D表达，但在转染编码对照NKG2D质粒的细胞表面未检测到NKG2D表达(图2，上栏)。鉴于NKG2D表面表达依赖于DAP10的表达，NKG2D表面表达的缺乏可以解释为NKG2D质粒中没有DAP10共表达。为了证实NKG2D转染的293T细胞表面NKG2D表达缺失并非由于转染不良导致，对NKG2D的存在进行了细胞内染色。关键地，在转染N1012或NKG2D质粒的293T细胞中观察到NKG2D的细胞内表达(图2，下栏)。这证明了从两种结构中成功表达NKG2D，也证实了DAP10共表达对实现NKG2D表面表达的必要。
实施例2：N1012和NKG2D在原代人T细胞中的表达
用涂有抗人CD3和抗人CD28抗体的顺磁珠活化原代人T细胞。活化48小时后，通过逆转录病毒转导将T细胞工程化，以表达N1012或NKG2D。通过流式细胞术、CD4和CD8联合染色检测NKG2D的表面表达。将NKG2D的百分比表达(图3的A)和中值荧光强度(MFI，图3的B)与未转化的T细胞进行比较。由于NKG2D在CD8+T细胞中的内源性表达，数据在CD4+T细胞上进行门控。如图所示，与UT T细胞或表达对照CAR的T细胞相比，NKG2D和N1012构建体在原代人类T细胞表面以高水平重复表达(图4)。
实施例3：N1012 T细胞对靶细胞破坏和识别的评估
为了评估细胞溶解能力，N1012+T细胞与11种不同的人类肿瘤细胞系共培养，这些细胞系代表5种不同的肿瘤类型(间皮瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌和乳腺癌)，或与不同E:T比率的肿瘤相关基质细胞(PS1)共培养。72小时后，移除T细胞，并进行MTT试验以评估肿瘤细胞的存活率。然而，当靶细胞与UT T细胞或表达NKG2D的T细胞共培养时，观察到肿瘤存活率的降低最小，即使在低E:T比率下(图5、7A和B)，N1012+T细胞对所有靶细胞系表现出有效的裂解。通过ELISA对共培养上清液的分析表明，N1012+T细胞大量分泌干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-2(IL-2)，但UT T细胞或表达对照NKG2D结构的细胞均未分泌干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-2(IL-2)(图6A和B)。这些数据证明了N1012+T细胞识别和裂解多种肿瘤类型的能力，包括肿瘤相关基质细胞。
实施例4：N1012 T细胞破坏肿瘤细胞和基质细胞共培养的范例
为了确定N1012+T细胞在基质细胞存在下生长时是否保留溶解肿瘤细胞的能力，将其与同时含有肿瘤细胞和基质细胞的单层细胞共培养。为了实现这一点，将5×104肿瘤细胞和5×104PS1星状细胞混合并接种在24孔板的三个孔中。24小时后，加入1×105T细胞，并将平板培养72小时。随后移除T细胞，并通过如实施例3所述的MTT法评估肿瘤细胞和基质细胞单层的存活率。N1012+T细胞可有效溶解肿瘤细胞和基质细胞，但与NKG2D或UT T细胞(图7的C-D)共培养时，靶细胞存活率略有降低。N1012+T细胞和表达A2028z CAR介导的等效裂解B×PC3_LT细胞均在分离培养中生长。a2028zCAR是一款靶向αvβ6整合素的pCAR。该CAR的靶向部分由VPI衍生的A20FMDV2 20mer肽(SEQ ID NO:80)组成，该肽与αvβ6整合素结合。其位于CD124信号肽的下游(Uniprot索引P24394的aa1-25，SEQ ID NO:81)。靶向部分通过AAA连接体与CD28的部分胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域(aa114-220，Uniprot索引P10747，SEQ ID NO:82)融合，其中CD28的B7结合残基(aa117-122)由人c-myc(Uniprot索引P01106，SEQ ID NO:52)的aa410-419取代。它与CD247的aa52-164(Uniprot索引P20963，SEQID NO:83)融合。
相比之下，虽然N1012+T细胞对包含B×PC3_LT肿瘤细胞和PS1星状细胞的单层细胞维持有效溶解，但A2028z T细胞的功效(图7的E-F)和细胞因子分泌(图7的G-H)显著降低。
实施例5：N1012 T细胞破坏肿瘤球状体的范例
为了评估N1012+T细胞在3D系统中介导靶细胞裂解的能力，将其与肿瘤球状体共培养。在球状体生成后，每孔添加6×103CellTracker紫罗兰标记的T细胞。在72小时和192小时后，分别通过测量GFP和RFP，使用荧光显微镜评估肿瘤细胞和星状细胞的存活率。使用Image J软件对GFP和RFP信号进行量化，并表示为在没有T细胞的情况下生长的球状体荧光读数的百分比。在N1012+T细胞中观察到球状体的有效溶解，但在NKG2D或UT T细胞中均未观察到(图7的I-J)。此外，只有N1012+T细胞显示出IFN-γ分泌(图7的K)。
用流式细胞术交替评估球状体存活率和T细胞增殖。为了实现这一点，在加入T细胞72或192小时后，从培养皿中取出球状体，并将其放入流式细胞仪管中，在同一管中加入多达五个经相同CAR T细胞处理的球状体。使用Accutase溶液和通过移液管尖端的剧烈重悬来实现球状体解聚。所得单细胞悬浮液在RPMI1640培养基+5％正常人AB血清中洗涤，随后重悬在含有计数珠的PBS中。在每根试管中采集相同数量的计数珠，并测定由此产生的肿瘤细胞(通过GFP和RFP荧光评估)和T细胞(通过CellTracker紫荧光评估)数量。数据显示在没有T细胞的情况下生长的球状体中存在的GFP和RFP细胞总数的百分比。
实施例6：N1012 T细胞识别序列目标的范例
为了评估N1012+T细胞对靶细胞进行连续裂解(“再刺激”)的能力，每周将其与新鲜单层共培养两次，直到未观察到单层破坏。UT或NKG2D+T细胞介导了最小的靶细胞破坏，没有显示出增殖的证据，而N1012+T细胞通过多轮再刺激(图8A-B)介导了有效的溶解。靶细胞破坏也与N1012+T细胞的大量增殖和扩张有关(图8C-D)。
与CYAD-01NKG2D CAR和对照T细胞相比，N1012+T细胞在B×PC3_LT细胞上经历了明显更多轮的再刺激(图14的A)。此外，N1012+T细胞的增殖也明显高于CYAD-01T细胞或对照组(图14的B)。
实施例7：N1012 T细胞在胰腺癌活体模型中的功效
为了确定N1012+T细胞在体内靶向肿瘤细胞的能力，产生了表达N1012、NKG2D的T细胞或两次不同的泛ErbB靶向CAR(T4和TMY)迭代。以1:1的比例(图9B)共培养72小时后，针对三种细胞系，证实了在体外的原代人T细胞内的各种构建体的表达(图9A)和T细胞的功效。为了评估体内功能，在NSG小鼠中建立了为期12天的腹腔内萤火虫荧光素酶(ffLUC)标记的B×PC3肿瘤。荷瘤小鼠腹腔注射PBS、4×106(N1012(lo)、T4或TMY)T细胞或1×107(N1012(hi)或NKG2D)转导的T细胞。通过生物发光成像每周测量肿瘤生长，小鼠每周称重三次。数据显示为每个治疗组的平均总通量(光子/秒)(图10A)或每个小鼠的总通量(光子/秒)(图10B)。接受NKG2D+、T4+或TMY+T细胞的小鼠的肿瘤负担与接受PBS的小鼠相同，表明缺乏疗效。相比之下，分别用N1012(lo)或N1012(hi)治疗的2/5小鼠和4/5小鼠的肿瘤被完全根除。在T细胞给药76天后，这些小鼠仍然保持没有肿瘤。通过测量体重的百分比变化进行评估时，未观察到任何毒性迹象(图10C)。
为了确定N1012+T细胞是否能在NSG小鼠体内移植并提供免疫记忆，那些完全排斥肿瘤的小鼠在初次肿瘤接种88天后(T细胞输注后76天)接受第二次腹腔接种1×105ffLUC标记的B×PC3细胞。虽然BLI在肿瘤再次刺激24小时后观察到发光增加，但4/5小鼠随后显示肿瘤大小显著减小，因此表明N1012+T细胞(图10D)再次活化。实验在145天后结束，并生成存活曲线，证实N1012 T细胞具有强大的抗肿瘤功效(图10E)。
为了进一步证实N1012+T细胞对体内胰腺癌模型的疗效，进行了重复实验。接种1×105ffLUC标记的B×PC3细胞12天后，将1×107CAR+或未转化T细胞的对照腹腔注射到NSG小鼠体内。通过生物发光成像每周监测肿瘤生长，数据显示为每个治疗组的平均总通量(光子/秒)(图11A)和每个小鼠的总通量(光子/秒)(图11B)。在N1012+T细胞治疗的小鼠中再次观察到显著且持续的肿瘤消退。事实上，在用N1012+T细胞治疗的5/6小鼠中，肿瘤完全根除。相比之下，接受UT T细胞治疗的小鼠的肿瘤生长动力学与接受PBS治疗的小鼠相同。这些数据证实，肿瘤根除是N1012+特异性的。
为了研究记忆性T细胞的潜在形成，在第41天(T细胞输注后29天)无肿瘤的小鼠注射1×105ffLUC标记的B×PC3新鲜细胞团进行再刺激。在第42天对小鼠进行成像，以确认肿瘤的发生。随后的成像显示，5/5再刺激小鼠将肿瘤负担降低到检测不到的程度，其中3/5小鼠显示出长期肿瘤控制(图11B)。这些数据表明，N1012 CAR T细胞能够形成记忆，并在靶细胞重新出现时重新活化。
实施例8：N1012 T细胞在恶性间皮瘤体内模型中的功效
为了证实N1012在另一个体内模型中的疗效，NSG小鼠腹腔接种1×106ffLUC标记的H226恶性间皮瘤细胞。肿瘤接种8天后，小鼠接受PBS或4×106N1012+T细胞治疗。作为对照，一组小鼠单独用表达NKG2D的4×106T细胞治疗。通过生物发光成像每周监测肿瘤生长，数据显示为每次治疗的平均总通量(光子/秒)(图12A)和每只小鼠的总通量(光子/秒)(图12B)。在接受PBS的小鼠中观察到肿瘤持续生长，而在接受N1012+T细胞的小鼠中观察到100％的肿瘤清除。
为了确认T细胞的持久性和功能的维持，在初始肿瘤接种91天后，所有无肿瘤小鼠腹腔注射额外的1×106ffLUC标记的H226细胞。24小时后，通过生物发光成像证实所有小鼠均出现肿瘤。所有再次刺激的小鼠都不产生肿瘤，证实了N1012+T细胞的持久性以及这些T细胞介导长期肿瘤控制的能力。
实施例9：N1012 T细胞与CYAD-01T细胞的比较
比较N1012 T细胞与CYAD-01T细胞的再刺激和增殖潜能。如前所述，CYAD-01CAR由NKG2D与CD3ζ(Zhang et al,2005,Blood 106:1544-1551)的融合组成。虽然名义上是第一代CAR，但它与T细胞中的内源性DAP10相关，这意味着信号1和2都要提供。Celyad S.A.目前正在对该CAR进行临床开发，其名称为CYAD-01，因此在这些实施例中提供该CAR仅用于比较。
当通过流式细胞术进行评估时，CYAD-01的表面表达在原代人类T细胞中得到证实(图13)。
简而言之，每周两次将N1012或CYAD-01T细胞与新鲜单层共培养，直到未观察到单层破坏。为了实现这一点，将1×105肿瘤细胞置于24孔板的三个孔中，并在37℃和5％CO2下培养24小时。24小时后，在每个孔中加入最终浓度为1×105CAR+/mL的1×105CAR+T细胞。72小时后，轻轻移除T细胞，并用1mL PBS清洗孔。去除PBS后，向每个孔中加入1mL MTT(最终浓度为500μg/mL)，并在37℃和5％CO2下培养平板约1小时。按照上述详细说明数板并计算肿瘤细胞存活率。如果肿瘤细胞存活率低于50％，则认为再刺激是成功的。
为了研究T细胞增殖对靶细胞识别的反应，将从培养板上移除的T细胞在400×g下进行5分钟的旋转培养，并移除上清液。将该沉淀重新悬浮于3.2mL R5培养基中，并向每个新鲜肿瘤单层孔中加入1mL，一式三份。通过对剩余200μL的一小部分进行台盼蓝拒染法来评估T细胞总数。
与CYAD-01、NKG2D CAR和对照T细胞相比，N1012+T细胞在B×PC3_LT细胞(图14的A)上经历了明显更多轮的再刺激。此外，N1012 T细胞的增殖也明显高于CYAD-01T细胞或对照组(图14的B)。
当与肿瘤球状体共培养时，观察到N1012+T细胞的球状体存活率显著降低，但UT对照T细胞和表达功能性CYAD-01CAR的细胞的存活率均未显著降低(图15A)。与UT或CYAD-01T细胞相比，N1012 T细胞也显示出显著的增殖(图15B)。
SEQ ID NO:1(人DAP10全序列)
MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVASLLIVGAVFL CARPRRSPAQ EDGKVYINMP GRG
SEQ ID NO:2(DAP10 aa19-93-缺乏引导序列)
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLCARPRRSPAQEDGKVYIN MPGRG
SEQ ID NO:3(DAP10 aa19-69-胞外/跨膜结构域)
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV F
SEQ ID NO:4(DAP10 aa1-71)
MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVASLLIVGAVFL C
SEQ ID NO:5(DAP10 aa19-71)
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLC
SEQ ID NO:6(DAP10 aa70-93-胞内结构域)
LCARPRRSPA QEDGKVYINM PGRG
SEQ ID NO:7(DAP10 aa49-93-跨膜和胞内结构域)
LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLCARPRRSP AQEDGKVYIN MPGRG
SEQ ID NO:8(DAP10 aa49-69-跨膜结构域)
LLAGLVAADA VASLLIVGAV F
SEQ ID NO:9(人DAP12全序列)
MGGLEPCSRL LLLPLLLAVS GLRPVQAQAQ SDCSCSTVSP GVLAGIVMGD LVLTVLIALAVYFLGRLVPR GRGAAEAATR KQRITETESP YQELQGQRSD VYSDLNTQRP YYK
SEQ ID NO:10(DAP12 aa22-113-缺乏引导序列)
LRPVQAQAQS DCSCSTVSPG VLAGIVMGDL VLTVLIALAV YFLGRLVPRG RGAAEAATRKQRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YK
SEQ ID NO:11(DAP12 aa62-113-细胞质/胞内结构域)
YFLGRLVPRG RGAAEAATRK QRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YK
SEQ ID NO:12(DAP12 aa41-61-跨膜结构域)
GVLAGIVMGD LVLTVLIALA V
SEQ ID NO:13(DAP12 aa22-61-胞外和跨膜结构域)
LRPVQAQAQS DCSCSTVSPG VLAGIVMGDL VLTVLIALAV
SEQ ID NO:14(人NKG2D全序列)
MGWIRGRRSR HSWEMSEFHN YNLDLKKSDF STRWQKQRCP VVKSKCRENA SPFFFCCFIAVAMGIRFIIM VAIWSAVFLN SLFNQEVQIP LTESYCGPCP KNWICYKNNC YQFFDESKNW YESQASCMSQNASLLKVYSK EDQDLLKLVK SYHWMGLVHI PTNGSWQWED GSILSPNLLT IIEMQKGDCA LYASSFKGYIENCSTPNTYI CMQRTV
