CN114728076A - Mcl-1抑制剂抗体-药物缀合物及使用方法 - Google Patents

Mcl-1抑制剂抗体-药物缀合物及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开抗CD74抗体‑药物缀合物。该抗CD74抗体‑药物缀合物包含Mcl‑1抑制剂药物部分及抗CD74抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合抗原靶标，例如在肿瘤或其他癌细胞上表达的抗原。本发明进一步涉及用于通过施用本文所提供的抗体‑药物缀合物来治疗癌症的方法及组合物。本发明还公开包含Mcl‑1抑制剂药物部分的接头‑药物缀合物及其制备方法。

Description

MCL-1抑制剂抗体-药物缀合物及使用方法
相关申请
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2019年5月20日提交的美国临时申请No.62/850,098的申请日的利益和优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及包含Mcl-1抑制剂及抗CD74抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体或其抗原结合片段结合抗原靶标，例如在肿瘤或其他癌细胞上表达的抗原。本公开进一步涉及可用于治疗和/或诊断表达靶抗原CD74和/或适合于通过调节Mcl-1表达和/或活性治疗的癌症的方法及组合物，以及制备那些组合物的方法。还公开包含Mcl-1抑制剂药物部分的接头-药物缀合物及其制备方法。
背景技术
细胞凋亡或程序性细胞死亡为对于胚胎发育及维持组织内稳态关键的生理过程。细胞凋亡型细胞死亡一般涉及形态变化，诸如核凝聚和DNA断裂，以及生物化学变化，诸如半胱天冬酶的活化，其可对细胞的关键结构组分造成损害。细胞凋亡的调节是复杂的，且通常涉及若干细胞内信号传导路径的活化或抑制(Cory等人(2002)Nature Review Cancer2:647-656)。
细胞凋亡的失调与某些病理相关。例如，增加的细胞凋亡与诸如帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿兹海默氏病(Alzheimer's disease)及缺血的神经退化性疾病相关。相反，细胞凋亡中的缺陷可在癌症及化学抗性的发生、自身免疫疾病、炎性疾病及病毒感染中起作用。不存在细胞凋亡为癌症的表型特征中的一种(Hanahan等人(2000)Cell100:57-70)。Bcl-2家族的抗细胞凋亡蛋白与多种类型的癌症相关，诸如结肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、慢性淋巴性白血病、淋巴瘤、骨髓瘤及胰腺癌。
骨髓细胞白血病1(Mcl-1)，即抗细胞凋亡Bcl-2家族成员，为细胞存活的调节剂。Mcl-1基因的扩增和/或Mcl-1蛋白的过表达已在多种癌症类型中观测到，且通常涉及肿瘤发展(Beroukhim等人(2010)Nature 463(7283):899-905)。Mcl-1为人类癌症中最频繁扩增的基因中的一种，且也是已显示介导对多种抗癌剂的抗药性的关键存活因子。
据信Mcl-1通过结合并中和促细胞凋亡蛋白(诸如Bim、Noxa、Bak及Bax)的死亡诱导活性促进细胞存活。Mcl-1的抑制释放这些促细胞凋亡蛋白，通常引起依赖于Mcl-1存活的肿瘤细胞中细胞凋亡的诱导。因此，治疗性靶向Mcl-1或在细胞凋亡信号传导路径中其上游和/或下游的蛋白质可表示治疗各种恶性肿瘤及克服某些人类癌症中的抗药性的有前景的策略。
CD74(DHLAG)为抗体药物缀合物的已确定且吸引人的靶标，因为其在正常组织上的表达受限且在广泛的血液恶性肿瘤中上调显著。CD74充当为II类MHC复合物的组装及运输所必需的伴侣蛋白以及巨噬细胞迁移抑制受体(MIF)的受体。在肿瘤学中，已充分确立CD74在广泛的B细胞及骨髓细胞恶性肿瘤(包括急性髓性白血病、多发性骨髓瘤及弥漫性大B细胞淋巴瘤)中RNA及蛋白质水平两者显著上调。另外，已知CD74在抗体接合后快速内化且运输至溶酶体以及在内化后快速重新填充于肿瘤细胞表面上。先前已证明靶向CD74的抗体及抗体药物缀合物在癌症的临床前模型中展现抗肿瘤活性。
发明内容
在一些实施方案中，本发明部分地提供具有针对癌细胞的生物活性的新颖抗体-药物缀合物(ADC)化合物。该化合物可减慢、抑制和/或逆转哺乳动物中的肿瘤生长，和/或可适用于治疗人类癌症患者。在一些实施方案中，本发明更具体地涉及能够结合及杀灭癌细胞的ADC化合物。在一些实施方案中，本文所公开的ADC化合物包含将Mcl-1抑制剂附接至全长抗CD74抗体或抗原结合片段的接头。在一些实施方案中，ADC化合物还能够在结合之后内化至靶细胞中。
在一些实施方案中，ADC化合物可由式(1)表示：
Ab-(L-D)p (1)
其中Ab为靶向癌细胞的抗CD74抗体或其抗原结合片段；
D为Mcl-1抑制剂；
L为将Ab共价附接至D的接头；且
p为1至16的整数。
在一些实施方案中，p为1至8的整数。在一些实施方案中，p为1至5的整数。在一些实施方案中，p为2至4的整数。在一些实施方案中，p为2。在一些实施方案中，p为4。在一些实施方案中，p通过液相色谱-质谱法(LC-MS)来测定。
在一些实施方案中，接头(L)包含附接基团、至少一个间隔子基团及至少一个可裂解基团。在一些情况下，可裂解基团包含焦磷酸酯基团和/或自降解基团。在具体实施方案中，L包含附接基团；至少一个桥接间隔子基团；及至少一个包含焦磷酸酯基团和/或自降解基团的可裂解基团。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头-药物(或“接头-有效负载”)部分-(L-D)，具有式(A)：
Figure BDA0003410186110000031
其中R1为附接基团，L1为桥接间隔子基团，且E为可裂解基团。
在一些实施方案中，可裂解基团包含焦磷酸酯基团。在一些实施方案中，可裂解基团包含：
Figure BDA0003410186110000032
在一些实施方案中，桥接间隔子基团包含聚氧乙烯(PEG)基团。在一些情况下，PEG基团可选自PEG1、PEG2、PEG3、PEG4、PEG5、PEG6、PEG7、PEG8、PEG9、PEG10、PEG11、PEG12、PEG13、PEG14及PEG15。在一些实施方案中，桥接间隔子基团可包含：-CO-CH2-CH2-PEG12-。在其他实施方案中，桥接间隔子基团包含丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基或辛酰基。在一些实施方案中，桥接间隔子基团包含己酰基。
在一些实施方案中，附接基团由至少一个选自马来酰亚胺基、巯基、环辛炔基及叠氮基的反应性基团形成。例如，马来酰亚胺基可具有以下结构：
Figure BDA0003410186110000041
叠氮基可具有结构：-N＝N+＝N-。
环辛炔基可具有以下结构：
Figure BDA0003410186110000042
且其中-*为连接至抗体的键。
在一些情况下，环辛炔基具有以下结构：
Figure BDA0003410186110000043
且其中-*为连接至抗体的键。
在一些实施方案中，附接基团具有包含
Figure BDA0003410186110000044
的式，且其中-*为连接至抗体的键。
在一些实施方案中，抗体通过选自以下的附接基团接合至接头(L)：
Figure BDA0003410186110000051
其中-*为连接至抗体的键，且其中
Figure BDA0003410186110000052
为连接至桥接间隔子基团的键。
在一些实施方案中，桥接间隔子基团接合至可裂解基团。
在一些实施方案中，桥接间隔子基团为-CO-CH2-CH2-PEG12-。
在一些实施方案中，可裂解基团为-焦磷酸酯-CH2-CH2-NH2-。
在一些实施方案中，可裂解基团接合至Mcl-1抑制剂(D)。
在一些实施方案中，可裂解基团通过苯基-嘧啶基接合至Mcl-1抑制剂(D)基团。
在一些实施方案中，接头包含：附接基团、至少一个桥接间隔子基团、肽基团及至少一个可裂解基团。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头-药物部分，-(L-D)，具有式(B)：
Figure BDA0003410186110000053
其中R1为附接基团，L1为桥接间隔子，Lp为包含1至6个氨基酸残基的肽基团，E为可裂解基团，L2为桥接间隔子，m为0或1；且D为Mcl-1抑制剂。在一些情况下，m为1，且桥接间隔子包含：
Figure BDA0003410186110000054
在一些实施方案中，该至少一个桥接间隔子包含PEG基团。在一些情况下，PEG基团选自PEG1、PEG2、PEG3、PEG4、PEG5、PEG6、PEG7、PEG8、PEG9、PEG10、PEG11、PEG12、PEG13、PEG14及PEG15。在一些情况下，至少一个桥接间隔子选自*-C(O)-CH2-CH2-PEG1-**、*-C(O)-CH2-PEG3-**、*-C(O)-CH2-CH2-PEG12**、*-NH-CH2-CH2-PEG1-**、聚羟基烷基及*-C(O)-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-C(O)-**，其中**指示将该至少一个桥接间隔子直接或间接附接至附接基团的点，且*指示将该至少一个桥接间隔子直接或间接附接至肽基团的点。
在一些实施方案中，L1选自*-C(O)-CH2-CH2-PEG1-**、*-C(O)-CH2-PEG3-**、*-C(O)-CH2-CH2-PEG12**、*-NH-CH2-CH2-PEG1-**及聚羟基烷基，其中**指示将L1直接或间接附接至R1的点，且*指示将L1直接或间接附接至Lp的点。
在一些实施方案中，m为1，且L2为-C(O)-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-C(O)-。
在一些实施方案中，肽基团包含1至12个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含1至10个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含1至8个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含1至6个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团包含1至4个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团包含1至3个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团包含1至2个氨基酸残基。在一些情况下，氨基酸残基选自L-甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-半胱氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-甲硫氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)及L-酪氨酸(Tyr)。例如，肽基团可包含Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys和/或磺基-Ala-Val-Ala。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含1个连接至
Figure BDA0003410186110000061
基团的氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含选自以下的基团：
Figure BDA0003410186110000062
在一些情况下，肽基团包含选自以下的基团：
Figure BDA0003410186110000071
在一些实施方案中，自降解基团包含对-氨基苯甲基-氨基甲酸酯、对-氨基苯甲基-铵、对-氨基-(磺基)苯甲基-铵、对-氨基-(磺基)苯甲基-氨基甲酸酯、对-氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苯甲基-氨基甲酸酯、对-氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苯甲基-氨基甲酸酯或对-氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苯甲基-铵。
在一些实施方案中，m为1，且桥接间隔子包含
Figure BDA0003410186110000072
在一些实施方案中，接头-药物部分，-(L-D)，由选自以下的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000073
Figure BDA0003410186110000081
Figure BDA0003410186110000091
Figure BDA0003410186110000101
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头-药物基团，-(L-D)，其包含选自以下的式：
Figure BDA0003410186110000102
Figure BDA0003410186110000111
Figure BDA0003410186110000121
Figure BDA0003410186110000131
Figure BDA0003410186110000141
Figure BDA0003410186110000142
且
其中-*为连接至抗体的键。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头药物基团，-(L-D)，其具有式(C)：
Figure BDA0003410186110000143
其中：R1为附接基团，L1为桥接间隔子；Lp为包含1至6个氨基酸的肽基团；D为Mcl-1抑制剂；G1-L2-A为自降解间隔子；L2为键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000144
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；L3为间隔子部分；且R2为亲水性部分。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含接头药物基团，-(L-D)，其具有式(D)：
Figure BDA0003410186110000151
其中：R1为附接基团；L1为桥接间隔子；Lp为包含1至6个氨基酸的肽基团；A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000152
Figure BDA0003410186110000153
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；L3为间隔子部分；且R2为亲水性部分。
在一些实施方案中，L1包含
Figure BDA0003410186110000154
或*-CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)-**，其中各n为1至12的整数，其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点。
在一些实施方案中，L1为
Figure BDA0003410186110000155
且n为1至12的整数，其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点。
在一些实施方案中，L1为
Figure BDA0003410186110000156
且n为1，其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点。
在一些实施方案中，L1为
Figure BDA0003410186110000157
且n为12，其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点。
在一些实施方案中，L1为
Figure BDA0003410186110000161
且n为1至12的整数，其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点。
在一些实施方案中，L1包含
Figure BDA0003410186110000162
其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点。
在一些实施方案中，L1为包含以下的桥接间隔子：
*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点，其中X1为
Figure BDA0003410186110000163
且
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；且
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30。
在一些实施方案中，R2为亲水性部分，其包含聚乙二醇、聚亚烷基二醇、多元醇、聚肌氨酸、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110000171
基团取代的C2-C6烷基。在一些实施方案中，R2为
Figure BDA0003410186110000172
Figure BDA0003410186110000173
其中n为介于1与6之间的整数、
Figure BDA0003410186110000174
Figure BDA0003410186110000175
在一些实施方案中，亲水性部分包含具有下式的聚乙二醇：
Figure BDA0003410186110000181
其中R为H、-CH3、-CH2CH2NHC(＝O)ORa、-CH2CH2NHC(＝O)Ra或-CH2CH2C(＝O)ORa，R'为OH、-OCH3、-CH2CH2NHC(＝O)ORa、-CH2CH2NHC(＝O)Ra或-OCH2CH2C(＝O)ORa，其中Ra为H或任选地用OH或C1-4烷氧基取代的C1-4烷基，且m及n中的每一者为介于2与25之间(例如介于3与25之间)的整数。
在一些实施方案中，亲水性部分包含
Figure BDA0003410186110000182
在一些实施方案中，亲水性部分包含例如具有以下部分的聚肌氨酸：
Figure BDA0003410186110000183
其中n为介于3与25之间的整数；且R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
在一些实施方案中，L3为具有结构
Figure BDA0003410186110000184
的间隔子部分，其中：
W为-CH2-、-CH2O-、-CH2N(Rb)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-、-C(＝O)N(X-R2)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)-、-CH2NRbC(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)NRb-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基；且
X为键、三唑基或-CH2-三唑基-。
在一些实施方案中，L3为具有结构
Figure BDA0003410186110000185
的间隔子部分，其中：
W为-CH2-、-CH2O-、-CH2N(Rb)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-、-C(＝O)N(X-R2)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)-、-CH2NRbC(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)NRb-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基；且
X为-CH2-三唑基-C1-4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-C4-6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-或-CH2-三唑基-C1-4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-，其中各n独立地为1、2或3。
在一些实施方案中，附接基团由包含至少一个反应性基团的反应形成。在一些情况下，附接基团通过使以下反应而形成：第一反应性基团，其附接至接头；及第二反应性基团，其附接至抗体或为抗体的氨基酸残基。
在一些实施方案中，反应性基团中的至少一个包含：
硫醇，
马来酰亚胺，
卤乙酰胺，
叠氮基，
炔，
环辛烯，
三芳基膦，
氧杂降冰片二烯(oxanobornadiene)，
环辛炔，
二芳基四嗪，
单芳基四嗪，
降冰片烯，
醛，
羟胺，
肼，
NH2-NH-C(＝O)-，
酮，
乙烯基砜，
氮丙啶，
氨基酸残基，
Figure BDA0003410186110000201
-ONH2、-NH2、
Figure BDA0003410186110000202
Figure BDA0003410186110000203
-N3、
Figure BDA0003410186110000204
-SH、-SR3、-SSR4、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、
Figure BDA0003410186110000205
-C(O)NHNH2、
Figure BDA0003410186110000206
Figure BDA0003410186110000207
Figure BDA0003410186110000211
其中：
各R3独立地选自H及C1-C6烷基；
各R4为2-吡啶基或4-吡啶基；
各R5独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；
各R6独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；
各R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、-C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基及-C(＝O)OH取代的C1-4烷基。
在一些实施方案中，第一反应性基团及第二反应性基团包含：
硫醇及马来酰亚胺，
硫醇及卤乙酰胺，
硫醇及乙烯基砜，
硫醇及氮丙啶，
叠氮基及炔，
叠氮基及环辛炔，
叠氮基及环辛烯，
叠氮基及三芳基膦，
叠氮基及氧杂降冰片二烯，
二芳基四嗪及环辛烯，单芳基四嗪及降冰片烯，
醛及羟胺，
醛及肼，
醛及NH2-NH-C(＝O)-，
酮及羟胺，
酮及肼，
酮及NH2-NH-C(＝O)-，
羟胺及
Figure BDA0003410186110000221
胺及
Figure BDA0003410186110000222
Figure BDA0003410186110000223
或
CoA或CoA类似物及丝氨酸残基。
在一些实施方案中，附接基团包含选自以下的基团：
Figure BDA0003410186110000224
Figure BDA0003410186110000231
Figure BDA0003410186110000241
Figure BDA0003410186110000251
酰胺；
Figure BDA0003410186110000252
Figure BDA0003410186110000253
及
二硫化物，
其中：
R32为H、C1-4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；
R35为H、C1-6烷基、苯基或用1至3个-OH基团取代的C1-4烷基；
各R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、-C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基及-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R37独立地选自H、苯基及吡啶；
q为0、1、2或3；
R8为H或甲基；且
R9为H、-CH3或苯基。
在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含1至6个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团(Lp)包含1至4个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团包含1至3个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽基团包含1至2个氨基酸残基。在一些实施方案中，氨基酸残基选自L-甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-半胱氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-甲硫氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)及L-酪氨酸(Tyr)。在一些实施方案中，肽基团包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Leu-Cit、磺基-Ala-Val和/或磺基-Ala-Val-Ala。在一些实施方案中，Lp选自：
Figure BDA0003410186110000261
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000262
其中：
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000271
Figure BDA0003410186110000272
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000273
其中：
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000274
Figure BDA0003410186110000275
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000276
其中：
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000281
Figure BDA0003410186110000282
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000283
其中：
各R独立地选自H、-CH3及-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000284
Figure BDA0003410186110000285
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000291
其中：
各R独立地选自H、-CH3及-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000292
Figure BDA0003410186110000293
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000294
其中：
Xa为-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-，且各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000295
Figure BDA0003410186110000296
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000301
其中：
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000302
Figure BDA0003410186110000303
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000304
其中：
Xb为-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-，且各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000305
Figure BDA0003410186110000306
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000311
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000312
Figure BDA0003410186110000313
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000314
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000315
Figure BDA0003410186110000316
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000321
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000322
Figure BDA0003410186110000323
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000324
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000325
Figure BDA0003410186110000326
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000331
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000332
Figure BDA0003410186110000333
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000334
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000335
Figure BDA0003410186110000336
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000341
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000342
Figure BDA0003410186110000343
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，接头-药物基团-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
Figure BDA0003410186110000344
其中：
各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110000345
Figure BDA0003410186110000351
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
在一些实施方案中，A为键。
在一些实施方案中，R为-CH3。
在一些实施方案中，Mcl-1抑制剂(D)包含式(I)的化合物：
Figure BDA0003410186110000352
其中：
环D0为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，
环E0为呋喃基、噻吩基或吡咯基环，
X01、X03、X04及X05彼此独立地为碳原子或氮原子，
X02为C-R026基团或氮原子，
Figure BDA0003410186110000353
意指环为芳族的，
Y0为氮原子或C-R03基团，
Z0为氮原子或C-R04基团，
R01为卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、羟基(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-Cy08、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-R012、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
R02、R03、R04及R05彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、羟基(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-R031、-O-(C1-C6)烷基-R012、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或(R01，R02)、(R02，R03)、(R03，R04)或(R04，R05)对与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中所得环任选地用1或2个选自以下的基团取代：卤素、直链或支链(C1-C6)烷基、(C0-C6)烷基-NR011R011'、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01或氧代，
R06及R07彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-R012、-C(O)-OR11、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR11-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或(R06，R07)对，当与两个相邻碳原子稠合时，与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中所得环任选地用直链或支链(C1-C6)烷基、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01或氧代取代，
W0为-CH2-基团、-NH-基团或氧原子，
R08为氢原子、直链或支链(C1-C8)烷基、-CHR0aR0b基团、芳基、杂芳基、芳基((C1-C6)烷基或杂芳基(C1-C6)烷基，
R09为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、-Cy02、-(C1-C6)烷基-Cy02、-(C2-C6)烯基-Cy02、-(C2-C6)炔基-Cy02、-Cy02-Cy03、-(C2-C6)炔基-O-Cy02、-Cy02-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy03、卤素原子、氰基、-C(O)-R014或-C(O)-NR014R014'，
R010为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、芳基(C1-C6)烷基、(C1-C6)环烷基烷基、直链或支链(C1-C6)卤烷基或-(C1-C6)烷基-O-Cy04，
或(R09，R010)对，当与两个相邻碳原子稠合时，与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，
R011及R011'彼此独立地为氢原子、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基或-(C0-C6)烷基-Cy01，
或(R011，R011')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中该氮可用1或2个选自氢原子及直链或支链(C1-C6)烷基的基团取代，且其中直链或支链(C1-C6)烷基的一个或多个碳原子任选地氘化，
R012为-Cy05、-Cy05-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-NR011-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-Cy06-O-(C0-C6)烷基-Cy07、-Cy05-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy09、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy09、-NH-C(O)-NH-R011、-Cy05-(C0-C6)烷基-NR011-(C0-C6)烷基-Cy09、-C(O)-NR011R011'、-NR011R011'、-OR011、-NR011-C(O)-R011'、-O-(C1-C6)烷基-OR011、-SO2-R011及-C(O)-OR011，
R013、R013'、R014及R014'彼此独立地为氢原子或任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基，
R0a为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
R0b为-O-C(O)-O-R0c基团、-O-C(O)-NR0cR0c'基团或-O-P(O)(OR0c)2基团，
R0c及R0c'彼此独立地为氢原子、直链或支链(C1-C8)烷基、环烷基、(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧羰基(C1-C6)烷基，
或(R0c，R0c')对与其所附接的氮原子一起形成由5至7个环成员构成的非芳环，其除氮原子之外可含有1至3个选自氧及氮的杂原子，其中该氮任选地用直链或支链(C1-C6)烷基取代，
Cy01、Cy02、Cy03、Cy04、Cy05、Cy06、Cy07、Cy08及Cy010彼此独立地表示环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一者任选地被取代，
Cy09为
Figure BDA0003410186110000381
或Cy09为杂芳基，其用选自以下的基团取代：-O-P(O)(OR020)2；-O-P(O)(O-M+)2；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；及-U0-(CH2)q0-NR021R021'，
R015为氢原子；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020基团；直链或支链(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基；-U0-(CH2)q0-NR021R021'基团；或-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基，
R016为氢原子；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；(CH2)r0-U0-V0-O-P(O)(OR020)2基团；-O-P(O)(O-M+)2基团；-O-S(O)2OR020基团；-S(O)2OR020基团；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020基团；-(CH2)p0-O-C(O)-NR022R023基团；或-U0-(CH2)q0-NR021R021'基团，
R017为氢原子；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020基团；-CH2-P(O)(OR020)2基团、-O-P(O)(OR020)2基团；-O-P(O)(O-M+)2基团；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；-U0-(CH2)q0-NR021R021'基团；或醛糖酸，
M+为药学上可接受的单价阳离子，
U0为键或氧原子，
V0为-(CH2)s0-基团或-C(O)-基团，
R018为氢原子或(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，
R019为氢原子或羟基(C1-C6)烷基，
R020为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
R021及R021'彼此独立地为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或羟基(C1-C6)烷基，
或(R021，R021')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中所得环任选地用氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基取代，
R022为(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基、-(CH2)p0-NR024R024'基团或-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020基团，
R023为氢原子或(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，
或(R022，R023)对与其所附接的氮原子一起形成含有5至18个环成员的芳环或非芳环，其除氮原子之外任选地含有1至5个选自O、S及N的杂原子，其中所得环任选地用氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或杂环烷基取代，
R024及R024'彼此独立地为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
或(R024，R024')对与其所附接的氮原子一起形成由5至7个环成员构成的芳环或非芳环，其除氮原子之外可含有1至3个选自O、S及N的杂原子，且其中所得环任选地用氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基取代，
R025为氢原子、羟基或羟基(C1-C6)烷基，
R026为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基或氰基，
R027为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
R028为-O-P(O)(O-)(O-)基团、-O-P(O)(O-)(OR030)基团、-O-P(O)(OR030)(OR030')基团、-(CH2)p0-O-SO2-O-基团、-(CH2)p0-SO2-O-基团、-(CH2)p0-O-SO2-OR030基团、-Cy010、-(CH2)p0-SO2-OR030基团、-O-C(O)-R029基团、-O-C(O)-OR029基团或-O-C(O)-NR029R029'基团；
R029及R029'彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或直链或支链氨基(C1-C6)烷基，
R030及R030'彼此独立地为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基(C1-C6)烷基，
R031为
Figure BDA0003410186110000401
Figure BDA0003410186110000402
其中铵阳离子任选地以两性离子形式存在或具有单价阴离子抗衡离子，
n0为等于0或1的整数，
p0为等于0、1、2或3的整数，
q0为等于1、2、3或4的整数，
r0及s0独立地为等于0或1的整数；
其中如果存在，则R03、R09或R012基团中的至多一个共价附接至接头，且其中原子的化合价通过一个或多个与其键合的取代基而未被超过，
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，Cy01、Cy02、Cy03、Cy04、Cy05、Cy06、Cy07、Cy08及Cy010彼此独立地为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一者任选地用一个或多个选自以下的基团取代：卤基；-(C1-C6)烷氧基；-(C1-C6)卤烷基；-(C1-C6)卤烷氧基；-(CH2)p0-O-SO2-OR030；-(CH2)p0-SO2-OR030；-O-P(O)(OR020)2；-O-P(O)(O-M+)2；-CH2-P(O)(OR020)2；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；或-U0-(CH2)q0-NR021R021'。
在一些实施方案中，D包含式(II)化合物：
Figure BDA0003410186110000411
其中：
Z0为氮原子或C-R04基团，
R01为卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、-Cy08、-NR011R011'，
R02、R03及R04彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-R031、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或(R02，R03)或(R03，R04)对与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中该环任选地用选自以下的基团取代：直链或支链(C1-C6)烷基、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01及氧代，
R06及R07彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-R012、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或(R06，R07)对，当与两个相邻碳原子稠合时，与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，且其中所得环任选地用选自以下的基团取代：直链或支链(C1-C6)烷基、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01及氧代，
R08为氢原子、直链或支链(C1-C8)烷基、芳基、杂芳基、芳基-(C1-C6)烷基或杂芳基(C1-C6)烷基，
R09为直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、-Cy02、-(C1-C6)烷基-Cy02、-(C2-C6)烯基-Cy02、-(C2-C6)炔基-Cy02、-Cy02-Cy03、-(C2-C6)炔基-O-Cy02、-Cy02-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy03、卤素原子、氰基、-C(O)-R014、-C(O)-NR014R014'，
R011及R011'彼此独立地为氢原子、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基或-(C0-C6)烷基-Cy01，
或(R011，R011')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中该N原子任选地用直链或支链(C1-C6)烷基取代，且其中直链或支链(C1-C6)烷基的一个或多个碳原子任选地氘化，
R012表示-Cy05、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-NR011-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-Cy06-O-(C0-C6)烷基-Cy07、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy09、-NH-C(O)-NH-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011R011'、-OR011、-NR011-C(O)-R011'、-O-(C1-C6)烷基-OR011、-SO2-R011或-C(O)-OR011，
R013、R013'、R014及R014'彼此独立地为氢原子或任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基，
Cy01、Cy02、Cy03、Cy05、Cy06、Cy07及Cy08彼此独立地为任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基，
Cy09为
Figure BDA0003410186110000431
其中R015、R016及R017如关于式(I)所定义，
R013为
Figure BDA0003410186110000432
其中R027及R028如关于式(I)所定义，
其中如果存在，则R03、R09或R012基团中的至多一个共价附接至接头，
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，D包含式(III)的化合物：
Figure BDA0003410186110000441
其中：
R01为直链或支链(C1-C6)烷基，
R03为-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'或
Figure BDA0003410186110000442
其中R011及R011'彼此独立地为氢原子、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基或-(C0-C6)烷基-Cy01；
或(R011，R011')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中该N原子可用1或2个选自氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基的基团取代，
且其中R027为氢原子，且R028为-(CH2)p0-O-SO2-O-基团或-(CH2)p0-SO2-OR030基团；
R09为直链或支链(C2-C6)炔基或-Cy02，
R012为-Cy05、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy06或-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy09，
Cy01、Cy02、Cy05及Cy06彼此独立地为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一者任选地被取代，
Cy09为
Figure BDA0003410186110000451
R015、R016及R017如关于式(I)所定义，
其中如果存在，则R03、R09或R012基团中的至多一个共价附接至接头，
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，Cy01、Cy02、Cy05、Cy06彼此独立地为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一者任选地用一个或多个选自以下的基团取代：卤基；-(C1-C6)烷氧基；-(C1-C6)卤烷基；-(C1-C6)卤烷氧基；-(CH2)p0-O-SO2-OR030；-(CH2)p0-SO2-OR030；-O-P(O)(OR020)2；-O-P(O)(O-M+)2；-CH2-P(O)(OR020)2；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；或-U0-(CH2)q0-NR021R021'。
在一些实施方案中，R01为甲基或乙基。
在一些实施方案中，R03为-O-CH2-CH2-NR011R011'，其中R011及R011'与携带其的氮原子一起形成哌嗪基，其可用氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基取代。
在一些实施方案中，R03包含式：
Figure BDA0003410186110000452
其中R027为氢原子，且R028为-(CH2)p0-O-SO2-OR030基团，p0为等于0、1、2或3的整数；且其中R030表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基(C1-C6)烷基。
在一些实施方案中，R03包含式：
Figure BDA0003410186110000461
其中-*为连接至接头的键。
在一些实施方案中，Cy01、Cy02、Cy03、Cy04、Cy05、Cy06、Cy07、Cy08及Cy010彼此独立地为任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基，其中任选的取代基选自任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基、任选地取代的直链或支链(C2-C6)烯基、任选地取代的直链或支链(C2-C6)炔基、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷氧基、任选地取代的(C1-C6)烷基-S-、羟基、氧代(或适当时，N-氧化物)、硝基、氰基、-C(O)-OR0'、-O-C(O)-R0'、-C(O)-NR0'R0”、-NR0'R0”、-(C＝NR0')-OR0”、直链或支链(C1-C6)卤烷基、三氟甲氧基或卤素，其中R0'及R0”各自独立地为氢原子或任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基，且其中直链或支链(C1-C6)烷基的一个或多个碳原子任选地氘化。
在一些实施方案中，R09为Cy02基团，优选为芳基，更优选为苯基。在一些实施方案中，Cy02为任选地取代的芳基。
在一些实施方案中，Cy05包含选自吡唑基及嘧啶基的杂芳基。
在一些实施方案中，Cy05为嘧啶基。
在一些实施方案中，Cy05为嘧啶基，且Cy06为苯基。
在一些实施方案中，接头(L)通过L与式(I)、(II)或(III)的R03的共价键附接至D。在一些实施方案中，接头(L)通过L与式(I)、(II)或(III)的R09的共价键附接至D。
在一些实施方案中，D包含：
Figure BDA0003410186110000471
Figure BDA0003410186110000481
或