SEQ ID NO:15(人NKG2D aa73-216-胞外结构域)
IWSAVFLNSL FNQEVQIPLT ESYCGPCPKN WICYKNNCYQ FFDESKNWYE SQASCMSQNASLLKVYSKED QDLLKLVKSY HWMGLVHIPT NGSWQWEDGS ILSPNLLTII EMQKGDCALY ASSFKGYIENCSTPNTYICM QRTV
SEQ ID NO:16(人NKG2D aa82-216-胞外结构域)
LFNQEVQIPL TESYCGPCPK NWICYKNNCY QFFDESKNWY ESQASCMSQN ASLLKVYSKEDQDLLKLVKS YHWMGLVHIP TNGSWQWEDG SILSPNLLTI IEMQKGDCAL YASSFKGYIE NCSTPNTYICMQRTV
SEQ ID NO:17(人NKG2D aa52-216-跨膜和胞外结构域)
PFFFCCFIAV AMGIRFIIMV AIWSAVFLNS LFNQEVQIPL TESYCGPCPK NWICYKNNCYQFFDESKNWY ESQASCMSQN ASLLKVYSKE DQDLLKLVKS YHWMGLVHIP TNGSWQWEDG SILSPNLLTIIEMQKGDCAL YASSFKGYIE NCSTPNTYIC MQRTV
SEQ ID NO:18(连接子)
GSG
SEQ ID NO:19(连接子)
GSGGG
SEQ ID NO:20(连接子)
GSGG
SEQ ID NO:21(连接子)
SGGG
SEQ ID NO:22(连接子)
GGGGS
SEQ ID NO:23(连接子)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
SEQ ID NO:24(连接子)
GGGGSGGGGS GGGGS
SEQ ID NO:25(连接子)
GPPGS
SEQ ID NO:26(连接子)
GGGS
SEQ ID NO:27(连接子)
GGGGS
SEQ ID NO:28(连接子)
GYS
SEQ ID NO:29(连接子)
GS
SEQ ID NO:30(连接子)
SGGGG
SEQ ID NO:31(连接子)
SGGG
SEQ ID NO:32(连接子)
SGG
SEQ ID NO:33(连接子)
SGSG
SEQ ID NO:34(连接子)
SG
SEQ ID NO:35(连接子)
GGGGA
SEQ ID NO:36(连接子)
GGGA
SEQ ID NO:37(连接子)
EAAAK
SEQ ID NO:38(呋喃酶裂解位点)
RRKR
SEQ ID NO:39(P2A核糖体跳肽)
ATNFSLLKQA GDVEENPGP
SEQ ID NO:40(T2A核糖体跳跃肽)
EGRGSLLTCG DVEENPGP
SEQ ID NO:41(SGSG+P2A)
SGSGATNFSL LKQAGDVEEN PGP
SEQ ID NO:42(SGSG+T2A)
SGSGEGRGSL LTCGDVEENP GP
SEQ ID NO:43(弗林蛋白酶裂解位点+SGSG+P2A)
RRKRSGSGAT NFSLLKQAGD VEENPGP
SEQ ID NO:44(弗林蛋白酶裂解位点+SGSG+T2A)
RRKRSGSGEG RGSLLTCGDV EENPGP
SEQ ID NO:45(F2A核糖体跳跃肽)
VKQTLNFDLL KLAGDVESNP GP
SEQ ID NO:46(E2A核糖体跳跃肽)
QCTNYALLKL AGDVESNPGP
SEQ ID NO:47(His标签)
HHHHHH
SEQ ID NO:48(FLAG标签)
DYKDDDDK
SEQ ID NO:49(Avi标签)
GLNDIFEAQK IEWHE
SEQ ID NO:50(V5标签)
GKPIPNPLLG LDST
SEQ ID NO:51(V5标签)
IPNPLLGLD
SEQ ID NO:52(Myc标签)
EQKLISEEDL
SEQ ID NO:53(AHF标签)
GLNDIFEAQK IEWHEGGHHH HHHDYKDDDD K
SEQ ID NO:54(FHA标签)
DYKDDDDKHH HHHHGGGLND IFEAQKIEWH E
SEQ ID NO:55(CD8α引导序列)
MALPVTALLL PLALLLHAAR P
SEQ ID NO:56(4-1BB胞内结构域)
KRGRKKLLYI FKQPFMRPVQ TTQEEDGCSC RFPEEEEGGC EL
SEQ ID NO:57(CD27胞内结构域)
QRRKYRSNKG ESPVEPAEPC HYSCPREEEG STIPIQEDYR KPEPACSP
SEQ ID NO:58(人IgG1铰链)
EPKSCDKTHT CP
SEQ ID NO:59(截短CD8α铰链)
TTTPAPRPPT PAPTIASQPL SLRPEACRPA AGGAVHTRGL DFACD
SEQ ID NO:60
Figure BDA0003645901330000341
SEQ ID NO:61
Figure BDA0003645901330000351
SEQ ID NO:62
Figure BDA0003645901330000352
SEQ ID NO:63
Figure BDA0003645901330000353
SEQ ID NO:64(构建体1/N012)
Figure BDA0003645901330000354
SEQ ID NO:65(构建体3)
Figure BDA0003645901330000355
SEQ ID NO:66(构建体8)
Figure BDA0003645901330000356
Figure BDA0003645901330000361
SEQ ID NO:67(构建体9)
Figure BDA0003645901330000362
SEQ ID NO:68(构建体10)
Figure BDA0003645901330000363
SEQ ID NO:69(构建体11)
Figure BDA0003645901330000364
Figure BDA0003645901330000371
SEQ ID NO:70(编码SEQ ID NO:60多肽)
Figure BDA0003645901330000372
SEQ ID NO:71(编码SEQ ID NO:61多肽)
Figure BDA0003645901330000373
SEQ ID NO:72(编码SEQ ID NO:62多肽)
Figure BDA0003645901330000374
SEQ ID NO:73(编码SEQ ID NO:63多肽)
Figure BDA0003645901330000375
SEQ ID NO:74(编码SEQ ID NO:64多肽/构建体1/N1012)
Figure BDA0003645901330000376
Figure BDA0003645901330000381
SEQ ID NO:75(编码SEQ ID NO:65多肽/构建体3)
Figure BDA0003645901330000382
SEQ ID NO:76(编码SEQ ID NO:66多肽/构建体8)
Figure BDA0003645901330000383
Figure BDA0003645901330000391
SEQ ID NO:77(编码SEQ ID NO:67多肽/构建体9)
Figure BDA0003645901330000392
SEQ ID NO:78(编码SEQ ID NO:68多肽/构建体10)
Figure BDA0003645901330000393
Figure BDA0003645901330000401
SEQ ID NO:79(编码SEQ ID NO:69多肽/构建体11)
Figure BDA0003645901330000402
SEQ ID NO:80(A20FMDV2多肽)
NAVPNLRGDL QVLAQKVART
SEQ ID NO:81(CD124单肽)
MGWLCSGLLF PVSCLVLLQV ASSGN
SEQ ID NO:82(CD28 aa114-220)
IEVMYPPPYL DNEKSNGTII HVKGKHLCPS PLFPGPSKPF WVLVVVGGVL ACYSLLVTVAFIIFWVRSKR SRLLHSDYMN MTPRRPGPTR KHYQPYAPPR DFAAYRS
SEQ ID NO:83(CD247 aa52-164)
RVKFSRSADA PAYQQGQNQL YNELNLGRRE EYDVLDKRRG RDPEMGGKPR RKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGER RRGKGHDGLY QGLSTATKDT YDALHMQALP PR
SEQ ID NO:84(WO 2019/182425的SEQ ID NO:1)
MGWSCIILFL VATATGVHSQ IQLVQSGPEL KKPGETVKIS CKTSGYTFTD YSMHWVNQAPGKGLKWMGWI NTETGEPTYT DDFKGRFAFS LETSASTAYL QINNLKNEDT ATYFCARTAV YWGQGTTLTVSSGSTSGSGK PGSGEGSDIQ MTQSPSSLSA SLGERVSLTC RASQEISGSL SWLQQKPDGT IKRLIYAASTLNSGVPKRFS GRRSGSDYSL TISSLESEDF VDYYCLQYSS YPWSFGGGTK LEIKEPKSPD KTHTCPPCPSHTQPLGVFLF PPKPKDQLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVLHEALH NHYTQKSLSLSLGKFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VARPRRSPAQ EDGKVYINMP GRGGRLVPRG RGAAEAATRKQRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YKRVKFSRSADAPAYQQGQN QLYNELNLGR REEYDVLDKRRGRDPEMGGK PQRRKNPQEG LYNELQKDKM AEAYSEIGMK
SEQ ID NO:85(WO 2019/182425的SEQ ID NO:9)
ARPRRSPAQE DGKVYINMPG RG
SEQ ID NO:86(WO 2019/182425的SEQ ID NO:11)
GRLVPRGRGA AEAATRKQRI TETESPYQEL QGQRSDVYSD LNTQRPYYK
SEQUENCE LISTING
<110> 伦敦国王学院
<120> DAP10/DAP12融合多肽
<130> P22111550WP
<150> GB1913697.7
<151> 2019-09-23
<160> 86
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 93
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 1
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
85 90
<210> 2
<211> 75
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 2
Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu
20 25 30
Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly
35 40 45
Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp
50 55 60
Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
65 70 75
<210> 3
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 3
Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu
20 25 30
Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly
35 40 45
Ala Val Phe
50
<210> 4
<211> 71
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 4
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys
65 70
<210> 5
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 5
Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu
20 25 30
Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly
35 40 45
Ala Val Phe Leu Cys
50
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 6
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 7
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 7
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
1 5 10 15
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
20 25 30
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
35 40 45
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 8
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
1 5 10 15
Val Gly Ala Val Phe
20
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 9
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp
20 25 30
Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met
35 40 45
Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu
50 55 60
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