任何前述物质中任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，-(L-D)由选自表A的化合物或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐形成。对于表A中的化合物，根据其电子电荷，这些化合物可含有一个药学上可接受的单价阴离子抗衡离子M1 -。在一些实施方案中，单价阴离子抗衡离子M1 -可选自溴离子、氯离子、碘离子、乙酸根、三氟乙酸根、苯甲酸根、甲磺酸根、甲苯磺酸根、三氟甲磺酸根、甲酸根等。在一些实施方案中，单价阴离子抗衡离子M1 -为三氟乙酸根或甲酸根。
表A.示例性接头药物基团
Figure BDA0003410186110000482
Figure BDA0003410186110000491
Figure BDA0003410186110000501
Figure BDA0003410186110000511
Figure BDA0003410186110000521
Figure BDA0003410186110000531
Figure BDA0003410186110000541
Figure BDA0003410186110000551
Figure BDA0003410186110000561
Figure BDA0003410186110000571
Figure BDA0003410186110000581
Figure BDA0003410186110000591
Figure BDA0003410186110000601
Figure BDA0003410186110000611
Figure BDA0003410186110000621
Figure BDA0003410186110000631
Figure BDA0003410186110000641
Figure BDA0003410186110000651
Figure BDA0003410186110000661
Figure BDA0003410186110000671
Figure BDA0003410186110000681
Figure BDA0003410186110000691
Figure BDA0003410186110000701
Figure BDA0003410186110000711
Figure BDA0003410186110000721
Figure BDA0003410186110000731
Figure BDA0003410186110000741
Figure BDA0003410186110000751
Figure BDA0003410186110000761
Figure BDA0003410186110000771
Figure BDA0003410186110000781
Figure BDA0003410186110000791
Figure BDA0003410186110000801
Figure BDA0003410186110000811
Figure BDA0003410186110000821
Figure BDA0003410186110000831
Figure BDA0003410186110000841
Figure BDA0003410186110000851
Figure BDA0003410186110000861
Figure BDA0003410186110000871
Figure BDA0003410186110000881
Figure BDA0003410186110000891
Figure BDA0003410186110000901
Figure BDA0003410186110000911
Figure BDA0003410186110000921
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有根据表B中所示的结构中任一的化学式。
表B.ADC结构
Figure BDA0003410186110000922
Figure BDA0003410186110000931
Figure BDA0003410186110000941
Figure BDA0003410186110000951
Figure BDA0003410186110000961
Figure BDA0003410186110000971
Figure BDA0003410186110000981
Figure BDA0003410186110000991
Figure BDA0003410186110001001
Figure BDA0003410186110001011
Figure BDA0003410186110001021
如本文所用，“L/P”是指本文所公开的接头-有效负载、接头-药物或接头-化合物，且术语“L#-P#”及“L#-C#”可互换使用以指代本文所公开的特定接头-药物，同时除非另外指定，否则代码“P#”及“C#”可互换使用以指代特定化合物。例如，“L1-C1”及“L1-P1”两者均指本文所公开的相同接头-有效负载结构，同时“C1”及“P1”是指本文所公开的相同化合物，包括前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段结合于癌细胞上的靶抗原CD74。在一些实施方案中，CD74为人类CD74异形体。在一些实施方案中，人类CD74异形体为具有以下的氨基酸序列的异形体1(NP_001020330.1)：
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKVLTKCQEEVSHIPAVHPGSFRPKCDENGNYLPLQCYGSIGYCWCVFPNGTEVPNTRSRGHHNCSESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPM(SEQ ID NO:61)。
在一些实施方案中，人类CD74异形体为具有以下的氨基酸序列的异形体2(NP_004346.1)：
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPM(SEQ ID NO:62)。
在一些实施方案中，本文还提供包含抗体-药物缀合物(例如本文所述的示例性抗体-药物缀合物中的任一种)的多个复本的组合物。在一些实施方案中，组合物中的抗体-药物缀合物的平均p为约2至约4。
在一些实施方案中，本文还提供包含抗体-药物缀合物(例如本文所述的示例性抗体-药物缀合物中的任一种)或组合物(例如本文所述的示例性组合物中的任一种)及药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些实施方案中，本文进一步提供用于所述ADC化合物及组合物，例如用于治疗癌症的治疗用途。在一些实施方案中，本发明提供治疗癌症(例如表达ADC的抗体或抗原结合片段靶向的CD74抗原的癌症)的方法。在一些实施方案中，本发明提供减少受试者的癌细胞群体或减慢受试者的癌细胞群体的扩增的方法。在一些实施方案中，本发明提供确定患有或疑似患有癌症的受试者是否对用本文所公开的ADC化合物或组合物的治疗有反应的方法。
示例性实施方案为治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物中的任一种)。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，癌症为肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症为乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，癌症为淋巴瘤或胃癌。
另一示例性实施方案为减少或抑制受试者的肿瘤生长的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物中的任一种)。在一些实施方案中，肿瘤表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，肿瘤为乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，肿瘤为胃癌。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用将肿瘤生长减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
另一示例性实施方案为减少受试者的癌细胞群体或减慢受试者的癌细胞群体的扩增的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物中的任一种)。在一些实施方案中，癌细胞群体表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，癌细胞群体来自肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌细胞群体来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，癌细胞群体来自淋巴瘤或胃癌。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用将癌细胞群体的扩增减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用将癌细胞群体的扩增减慢至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
另一示例性实施方案为用于治疗患有或疑似患有癌症的受试者的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物中的任一种)。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，癌症为肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症为乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，癌症为淋巴瘤或胃癌。
另一示例性实施方案为抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物中的任一种)在治疗患有或疑似患有癌症的受试者中的用途。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，癌症为肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症为乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，癌症为淋巴瘤或胃癌。
另一示例性实施方案为抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物中的任一种)在制备用于治疗患有或疑似患有癌症的受试者的药物的方法中的用途。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，癌症为肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症为乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，癌症为淋巴瘤或胃癌。
另一示例性实施方案为通过提供来自受试者的生物样品；使样品与抗体-药物缀合物接触；及检测样品中抗体-药物缀合物与癌细胞的结合来确定患有或疑似患有癌症的受试者是否对用抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物中的任一种)的治疗有反应的方法。在一些实施方案中，样品中的癌症表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，癌症为肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症为乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，癌症为淋巴瘤或胃癌。在一些实施方案中，样品组织活检样品、血液样品或骨髓样品。
还公开制备所述ADC化合物及组合物的方法。示例性实施方案为通过在允许缀合的条件下使抗体或抗原结合片段与接合至Mcl-1抑制剂的可裂解接头反应来制备抗体-药物缀合物的方法。
附图说明
图1A显示DLBCL细胞系中CD74-L7-P1及P1有效负载的体外活性(CTG 72h)。
图1B显示DLBCL细胞系中CD74-L7-P1、IgG-L7-P1及P1有效负载的体外活性(CTG72h)。
图2显示Monomac1细胞系中各种CD74 ADC及相应有效负载的体外活性(CTG 72h)。
图3显示CD74 MCL-1抗体药物缀合物CD74-L7-P1、同种型IgG-L7-P1 ADC及无MCL-1的有效负载P1针对内源癌细胞系，包括KMS-21BM、KMS-20、MONO-MAC-1、NOMO-1、Kasumi-6及EOL-1的体外活性。
图4显示CD74 MCL-1抗体药物缀合物CD74-L5-P1、同种型IgG-L5-P1 ADC及无MCL-1的有效负载P1单独或与维奈托克(venetoclax)组合针对MONO-MAC-1、NOMO-1及EOL-1的体外活性。
图5显示CD74 MCL-1抗体药物缀合物CD74-L5-P1、同种型IgG-L5-P1 ADC及无MCL-1的有效负载P1单独或与化合物A1组合针对MONO-MAC-1、NOMO-1及EOL-1的体外活性。
图6显示Nomo1移植的雌性SCID小鼠在用IgG1-接头-有效负载Fc沉默、抗CD74_CysmAb Fc沉默及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(30mg/kg，IV施用一次)单独或与维奈托克(50mpk，施用4ON/3OFF/4ON PO)组合治疗(n＝6)后的肿瘤体积(mm3)。三角形及菱形形状分别是指维奈托克及抗体的治疗时间表。
图7显示Nomo1移植的雌性SCID小鼠在用IgG1-接头-有效负载Fc沉默、抗CD74_CysmAb Fc沉默及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(30mg/kg，IV施用一次)单独或与维奈托克(50mpk，施用4ON/3OFF/4ON PO)组合治疗(n＝6)后的体重损失百分比。
图8显示Karpas422移植的雌性NSG小鼠在用IgG1-接头-有效负载Fc沉默、抗CD74_CysmAb Fc沉默及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(30mg/kg，IV施用一次)单独或与维奈托克(50mpk，施用4ON/3OFF/4ON PO)组合治疗(n＝6)后的肿瘤体积(mm3)。三角形及菱形形状分别是指维奈托克及抗体的治疗时间表。
图9显示Karpas422移植的雌性NSG小鼠在用IgG1-接头-有效负载Fc沉默、抗CD74_CysmAb Fc沉默及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(30mg/kg，IV施用一次)单独或与维奈托克(50mpk，施用4ON/3OFF/4ON PO)组合治疗(n＝6)后的体重损失百分比。
图10显示Monomac1移植的雌性SCID小鼠在用IgG1-接头-有效负载Fc沉默、抗CD74_CysmAb Fc沉默及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(30mg/kg，IV施用一次)单独或与维奈托克(50mpk，施用2ON/2OFF/5ON/2OFF/4ON PO)组合治疗(n＝6)后的肿瘤体积(mm3)。三角形及菱形形状分别是指维奈托克及抗体的治疗时间表。
图11显示Monomac1移植的雌性SCID小鼠在用IgG1-接头-有效负载Fc沉默、抗CD74_CysmAb Fc沉默及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(30mg/kg，IV施用一次)单独或与维奈托克(50mpk，施用2ON/2OFF/5ON/2OFF/4ON PO)组合治疗(n＝6)后的体重损失百分比。
图12显示EOL1人类急性髓性(嗜酸性粒细胞性)白血病异种移植的雌性SCID小鼠在用CD74-L5-P1 Fc沉默与维奈托克组合以及各种对照组治疗后的肿瘤体积(mm3)。
图13显示EOL1人类急性髓性(嗜酸性粒细胞性)白血病异种移植的雌性SCID小鼠在用CD74-L5-P1 Fc沉默与维奈托克组合以及各种对照组治疗后的体重损失百分比。
图14显示EOL1人类急性髓性(嗜酸性粒细胞性)白血病异种移植的雌性SCID小鼠在用具有不同接头有效负载的CD74-ADC(L5-P1、L30-P1、L31-P1、L32-P1、L33-P1及L34-P1)治疗后的肿瘤体积(mm3)。
图15显示雌性EOL1人类急性髓性(嗜酸性粒细胞性)白血病异种移植的SCID小鼠在用具有不同接头有效负载的CD74-ADC(L5-P1、L30-P1、L31-P1、L32-P1、L33-P1及L34-P1)治疗后的体重损失百分比。
图16显示使用细菌转谷氨酰胺酶(BTG)的示例性位点特异性抗体缀合。
具体实施方式
结合形成本发明的一部分的附图，参照以下详细描述可更容易地理解所公开的组合物及方法。
在整个本文中，描述涉及组合物及使用该组合物的方法。当本发明描述或要求保护与组合物相关的特征或实施方案时，此类特征或实施方案同样适用于使用该组合物的方法。同样，当本发明描述或要求保护与使用组合物的方法相关的特征或实施方案时，此类特征或实施方案同样适用于该组合物。
当表示值的范围时，其包括使用该范围内之任何特定值的实施方案。此外，对按范围陈述的值的提及包括所述范围内的每一个值。所有范围均包括其端点在内且可组合。当通过在前面使用“约”，以近似值表示值时，应理解特定值形成另一实施方案。除非上下文另外明确指示，否则提及特定数值至少包括该特定值。除非另外指示其使用的特定情形，否则使用“或”将意谓“和/或”。出于任何目的，本文中所引用的所有参考文献均以引用的方式并入。在参考文献与本说明书矛盾的情况下，将以本说明书为准。
除非本说明书的上下文另外指示，例如在无指示特定连接点的符号存在下，否则当绘制结构或结构的片段时，其可独立地使用或附接至ADC的其他组分，且其可以任何定向使用或附接，例如其中抗体在任何适合的附接点处附接至诸如接头-药物的化学部分。然而，在指示的情况下，ADC的组分以在给定式中所显示的定向附接。例如，如果式(1)描述为Ab-(L-D)p且基团“-(L-D)”描述为
Figure BDA0003410186110001101
则式(1)的详述结构为
Figure BDA0003410186110001102
其并非
Figure BDA0003410186110001103
应了解，本文中为清楚起见而在单独实施方案的情形下描述的所公开的组合物及方法的某些特点也可以在单个实施方案中以组合形式提供。相反地，所公开的组合物及方法为了简便起见在单个实施例的情形下描述的各种特点也可单独或以任何子组合形式提供。
如在本申请全篇中所用，抗体药物缀合物可以“靶抗原/抗体-接头-有效负载”的一般形式使用命名惯例确定。仅例如，如果抗体药物缀合物称为“靶X-L0-P0”，则此类缀合物将包含结合靶X的抗体、指定为L0的接头及指定为P0的有效负载。或者，如果抗体药物缀合物称为“抗靶X-L0-P0”，则此类缀合物将包含结合靶X的抗体、指定为L0的接头及指定为P0的有效负载。在另一替代方案中，如果抗体药物缀合物称为“AbX-L0-P0”，则此类缀合物将包含指定为AbX的抗体、指定为L0的接头及指定为P0的有效负载。包含非特异性同种型对照抗体的对照抗体药物缀合物可称为“同种型对照IgG1-L0-P0”或“IgG1-L0-P0”。
本文中给定的任何式还意欲表示化合物的未经标记的形式以及经同位素标记的形式。经同位素标记的化合物具有由本文中给定的式所描绘的结构，其例外之处在于一个或多个原子经具有选定原子质量或质量数的原子替换。可并入本发明化合物中的同位素包括例如氢、碳、氮、氧、氟及氯的同位素，诸如3H、11C、13C、14C、15N、18F及36Cl。因此应理解，本发明包括合并有任何前述同位素中的一或多者的化合物，这类同位素包括例如放射性同位素(诸如3H及14C)，或其中存在非放射性同位素(诸如2H及13C)的化合物。这类经同位素标记的化合物适用于代谢研究(使用14C)；反应动力学研究(使用例如2H或3H)；检测或成像技术，诸如正电子发射断层摄影术(PET)或单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)，包括药物或底物组织分布分析；或适用于患者的放射性治疗。特别地，18F或标记的化合物可能对于PET或SPECT研究为特别需要的。同位素标记的化合物可通常通过本领域技术人员已知的常规技术制备，例如使用适当的同位素标记的试剂代替先前所用未经标记的试剂。
定义
在整个本说明书及权利要求使用与本说明书各方面相关的多种术语。除非另外指示，否则该术语将提供其在本领域中的普通含义。其他特定定义的术语以符合本文所提供的定义的方式解释。
除非上下文另外明确指示，否则如本文所用，单数形式“一个(种)(a/an)”及“该(the)”包括复数形式。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“具有化学式”中的“具有(being of)”、“包括”及“含有”理解为开放式术语(即，意谓“包括但不限于”)。另外，只要“包含”或另一开放式术语用于一实施方案中，应理解同一实施方案可使用过渡术语“基本上由……组成”或封闭式术语“由……组成”更窄地限定。
术语“约”或“大约”当用于数值及范围的情形下时是指近似或接近所列举的值或范围以使得可按预期执行实施例的值或范围，正如本领域技术人员自本文中所含教导内容显而易知的那样。在一些实施方案中，约意谓数字量加或减20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或0.1％。在一个实施方案中，术语“约”是指多于或少于指定值的10％的值范围。在另一实施方案中，术语“约”是指多于或少于指定值的5％的值范围。在另一实施方案中，术语“约”是指多于或少于指定值的1％的值范围。
术语“抗体-药物缀合物”、“抗体缀合物”、“缀合物”、“免疫缀合物”及“ADC”可互换使用，且是指连接至一种或多种抗体或抗原结合片段的一种或多种治疗性化合物(例如Mcl-1抑制剂)。在一些实施方案中，ADC由以下通式定义：Ab-(L-D)p(式1)，其中Ab＝抗体或抗原结合片段，L＝接头部分，D＝药物部分(例如Mcl-1抑制剂药物部分)，且p＝每个抗体或抗原结合片段的药物部分数目。在包含Mcl-1抑制剂药物部分的ADC中，“p”是指连接至抗体或抗原结合片段的Mcl-1抑制剂化合物的数目。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，以指经由免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点识别且特异性结合于靶标，诸如蛋白质、多肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合的免疫球蛋白分子。抗体可为多克隆或单克隆的、多链或单链的或完整免疫球蛋白，且可衍生自天然来源或衍生自重组来源。“完整”抗体为通常包含通过二硫键互连的至少两个重(H)链及两个轻(L)链的糖蛋白。各重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)及重链恒定区构成。重链恒定区包含三个域，即CH1、CH2及CH3。各轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)及轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域，即CL构成。VH区及VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其穿插有称为框架区(FR)的较保守区。各VH及VL自氨基端至羧基端由按以下顺序排列的三个CDR及四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)及经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。抗体可为单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体、骆驼抗体或嵌合抗体。抗体可具有任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子类。抗体可为完整抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”或“功能性抗体片段”是指保持与抗原(例如CD74)的表位特异性相互作用(例如通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗原结合片段也可保持内化至抗原表达细胞中的能力。在一些实施方案中，抗原结合片段也保持免疫效应子活性。术语抗体、抗体片段、抗原结合片段等意欲涵盖在较大巨分子(诸如ADC)的情形下使用来自抗体的结合域。已显示，全长抗体的片段可执行全长抗体的抗原结合功能。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、由VH域及CH1域组成的Fd片段、线性抗体、诸如sdAb的单域抗体(VL或VH)、骆驼VHH域、由诸如二价片段的抗体片段形成的多特异性抗体(包含经铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段)及分离的CDR或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段也可并入单域抗体、最大抗体(maxibody)、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、双特异性或多特异性抗体构建体、ADC、v-NAR及双-scFv中(参见例如Holliger and Hudson(2005)Nat Biotechnol.23(9):1126-36)。抗原结合片段也可移植至基于多肽的骨架中，诸如III型纤连蛋白(Fn3)(参见美国专利第6,703,199号，其描述纤连蛋白多肽微型抗体)。术语“scFv”是指包含含有轻链可变区的至少一个抗原结合片段及包含重链可变区的至少一个抗原结合片段的融合蛋白，其中轻链可变区及重链可变区例如经由合成接头(例如短的柔性多肽接头)连续地连接，且能够表达为单链多肽，且其中scFv保留其衍生自完整抗体的特异性。除非指定，否则scFv可例如关于多肽的N端及C端末端具有任一顺序的VL及VH可变区，scFv可包含VL-接头-VH或可包含VH-接头-VL。抗原结合片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，且结合片段以与完整抗体相同的方式进行效用(例如结合亲和力、内化)筛选。例如，抗原结合片段可通过裂解完整蛋白质，例如通过蛋白酶或化学裂解来制备。
如本文所用的术语“互补决定区”或“CDR”是指在抗体可变区内的氨基酸序列，其赋予抗原特异性及结合亲和力。例如，一般地，各重链可变区中存在三个CDR(例如，HCDR1、HCDR2及HCDR3)且各轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可使用多个公知方案中的任一个，包括以下由所述的那些确定：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人(1997)J Mol Biol.273(4):927-48(“Chothia”编号方案)；ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc(2001)Nucleic Acids Res.29(1):207-9；Lefranc等人(2003)DevComp Immunol.27(1):55-77)(“IMGT”编号方案)；或其组合。在针对给定CDR区(例如HCCDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2或LC CDR3)的组合的Kabat及Chothia编号方案中，在一些实施方案中，CDR对应于定义为Kabat CDR的一部分的氨基酸残基，连同定义为Chothia CDR的一部分的氨基酸残基。如本文所用，根据“Chothia”编号方案定义的CDR有时也称为“高变环”。
在一些实施方案中，根据Kabat，重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)(例如位置35后的插入)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)；且轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)(例如位置27后的插入)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)。在一些实施方案中，根据Chothia，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)(例如位置31后的插入)、52-56(HCDR2)及95-102(HCDR3)；且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)(例如位置30后的插入)、50-52(LCDR2)及91-96(LCDR3)。通过组合Kabat及Chothia两者的CDR定义，在一些实施方案中，CDR包含以下或由以下组成，例如人类VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)以及人类VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)。在一些实施方案中，根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基编号为大约26-35(CDR1)、51-57(CDR2)及93-102(CDR3)，且VL中的CDR氨基酸残基编号为大约27-32(CDR1)、50-52(CDR2)及89-97(CDR3)。在一些实施方案中，根据IMGT，抗体的CDR区可使用程序IMGT/DomainGap Align确定。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指自基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除可能少量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体针对单一抗原性表位具有高度特异性。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂通常包括针对不同表位(或对其具有特异性)的多种抗体。修饰语“单克隆”是指抗体的特征为自基本上均质的抗体群体获得，而不应解释为需要通过任何特定方法产生该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过Kohler等人(1975)Nature 256:495首先描述的杂交瘤方法制得，或可通过重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)制得。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson等人(1991)Nature 352:624-8及Marks等人(1991)J Mol Biol.222:581-97中所述的技术自噬菌体抗体文库分离。该术语也包括具有单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示针对特定表位的单一结合特异性及亲和力。
本文所述的单克隆抗体可为非人类、人类或人源化的。该术语特别地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链中的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，同时该链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体以及这类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要其特异性结合靶抗原和/或展现所需生物活性即可。
如本文所用，术语“人类抗体”是指由人类产生的抗体或具有由人类产生的抗体的氨基酸序列的抗体。该术语包括可变区中的框架与CDR区均衍生自人源序列的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自这类人类序列，例如人类种系序列，或人类种系序列或抗体的突变型，其含有衍生自人类框架序列分析的共有框架序列，例如如Knappik等人((2000)J Mol Biol.296(1):57-86)中所述。免疫球蛋白可变域，例如CDR的结构及位置可使用公知编号方案，例如Kabat编号方案、Chothia编号方案或Kabat与ChothiA的组合和/或ImMunoGenTics(IMGT)编号来定义。本发明的人类抗体可包括非由人类序列编码的氨基酸残基(例如由体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变或促进稳定性或制备的保守置换)。然而，如本文所用，术语“人类抗体”并不意欲包括其中衍生自另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已移植于人类框架序列上的抗体。
如本文所用，术语“重组人类抗体”是指通过重组方式制备、表达、形成或分离的人类抗体，诸如来自针对人类免疫球蛋白基因进行转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体、从转化以表达人类抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)分离的抗体、从重组、组合人类抗体文库分离的抗体及通过涉及所有或一部分人类免疫球蛋白基因、序列与其他DNA序列的剪接的任何其他方式制备、表达、形成或分离的抗体。这类重组人类抗体具有其中框架区及CDR区衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区。在一些实施方案中，然而，这类重组人类抗体可经历体外诱变(或在使用人类Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的VH区及VL区的氨基酸序列为可能不天然存在于体内人类抗体种系库内的序列，尽管衍生自人类种系VH及VL序列及与其相关。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自两种或更多种物种的抗体。在一些情况下，重链及轻链的可变区对应于衍生自具有所需特异性、亲和力及活性的一种物种的抗体的可变区，而恒定区与衍生自另一物种(例如人类)的抗体同源，以使后一物种中的免疫反应减到最少。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指含有来自非人类(例如鼠类)抗体以及人类抗体的序列的抗体形式。这类抗体为含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的一种类型的嵌合抗体。一般而言，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变域的基本上全部，其中所有或基本上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白的区域且所有或基本上所有框架(FR)区是人类免疫球蛋白序列的区域。人源化抗体任选地也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。人源化抗体可通过Fv框架区中和/或所置换的非人类残基内残基的置换而进一步修饰，以改进及优化抗体特异性、亲和力和/或活性。
如本文所用，术语“Fc区”是指包含抗体的恒定域的CH3、CH2及至少一部分铰链区的多肽。任选地，Fc区可包括存在于一些抗体类别中的CH4域。Fc区可包含抗体恒定域的全部铰链区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含抗体的Fc区及CH1区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含抗体的Fc区、CH3区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含来自抗体的恒定域的Fc区、CH1区及κ/λ区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含恒定区，例如重链恒定区和/或轻链恒定区。在一些实施方案中，此类恒定区与野生型恒定区相比经修饰。即，多肽可包含对三个重链恒定域(CH1、CH2或CH3)中的一或多者和/或对轻链恒定区结构域(CL)的变化或修饰。修饰实例包括一个或多个域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或置换。可包括此类变化以使效应子功能、半衰期等优化。
如本文所用的，关于抗体或抗原结合片段“内化”是指能够在结合于细胞后通过细胞的脂质双层膜吸收进入内部区室(即，〝内化”)，优选进入细胞中的降解区室的抗体或抗原结合片段。例如，内化抗HER2抗体是在结合于细胞膜上的HER2之后能够吸收进入细胞中的抗体。在一些实施方案中，本文所公开的ADC中所用的抗体或抗原结合片段靶向细胞表面抗原(例如CD74)，且为内化抗体或内化抗原结合片段(即ADC在抗原结合之后通过细胞膜转移)。在一些实施方案中，内化抗体或抗原结合片段结合细胞表面上的受体。靶向细胞膜上的受体的内化抗体或内化抗原结合片段可以诱导受体介导的内吞作用。在一些实施方案中，内化抗体或内化抗原结合片段经由受体介导的内吞作用吸收进入细胞中。
如本文所用的，关于抗体或抗原结合片段〝非内化”是指在结合于细胞时保留在细胞表面处的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所公开的ADC中使用的抗体或抗原结合片段靶向细胞表面抗原，且为非内化抗体或非内化抗原结合片段(即，ADC在抗原结合之后保留在细胞表面处且不通过细胞膜转移)。在一些实施方案中，非内化抗体或抗原结合片段结合非内化受体或其他细胞表面抗原。示例性非内化细胞表面抗原包括但不限于CA125及CEA，且结合至非内化抗原靶标的抗体也是本领域中已知的(参见例如Bast等人(1981)J Clin Invest.68(5):1331-7；Scholler及Urban(2007)Biomark Med.1(4):513-23；及Boudousq等人(2013)PLoS One 8(7):e69613)。
如本文所用，术语〝结合特异性”是指单个抗体或抗原结合片段相对于不同抗原决定簇与一种抗原决定簇优先反应的能力。特异性程度是指抗体或片段优先结合于抗原决定簇而非不同抗原决定簇的程度。此外，如本文所用，术语〝特异性的”、〝特异性结合”及〝特异性地结合”是指在蛋白质及其他生物制剂的非均质群体中，抗体或抗原结合片段(例如抗CD74抗体)与靶抗原(例如CD74)之间的结合反应。可通过在一组给定条件下比较与适当抗原的结合和与不相关抗原或抗原混合物的结合来测试抗体的结合特异性。如果抗体结合至适当抗原的亲和力比与不相关抗原或抗原混合物的亲和力高至少2倍、5倍、7倍、10倍或更多倍，则认为其具有特异性。〝特异性抗体”或〝靶标特异性抗体”为仅结合靶抗原(例如CD74)，但不结合(或展现极小结合)其他抗原的抗体。在一些实施方案中，特异性结合靶抗原(例如CD74)的抗体或抗原结合片段的KD小于1×10-6M、小于1×10-7M、小于1×10-8M、小于1×10-9M、小于1×10-10M、小于1×10-11M、小于1×10-12M或小于1×10-13M。在一些实施方案中，KD为1pM至500pM。在一些实施方案中，KD是介于500pM至1μM、1μM至100nM或100mM至10nM之间。
如本文所用，术语〝亲和力”是指在单一抗原位点处抗体与抗原之间的相互作用的强度。不受理论束缚，在各抗原结合位点内，抗体〝臂”的可变区在多个位点处通过弱非共价力与抗原相互作用；相互作用愈多，通常亲和力愈强。抗体的结合亲和力为抗原决定簇与抗体的结合位点之间作用的吸引力及排斥力的总和。
术语〝kon”或〝ka”是指抗体与抗原结合形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。该速率可使用标准分析，诸如表面等离子体共振、生物层干涉法或ELISA分析测定。
术语〝koff”或〝kd”是指抗体自抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。该速率可使用标准分析，诸如表面等离子体共振、生物层干涉法或ELISA分析测定。
术语〝KD”是指具体抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。KD由ka/kd计算。该速率可使用标准分析，诸如表面等离子体共振、生物层干涉法或ELISA分析测定。
术语〝表位”是指抗原中能够经抗体(或抗原结合片段)识别且特异性结合的部分。表位决定子一般由分子的化学活性表面组团，诸如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成，且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。当抗原为多肽时，表位可由连续氨基酸或通过多肽的三级折叠而并列的非连续氨基酸形成。表位可为〝线性”或〝构象”的。构象表位与线性表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失，但与后者的结合未丧失。抗体(或抗原结合片段)所结合的表位可以使用本领域中已知的任何表位定位技术鉴别，包括通过直接观测抗原-抗体复合物鉴别表位的X射线晶体学，以及监测抗体与抗原的片段或突变的变型的结合，或监测抗体及抗原的不同部分的溶剂可及性。用于定位抗体表位的示例性策略包括但不限于基于阵列的寡肽扫描、受限蛋白水解、定点诱变、高通量诱变定位、氢-氘交换及质谱法(参见例如Gershoni等人(2007)21:145-56；及Hager-Braun及Tomer(2005)Expert Rev Proteomics 2:745-56)。
也可使用竞争性结合及表位分箱确定共享相同或重叠表位的抗体。竞争性结合可以使用交叉阻断分析，诸如〝Antibodies,A Laboratory Manual”,Cold Spring Harb或Laboratory,Harlow及Lane(1988年第1版,2014年第2版)中所述的分析来评估。在一些实施方案中，在交叉阻断分析中测试抗体或结合蛋白将参考抗体或结合蛋白与诸如CD74的靶抗原(例如，包含CDR和/或选自表3-5中鉴别出的那些的可变域的结合蛋白)的结合减少至少约50％(例如50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％或更多或其间任何百分比)时，鉴别出竞争性结合，和/或反之亦然。在一些实施方案中，竞争性结合可归因于共享或类似(例如部分重叠)的表位，或由于其中抗体或结合蛋白在邻近表位处结合的位阻(参见例如Tzartos,Methods in Molecular Biology(Morris,编辑(1998)第66卷,第55-66页))。在一些实施方案中，可使用竞争性结合分选共享类似表位的结合蛋白的群组。例如，竞争结合的结合蛋白可〝分箱”为具有重叠或邻近表位的结合蛋白群组，而不竞争的这类结合蛋白归入不具有重叠或邻近表位的独立结合蛋白群组。
如本文所用，术语〝肽”、〝多肽”及〝蛋白质”可互换使用指代氨基酸残基的聚合物。该术语涵盖包含通过肽键彼此接合的两个或更多个氨基酸的氨基酸聚合物、其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物及非天然存在的氨基酸聚合物。该术语包括例如生物活性片段、实质上同源的多肽、寡肽、均二聚体、杂二聚体、多肽变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白以及其他物质。该术语也包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。除非另有指示，否则具体多肽序列也隐含地涵盖其保守性修饰的变体。
〝重组”蛋白是指使用重组技术，例如通过表达重组核酸而制成的蛋白质(例如抗体)。
〝分离的”蛋白质是指未伴随有至少一些通常与其天然状态相关的材料的蛋白质。例如，活生物体中存在的天然存在的多核苷酸或多肽是未分离的，但与活生物体中的共存材料中的一些或全部分离的相同多核苷酸或多肽是分离的。该定义包括在本领域中已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生抗体。
如本文所用，〝分离的抗体”为已从其来源环境的组分(按重量计)中的一种或多种(例如大部分)组分，例如杂交瘤细胞培养物或用于其制备的不同细胞培养物的组分鉴别和分离的抗体。在一些实施方案中，执行分离以使得其充分移除可以其他方式干扰抗体用于所需应用(例如用于治疗用途)的适用性的组分。用于制备分离的抗体的方法为本领域中已知的，且包括但不限于蛋白A色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、病毒滞留过滤(virusretentive filtration)及超滤。
如本文所用，术语〝变体”是指分别不同于参考核酸序列或氨基酸序列，但保留参考序列的一种或多种生物特性的核酸序列或氨基酸序列。相对于参考序列，变体可含有一个或多个氨基酸置换、缺失和/或插入(或密码子的相应取代、缺失和/或插入)。核酸变体中的变化可能不改变由参考核酸序列编码的肽的氨基酸序列，或可导致氨基酸置换、添加、缺失、融合和/或截短。在一些实施方案中，本文所公开的核酸变体编码与由未修饰核酸编码的氨基酸序列一致的氨基酸序列，或编码保留未修饰氨基酸序列的一种或多种功能特性的经修饰的氨基酸序列。肽变体的序列的变化通常为有限的或保守的，以使得未修饰的肽及变体的序列整体上十分相似，且在许多区域中相同。在一些实施方案中，肽变体保留未修饰肽序列的一种或多种功能特性。变体及未修饰的肽的氨基酸序列的不同之处可在于任何组合的一个或多个置换、添加、缺失。
核酸或肽的变体可为天然存在的变体或未知为天然存在的变体。核酸及肽的变体可通过诱变技术、通过直接合成或通过本领域中已知的其他技术制成。变体不一定需要物理操纵参考序列。只要与参考序列相比，序列含有不同核酸或氨基酸，则将其视为〝变体”，无论其如何合成。在一些实施方案中，与参考序列相比，变体具有高序列同一性(即，60％核酸或氨基酸序列同一性或更高)。在一些实施方案中，肽变体涵盖具有氨基酸置换、缺失和/或插入的多肽，只要该多肽具有与参考序列或与参考序列的相应节段(例如功能片段)至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的氨基酸序列同一性即可，例如也保留参考序列的一种或多种功能的那些变体。在一些实施方案中，核酸变体涵盖具有氨基酸置换、缺失和/或插入的多核苷酸，只要多核苷酸具有与参考序列或与参考序列的相应节段(例如功能片段)至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的核酸序列同一性即可。
术语〝保守修饰的变体”适用于氨基酸及核酸序列两者。对于核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG及GCU皆编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸通过密码子指定的每一位置上，密码子可改变成描述的任一个相应密码子而不改变编码的多肽。这类核酸变异为〝沉默变异”，其为保守修饰的变异的一个种类。本文中编码多肽的每一核酸序列也描述核酸的每一可能的沉默变异。本领域技术人员应认识到核酸中的各密码子(除通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG及通常为色氨酸的唯一密码子的TGG外)可经修饰以产生功能上一致的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变异隐含于各所述序列中。对于多肽序列，保守修饰的变体包括使得氨基酸用化学上类似氨基酸置换的针对多肽序列的单个置换、缺失或添加。提供功能上类似的氨基酸的保守置换在本领域中已公知。
如本文所用，术语〝保守序列修饰”是指不显著影响或改变例如含有氨基酸序列的抗体或抗原结合片段的结合特征的氨基酸修饰。这类保守修饰包括氨基酸置换、添加及缺失。修饰可通过本领域中已知的标准技术，诸如定点诱变及PCR介导的诱变引入至抗体或抗原结合片段中。保守氨基酸置换为氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基置换的那些。本领域中已限定具有类似侧链的氨基酸残基家族。此类家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在一些实施方案中，抗体内的一个或多个氨基酸残基可用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，且改变的抗体可使用本文所述的功能分析加以测试。
如本文所用，术语〝同源”或〝同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子，诸如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚单元序列同一性。当两个分子中的亚单元位置均由相同单体亚单元占据时，例如当两个DNA分子中每一者中的位置均由腺嘌呤占据时，则其在该位置处为同源或同一的。两个序列之间的同源性与匹配或同源位置的数目直接相关。例如，如果两个序列中一半(例如长度为十个亚单元的聚合物中的五个位置)位置为匹配或同源的，则两个序列为50％同源的；如果90％的位置(例如9/10)为匹配或同源的，则两个序列为90％同源的。
〝序列同一性”的百分比可通过将两个最佳比对的序列在比较窗口内进行比较来测定，其中比较窗口中的氨基酸序列的片段与两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，可包含添加或缺失(例如，空位或突出物)。可通过以下方式计算该百分比：测定两个序列中出现相同氨基酸残基的位置的数目，得到匹配位置数目；将匹配位置数目除以比较窗口中的总位置数目；以及将结果乘以100，得到序列同一性百分比。输出为目标序列相对于查询序列的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数目的函数，其考虑为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位数目及各空位长度。一般而言，本文所公开的蛋白质与其变体，包括靶抗原(诸如CD74)的变体及抗体可变域的变体(包括单个变体CDR)之间的氨基酸同一性或同源性为本文中所描绘的序列的至少80％，例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、几乎100％或100％的同一性或同源性。
可使用数学算法实现序列比较及测定两个序列之间的同一性百分比。在一些实施方案中，使用已并入GCG软件包的GAP程序中的Needleman及Wunsch((1970)J Mol Biol.48:444-53)算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及空位权重16、14、12、10、8、6或4及长度权重1、2、3、4、5或6测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。在一些实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及空位权重40、50、60、70或80及长度权重1、2、3、4、5或6测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。一组示例性参数为Blossum 62评分矩阵，其中空位罚分为12，空位扩展罚分为4，且框转移空位罚分为5。也可使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的Meyers及Miller((1989)CABIOS 4:11-17)的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12及空位罚分4测定两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比。
术语〝药剂”在本文中用于指代化合物、化合物的混合物、生物大分子、由生物材料制成的提取物或其两者或更多者的组合。术语〝治疗剂”或〝药物”是指能够调节生物过程和/或具有生物活性的药剂。如本文所述的Mcl-1抑制剂及包含其的ADC为示例性治疗剂。
术语〝化学治疗剂”或〝抗癌剂”在本文中用于指代有效治疗癌症的所有药剂(不管作用机制如何)。抑制转移或血管生成常常是化学治疗剂的一种特性。化学治疗剂包括抗体、生物分子及小分子，且涵盖如本文所述的Mcl-1抑制剂及包含其的ADC。化学治疗剂可为细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。术语〝细胞生长抑制剂”是指抑制或遏止细胞生长和/或细胞增殖的药剂。术语〝细胞毒性剂”是指主要通过干扰细胞的表达活性和/或功能引起细胞死亡的物质。
如本文所用，术语〝骨髓细胞白血病1”或〝Mcl-1”是指人类Mcl-1的任何天然形式，即Bcl-2蛋白家族的抗细胞凋亡成员。该术语涵盖全长人类Mcl-1(例如UniProt参考序列：Q07820；SEQ ID NO:63)以及可由细胞处理得到的人类Mcl-1的任何形式。该术语也涵盖人类Mcl-1的功能变体或片段，包括但不限于保留人类Mcl-1的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体及异形体(即，除非上下文指示该术语仅用于指野生型蛋白质，否则涵盖变体及片段)。Mcl-1可自人类分离，或可以重组方式或通过合成方法制备。
如本文所用，术语〝抑制(inhibit/inhibition/inhibiting)”意谓将生物活性或过程减少可测量的量，且可包括但不需要完全阻止或抑制。在一些实施方案中，〝抑制”意谓减少Mcl-1和/或其一种或多种上游调节子或下游靶标的表达和/或活性。
如本文所用，术语〝Mcl-1抑制剂”是指能够减少Mcl-1和/或其一种或多种上游调节剂或下游靶标的表达和/或活性的药剂。示例性Mcl-1调节剂(包括Mcl-1的示例性抑制剂)描述于WO 2015/097123；WO 2016/207216；WO 2016/207217；WO 2016/207225；WO 2016/207226；WO 2017/125224；WO 2019/035899、WO 2019/035911、WO 2019/035914、WO 2019/035927、US 2019/0055264、WO 2016/033486、WO 2017/147410、WO 2018/183418及WO 2017/182625中，其中的每一者作为示例性Mcl-1调节剂(包括示例性Mcl-1抑制剂，其可包括为所公开的ADC中的药物部分)以引用的方式并入本文中。例如，可包括为所公开的ADC中的药物部分的示例性Mcl-1抑制剂为下式的那些抑制剂：