65 70 75 80
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
85 90 95
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr
100 105 110
Lys
<210> 10
<211> 92
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 10
Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr
1 5 10 15
Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu
20 25 30
Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro
35 40 45
Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr
50 55 60
Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys
85 90
<210> 11
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 11
Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala
1 5 10 15
Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu
20 25 30
Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg
35 40 45
Pro Tyr Tyr Lys
50
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 12
Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu
1 5 10 15
Ile Ala Leu Ala Val
20
<210> 13
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 13
Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr
1 5 10 15
Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu
20 25 30
Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val
35 40
<210> 14
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 14
Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser
1 5 10 15
Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr
20 25 30
Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu
35 40 45
Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly
50 55 60
Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn
65 70 75 80
Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys
85 90 95
Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln
100 105 110
Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met
115 120 125
Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp
130 135 140
Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile
145 150 155 160
Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro
165 170 175
Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr
180 185 190
Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr
195 200 205
Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
210 215
<210> 15
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 15
Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln
1 5 10 15
Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile
20 25 30
Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp
35 40 45
Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys
50 55 60
Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr
65 70 75 80
His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp
85 90 95
Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met
100 105 110
Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile
115 120 125
Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
130 135 140
<210> 16
<211> 135
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 16
Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly
1 5 10 15
Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe
20 25 30
Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser
35 40 45
Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu
50 55 60
Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro
65 70 75 80
Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn
85 90 95
Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala
100 105 110
Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr
115 120 125
Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
130 135
<210> 17
<211> 165
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 17
Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe
1 5 10 15
Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe
20 25 30
Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys
35 40 45
Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp
50 55 60
Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn
65 70 75 80
Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys
85 90 95
Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn
100 105 110
Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu
115 120 125
Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser
130 135 140
Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys
145 150 155 160
Met Gln Arg Thr Val
165
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<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 18
Gly Ser Gly
1
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 19
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 20
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 20
Gly Ser Gly Gly
1
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 21
Ser Gly Gly Gly
1
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 25
Gly Pro Pro Gly Ser
1 5
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 26
Gly Gly Gly Ser
1
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 28
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 28
Gly Tyr Ser
1
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<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 29
Gly Ser
1
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 30
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 31
Ser Gly Gly Gly
1
<210> 32
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 32
Ser Gly Gly
1
<210> 33
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 33
Ser Gly Ser Gly
1
<210> 34
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 34
Ser Gly
1
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ala
1 5
<210> 36
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 36
Gly Gly Gly Ala
1
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 37
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 38
Arg Arg Lys Arg
1
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<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 39
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 40
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 40
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 41
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 41
Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 42
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 42
Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 43
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 43
Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 44
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 44
Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 45
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 45
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 46
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 46
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 47