Figure BDA0003410186110001251
其中各变量如在WO2019/035911；WO 2019/035899；WO 2019/035914；或WO 2019/035927中定义。特定实例包括例如
Figure BDA0003410186110001261
Figure BDA0003410186110001262
其中作为药物有效负载的各化合物可经由化合物的哌嗪基官能团中的N-甲基的氮原子缀合于抗体或接头。如本文所用，术语〝衍生物”及〝类似物”在提及Mcl-1抑制剂或其类似物时意谓与初始化合物相比保留基本上相同、类似或增强的生物功能或活性但具有改变的化学或生物结构的任何此类化合物。
如本文所用，〝Mcl-1抑制剂药物部分”、〝Mcl-1抑制剂”等是指提供Mcl-1抑制剂化合物或对于附接至ADC修饰的化合物的结构的ADC或组合物的组分，其与初始化合物相比保留基本上相同、类似或增强的生物功能或活性。在一些实施方案中，Mcl-1抑制剂药物部分为式(1)的ADC中的组分(D)。
如本文所用，术语〝癌症”是指存在具有导致癌症的细胞的典型特征(诸如不受控的增殖、永生性、转移潜力、快速生长及增殖率和/或某些形态特征)的细胞。通常，癌细胞可呈肿瘤或肿块形式，但这类细胞可单独存在于受试者内，或可在血流中作为独立细胞循环，诸如白血病或淋巴瘤细胞。术语〝癌症”包括所有类型的癌症及癌症转移，包括血液癌、实体肿瘤、肉瘤、癌瘤以及其他实体及非实体肿瘤癌症。血液癌可包括B细胞恶性肿瘤、血液癌症(白血病)、浆细胞癌症(骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤)或淋巴结癌症(淋巴瘤)。示例性B细胞恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤及弥漫性大B细胞淋巴瘤。白血病可包括急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓单核球性白血病(CMML)、急性单核球性白血病(AMoL)等。淋巴瘤可包括霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤等。其他血液癌可包括骨髓发育不良综合征(MDS)。实体肿瘤可以包括癌瘤，诸如腺癌，例如乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌或结肠直肠癌、肺癌、胃癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胆管癌、神经胶质瘤、黑色素瘤等。在一些实施方案中，癌症为乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性疾病、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，癌症为淋巴瘤或胃癌。
在一些实施方案中，癌症为血液癌，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。例如，本文所述的组合可用于治疗癌症恶性肿瘤及相关病症，包括但不限于例如急性白血病，例如B细胞急性淋巴白血病(BALL)、T细胞急性淋巴白血病(TALL)、急性髓性白血病(AML)、急性淋巴白血病(ALL)；慢性白血病，例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；额外血液癌症或血液病症，例如B细胞前淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增殖病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良及骨髓发育不良综合征、非霍奇金氏淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞赘瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
Figure BDA0003410186110001281
macroglobulinemia)、骨髓纤维化、淀粉样蛋白轻链淀粉样变性病、慢性嗜中性球白血病、原发性血小板增多症、慢性嗜酸性粒细胞白血病、慢性骨髓单核球性白血病、Richter综合征、混合表型急性白血病、急性双表型白血病及〝白血病前期”，其为与骨髓血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液病症的多样集合，等等。
如本文所用，术语〝肿瘤”是指由过量细胞生长或增殖引起的任何组织肿块，可为良性或恶性的，包括癌前病变。在一些实施方案中，肿瘤为乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，肿瘤为胃癌。
术语〝肿瘤细胞”及〝癌细胞”可在本文中互换使用，且是指衍生自肿瘤或癌症的单个细胞或总细胞群体，包括非致瘤细胞及癌症干细胞两者。在仅仅指缺乏更新及分化能力以区分那些细胞与癌症干细胞的那些细胞时，术语〝肿瘤细胞”或〝癌细胞”将由术语〝非致瘤性”修饰。
如本文所用，术语〝靶阴性”、〝靶抗原阴性”或〝抗原阴性”是指细胞或组织中不存在靶抗原表达。术语〝靶阳性”、〝靶抗原阳性”或〝抗原阳性”是指存在靶抗原表达。例如，不表达靶抗原的细胞或细胞系可以描述为靶阴性的，而表达靶抗原的细胞或细胞系可以描述为靶阳性的。
术语〝受试者”及〝患者”在本文中可互换使用以指代需要治疗的任何人类或非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物及非哺乳动物)，诸如任何哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人类、黑猩猩、猿、猴、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、大鼠、小鼠及豚鼠。非哺乳动物的非限制性实例包括鸟类及鱼类。在一些实施方案中，受试者为人类。
如本文所用，术语〝需要治疗的受试者”是指在生物学上、医学上或生活质量上受益于治疗(例如用本文所述的示例性ADC化合物中的任何一种或多种进行的治疗)的受试者。
如本文所用，〝治疗”、“处理”或“疗法”是指疾病、障碍或病症的任何后果的任何好转，诸如延长存活期、较低发病率和/或减轻由替代性治疗模式引起的副作用。在一些实施方案中，治疗包含延迟或改善疾病、障碍或病症(即，减慢或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在一些实施方案中，治疗包含延迟、缓解或改善疾病、障碍或病症的至少一种身体参数，包括患者可能无法辨别的身体参数。在一些实施方案中，治疗包含身体上(例如稳定化可辨别的症状)、生理上(例如稳定化身体参数)或两者调节疾病、障碍或病症。在一些实施方案中，治疗包含向受试者，例如患者施用所述ADC化合物或组合物以获得本文中所列举的治疗益处。治疗可为治愈、恢复、缓解、延迟、预防、减轻、改变、补救、改善、缓和、改良或影响疾病、障碍或病症(例如癌症)，疾病、障碍或病症(例如癌症)的症状或向疾病、障碍或病症(例如癌症)的倾向性。在一些实施方案中，除治疗患有疾病、障碍或病症的受试者之外，也可预防性地提供本文所公开的组合物以预防或降低罹患该疾病、障碍或病症的可能性。
如本文所使用，术语〝预防(prevent/preventing/prevention)”疾病、障碍或病症是指对该疾病、障碍或病症的预防性治疗；或延迟该疾病、障碍或病症的发作或进展。
如本文所用，〝药物组合物”是指除适用于向受试者施用的至少一种其他(及任选地选用的超过一种其他)组分，诸如药学上可接受的载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂之外的组合物，例如ADC化合物或组合物的制剂。本文所提供的药物组合物为如准许施用及随后提供活性成分的预期生物活性和/或获得治疗效果的形式。本文所提供的药物组合物优选不含有对将施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。
如本文所用，可互换使用的术语〝药学上可接受的载体”及〝生理学上可接受的载体”是指不对受试者引起显著刺激且不消除所施用ADC化合物或组合物和/或组合物中的任何另外的治疗剂的生物活性及特性的载体或稀释剂。药学上可接受的载体可增强或稳定组合物，或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体可包括溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，正如本领域技术人员已知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版MackPrinting Company,1990,第1289-1329页)。除非迄今任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗性或药物组合物中。载体可经选择以使受试者的不利副作用降至最低和/或使活性成分的降解降至最低。此类制剂中的任一种中也可包括佐剂。
如本文所用，术语〝赋形剂”是指添加至药物组合物中以进一步促进施用活性成分的惰性物质。用于肠胃外施用的制剂可例如含有赋形剂，诸如无菌水或生理盐水；聚亚烷基二醇(诸如聚乙二醇)、植物油或氢化萘。其他示例性赋形剂包括但不限于碳酸氢钙、磷酸钙、多种糖及各种类型淀粉、纤维素衍生物、明胶、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒及表面活性剂，包括例如聚山梨醇酯20。
如本文所用，术语〝药学上可接受的盐”是指不消除本发明化合物的生物活性及特性，且不会对其所施用的受试者引起显著刺激的盐。这类盐的实例包括但不限于：(a)由无机酸形成的酸加成盐，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；及由有机酸形成的盐，有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、褐藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；及(b)由基本阴离子形成的盐，阴离子诸如氯离子、溴离子及碘离子。参见例如Haynes等人,〝Commentary:Occurrence of Pharmaceutically AcceptableAnions and Cations in the Cambridge Structural Database”,J.PharmaceuticalSciences,第94卷,第10号(2005)及Berge等人,〝Pharmaceutical Salts”,J.Pharmaceutical Sciences,第66卷,第1号(1977)，其以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，根据其电子电荷，本文所述的抗体-药物缀合物(ADC)、接头、有效负载及接头-有效负载可含有单价阴离子抗衡离子M1 -。可使用任何适合的阴离子抗衡离子。在某些实施方案中，单价阴离子抗衡离子为药学上可接受的单价阴离子抗衡离子。在某些实施方案中，单价阴离子抗衡离子M1 -可选自溴离子、氯离子、碘离子、乙酸根、三氟乙酸根、苯甲酸根、甲磺酸根、甲苯磺酸根、三氟甲磺酸根、甲酸根等。在一些实施方案中，单价阴离子抗衡离子M1 -为三氟乙酸根或甲酸根。
如本文所用，术语〝治疗有效量”或〝治疗有效剂量”是指实现所需治疗性结果(即，减少或抑制酶或蛋白质活性、改善症状、缓解症状或病症、延迟疾病进展、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、预防转移)的本文所述的化合物，例如本文所述的ADC化合物或组合物的量。在一些实施方案中，治疗有效量不诱导或引起不希望的副作用。在一些实施方案中，治疗有效量诱发或引起副作用，但仅引起鉴于患者的病症治疗临床医师可接受的副作用。在一些实施方案中，治疗有效量为能有效地实现可检测的杀灭、减少和/或抑制癌细胞的生长或扩散、肿瘤尺寸或数目和/或其他癌症的等级、阶段、进展和/或严重程度的量度。该术语也适用于将诱发靶细胞中的特定响应，例如减少、减慢或抑制细胞生长的剂量。治疗有效量可通过首先施用低剂量，且随后递增地增加该剂量直至达成所需效果来确定。治疗有效量也可视预期应用(体外或体内)、或所治疗的受试者及疾病状况(例如受试者体重及年龄、疾病病症的严重程度)、施用方式等而变化，这类因素可容易地通过一般本领域技术人员确定。具体量可视例如特定药物组合物、受试者及其年龄及现有健康情况或健康情况的风险、待遵循的给药方案、疾病的严重程度、其是否与其他试剂组合施用、施用时序、其所施用的组织及携带于其中的物理递送系统而变化。在癌症情况下，治疗有效量的ADC可以减少癌细胞的数量、减小肿瘤尺寸、抑制(例如减慢或终止)肿瘤转移、抑制(例如减慢或终止)肿瘤生长和/或减轻一种或多种症状。
如本文所用，术语〝预防有效量”或〝预防有效剂量”是指在必要剂量下及必要时间段期间有效获得所需预防结果的本文所公开的化合物，例如本文所述的ADC化合物或组合物的量。通常，由于预防剂量是在疾病之前或在疾病早期阶段时用于受试者，因此预防有效量将小于治疗有效量。在一些实施方案中，预防有效量可预防疾病症状，包括与癌症相关的症状发作。
术语〝p”或〝药物负载”或〝药物:抗体比率”或〝药物与抗体比率”或〝DAR”是指每个抗体或抗原结合片段的药物部分的数目，即药物负载，或式(1)的ADC中每个抗体或抗原结合片段(Ab)的-L-D部分的数目。在包含Mcl-1抑制剂药物部分的ADC中，〝p”是指连接至抗体或抗原结合片段的Mcl-1抑制剂化合物的数目。例如，如果两个Mcl-1抑制剂化合物连接至抗体或抗原结合片段，则p＝2。在包含式(1)的ADC的多个复本的组合物中，〝平均p”是指每个抗体或抗原结合片段的-L-D部分的平均数目，也称为〝平均药物负载”。
抗体-药物缀合物
本发明的抗体-药物缀合物(ADC)化合物包括具有抗癌活性的化合物。特别地，ADC化合物包括缀合(即，通过接头共价附接)至药物部分(例如Mcl-1抑制剂)的抗体或抗原结合片段，其中药物部分在不缀合于抗体或抗原结合片段时具有细胞毒性或细胞生长抑制作用。在一些实施方案中，药物部分在不缀合于抗体或抗原结合片段时能够减少Mcl-1和/或其一种或多种上游调节剂或下游靶标的表达和/或活性。不受理论束缚，在一些实施方案中，通过靶向Mcl-1表达和/或活性，本文所公开的ADC可提供有效抗癌剂。此外，不受理论束缚，通过将药物部分缀合至结合于肿瘤细胞或癌症中的表达相关的抗原的抗体，与单独施用时的药物部分相比，ADC可提供提高的活性、优选细胞毒性特异性和/或减少的脱靶杀灭。
因此，在一些实施方案中，所选ADC的组分应(i)保持分离的抗体及药物部分所展现的一种或多种治疗特性；(ii)维持抗体或抗原结合片段的特异性结合特性；(iii)使药物负载及药物与抗体比率优化；(iv)允许经由稳定附接至抗体或抗原结合片段递送，例如胞内递送药物部分；(v)保持ADC作为完整缀合物的稳定性，直至转运或递送至靶位点；(vi)使ADC在施用之前或之后的聚集减到最少；(vii)在药物部分于细胞环境中经历裂解或其他释放机制之后实现治疗效果，例如细胞毒性效果；(viii)展现类似于或优于分离的抗体及药物部分的体内抗癌治疗功效；(ix)使药物部分引起的脱靶杀伤降至最低；和/或(x)展现所需药代动力学及药效学特性、可配制性及毒理/免疫谱。此类特性中的每一者可提供用于治疗用途的经改善的ADC(Ab等人(2015)Mol Cancer Ther.14:1605-13)。
本发明的ADC化合物可以将有效剂量的细胞毒性或细胞生长抑制剂选择性递送至癌细胞或肿瘤组织。在一些实施方案中，ADC的细胞毒性和/或细胞生长抑制活性取决于细胞中的靶抗原表达。在一些实施方案中，所公开的ADC在杀灭表达靶抗原的癌细胞方面特别有效，同时使脱靶杀灭降至最低。在一些实施方案中，所公开的ADC不会对不表达靶抗原的癌细胞展现细胞毒性和/或细胞生长抑制效果。
在某些方面中，本文提供包含靶向癌细胞的抗体或其抗原结合片段(Ab)、Mcl-1抑制剂药物部分(D)及将Ab共价附接至D的接头部分(L)的ADC化合物。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段能够结合于具有高特异性及高亲和力的肿瘤相关抗原(例如BCMA、CD33、PCAD或HER2)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段在结合时内化至靶细胞中，例如内化至细胞中的降解区室中。在一些实施方案中，ADC在结合至靶细胞后内化，经历降解，且释放Mcl-1抑制剂药物部分以杀死癌细胞。Mcl-1抑制剂药物部分可通过酶促作用、水解、氧化或任何其他机制自该ADC中的抗体和/或接头部分释放。
示例性ADC具有式(1)：
Ab-(L-D)p (1)
其中Ab＝抗体或抗原结合片段，L＝接头部分，D＝Mcl-1抑制剂药物部分，且p＝每个抗体或抗原结合片段的Mcl-1抑制剂药物部分的数目。
抗体
式(1)的抗体或抗原结合片段(Ab)在其范围内包括特异性结合至癌细胞上的靶抗原的任何抗体或抗原结合片段。抗体或抗原结合片段可结合至靶抗原，其中如通过例如
Figure BDA0003410186110001341
分析所测量，解离常数(KD)≤1mM、≤100nM或≤10nM或其间任何量。在一些实施方案中，KD为1pM至500pM。在一些实施方案中，KD是介于500pM至1μM、1μM至100nM或100mM至10nM之间。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是包含两条重链及两条轻链的四链抗体(也称为免疫球蛋白或全长或完整抗体)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段为免疫球蛋白的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段为保留结合目标癌症抗原和/或提供免疫球蛋白的至少一个功能的能力的免疫球蛋白的抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是内化抗体或其内化抗原结合片段。在一些实施方案中，内化抗体或其内化抗原结合片段结合至细胞表面上表达的目标癌症抗原且在结合后进入细胞。在一些实施方案中，在ADC进入及存在于表达目标癌症抗原的细胞中之后(即，ADC已经内化之后)，例如通过裂解、通过降解抗体或抗原结合片段或通过任何其他适合释放机制，自ADC的抗体或抗原结合片段释放ADC的Mcl-1抑制剂药物部分。
除示例性抗原靶标之外，本发明的示例性抗体的氨基酸序列阐述于表C、D及E中。
表C.mAb CDR的氨基酸序列
Figure BDA0003410186110001351
Figure BDA0003410186110001361
Figure BDA0003410186110001371
Figure BDA0003410186110001381
表D.mAb可变区的氨基酸序列及核酸序列
Figure BDA0003410186110001382
Figure BDA0003410186110001391
Figure BDA0003410186110001401
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Figure BDA0003410186110001421
Figure BDA0003410186110001431
表E.全长mAb IgG链的氨基酸及核酸序列(所有重链序列包括用于定点缀合的E152C及S375C突变)
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Figure BDA0003410186110001441
Figure BDA0003410186110001451
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Figure BDA0003410186110001501
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Figure BDA0003410186110001521
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Figure BDA0003410186110001571
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在一些实施方案中，本文所公开的ADC的抗体或抗原结合片段可包含上表中所列的任一组重链及轻链可变域或来自上表中所列的任一组重链及轻链可变域的一组六个CDR。在一些实施方案中，本文所公开的ADC的抗体或抗原结合片段可包含保守修饰的和/或与上表中所列的序列同源的氨基酸序列，只要ADC保留结合于其靶癌症抗原(例如，其中KD小于1×10-8M)的能力，且保留本文所公开的ADC的一种或多种功能特性(例如内化、结合于抗原靶标，例如在肿瘤或其他癌细胞上表达的抗原的能力等)。
在一些实施方案中，本文所公开的ADC的抗体或抗原结合片段进一步包含人类重链及轻链恒定域或其片段。例如，所述ADC的抗体或抗原结合片段可包含人类IgG重链恒定域(诸如IgG1)及人类κ或λ轻链恒定域。在一些实施方案中，所述ADC的抗体或抗原结合片段包含人类免疫球蛋白G亚型1(IgG1)重链恒定域与人类Igκ轻链恒定域。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:1组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:4组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:19组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:21组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:22组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:1组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:35组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:4组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:35组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:22组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:21组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10的重链可变区氨基酸序列及SEQ IDNO:23的轻链可变区氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:10至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:23至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10的重链可变区氨基酸序列及SEQ IDNO:27的轻链可变区氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:10至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:27至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10的重链可变区氨基酸序列及SEQ IDNO:31的轻链可变区氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:10至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:31至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10的重链可变区氨基酸序列及SEQ IDNO:36的轻链可变区氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:10至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:36至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10的重链可变区氨基酸序列及SEQ IDNO:40的轻链可变区氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:10至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:40至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10的重链可变区氨基酸序列及SEQ IDNO:44的轻链可变区氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:10至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:44至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:12至少95％同一的序列及SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:25至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQID NO:25的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:12至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:25至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体为米拉珠单抗(参见美国专利第7931903号)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列或与SEQID NO:14至少95％同一的序列及SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:25至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:14至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:25至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:15至少95％同一的序列及SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:25至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQID NO:25的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:15至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:25至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:12至少95％同一的序列及SEQ ID NO:29的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:29至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQID NO:29的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:12至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:29至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:14至少95％同一的序列及SEQ ID NO:29的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:29至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQID NO:29的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:14至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:29至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:15至少95％同一的序列及SEQ ID NO:29的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:29至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQID NO:29的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:15至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:29至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:12至少95％同一的序列及SEQ ID NO:33的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:33至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQID NO:33的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:12至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:33至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:14至少95％同一的序列及SEQ ID NO:33的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:33至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQID NO:33的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:14至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:33至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:15至少95％同一的序列及SEQ ID NO:33的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:33至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQID NO:33的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:15至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:33至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:12至少95％同一的序列及SEQ ID NO:38的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:38至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQID NO:38的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:12至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:38至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:14至少95％同一的序列及SEQ ID NO:38的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:38至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQID NO:38的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:14至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:38至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:15至少95％同一的序列及SEQ ID NO:38的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:38至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQID NO:38的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:15至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:38至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:12至少95％同一的序列及SEQ ID NO:42的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:42至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQID NO:42的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:12至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:42至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:14至少95％同一的序列及SEQ ID NO:42的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:42至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQID NO:42的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:14至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:42至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:15至少95％同一的序列及SEQ ID NO:42的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:42至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQID NO:42的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:15至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:42至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:12至少95％同一的序列及SEQ ID NO:46的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:46至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQID NO:46的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:12至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:46至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:14至少95％同一的序列及SEQ ID NO:46的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:46至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQID NO:46的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:14至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:46至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:15至少95％同一的序列及SEQ ID NO:46的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:46至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQID NO:46的轻链氨基酸序列，或与所公开的序列至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:15至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列及与SEQ ID NO:46至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。
如果残基占据多肽结构中的类似位置，则两个或更多个多肽中的残基称为〝对应”。两个或更多个多肽中的类似位置可通过基于氨基酸序列或结构类似性比对多肽序列来确定。本领域技术人员理解可能有必要在任一序列中引入空位以产生令人满意的比对。
在一些实施方案中，氨基酸置换为单残基的。插入通常为约1至约20个氨基酸残基的数量级，但显著更大的插入为可容许的，只要保持生物功能(例如结合至靶抗原)即可。缺失通常在约1至约20个氨基酸残基的范围内，但在一些情况下，缺失可能要大得多。置换、缺失、插入或其任何组合可用于获得最终衍生物或变体。一般而言，对数个氨基酸进行这些变化以使该分子，特别是抗原结合蛋白的免疫原性及特异性的改变降至最低。然而，在某些情况下，更大的变化为可容许的。保守置换可根据以下如表1所描绘的图表进行。
表1
Figure BDA0003410186110001681
Figure BDA0003410186110001691
在ADC中使用变异抗体序列的一些实施方案中，变体通常展现相同的定性生物活性且将引发相同免疫反应，尽管也可视需要选择变体以修饰抗原结合蛋白的特征。可替代地，该变体可以设计成使得抗原结合蛋白的生物活性改变。例如，可以改变或移除糖基化位点。
本发明的免疫缀合物可包含修饰的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含对VH和/或VL内框架残基的修饰例如以改良抗体的特性。在一些实施方案中，进行框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法为使一个或多个框架残基〝回复突变”成相应种系序列。更特别地，已经历体细胞突变的抗体可含有不同于抗体所衍生的种系序列的框架残基。这类残基可通过比较抗体框架序列与抗体所衍生的种系序列来鉴别。为使框架区序列恢复其种系构型，体细胞突变可通过例如定点诱变来〝回复突变”成种系序列。本发明也意欲涵盖这类〝回复突变”抗体。
另一类型的框架修饰涉及使框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变，以移除T细胞表位，以由此降低抗体的潜在免疫原性。此方法也称为〝去免疫”，且进一步详细描述于Carr等人的美国专利公开第20030153043号中。
另外地或在框架或CDR区内进行的修饰的替代方案中，本发明的抗体可工程化以包括Fc区内的修饰，通常用于改变抗体的一种或多种功能特性，诸如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，本发明的抗体可经化学修饰(例如，可将一个或多个化学部分附接至抗体上)，或经修饰以改变其糖基化，再次改变该抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案中的每一者进一步详细描述于下文中。
在一个实施方案中，CH1的铰链区经修饰以使得铰链区中的半胱氨酸残基数目改变，例如增加或减少。此方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利第5,677,425号中。CH1铰链区中的半胱氨酸残基数经改变以例如促进轻链及重链的组装或提高或降低抗体的稳定性。
在一些实施方案中，本文所公开的抗体或抗体片段包括经修饰或经工程化的氨基酸残基，例如一个或多个半胱氨酸残基，如用于与药物部分的缀合的位点(Junutula JR等人:Nat Biotechnol 2008,26:925-932)。在一个实施方案中，本发明提供经修饰的抗体或抗体片段，其包含本文所述的位置处用半胱氨酸进行的一个或多个氨基酸的置换。用于半胱氨酸置换的位点位于抗体或抗体片段的恒定区中且因此适用于多种抗体或抗体片段，且位点经选择以提供稳定及均质的缀合物。经修饰的抗体或片段可具有一个、两个或更多个半胱氨酸置换，且此类置换可与如本文所述的其他修饰及缀合方法组合使用。用于在抗体的特异性位置插入半胱氨酸的方法为本领域中已知的，参见例如Lyons等人,(1990)Protein Eng.,3:703-708、WO 2011/005481、WO 2014/124316、WO 2015/138615。在某些实施方案中，经修饰的抗体包含在选自以下的其恒定区内用半胱氨酸进行的一个或多个氨基酸的置换：抗体的重链的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、191、195、197、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400及422，且其中这类位置是根据EU系统编号。在一些实施方案中，经修饰的抗体或抗体片段包含在选自以下的其恒定区内用半胱氨酸进行的一个或多个氨基酸的置换：抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199及203，其中这类位置是根据EU系统编号，且其中轻链为人类κ轻链。在某些实施方案中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区内用半胱氨酸进行的两个或更多个氨基酸的置换的组合，其中这类组合包含在抗体重链的位置375、抗体重链的位置152、抗体重链的位置360或抗体轻链的位置107处的置换，且其中这类位置是根据EU系统编号。在某些实施方案中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区内用半胱氨酸进行的一个氨基酸的置换，其中该置换为抗体重链的位置375、抗体重链的位置152、抗体重链的位置360、抗体轻链的位置107、抗体轻链的位置165或抗体轻链的位置159，且其中这类位置是根据EU系统编号，且其中轻链为κ链。在特定实施方案中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区内用半胱氨酸进行的两个氨基酸的置换的组合，其中这类组合包含抗体重链的位置375及抗体重链的位置152处的取代，其中这类位置是根据EU系统编号。在特定实施方案中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在抗体重链的位置360处用半胱氨酸进行的一个氨基酸的置换，其中这类位置是根据EU系统编号。在其他特定实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在抗体轻链的位置107处用半胱氨酸进行的一个氨基酸的置换，且其中这类位置是根据EU系统编号，且其中轻链为κ链。
在其他实施方案中，本发明的免疫缀合物中适用的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包括经修饰或经工程化的抗体，诸如经修饰以引入一个或多个其他反应性氨基酸(除半胱氨酸以外)(包括Pcl、吡咯赖氨酸肽标签(诸如S6、A1及ybbR标签))及非天然氨基酸代替原始序列中的至少一个氨基酸的抗体，因此在抗体或抗原结合片段上提供用于与具有互补反应性的药物部分或接头-药物部分结合的反应性位点。例如，抗体或抗体片段可经修饰以合并Pcl或吡咯赖氨酸(W.Ou等人,(2011)PNAS 108(26),10437-10442；WO2014124258)或非天然氨基酸(J.Y.Axup等人,Proc Natl Acad Sci U S A,109(2012),第16101-16106页；对于综述，参见C.C.Liu及P.G.Schultz(2010)Annu Rev Biochem 79,413-444；C.H.Kim等人,(2013)Curr Opin Chem Biol.17,412-419)作为用于与药物结合的位点。类似地，可将用于酶促缀合方法的肽标签引入抗体(Strop P.等人,Chem Biol.2013,20(2):161-7；Rabuka D.,Curr Opin Chem Biol.2010年12月；14(6):790-6；Rabuka D等人,NatProtoc.2012,7(6):1052-67)。另一实例为使用4'-磷酰基泛酰巯基转移酶(PPTase)用于辅酶A类似物的缀合(WO2013184514)及(Grünewald等人,(2015)Bioconjugate Chem.26(12),2554-62)。用于使该修饰或工程化的抗体与有效负载或接头-有效负载组合缀合的方法为本领域中已知的。
在另一实施方案中，抗体的Fc铰链区经突变以减少抗体的生物半衰期。更特别地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3域界面区域中，使得抗体对葡萄球菌蛋白质A(SpA)的结合相对于原始Fc铰链域SpA结合而言减弱。此方法进一步详细描述于Ward等人的美国专利第6,165,745号中。
在其他实施方案中，Fc区通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变，以改变抗体的效应子功能。例如，一个或多个氨基酸可经不同氨基酸残基置换以使得该抗体具有改变的针对效应子配体的亲和力、但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应子配体可为例如Fc受体或补体的C1组分。此方法描述于例如Winter等人的美国专利第5,624,821号及第5,648,260号中。
在另一实施方案中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可经不同氨基酸残基置换，以使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法描述于例如Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中。
在另一实施方案中，一个或多个氨基酸残基经改变以由此改变抗体固定补体的能力。此方法描述于例如Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中。异型氨基酸残基也包括但不限于IgG1、IgG2及IgG3子类的重链的恒定区以及κ同种型的轻链的恒定区，如Jefferis等人,MAbs.1:332-338(2009)所述。
在一些实施方案中，抗体包含突变，这类抗体介导降低的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)或无抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，此类突变称为Fc沉默(Fc Silencing/Fc Silent/FcSilenced)突变。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基L234及L235置换为A234及A235(也称为〝LALA”)。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基N297置换为A297(也称为〝N297A”)。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基D265及P329置换为A265及A329(也称为〝DAPA”)。也可使用其他抗体Fc沉默突变。在一些实施方案中，Fc沉默突变组合使用，例如D265A、N297A及P329A(也称为〝DANAPA”)。
在另一实施方案中，一个或多个氨基酸残基经改变以由此改变抗体固定补体的能力。此方法描述于例如Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中。在特定实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸由一个或多个异型氨基酸残基置换。异型氨基酸残基也包括但不限于IgG1、IgG2及IgG3子类的重链的恒定区以及κ同种型的轻链的恒定区，如Jefferis等人,MAbs.1:332-338(2009)所述。
在再一实施方案中，抗体的糖基化经修饰。例如，可制备非糖基化抗体(即，缺乏糖基化的抗体)。糖基化可经改变以例如提高抗体对〝抗原”的亲和力。这类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可进行一个或多个氨基酸置换，从而排除一个或多个可变区框架糖基化位点，以藉此消除该位点的糖基化。这类非糖基化可提高抗体对抗原的亲和力。此类方法描述于例如Co等人的美国专利第5,714,350号及第6,350,861号中。
在另一实施方案中，抗体经修饰以增加其生物半衰期。多种方法为可能的。例如，可引入以下突变中的一或多者：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利第6,277,375号中所描述。可替代地，为了增加生物半衰期，抗体可在CH1或CL区内进行改变以含有获自IgG的Fc区的CH2域的两个环的救助受体结合表位，如Presta等人的美国专利第5,869,046号及第6,121,022号中所描述。
接头
在一些实施方案中，ADC中的接头以一种足以在治疗上有效的方式在细胞外稳定。在一些实施方案中，接头在细胞外部稳定以使得ADC在存在于胞外条件中时(例如在转运或递送至细胞中之前)保持完整。ADC的情形中所用的术语〝完整”意谓抗体或抗原结合片段保持附接至药物部分(例如Mcl-1抑制剂)。
如本文所用，在接头或包含接头的ADC的情形下，〝稳定”意谓当ADC存在于胞外条件中时，ADC样品中的不超过20％、不超过约15％、不超过约10％、不超过约5％、不超过约3％或不超过约1％(或其间任何百分比)的接头经裂解(或在总体ADC的情况下，在其他方面不完整)。在一些实施方案中，相较于替代性接头和/或具有替代性接头和/或Mcl-1抑制剂有效负载的ADC，本文所公开的接头和/或ADC为稳定的。在一些实施方案中，本文所公开的ADC可以保持完整超过约48小时、超过60小时、超过约72小时、超过约84小时或超过约96小时。
可例如通过在血浆中包括ADC达预先确定的时间段(例如2、4、6、8、16、24、48或72小时)且随后定量血浆中存在的游离药物部分的量来确定接头在细胞外是否稳定。稳定性可允许ADC有时间定位至靶癌细胞且防止药物部分过早释放，否则可能因无差别地损害正常及癌症组织而降低ADC的治疗指数。在一些实施方案中，接头在靶细胞外稳定，且一旦在细胞内部即自ADC释放药物部分，以使得药物可结合于其靶标。因此，有效接头将：(i)维持抗体或抗原结合片段的特异性结合特性；(ii)允许经由稳定附接至抗体或抗原结合片段递送，例如胞内递送药物部分；(iii)保持稳定及完整，直至ADC经转运或递送至其靶位点；以及(iv)在裂解或替代性释放机制之后实现药物部分的治疗效果，例如细胞毒性效果。
接头可能影响ADC的物理-化学特性。由于许多细胞毒性剂本质上是疏水性的，故将其连接至具有额外疏水性部分的抗体可能引起聚集。ADC聚集体是不溶性的且通常限制药物负载达到抗体上，由此可能不利地影响ADC的效能。一般而言，生物制品的蛋白质聚集体也与免疫原性增加相关联。如下文所示，本文所公开的接头使ADC具有较低聚集水平及所需的药物负载水平。
接头可为〝可裂解的”或〝不可裂解的”(Ducry及Stump(2010)BioconjugateChem.21:5-13)。可裂解接头经设计以在经历某些环境因素时，例如在内化至靶细胞中时释放药物部分(例如Mcl-1抑制剂)，而不可裂解接头一般依赖于抗体或抗原结合片段本身的降解。
如本文所用，术语〝烷基”是指仅由碳原子及氢原子组成，不含不饱和度的直链或支链烃链基团。如本文所用，术语〝C1-C6烷基”是指仅由碳原子及氢原子组成、不含有不饱和、具有一个至六个碳原子且通过单键附接至分子的其余部分的直链或支链烃链基团。〝C1-C6烷基”的非限制性实例包括甲基(C1烷基)、乙基(C2烷基)、1-甲基乙基(C3烷基)、正丙基(C3烷基)、异丙基(C3烷基)、正丁基(C4烷基)、异丁基(C4烷基)、仲丁基(C4烷基)、叔丁基(C4烷基)、正戊基(C5烷基)、异戊基(C5烷基)、新戊基(C5烷基)及己基(C6烷基)。
如本文所用，术语〝烯基”是指仅由碳原子及氢原子组成，含有至少一个双键的直链或支链烃链基团。如本文所用，术语〝C2-C6烯基”是指仅由碳原子及氢原子组成、含有至少一个双键、具有二个至六个碳原子、经单键附接至分子的其余部分的直链或支链烃链基团。〝C2-C6烯基”的非限制性实例包括乙烯基(C2烯基)、丙-1-烯基(C3烯基)、丁-1-烯基(C4烯基)、戊-1-烯基(C5烯基)、戊-4-烯基(C5烯基)、戊-1,4-二烯基(C5烯基)、己-1-烯基(C6烯基)、己-2-烯基(C6烯基)、己-3-烯基(C6烯基)、己-1-,4-二烯基(C6烯基)、己-1-,5-二烯基(C6烯基)及己-2-,4-二烯基(C6烯基)。如本文所用，术语〝C2-C3烯基”是指仅由碳原子及氢原子组成、含有至少一个双键、具有两个至三个碳原子、通过单键附接至分子的其余部分的直链或支链烃链基团。〝C2-C3烯基”的非限制性实例包括乙烯基(C2烯基)及丙-1-烯基(C3烯基)。
如本文所用，术语〝亚烷基”是指仅由碳原子及氢原子组成且不含不饱和度的二价直链或支链烃链基团。如本文所用，术语〝C1-C6亚烷基”是指仅由碳原子及氢原子组成、不含不饱和度、具有一个至六个碳原子的二价直链或支链烃链基团。〝C1-C6亚烷基”的非限制性实例包括亚甲基(C1亚烷基)、亚乙基(C2亚烷基)、1-甲基亚乙基(C3亚烷基)、亚正丙基(C3亚烷基)、亚异丙基(C3亚烷基)、亚正丁基(C4亚烷基)、异丁烯(C4亚烷基)、亚仲丁基(C4亚烷基)、亚叔丁基(C4亚烷基)、亚正戊基(C5亚烷基)、亚异戊基(C5亚烷基)、亚新戊基(C5亚烷基)及亚己基(C6亚烷基)。