His His His His His His
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 48
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 49
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 50
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 51
Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp
1 5
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 52
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 53
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 53
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly
1 5 10 15
Gly His His His His His His Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20 25 30
<210> 54
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 54
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His His His Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
20 25 30
<210> 55
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 55
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 56
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 56
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 57
<211> 48
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 57
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 58
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10
<210> 59
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 59
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 60
<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 60
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Tyr Phe Leu
85 90 95
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
100 105 110
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
115 120 125
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr
130 135 140
Lys
145
<210> 61
<211> 132
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 61
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gln Thr Thr
20 25 30
Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly Thr Ser Gly
35 40 45
Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu
50 55 60
Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala Val Phe
65 70 75 80
Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala
85 90 95
Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu
100 105 110
Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg
115 120 125
Pro Tyr Tyr Lys
130
<210> 62
<211> 138
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 62
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Pro Lys
20 25 30
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala
35 40 45
Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala Val Phe Leu Cys
50 55 60
Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile
65 70 75 80
Asn Met Pro Gly Arg Gly Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly
85 90 95
Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr
100 105 110
Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser
115 120 125
Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys
130 135
<210> 63
<211> 171
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 63
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Thr Thr Thr
20 25 30
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
35 40 45
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
50 55 60
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Leu Leu Ala Gly Leu Val
65 70 75 80
Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala Val Phe Leu
85 90 95
Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr
100 105 110
Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg
115 120 125
Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu
130 135 140
Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr
145 150 155 160
Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys
165 170
<210> 64
<211> 388
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 64
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Tyr Phe Leu
85 90 95
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
100 105 110
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
115 120 125
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr
130 135 140
Lys Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Trp Ile
165 170 175
Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser Glu Phe His Asn
180 185 190
Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr Arg Trp Gln Lys
195 200 205
Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu Asn Ala Ser Pro
210 215 220
Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile
225 230 235 240
Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn
245 250 255
Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro
260 265 270
Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu
275 280 285
Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala
290 295 300
Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu
305 310 315 320
Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly
325 330 335
Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr
340 345 350
Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe
355 360 365
Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met
370 375 380
Gln Arg Thr Val
385
<210> 65
<211> 494
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 65
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gln Thr Thr
20 25 30
Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly Thr Ser Gly
35 40 45
Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu
50 55 60
Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala Val Phe
65 70 75 80
Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala
85 90 95
Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu
100 105 110
Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg
115 120 125
Pro Tyr Tyr Lys Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly
130 135 140
Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ile
145 150 155 160
His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala Ala Ala
165 170 175
Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly
180 185 190
Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu
195 200 205
Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly
210 215 220
Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp
225 230 235 240
Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Arg Arg Lys Arg Ser
245 250 255
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
260 265 270
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg
275 280 285
His Ser Trp Glu Met Ser Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys
290 295 300
Lys Ser Asp Phe Ser Thr Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val
305 310 315 320
Lys Ser Lys Cys Arg Glu Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe
325 330 335
Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp
340 345 350
Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro
355 360 365
Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr
370 375 380
Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu
385 390 395 400
Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr
405 410 415
Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp
420 425 430
Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp
435 440 445
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450 455 460
Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn
465 470 475 480
Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
485 490
<210> 66
<211> 527
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 66
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Tyr Phe Leu
85 90 95
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
100 105 110
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
115 120 125
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr
130 135 140
Lys Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Trp Ile
165 170 175
Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser Glu Phe His Asn
180 185 190
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Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu Asn Ala Ser Pro
210 215 220
Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile
225 230 235 240
Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn
245 250 255
Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro
260 265 270
Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu
275 280 285
Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala
290 295 300
Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu
305 310 315 320
Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly
325 330 335
Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr
340 345 350
Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe
355 360 365
Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met
370 375 380
Gln Arg Thr Val Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly
385 390 395 400
Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ile
405 410 415
His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala Ala Ala
420 425 430
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435 440 445
Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu
450 455 460
Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly
465 470 475 480
Ala Val Phe Leu Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
485 490 495
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Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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<211> 538
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 67
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1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Tyr Phe Leu
85 90 95
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
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130 135 140
Lys Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
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165 170 175
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180 185 190
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Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile
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Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn
245 250 255
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Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu
275 280 285
Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala
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Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu
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325 330 335
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340 345 350
Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe
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Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met
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Gln Arg Thr Val Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly
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Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala
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Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys
450 455 460
Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala
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Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala Val Phe Leu Cys
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<211> 533
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 68
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
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Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
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Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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180 185 190
Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr Arg Trp Gln Lys
195 200 205
Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu Asn Ala Ser Pro
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Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile
225 230 235 240
Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn
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Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro
260 265 270
Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu
275 280 285
Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala
290 295 300
Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu
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Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly
325 330 335
Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr
340 345 350
Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe
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370 375 380
Gln Arg Thr Val Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly
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Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly
435 440 445
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Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly
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530
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<211> 544
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 69
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1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
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130 135 140
Lys Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Trp Ile
165 170 175
Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser Glu Phe His Asn
180 185 190
Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr Arg Trp Gln Lys
195 200 205
Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu Asn Ala Ser Pro
210 215 220
Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile
225 230 235 240
Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn
245 250 255
Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro
260 265 270
Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu
275 280 285
Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala
290 295 300
Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu
305 310 315 320
Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly
325 330 335
Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr
340 345 350
Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe
355 360 365
Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met
370 375 380
Gln Arg Thr Val Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly
385 390 395 400
Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala
405 410 415
Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala
420 425 430
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450 455 460
Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala
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Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala Val Phe Leu Cys
485 490 495
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
500 505 510
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
515 520 525
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
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<210> 70
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 70
atgatccacc tgggccacat cctgttcctg ctgctgctgc ccgtggccgc tgcccagacc 60
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agcccctacc aggagctgca gggccagcgg agcgacgtgt acagcgacct gaacacccag 420
aggccctact acaag 435
<210> 71
<211> 396
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 71
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctaga 60
cccgattata aggacgacga cgacaagcag accacccctg gcgagcggag cagcctgcct 120
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<210> 72
<211> 414
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 72
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctaga 60
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<210> 73
<211> 513
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 73
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctaga 60
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<210> 74
<211> 1164
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 74
atgatccacc tgggccacat cctgttcctg ctgctgctgc ccgtggccgc tgcccagacc 60
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atccccctga ccgagagcta ctgcggcccc tgccccaaga actggatctg ctacaagaac 840
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tacatctgca tgcagcggac cgtg 1164
<210> 75
<211> 1482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 75
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctaga 60
cccgattata aggacgacga cgacaagcag accacccctg gcgagcggag cagcctgcct 120
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tgcagcaccc ccaacaccta catctgcatg cagcggaccg tg 1482
<210> 76
<211> 1581
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 76
atgatccacc tgggccacat cctgttcctg ctgctgctgc ccgtggccgc tgcccagacc 60
acccctggcg agcggagcag cctgcctgcc ttctaccctg gcaccagcgg cagctgcagc 120
ggctgcggca gcctgagcct gcccctgctg gccggcctgg tggccgccga cgccgtggcc 180
agcctgctga tcgtgggcgc cgtgttcctg tgcgccaggc ccaggcggag ccctgcccag 240
gaggacggca aggtgtacat caacatgccc ggccggggct acttcctggg caggctggtg 300
cccaggggca ggggcgctgc cgaggctgcc acccggaagc agcggatcac cgagaccgag 360
agcccctacc aggagctgca gggccagcgg agcgacgtgt acagcgacct gaacacccag 420
aggccctact acaagaggcg gaaaaggtct gggagtgggg ctaccaattt ctctctcctc 480
aagcaagccg gagacgttga ggaaaaccct ggacccatgg gctggatccg gggacggagg 540
agccggcaca gctgggagat gagcgagttc cacaactaca acctggacct gaagaagagc 600
gacttcagca cccggtggca gaagcagcgg tgccccgtgg tgaagagcaa gtgccgggag 660
aacgccagcc ccttcttctt ctgctgcttc atcgccgtgg ctatgggcat ccggttcatc 720
atcatggtgg ccatctggag cgccgtgttc ctgaacagcc tgttcaacca ggaggtgcag 780
atccccctga ccgagagcta ctgcggcccc tgccccaaga actggatctg ctacaagaac 840
aactgctacc agttcttcga cgagagcaag aactggtacg agagccaggc cagctgcatg 900
agccagaacg ccagcctgct gaaggtgtac agcaaggagg accaggacct gctgaagctg 960
gtgaagagct accactggat gggcctggtg cacatcccca ccaacggcag ctggcagtgg 1020
gaggacggca gcatcctgag ccccaacctg ctgaccatca tcgagatgca gaagggcgac 1080
tgcgccctgt acgccagcag cttcaagggc tacatcgaga actgcagcac ccccaacacc 1140
tacatctgca tgcagcggac cgtgagaaga aagagaagcg gcagcggcga gggcagaggc 1200
agcctgctga cctgcggcga cgtggaggag aaccccggac ccatgattca tctcggacat 1260
attctctttc tcttgctctt gcctgtcgct gccgctcaaa caactcccgg agaaagatct 1320
tctctccccg ctttttatcc cggaacatct ggatcttgtt ctggatgtgg atctttgtct 1380
ctccctctcc tcgctggact cgtcgcagct gatgctgtcg cttctctctt gattgtcgga 1440
gctgtctttt tgtgtaagag aggcagaaag aagctgctgt acatcttcaa gcagcccttc 1500
atgagacccg tgcagaccac ccaggaggag gacggctgca gctgcagatt ccccgaggag 1560
gaggagggcg gctgcgagct g 1581
<210> 77
<211> 1614
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 77
atgatccacc tgggccacat cctgttcctg ctgctgctgc ccgtggccgc tgcccagacc 60
acccctggcg agcggagcag cctgcctgcc ttctaccctg gcaccagcgg cagctgcagc 120
ggctgcggca gcctgagcct gcccctgctg gccggcctgg tggccgccga cgccgtggcc 180
agcctgctga tcgtgggcgc cgtgttcctg tgcgccaggc ccaggcggag ccctgcccag 240
gaggacggca aggtgtacat caacatgccc ggccggggct acttcctggg caggctggtg 300
cccaggggca ggggcgctgc cgaggctgcc acccggaagc agcggatcac cgagaccgag 360
agcccctacc aggagctgca gggccagcgg agcgacgtgt acagcgacct gaacacccag 420
aggccctact acaagaggcg gaaaaggtct gggagtgggg ctaccaattt ctctctcctc 480
aagcaagccg gagacgttga ggaaaaccct ggacccatgg gctggatccg gggacggagg 540
agccggcaca gctgggagat gagcgagttc cacaactaca acctggacct gaagaagagc 600
gacttcagca cccggtggca gaagcagcgg tgccccgtgg tgaagagcaa gtgccgggag 660
aacgccagcc ccttcttctt ctgctgcttc atcgccgtgg ctatgggcat ccggttcatc 720
atcatggtgg ccatctggag cgccgtgttc ctgaacagcc tgttcaacca ggaggtgcag 780
atccccctga ccgagagcta ctgcggcccc tgccccaaga actggatctg ctacaagaac 840
aactgctacc agttcttcga cgagagcaag aactggtacg agagccaggc cagctgcatg 900
agccagaacg ccagcctgct gaaggtgtac agcaaggagg accaggacct gctgaagctg 960
gtgaagagct accactggat gggcctggtg cacatcccca ccaacggcag ctggcagtgg 1020
gaggacggca gcatcctgag ccccaacctg ctgaccatca tcgagatgca gaagggcgac 1080
tgcgccctgt acgccagcag cttcaagggc tacatcgaga actgcagcac ccccaacacc 1140
tacatctgca tgcagcggac cgtgagaaga aagagaagcg gcagcggcga gggcagaggc 1200
agcctgctga cctgcggcga cgtggaggag aaccccggac ctatggctct gcctgtgaca 1260
gctctgctgc tgcctctggc tctgctgctg cacgccgcta gacccgatta taaggacgac 1320
gacgacaagc aaacaactcc cggagaaaga tcttctctcc ccgcttttta tcccggaaca 1380