如本文所用，术语〝亚烯基”是指仅由碳原子及氢原子组成且含有至少一个双键的二价直链或支链烃链基团。如本文所用，术语〝C2-C6亚烯基”是指仅由碳原子及氢原子组成、含有至少一个双键且具有二个至六个碳原子的二价直链或支链烃链基团基团。〝C2-C6亚烯基”的非限制性实例包括亚乙烯基(C2亚烯基)、亚丙-1-烯基(C3亚烯基)、亚丁-1-烯基(C4亚烯基)、亚戊-1-烯基(C5亚烯基)、亚戊-4-烯基(C5亚烯基)、亚戊-1,4-二烯基(C5亚烯基)、亚己-1-烯基(C6亚烯基)、亚己-2-烯基(C6亚烯基)、亚己-3-烯基(C6亚烯基)、亚己-1-,4-二烯基(C6亚烯基)、亚己-1-,5-二烯基(C6亚烯基)及亚己-2-,4-二烯基(C6亚烯基)。如本文所用，术语〝C2-C6亚烯基”是指仅由碳原子及氢原子组成、含有至少一个双键且具有两个至三个碳原子的二价直链或支链烃链基团。〝C2-C3亚烯基”的非限制性实例包括亚乙烯基(C2亚烯基)及亚丙-1-烯基(C3亚烯基)。
如本文所用，术语〝环烷基”或〝C3-C8环烷基”是指饱和、单环、稠合双环、稠合三环或桥接多环环系统。稠合双环或桥接多环系统的非限制性实例包括双环[1.1.1]戊烷、双环[2.1.1]己烷、双环[2.2.1]庚烷、双环[3.1.1]庚烷、双环[3.2.1]辛烷、双环[2.2.2]辛烷及金刚烷基。单环C3-C8环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基及环辛基。
如本文所用，术语〝卤烷基”是指经一个或多个卤基代替氢沿烃链取代的直链或支链烷基链。适用于卤烷基中的取代的卤基的实例包括氟、溴、氯及碘。卤烷基可包括经多种卤基代替氢在烷基链中进行的取代，其中这类卤基可在烷基链中附接至同一碳或附接至另一碳。
如本文所用，烷基、烯基、炔基、烷氧基、氨基、芳基、杂芳基、环烷基及杂环烷基可任选地用1至4个选自以下的基团取代：任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基、任选地取代的直链或支链(C2-C6)烯基、任选地取代的直链或支链(C2-C6)炔基、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷氧基、任选地取代的(C1-C6)烷基-S-、羟基、氧代(或适当时N-氧化物)、硝基、氰基、-C(O)-OR0'、-O-C(O)-R0'、-C(O)-NR0'R0”、-NR0'R0”、-(C＝NR0')-OR0”、直链或支链(C1-C6)卤烷基、三氟甲氧基或卤素，其中R0'及R0”各自独立地为氢原子或任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基，且其中直链或支链(C1-C6)烷基的碳原子中的一个或多个任选地氘化。
如本文所用，术语〝聚氧乙烯”、〝聚乙二醇”或〝PEG”是指由(OCH2CH2)基团构成的直链、支链或星形构型。在某些实施方案中，聚亚乙基或PEG基团为-(OCH2CH2)t *-，其中t为4-40，且其中“-”是指指向的自降解间隔子的末端，且“*-”是指附接至末端基团R'的点，其中R'为OH、OCH3或OCH2CH2C(＝O)OH。在其他实施方案中，聚亚乙基或PEG基团为-(CH2CH2O)t *-，其中t为4-40，且其中“-”是指指向自降解间隔子的末端，且“*-”是指附接至末端基团R”的点，其中R”为H、CH3或CH2CH2C(＝O)OH。例如，如本文所用的术语〝PEG12”意谓t为12。
如本文所用，术语〝聚亚烷基二醇”是指由(O(CH2)m)n基团构成的直链、分支链或星形构型。在某些实施方案中，聚亚乙基或PEG基团为-(O(CH2)m)t *-，其中m为1-10，t为4-40，且其中“-”是指指向的自降解间隔子的末端，且“*-”是指附接至末端基团R'的点，其中R'为OH、OCH3或OCH2CH2C(＝O)OH。在其他实施方案中，聚亚乙基或PEG基团为-((CH2)mO)t *-，其中m为1-10，t为4-40，且其中“-”是指指向自降解间隔子的末端，且“*-”是指附接至末端基团R”的点，其中R”为H、CH3或CH2CH2C(＝O)OH。
如本文所用，术语〝反应性基团”为能够与抗体、抗体片段的官能团或附接至抗体或抗体片段的另一反应性基团形成共价键的官能团。这类官能团的非限制性实例包括本文所提供的表2的反应性基团。
如本文所用，术语〝附接基团”或〝偶联基团”是指将桥接间隔子连接至抗体或其片段的二价部分。附接或偶联基团为由反应物基团与抗体或其片段上的官能团之间的反应形成的二价部分。这类二价部分的非限制性实例包括本文所提供的表2及表3中给出的二价化学部分。
如本文所用，术语〝桥接间隔子”是指共价附接在一起以形成二价部分的一种或多种接头组分，该二价部分将二价肽间隔子连接至反应性基团，将二价肽空间连接至偶联基团，或将附接基团连接至至少一个可裂解基团。在某些实施方案中，〝桥接间隔子”包含经由酰胺键附接至二价肽间隔子的N端的羧基。
如本文所用，术语〝间隔子部分”是指共价附接在一起以形成将自降解间隔子连接至亲水性部分的部分的一种或多种接头组分。
如本文所用，术语〝二价肽间隔子”是指包含共价附接在一起以形成将桥接间隔子连接至自降解间隔子的部分的一个或多个氨基酸残基的二价接头。一个或多个氨基酸残基可为选自以下的氨基酸的残基：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸及去甲基吡咯赖氨酸。
在某些实施方案中，〝二价肽间隔子”为2至4个氨基酸残基的组合，其中各残基独立地选自以下的氨基酸的残基：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸及去甲基吡咯赖氨酸，例如-ValCit*；-CitVal*；-AlaAla*；-AlaCit*；-CitAla*；-AsnCit*；-CitAsn*；-CitCit*；-ValGlu*；-GluVal*；-SerCit*；-CitSer*；-LysCit*；-CitLys*；-AspCit*；-CitAsp*；-AlaVal*；-ValAla*；-PheAla*；-AlaPhe*；-PheLys*；-LysPhe*；-ValLys*；-LysVal*；-AlaLys*；-LysAla*；-PheCit*；-CitPhe*；-LeuCit*；-CitLeu*；-IleCit*；-CitIle*；-PheArg*；-ArgPhe*；-CitTrp*；-TrpCit*；-PhePheLys*；-LysPhePhe*；-DphePheLys*；-DlysPhePhe*；-GlyPheLys*；-LysPheGly*；-GlyPheLeuGly-[SEQ ID NO:69]；-GlyLeuPheGly-[SEQ ID NO:64]；-AlaLeuAlaLeu-[SEQ ID NO:65]、-GlyGlyGly*；-GlyGlyGlyGly-[SEQ ID NO:66]；-GlyPheValGly-[SEQ ID NO:67]；及-GlyValPheGly-[SEQID NO:68]，其中“-”是指附接至桥接间隔子的点，且“*”是指附接至自降解间隔子的点。
如本文所用，术语〝接头组分”是指作为接头的一部分的化学部分。接头组分的实例包括：亚烷基：-(CH2)n-，其可为直链或支链(其中在此情况下n为1-18)；亚烯基；亚炔基；烯基；炔基；乙二醇单元：-OCH2CH2-或-CH2CH2O-；聚乙二醇单元：(-CH2CH2O-)x(其中x在此情况下为2-20)；-O-；-S-；羰基：-C(＝O)；酯：C(＝O)-O或O-C(＝O)；碳酸酯：-OC(＝O)O-；胺：-NH-；叔胺；酰胺：-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-或-C(＝O)N(C1-6烷基)；氨基甲酸酯：-OC(＝O)NH-或-NHC(＝O)O；脲：-NHC(＝O)NH；磺酰胺：-S(O)2NH-或-NHS(O)2；醚：-CH2O-或-OCH2-；用一个或多个独立地选自以下的基团取代的亚烷基：羧基、磺酸酯、羟基、胺、氨基酸、糖、磷酸酯及膦酸酯)；用一个或多个独立地选自以下的基团取代的亚烯基：羧基、磺酸酯、羟基、胺、氨基酸、糖、磷酸酯及膦酸酯)；用一个或多个独立地选自以下的基团取代的亚炔基：羧基、磺酸酯、羟基、胺、氨基酸、糖、磷酸酯及膦酸酯)；C1-C10亚烷基，其中一个或多个亚甲基经一个或多个-S-、-NH-或-O-部分置换；具有两个可用附接点的环系统，诸如选自以下的二价环：苯基(包括1,2-二取代的苯基、1,3-二取代的苯基及1,4-二取代的苯基)、C5-C6杂芳基、C3-C8环烷基(包括1,1-二取代的环丙基、环丁基、环戊基或环己基及1,4-二取代的环己基)及C4-C8杂环烷基；选自以下的氨基酸的残基：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸及去甲基吡咯赖氨酸；2个或更多个氨基酸残基的组合，其中各残基独立地选自以下的氨基酸的残基：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸及去甲基吡咯赖氨酸，例如Val-Cit；Cit-Val；Ala-Ala；Ala-Cit；Cit-Ala；Asn-Cit；Cit-Asn；Cit-Cit；Val-Glu；Glu-Val；Ser-Cit；Cit-Ser；Lys-Cit；Cit-Lys；Asp-Cit；Cit-Asp；Ala-Val；Val-Ala；Phe-Lys；Lys-Phe；Val-Lys；Lys-Val；Ala-Lys；Lys-Ala；Phe-Cit；Cit-Phe；Leu-Cit；Cit-Leu；Ile-Cit；Cit-Ile；Phe-Arg；Arg-Phe；Cit-Trp；及Trp-Cit；及自降解间隔子，其中自降解间隔子包含一个或多个保护(触发)基团，其对酸诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解、糖苷酶诱导的裂解、磷酸二酯酶诱导的裂解、磷酸酶诱导的裂解、蛋白酶诱导的裂解、脂肪酶诱导的裂解或二硫键裂解敏感。
这类自降解间隔子的非限制性实例包括：
Figure BDA0003410186110001811
Figure BDA0003410186110001812
其中：
PG为保护(触发)基团；
Xa为O、NH或S；
Xb为O、NH、NCH3或S；
Xc为O或NH；
Ya为CH2、CH2O或CH2NH；
Yb为CH2、O或NH；
Yc为键、CH2、O或NH，且
LG为离去基团，诸如本发明的接头-药物基团的药物部分(D)。
这类自降解间隔子的额外非限制性实例描述于Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,7492-7509中。
另外，接头组分可为易于由两个反应性基团之间的反应形成的化学部分。这类化学部分的非限制性实例在表2中给出。
表2
Figure BDA0003410186110001813
Figure BDA0003410186110001821
Figure BDA0003410186110001831
Figure BDA0003410186110001841
Figure BDA0003410186110001851
Figure BDA0003410186110001861
其中：表2中的R32为H、C1-4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；表2中的R35为H、C1-6烷基、苯基或用1至3个-OH基团取代的C1-4烷基；表2中的各R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、-C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基及-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；表2中的R37独立地选自H、苯基及吡啶；表2中的q为0、1、2或3；表2中的R8及R13各自为H或甲基；且表2中的R9及R14各自为H、-CH3或苯基；表2中的R为H或任何适合的取代基；且表2中的R50为H。
另外，接头组分可为下表3中所列的基团。
表3.
Figure BDA0003410186110001862
Figure BDA0003410186110001871
Figure BDA0003410186110001881
Figure BDA0003410186110001891
如本文所用，当说明化合物的部分结构时，波浪线(﹏)是指部分结构与分子的其余部分的附接点。
如本文所用，术语〝自降解间隔子”及〝自降解基团”是指包含一个或多个触发基团(TG)的部分，这类触发基团通过酸诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解、糖苷酶诱导的裂解、磷酸二酯酶诱导的裂解、磷酸酶诱导的裂解、蛋白酶诱导的裂解、脂肪酶诱导的裂解或二硫键裂解活化，且在活化之后移除保护基，由此产生引起在时间上依序释放离去基团的分解反应的级联。反应的该级联可为但不限于1,4-消除反应、1,6-消除反应或1,8-消除反应。
自降解间隔子或基团的非限制性实例包括：
Figure BDA0003410186110001892
Figure BDA0003410186110001893
其中这类基团可任选地取代，且
其中：
TG为触发基团；
Xa为O、NH或S；
Xb为O、NH、NCH3或S；
Xc为O或NH；
Ya为CH2、CH2O或CH2NH；
Yb为CH2、O或NH；
Yc为键、CH2、O或NH，且
LG为离去基团，诸如本发明的接头-药物基团的药物部分(D)。
自降解间隔子的额外非限制性实例描述于Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,7492-7509中。
在某些实施方案中，自降解间隔子为具有以下结构的部分：
Figure BDA0003410186110001901
其中Lp为酶促可裂解二价肽间隔子，且A、D、L3及R2如本文所定义。
在优选实施方案中，自降解间隔子为具有以下结构的部分：
Figure BDA0003410186110001902
其中Lp为酶促可裂解二价肽间隔子，且D、L3及R2如本文所定义。在一些实施方案中，D为含有季铵化叔胺的MCl1抑制剂。
在其他优选实施例中，自降解间隔子为具有以下结构的部分：
Figure BDA0003410186110001903
其中Lp为酶促可裂解二价肽间隔子，且D、L3及R2如本文所定义。
如本文所用，术语〝亲水性部分”是指具有亲水性特性的部分，其在药物部分(D)附接至本发明的接头基团时提高药物部分(D)的水溶性。这类亲水性基团的实例包括但不限于聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽、用1至3个
Figure BDA0003410186110001911
基团取代的C2-C6烷基。
药物部分
在一些实施方案中，作为接头部分的前体的中间体在适当条件下与药物部分(例如Mcl-1抑制剂)反应。在一些实施方案中，在药物和/或中间体或接头上使用反应性基团。药物与中间体或衍生药物(药物加接头)之间的反应产物随后在促进药物及中间体或衍生药物与抗体或抗原结合片段的结合的条件下与抗体或抗原结合片段反应。可替代地，中间体或接头可首先与抗体或抗原结合片段或衍生抗体或抗原结合片段反应，且随后与该药物或衍生药物反应。
多种不同反应可用于将药物部分和/或接头部分共价附接至抗体或抗原结合片段。此通常是通过使抗体或抗原结合片段的一个或多个氨基酸残基，包括赖氨酸的氨基、谷氨酸及天冬氨酸的游离羧酸基、半胱氨酸的巯基及芳族氨基酸的各种部分反应来实现。例如，非特异性共价附接可以使用碳二亚胺反应物进行以将药物部分上的羧基(或氨基)连接至抗体或抗原结合片段上的氨基(或羧基)。另外，也可使用双官能试剂，诸如二醛或酰亚胺酯将药物部分上的氨基连接至抗体或抗原结合片段上的氨基。希夫碱(Schiff base)反应也可用于将药物(例如Mcl-1抑制剂)附接至结合剂。此方法涉及过碘酸盐氧化含有二醇或羟基的药物，由此形成醛，其随后与结合剂反应。附接是经由与结合剂的氨基形成希夫碱而发生。也可使用异硫氰酸酯作为偶合剂，用于将药物共价附接至结合剂。其他技术是本领域技术人员所知的且在本发明的范围内。可使用本领域中已知的多种化学物质产生且连接至抗体或抗原结合片段的药物部分的实例包括Mcl-1抑制剂，例如本文所描述及例示的Mcl-1抑制剂。
适合的药物部分可包含式(I)、(II)、(III)化合物或对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或其与药学上可接受的酸或碱的加成盐。另外，药物部分可包含本文所述的Mcl-1抑制剂(D)的任何化合物。
如本文所用，〝阻转异构体”为由于围绕单键位阻旋转而产生的立体异构体，其中归因于立体应变或其他促成因素的能量差异形成足够高的旋转障碍以允许单个构象异构体的分离(Bringmann等人Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,5384-5427)。例如，对于根据本发明的式(II)化合物，阻转异构体可为如下：
Figure BDA0003410186110001921
例如，优选阻转异构体可为(5Sa)，也称为(5aS)。
本发明的药物部分可为以下中所公开的化合物中的任一种：国际专利申请公开第WO 2015/097123号；第WO 2016/207216号；第WO 2016/207217号；第WO 2016/207225号；第WO 2016/207226号；第WO 2017/125224号；第WO 2019/035899号；第WO 2019/035911号；第WO 2019/035914号；第WO 2019/035927号；第WO 2016/033486号；第WO 2017/147410号；第WO 2018/183418号及第WO 2017/182625以及美国专利申请公开第2019/0055264号，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的药物部分可包含式(I)化合物：
Figure BDA0003410186110001931
其中：
环D0为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，
环E0为呋喃基、噻吩基或吡咯基环，
X01、X03、X04及X05彼此独立地为碳原子或氮原子，
X02为C-R026基团或氮原子，
Figure BDA0003410186110001932
意指环为芳族的，
Y0为氮原子或C-R03基团，
Z0为氮原子或C-R04基团，
R01为卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、羟基(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-Cy08、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-R012、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
R02、R03、R04及R05彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-R031、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-O-(C1-C6)烷基-R012、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或(R01，R02)、(R02，R03)、(R03，R04)或(R04，R05)对与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中所得环任选地用1或2个选自以下的基团取代：卤素、直链或支链(C1-C6)烷基、(C0-C6)烷基-NR011R011'、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01或氧代，
R06及R07彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-R012、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或(R06，R07)对当与两个相邻碳原子稠合时与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中该所得环任选地用直链或支链(C1-C6)烷基、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01或氧代取代，
W0为-CH2-基团、-NH-基团或氧原子，
R08为氢原子、直链或支链(C1-C8)烷基、-CHR0aR0b基团、芳基、杂芳基、芳基(C1-C6)烷基或杂芳基(C1-C6)烷基，
R09为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、-Cy02、-(C1-C6)烷基-Cy02、-(C2-C6)烯基-Cy02、-(C2-C6)炔基-Cy02、-Cy02-Cy03、-(C2-C6)炔基-O-Cy02、-Cy02-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy03、卤素原子、氰基、-C(O)-R014或-C(O)-NR014R014'，
R010为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、芳基(C1-C6)烷基、(C1-C6)环烷基烷基、直链或支链(C1-C6)卤烷基或-(C1-C6)烷基-O-Cy04，
或(R09，R010)对当与两个相邻碳原子稠合时与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，
R011及R011'彼此独立地为氢原子、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基或-(C0-C6)烷基-Cy01，
或(R011，R011')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除该氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中N原子可用1或2个选自直链或支链(C1-C6)烷基的基团取代，且其中该直链或支链(C1-C6)烷基的碳原子中的一个或多个任选地氘化，
R012为-Cy05、-Cy05-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-NR011-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-Cy06-O-(C0-C6)烷基-Cy07、-Cy05-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy09、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy09、-NH-C(O)-NH-R011、-Cy05-(C0-C6)烷基-NR011-(C0-C6)烷基-Cy09、-C(O)-NR011R011'、-NR011R011'、-OR011、-NR011-C(O)-R011'、-O-(C1-C6)烷基-OR011、-SO2-R011及-C(O)-OR011，
R013、R013'、R014及R014'彼此独立地为氢原子或任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基，
R0a为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
R0b为-O-C(O)-O-R0c基团、-O-C(O)-NR0cR0c'基团或-O-P(O)(OR0c)2基团，
R0c及R0c'彼此独立地为氢原子、直链或支链(C1-C8)烷基、环烷基、(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧羰基(C1-C6)烷基，
或(R0c，R0c')对与其所附接的氮原子一起形成由5至7个环成员构成的非芳环，其除该氮原子之外可含有1至3个选自氧及氮的杂原子，其中该氮任选地用直链或支链(C1-C6)烷基取代，
Cy01、Cy02、Cy03、Cy04、Cy05、Cy06、Cy07、Cy08及Cy010彼此独立地为任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基，
Cy09为
Figure BDA0003410186110001961
或Cy09为杂芳基，其用选自以下的基团取代：-O-P(O)(OR020)2；-O-P(O)(O-M+)2；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；及-U0-(CH2)q0-NR021R021'，
R015为氢原子；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020基团；直链或支链(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基；-U0-(CH2)q0-NR021R021'基团；或-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基，
R016为氢原子；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；(CH2)r0-U0-V0-O-P(O)(OR020)2基团；-O-P(O)(O-M+)2基团；-O-S(O)2OR020基团；-S(O)2OR020基团；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020基团；-(CH2)p0-O-C(O)-NR022R023基团；或-U0-(CH2)q0-NR021R021'基团，
R017为氢原子；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020基团；-CH2-P(O)(OR020)2基团、-O-P(O)(OR020)2基团；-O-P(O)(O-M+)2基团；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；-U0-(CH2)q0-NR021R021'基团；或醛糖酸，
M+为药学上可接受的单价阳离子，
U0为键或氧原子，
V0为-(CH2)s0-基团或-C(O)-基团，
R018为氢原子或(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，
R019为氢原子或羟基(C1-C6)烷基，
R020为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
R021及R021'彼此独立地为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或羟基(C1-C6)烷基，
或(R021，R021')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除该氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中所得环任选地用氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基取代，
R022为(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基、-(CH2)p0-NR024R024'基团或-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020基团，