tctggatctt gttctggatg tggatctttg tctctccctc tcctcgctgg actcgtcgca 1440
gctgatgctg tcgcttctct cttgattgtc ggagctgtct ttttgtgtaa gagaggcaga 1500
aagaagctgc tgtacatctt caagcagccc ttcatgagac ccgtgcagac cacccaggag 1560
gaggacggct gcagctgcag attccccgag gaggaggagg gcggctgcga gctg 1614
<210> 78
<211> 1599
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 78
atgatccacc tgggccacat cctgttcctg ctgctgctgc ccgtggccgc tgcccagacc 60
acccctggcg agcggagcag cctgcctgcc ttctaccctg gcaccagcgg cagctgcagc 120
ggctgcggca gcctgagcct gcccctgctg gccggcctgg tggccgccga cgccgtggcc 180
agcctgctga tcgtgggcgc cgtgttcctg tgcgccaggc ccaggcggag ccctgcccag 240
gaggacggca aggtgtacat caacatgccc ggccggggct acttcctggg caggctggtg 300
cccaggggca ggggcgctgc cgaggctgcc acccggaagc agcggatcac cgagaccgag 360
agcccctacc aggagctgca gggccagcgg agcgacgtgt acagcgacct gaacacccag 420
aggccctact acaagaggcg gaaaaggtct gggagtgggg ctaccaattt ctctctcctc 480
aagcaagccg gagacgttga ggaaaaccct ggacccatgg gctggatccg gggacggagg 540
agccggcaca gctgggagat gagcgagttc cacaactaca acctggacct gaagaagagc 600
gacttcagca cccggtggca gaagcagcgg tgccccgtgg tgaagagcaa gtgccgggag 660
aacgccagcc ccttcttctt ctgctgcttc atcgccgtgg ctatgggcat ccggttcatc 720
atcatggtgg ccatctggag cgccgtgttc ctgaacagcc tgttcaacca ggaggtgcag 780
atccccctga ccgagagcta ctgcggcccc tgccccaaga actggatctg ctacaagaac 840
aactgctacc agttcttcga cgagagcaag aactggtacg agagccaggc cagctgcatg 900
agccagaacg ccagcctgct gaaggtgtac agcaaggagg accaggacct gctgaagctg 960
gtgaagagct accactggat gggcctggtg cacatcccca ccaacggcag ctggcagtgg 1020
gaggacggca gcatcctgag ccccaacctg ctgaccatca tcgagatgca gaagggcgac 1080
tgcgccctgt acgccagcag cttcaagggc tacatcgaga actgcagcac ccccaacacc 1140
tacatctgca tgcagcggac cgtgagaaga aagagaagcg gcagcggcga gggcagaggc 1200
agcctgctga cctgcggcga cgtggaggag aaccccggac ccatgattca tctcggacat 1260
attctctttc tcttgctctt gcctgtcgct gccgctcaaa caactcccgg agaaagatct 1320
tctctccccg ctttttatcc cggaacatct ggatcttgtt ctggatgtgg atctttgtct 1380
ctccctctcc tcgctggact cgtcgcagct gatgctgtcg cttctctctt gattgtcgga 1440
gctgtctttt tgtgtcagag gcggaagtac cggagcaaca agggcgagag ccccgtggag 1500
cctgccgagc cctgccacta cagctgtccc cgggaggagg agggcagcac catccccatc 1560
caggaggact accggaagcc cgagcctgcc tgcagcccc 1599
<210> 79
<211> 1632
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 79
atgatccacc tgggccacat cctgttcctg ctgctgctgc ccgtggccgc tgcccagacc 60
acccctggcg agcggagcag cctgcctgcc ttctaccctg gcaccagcgg cagctgcagc 120
ggctgcggca gcctgagcct gcccctgctg gccggcctgg tggccgccga cgccgtggcc 180
agcctgctga tcgtgggcgc cgtgttcctg tgcgccaggc ccaggcggag ccctgcccag 240
gaggacggca aggtgtacat caacatgccc ggccggggct acttcctggg caggctggtg 300
cccaggggca ggggcgctgc cgaggctgcc acccggaagc agcggatcac cgagaccgag 360
agcccctacc aggagctgca gggccagcgg agcgacgtgt acagcgacct gaacacccag 420
aggccctact acaagaggcg gaaaaggtct gggagtgggg ctaccaattt ctctctcctc 480
aagcaagccg gagacgttga ggaaaaccct ggacccatgg gctggatccg gggacggagg 540
agccggcaca gctgggagat gagcgagttc cacaactaca acctggacct gaagaagagc 600
gacttcagca cccggtggca gaagcagcgg tgccccgtgg tgaagagcaa gtgccgggag 660
aacgccagcc ccttcttctt ctgctgcttc atcgccgtgg ctatgggcat ccggttcatc 720
atcatggtgg ccatctggag cgccgtgttc ctgaacagcc tgttcaacca ggaggtgcag 780
atccccctga ccgagagcta ctgcggcccc tgccccaaga actggatctg ctacaagaac 840
aactgctacc agttcttcga cgagagcaag aactggtacg agagccaggc cagctgcatg 900
agccagaacg ccagcctgct gaaggtgtac agcaaggagg accaggacct gctgaagctg 960
gtgaagagct accactggat gggcctggtg cacatcccca ccaacggcag ctggcagtgg 1020
gaggacggca gcatcctgag ccccaacctg ctgaccatca tcgagatgca gaagggcgac 1080
tgcgccctgt acgccagcag cttcaagggc tacatcgaga actgcagcac ccccaacacc 1140
tacatctgca tgcagcggac cgtgagaaga aagagaagcg gcagcggcga gggcagaggc 1200
agcctgctga cctgcggcga cgtggaggag aaccccggac ctatggctct gcctgtgaca 1260
gctctgctgc tgcctctggc tctgctgctg cacgccgcta gacccgatta taaggacgac 1320
gacgacaagc aaacaactcc cggagaaaga tcttctctcc ccgcttttta tcccggaaca 1380
tctggatctt gttctggatg tggatctttg tctctccctc tcctcgctgg actcgtcgca 1440
gctgatgctg tcgcttctct cttgattgtc ggagctgtct ttttgtgtca gaggcggaag 1500
taccggagca acaagggcga gagccccgtg gagcctgccg agccctgcca ctacagctgt 1560
ccccgggagg aggagggcag caccatcccc atccaggagg actaccggaa gcccgagcct 1620
gcctgcagcc cc 1632
<210> 80
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 80
Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys
1 5 10 15
Val Ala Arg Thr
20
<210> 81
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 81
Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn
20 25
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 82
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105
<210> 83
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 83
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 84
<211> 695
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 84
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
115 120 125
Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
130 135 140
Glu Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
145 150 155 160
Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile
165 170 175
Ser Gly Ser Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys
180 185 190
Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asn Ser Gly Val Pro Lys Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Arg Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser
210 215 220
Leu Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Ser
225 230 235 240
Tyr Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro
245 250 255
Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ser His Thr
260 265 270
Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu
275 280 285
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
290 295 300
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
305 310 315 320
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
325 330 335
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
340 345 350
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
355 360 365
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
370 375 380
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
385 390 395 400
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
405 410 415
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
420 425 430
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
435 440 445
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
450 455 460
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
465 470 475 480
Ser Leu Gly Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
485 490 495
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Ala
500 505 510
Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn
515 520 525
Met Pro Gly Arg Gly Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala
530 535 540
Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr
545 550 555 560
Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr
565 570 575
Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
580 585 590
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
595 600 605
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
610 615 620
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
625 630 635 640
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
645 650 655
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
660 665 670
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
675 680 685
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
690 695
<210> 85
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 85
Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile
1 5 10 15
Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 86
<211> 49
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分离的
<400> 86
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
1 5 10 15
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
20 25 30
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr
35 40 45
Lys

Claims (48)

1.一种融合多肽，其包括(i)DNAX-活化蛋白10(DAP10)多肽，或其功能变体和(ii)DNAX-活化蛋白12(DAP12)多肽，或其功能变体。
2.如权利要求1所述的融合多肽，其具有以下通式，从N端到C端：A-B-C-D-E，
其特征在于，
A＝一种任选的N端序列；
B＝一种DAP10多肽或其功能变体；
C＝一种任选的连接子序列；
D＝一种DAP12多肽或其功能变体；
E＝一种任选的C端序列。
3.如权利要求1或2所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP10多肽和/或所述DAP12多肽为哺乳动物序列。
4.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP10多肽和/或所述DAP12多肽为人序列。
5.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP10多肽为DAP10的功能变体，所述DAP10的功能变体包括与如SEQ ID NO:1所示的DAP10多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
6.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP10多肽为SEQ ID NO:1的功能变体，具有一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)的点突变，所述点突变为增加、缺失或取代如SEQ ID NO:1所示的所述DAP10多肽中的任意氨基酸。
7.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP10多肽为DAP10多肽的功能变体，所述功能变体为SEQ ID NO:1的截短变体。
8.如权利要求7所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP10的截短变体包括或由SEQ IDNO:1中的氨基酸19-93、19-69、1-71、19-71、19-48、49-69、49-93或70-93组成。
9.如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP10多肽包括或由SEQID NO:1-8中任一个组成。
10.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP12多肽为DAP12的功能变体，包括与如SEQ ID NO:9所示的DAP12多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
11.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP12多肽为SEQ IDNO:8的功能变体，具有一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)的点突变，所述点突变为增加、缺失或取代如SEQ ID NO:9所示的所述DAP12多肽中的任意氨基酸。
12.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP12多肽为DAP12多肽的功能变体，所述功能变体为SEQ ID NO:9的截短变体。
13.如权利要求12所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP12的截短变体包括或由如SEQID NO:9所示氨基酸的22-113、62-113、22-61或41-61组成。
14.如权利要求1-9中任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP12多肽包括或由SEQ ID NO:9-13中任一个组成。
15.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述DAP10多肽和所述DAP12多肽通过连接子连接。
16.如权利要求15所述的融合多肽，其特征在于，所述连接子包括或由以下组成：SEQID NO:18-46中列举的任意氨基酸序列。
17.如权利要求15或16所述的融合多肽，其特征在于，所述连接子包括或由SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:38-44中列举的任一氨基酸序列组成。
18.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽包括N端序列。
19.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽包括C端序列。
20.如权利要求18或19所述的融合多肽，其特征在于，所述N端序列或所述C端序列包括His-标签、FLAG-标签、Arg-标签、T7-标签、Strep-标签、S-标签、Avi标签TM、适配子-标签、myc标签、CD8α引导序列、4-1BB胞内结构域、V5标签或CD27胞内结构域中的一种或多种。
21.如权利要求20所述的融合多肽，其特征在于，所述N端序列或C端序列包括CD8α引导序列、4-1BB胞内结构域或CD27胞内结构域中的一种或多种。
22.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽包括或由如SEQ ID NO:60-63中任一所示的序列组成。
23.如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽：
(a)不包括如SEQ ID NO:84所示的序列；和/或
(b)不包括抗EpCAM肽；和/或
(c)不包括如SEQ ID NO:85所示的序列；和/或
(d)不包括如SEQ ID NO:86所示的序列；和/或
(e)不包括如SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86所示的序列。
24.如前述权利要求任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽为连续嵌合多肽的一部分，所述连续嵌合多肽进一步包括NKG2D多肽。
25.如权利要求1-23中任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽与NKG2D多肽静电连接。
26.如权利要求24或25所述的融合多肽，其特征在于，所述NKG2D多肽包括与如SEQ IDNO:14所示的人NKG2D多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
27.如权利要求24-26中任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述NKG2D多肽为SEQ IDNO:14的功能变体，具有一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)点突变，所述点突变为在如SEQ ID NO:14所示的所述NKG2D多肽中增加、缺失或取代的任一氨基酸。
28.如权利要求24-27中任一项的所述融合多肽，其特征在于，所述NKG2D多肽为所述NKG2D多肽的功能变体，所述NKG2D多肽的功能变体为SEQ ID NO:14的截短变体。
29.如权利要求24-28中任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述NKG2D的截短变体包括或由如SEQ ID NO:14所示的氨基酸52-216、73-216或82-216组成。
30.如权利要求24或26-29中任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述连续嵌合多肽包括或由如SEQ ID NO:64-69中任一个所示的序列组成。
31.一种分离的核酸的序列，其编码如前述权利要求任一项所述的融合多肽。
32.如权利要求31所述的分离的核酸，其包括与编码SEQ ID NO:60-69中任一核酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。
33.如权利要求31所述的分离的核酸，其包括或由如SEQ ID NO:70-79中任一所示的核苷酸序列组成。
34.一种载体，其包含如权利要求31-33中任一项所述的核酸。
35.如权利要求34所述的载体，其为一种慢病毒载体或逆转录病毒载体。
36.一种宿主细胞，其包含如权利要求1-30中任一项所述的融合多肽。
37.一种宿主细胞，其包含如权利要求31-33中任一项所述的核酸或如权利要求34或35所述的载体。
38.如权利要求36或37所述的宿主细胞，其为一种T细胞或NK细胞。
39.一种制备如权利要求1-30中的任一项所述的融合多肽的方法，其包括将如权利要求37或38所述的宿主细胞维持在适合表达所述核酸的条件下，以此表达所述核酸并产生融合多肽。
40.一种制备免疫反应性细胞的方法，其包括以下步骤：(i)将如权利要求31-33中任一项所述的核酸或者如权利要求34或35所述的载体转入所述免疫应答细胞，以及(ii)培养所述免疫应答细胞，使融合多肽表达并与NKG2D多肽结合形成CAR。
41.一种方法，包括(i)从患者上获得T细胞和/或NK细胞；(ii)将如权利要求31-33中任一项所述的核酸或者权利要求34或35所述的载体转入所述T细胞和/或NK细胞；以及(iii)培养所述T细胞和/或NK细胞，使融合多肽表达并与NKG2D多肽结合形成CAR。
42.一种药物组合物，其包括如权利要求1-30中任一项的融合多肽、如权利要求31-33中任一项所述的核酸、如权利要求34或35所述的载体、或者如权利要求36-38中任一项的所述宿主细胞。
43.如权利要求42所述的药物组合物，其进一步包括药学或生理学上可接受的稀释剂和/或载体。
44.如权利要求1-30中任一项所述的融合多肽、如权利要求31-33中任一项所述的核酸、如权利要求34或35所述的载体、如权利要求36-38中任一项的所述宿主细胞、或者如权利要求42或43所述的药物组合物用于治疗或作为药物。
45.如权利要求1-30中任一项所述的融合多肽、如权利要求31-33中任一项所述的核酸、如权利要求34或35所述的载体、如权利要求36-38中任一项的所述宿主细胞、或者如权利要求42或43所述的药物组合物用于治疗病理性疾病。
46.如权利要求1-30中任一项所述的融合多肽、如权利要求31-33中任一项所述的核酸、如权利要求34或35所述的载体、如权利要求36-38中任一项的所述宿主细胞、或者如权利要求42或43所述的药物组合物在制备治疗病理性疾病的药物中的应用。
47.一种治疗患有病理性疾病的患者的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的如权利要求1-30中任一项所述的融合多肽、如权利要求31-33中任一项所述的核酸、如权利要求34或35所述的载体、如权利要求36-38中任一项的所述宿主细胞、或者如权利要求42或43所述的药物组合物。
48.如权利要求44-47中任一项所述的融合多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物的用途、应用或方法，其特征在于，所述病理性疾病选自以下癌症：实体瘤癌；软组织肿瘤；转移性病变和血液癌；例如肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、结肠癌、肾癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌症、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺的癌症、甲状旁腺的癌症、肾上腺的癌症、软组织的肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病，儿童实体肿瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、血管生成肿瘤、脊柱轴瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓性白血病-慢性期(CMLCP)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、肝细胞癌(HCC)、胃肠道间质瘤(GIST)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈鳞细胞癌(SCCHN)；环境诱发的癌症，包括由石棉诱发的癌症；以及上述癌症的组合。
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