R023为氢原子或(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，
或(R022，R023)对与其所附接的氮原子一起形成含有5至18个环成员的芳环或非芳环，其除该氮原子之外任选地含有1至5个选自O、S及N的杂原子，其中所得环任选地用氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或杂环烷基取代，
R024及R024'彼此独立地为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
或(R024，R024')对与其所附接的氮原子一起形成由5至7个环成员构成的芳环或非芳环，其除该氮原子之外可含有1至3个选自O、S及N的杂原子，且其中所得环任选地用氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基取代，
R025为氢原子、羟基或羟基(C1-C6)烷基，
R026为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基或氰基，
R027为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
R028为-O-P(O)(O-)(O-)基团、-O-P(O)(O-)(OR030)基团、-O-P(O)(OR030)(OR030')基团、-(CH2)p0-O-SO2-基团、-(CH2)p0-SO2-O-基团、-(CH2)p0-O-SO2-OR030基团、-Cy010、-(CH2)p0-SO2-OR030基团、-O-C(O)-R029基团、-O-C(O)-OR029基团或-O-C(O)-NR029R029'基团；
R029及R029'彼此独立地为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或直链或支链氨基(C1-C6)烷基，
R030及R030'彼此独立地为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基(C1-C6)烷基，
R031为
Figure BDA0003410186110001981
Figure BDA0003410186110001982
其中铵离子任选地以两性离子形式存在或具有单价阴离子抗衡离子，
n0为等于0或1的整数，
p0为等于0、1、2或3的整数，
q0为等于1、2、3或4的整数，
r0及s0独立地为等于0或1的整数；
其中如果存在，则R03、R09或R012基团中的至多一个共价附接至接头，且
其中原子的化合价因一个或多个与其键合的取代基而未超过，
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的药物部分可包含式(II)化合物：
Figure BDA0003410186110001983
其中：
Z0为氮原子或C-R04基团，
R01为卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、-Cy08、-NR011R011'，
R02、R03及R04彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-R031、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或(R02，R03)或(R03，R04)对与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中该环任选地用选自以下的基团取代：直链或支链(C1-C6)烷基、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01及氧代，
R06及R07彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-R012、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或(R06，R07)对当与两个相邻碳原子稠合时与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，且其中该所得环任选地用选自以下的基团取代：直链或支链(C1-C6)烷基、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01及氧代，
R08为氢原子、直链或支链(C1-C8)烷基、芳基、杂芳基、芳基-(C1-C6)烷基或杂芳基(C1-C6)烷基，
R09为直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、-Cy02、-(C1-C6)烷基-Cy02、-(C2-C6)烯基-Cy02、-(C2-C6)炔基-Cy02、-Cy02-Cy03、-(C2-C6)炔基-O-Cy02、-Cy02-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy03、卤素原子、氰基、-C(O)-R014、-C(O)-NR014R014'，
R011及R011'彼此独立地为氢原子、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基或-(C0-C6)烷基-Cy01，
或(R011，R011')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除该氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中该N原子任选地用直链或支链(C1-C6)烷基取代，且其中该直链或支链(C1-C6)烷基的碳原子中的一个或多个任选地氘化，
R012为-Cy05、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-NR011-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-Cy06-O-(C0-C6)烷基-Cy07、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy09、-NH-C(O)-NH-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011R011'、-OR011、-NR011-C(O)-R011'、-O-(C1-C6)烷基-OR011、-SO2-R011或-C(O)-OR011，
R013、R013'、R014及R014'彼此独立地为氢原子或任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基，
Cy01、Cy02、Cy03、Cy05、Cy06、Cy07及Cy08彼此独立地为任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基，
Cy09为
Figure BDA0003410186110002001
其中R015、R016及R017如关于式(I)所定义，
R031为
Figure BDA0003410186110002011
其中R027及R028如关于式(I)所定义，
其中如果存在，则R03、R09或R012基团中的至多一个共价附接至接头，
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的药物部分可包含式(III)化合物：
Figure BDA0003410186110002012
其中：
R01为直链或支链(C1-C6)烷基，
R03为-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'或
Figure BDA0003410186110002013
其中R011及R011'彼此独立地为氢原子、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基或-(C0-C6)烷基-Cy01；
或(R011，R011')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除该氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中N原子可用1或2个选自氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基的基团取代，
且其中R027为氢原子，且R028为-(CH2)p0-O-SO2-O-基团或-(CH2)p0-SO2-OR030基团；
R09为直链或支链(C2-C6)炔基或-Cy02，
R012为-Cy05、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy06或-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy09，
Cy01、Cy02、Cy05及Cy06彼此独立地为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一者任选地被取代，
Cy09为
Figure BDA0003410186110002021
p0、R015、R016及R017如关于式(I)所定义，
其中如果存在，则R03、R09或R012基团中的至多一个共价附接至接头，
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，Cy01、Cy02、Cy03、Cy04、Cy05、Cy06、Cy07、Cy08及Cy010彼此独立地为任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基，其中任选地存在的取代基选自任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基、任选地取代的直链或支链(C2-C6)烯基、任选地取代的直链或支链(C2-C6)炔基、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷氧基、任选地取代的(C1-C6)烷基-S-、羟基、氧代(或适当时N-氧化物)、硝基、氰基、-C(O)-OR0'、-O-C(O)-R0'、-C(O)-NR0'R0”、-NR0'R0”、-(C＝NR0')-OR0”、直链或支链(C1-C6)卤烷基、三氟甲氧基或卤素，其中R0'及R0”各自独立地为氢原子或任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基，且其中直链或支链(C1-C6)烷基的碳原子中的一个或多个任选地氘化。
在一些实施方案中，药物部分(D)包含：
Figure BDA0003410186110002031
Figure BDA0003410186110002041
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
另外，本发明的药物部分可包含以下中的任一种：
Figure BDA0003410186110002042
Figure BDA0003410186110002051
在一些实施方案中，接头-药物(或〝接头-有效负载”部分-(L-D)可包含选自表A的化合物。
药物负载
药物负载是由p表示，且在本文中也称为药物与抗体比率(DAR)。药物负载可在每个抗体或抗原结合片段1至16个药物部分的范围内。在一些实施方案中，p为1至16的整数。在一些实施方案中，p为1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数。在一些实施方案中，p为2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3的整数。在一些实施方案中，p为1至16的整数。在一些实施方案中，p为1至8的整数。在一些实施方案中，p为1至5的整数。在一些实施方案中，p为2至4的整数。在一些实施方案中，p为1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，p为2。在一些实施方案中，p为4。
药物负载可受抗体或抗原结合片段上附接位点的数目的限制。在一些实施方案中，ADC的接头部分(L)经由抗体或抗原结合片段上的一个或多个氨基酸残基上的化学活性基团附接至抗体或抗原结合片段。例如，接头可经由游离氨基、亚氨基、羟基、硫醇或羧基附接至抗体或抗原结合片段(例如N端或C端、一个或多个赖氨酸残基的ε氨基、一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基、或一个或多个半胱氨酸残基的巯基)。与接头附接的位点可为抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中的天然残基，或其可例如通过DNA重组技术(例如通过将半胱氨酸残基引入氨基酸序列中)或通过蛋白质生物化学(例如通过还原、pH调节或水解)引入抗体或抗原结合片段中。
在一些实施方案中，可缀合至抗体或抗原结合片段的药物部分的数目受游离半胱氨酸残基的数目限制。例如，在附接是半胱氨酸巯基的情况下，抗体可具有仅一个或数个半胱氨酸巯基，或可具有仅一个或数个具有足够反应性的巯基，通过这类巯基可附接接头。一般而言，抗体不含有许多可连接至药物部分的游离及反应性半胱氨酸巯基。实际上，抗体中的大部分半胱氨酸巯基残基参与链间或链内二硫键。因此，在一些实施方案中，缀合至半胱氨酸可能需要至少部分还原抗体。接头-毒素与抗体的过量附接可通过还原可用于形成二硫键的半胱氨酸残基使抗体不稳定。因此，最佳的药物:抗体比率应当增加ADC的效能(通过增加每个抗体附接的药物部分的数目)，同时不会使抗体或抗原结合片段不稳定。在一些实施方案中，最佳比率可为2、4、6或8。在一些实施方案中，最佳比率可为2或4。
在一些实施方案中，使抗体或抗原结合片段在缀合之前暴露于还原条件，以便产生一个或多个游离半胱氨酸残基。在一些实施方案中，抗体可在部分或总体还原条件下用还原剂，诸如二硫苏糖醇(DTT)或参(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原，以产生反应性半胱氨酸巯基。可经由用有限摩尔当量的TCEP进行部分还原来产生未经配对的半胱氨酸，该有限摩尔当量的TCEP可还原连接轻链及重链(一对/个H-L配对)及铰链区中的两个重链(在人类IgG1的情况下，两对/个H-H配对)的链间二硫键，但使链内二硫键完整(Stefano等人(2013)Methods Mol Biol.1045:145-71)。在实施例中，通过例如采用工作电极施加交替的还原及氧化电压，以电化学方式还原抗体内的二硫键。此方法可允许将二硫键还原与分析装置(例如电化学检测装置、NMR光谱仪或质谱仪)或化学分离装置(例如液相色谱仪(例如HPLC)或电泳装置(参见例如US 2014/0069822))的在线偶联。在一些实施方案中，抗体经受变性条件以显露诸如半胱氨酸的氨基酸残基上的反应性亲核基团。
ADC的药物负载可通过不同方式控制，例如：(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量；(ii)限制结合反应时间或温度；(iii)用于半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件；和/或(iv)利用重组技术工程化抗体的氨基酸序列以修饰半胱氨酸残基的数目及位置，由此控制接头-药物附接的数目和/或位置。
在一些实施方案中，将游离半胱氨酸残基引入抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中。例如，可制备出半胱氨酸工程化的抗体，其中亲本抗体的一个或多个氨基酸经半胱氨酸氨基酸置换。任何形式的抗体均可经如此工程化，即突变。例如，亲本Fab抗体片段可经工程化以形成经半胱氨酸工程化的Fab，称为〝ThioFab”。类似地，亲本单克隆抗体可经工程化以形成〝ThioMab”。单位点突变在ThioFab中产生单一工程化的半胱氨酸残基，而归因于IgG抗体的二聚体性质，单位点突变在ThioMab中产生两个工程化的半胱氨酸残基。编码亲本多肽的氨基酸序列变体的DNA可通过本领域中已知的各种方法来制备(参见例如WO 2006/034488中所述的方法)。此类方法包括但不限于通过先前制备的编码该多肽的DNA的定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变及卡匣诱变制备。重组抗体变体也可通过限制性片段操纵或通过重叠延伸PCR，利用合成寡核苷酸构筑。式(1)的ADC包括但不限于具有1、2、3或4个经工程化的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon等人(2012)Methods Enzymol.502:123-38)。在一些实施方案中，一个或多个游离半胱氨酸残基已存在于抗体或抗原结合片段中，无需使用工程化，在此情况下，可使用现有游离半胱氨酸残基将抗体或抗原结合片段结合至药物部分。
在超过一个亲核性基团与药物-接头中间体或接头部分试剂反应，随后与药物部分试剂反应的情况下，在包含抗体或抗原结合片段及接头部分的多个复本的反应混合物中，随后所得产物可为ADC化合物的混合物，其具有一个或多个药物部分附接至该混合物中抗体或抗原结合片段的每一复本的分布。在一些实施方案中，由缀合反应得到的ADC的混合物中的药物负载在每个抗体或抗原结合片段附接1至16个药物部分的范围内。每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数目(即，平均药物负载或平均p)可以通过本领域中已知的任何常规方法，例如通过质谱分析(例如液相色谱-质谱法(LC-MS))和/或高效液相色谱(例如HIC-HPLC)计算。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数目是通过液相色谱-质谱法(LC-MS)测定。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数目为约1.5至约3.5、约2.5至约4.5、约3.5至约5.5、约4.5至约6.5、约5.5至约7.5、约6.5至约8.5或约7.5至约9.5。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数目为约2至约4、约3至约5、约4至约6、约5至约7、约6至约8、约7至约9、约2至约8或约4至约8。
在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数目为约2。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数目为约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4或约2.5。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数目为2。
在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数目为约4。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数目为约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4或约4.5。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数目为4。
在一些实施方案中，如关于每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数目所使用的术语〝约”意谓加或减20％、15％、10％、5％或1％。在一个实施方案中，术语〝约”是指是多于或少于指定值的10％的值范围。在另一实施方案中，术语〝约”是指多于或少于指定值的5％的值范围。在另一实施方案中，术语〝约”是指多于或少于指定值的1％的值范围。
单个ADC化合物或〝种类”可在混合物中通过质谱分析鉴别且通过UPLC或HPLC，例如疏水性相互作用色谱(HIC-HPLC)分离。在一些实施方案中，具有单一负载值的均质或接近均质的ADC产物可例如通过电泳或色谱法自缀合混合物分离。
在一些实施方案中，较高药物负载(例如p>16)可能引起某些抗体-药物缀合物的聚集、不可溶性、毒性或细胞渗透性损失。较高的药物负载也可不利地影响某些ADC的药代动力学(例如清除率)。在一些实施方案中，较低药物负载(例如p<2)可能降低某些ADC针对表达靶标的细胞的效能。在一些实施方案中，本发明的ADC的药物负载在约2至约16；约2至约10；约2至约8；约2至约6；约2至约5；约3至约5；约2至约4；或约4至约8的范围内。
在一些实施方案中，例如使用抗体或抗原结合片段上的链内二硫基的部分还原来达成约2的药物负载和/或平均药物负载，且提供有益特性。在一些实施方案中，例如使用抗体或抗原结合片段上的链内二硫基的部分还原来达成约4、或约6、或约8的药物负载和/或平均药物负载，且提供有益特性。在一些实施方案中，小于约2的药物负载和/或平均药物负载可产生不可接受地高水平的未缀合的抗体种类，其可与用于结合于靶抗原CD74的ADC竞争和/或提供降低的治疗功效。在一些实施方案中，大于约16的药物负载和/或平均药物负载可能产生不可接受地高水平的产物异质性和/或ADC聚集。大于约16的药物负载和/或平均药物负载也可能因使抗体或抗原结合片段稳定所需的一个或多个化学键的损失而影响ADC的稳定性。
本发明包括制备所述ADC的方法。简言之，ADC包含作为该抗体或抗原结合片段的抗体或抗原结合片段、药物部分(例如Mcl-1抑制剂)及接合药物部分及抗体或抗原结合片段的接头。在一些实施方案中，ADC可使用具有用于共价附接至药物部分及抗体或抗原结合片段的反应性官能团的接头制备。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段经官能化以制备可与接头或药物-接头中间体反应的官能团。例如，在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段的半胱氨酸巯基可与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以制得ADC。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段利用用含有BCN(N-[(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基]-1,8-二胺-3,6-二恶辛烷)部分的胺特异性官能化的细菌转谷氨酰胺酶(BTG)反应性谷氨酰胺制备。在一些实施方案中，例如如本文中所述及例示，执行接头或药物-接头中间体与抗体或抗原结合片段的BCN部分的定点结合。ADC的产生可通过本领域技术人员已知的技术实现。
在一些实施方案中，ADC通过以依序方式使抗体或抗原结合片段与接头及药物部分(例如Mcl-1抑制剂)接触产生，以使得抗体或抗原结合片段首先共价连接至接头，且随后预先形成的抗体-接头中间体与药物部分反应。抗体-接头中间体在接触药物部分之前可经历或可不经历纯化步骤。在其他实施方案中，ADC是通过使抗体或抗原结合片段与接头-药物化合物接触来制备，该接头-药物化合物是由接头与药物部分反应预先形成。预先形成的接头-药物化合物在接触抗体或抗原结合片段之前可经历或可不经历纯化步骤。在其他实施方案中，抗体或抗原结合片段接触一种反应混合物中的接头及药物部分，由此允许在抗体或抗原结合片段与接头之间及接头与药物部分之间同时形成共价键。此制备ADC的方法可以包括一反应，其中抗体或抗原结合片段在将接头添加至反应混合物中之前接触抗体或抗原结合片段，且反之亦然。在一些实施方案中，ADC通过在允许缀合的条件下使抗体或抗原结合片段与接合至药物部分(诸如Mcl-1抑制剂)的接头反应来制备。
根据上文所述的方法制备的ADC可经历纯化步骤。该纯化步骤可涉及本领域中已知用于纯化蛋白质的任何生物化学方法，或其任何方法组合。此类方法包括但不限于切向流过滤(TFF)、亲和色谱法、离子交换色谱法、基于电荷或等电点的任何色谱法、混合模式色谱法(例如CHT(陶瓷羟基磷灰石))、疏水性相互作用色谱法、尺寸排阻色谱法、透析、过滤、选择性沉淀或其任何组合。
治疗用途及组合物
本文公开使用本文所述的组合物，例如所公开的ADC化合物及组合物治疗受试者的病症，例如癌症的方法。组合物，例如ADC可单独或与至少一种额外非活性剂和/或活性剂，例如至少一种另外的治疗剂组合施用，且可以任何药学上可接受的制剂、剂量及给药方案施用。可针对毒性以及功效指标评估治疗功效且相应地进行调整。功效量度包括但不限于在体外或体内观察到的细胞生长抑制和/或细胞毒性效果、肿瘤体积减小、肿瘤生长抑制作用和/或延长的存活期。
已知确定ADC是否对细胞发挥细胞生长抑制和/或细胞毒性效果的方法。例如，ADC的细胞毒性或细胞生长抑制活性可通过以下测量，例如将表达ADC的靶抗原CD74的哺乳动物细胞暴露在细胞培养基中；将细胞培养约6小时至约6天的时间段；及测量细胞活力(例如使用CellTiter-
Figure BDA0003410186110002121
(CTG)或MTT细胞活力分析)。基于细胞的体外分析也可用于测量ADC的活力(增殖)、细胞毒性及对细胞凋亡的诱导(半胱天冬酶活化)。
为测定细胞毒性，可测量坏死或细胞凋亡(程序性细胞死亡)。坏死通常伴随着质膜的渗透率增加、细胞溶胀及质膜破裂。细胞凋亡可例如通过测量DNA断裂来定量。用于定量体外测定DNA片段化的市售光学测量方法是可用的。包括TUNEL(其检测片段化的DNA中经标记核苷酸的并入)及基于ELISA的分析的这类分析的实例描述于Biochemica(1999)2:34-7(Roche Molecular Biochemicals)中。
细胞凋亡也可通过测量细胞的形态变化来测定。例如，如同坏死，质膜完整性的损失可通过测量对某些染料(例如荧光染料，如吖啶橙(acridine orange)或溴化乙锭)的吸收来测定。用于测量细胞凋亡数目的方法已由Duke及Cohen,Current Protocols inImmunology(Coligan等人,编(1992)第3.17.1-3.17.16页)描述。细胞也可用DNA染料(例如吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙锭)标记且细胞观测到沿内部核膜的染色体凝聚及边集。在一些实施方案中，细胞凋亡也可通过针对半胱天冬酶活性筛选进行测定。在一些实施方案中，可使用Caspase-
Figure BDA0003410186110002122
分析来测量半胱天冬酶-3及半胱天冬酶-7的活性。在一些实施方案中，分析在针对半胱天冬酶活性、荧光素酶活性及细胞溶解优化的试剂中提供致发光半胱天冬酶-3/7受质。在一些实施方案中，以〝添加-混合-测量”格式添加Caspase-
Figure BDA0003410186110002123
3/7试剂可引起细胞溶解，随后底物的半胱天冬酶裂解和由荧光素酶产生的〝辉光型”发光信号的产生。在一些实施方案中，荧光可与存在的半胱天冬酶活性的量成比例，且可以充当细胞凋亡的指标。可经测量以测定细胞凋亡的其他形态变化包括例如细胞质凝聚、增加的膜鼓泡及细胞收缩。测定对癌细胞的此类作用中的任一种指示ADC适用于治疗癌症。
细胞活力可例如通过测定细胞中诸如中性红、锥虫蓝(trypan blue)、结晶紫或ALAMARTM蓝的染料的吸收来测量(参见例如Page等人(1993)Intl J Oncology 3:473-6)。在该分析中，在含有染料的培养基中孵育细胞，洗涤细胞，且以分光光度法测量剩余染料，其反映细胞对染料的吸收。
细胞活力也可例如通过定量作为代谢活性细胞的指标的ATP来测量。在一些实施方案中，所制备的ADC或Mcl-1抑制剂化合物的体外效能和/或细胞活力可使用如本文所提供的实例中所述的CellTiter
Figure BDA0003410186110002131
(CTG)细胞活力分析进行评定。在一些实施方案中，在此分析中，将单一试剂(CellTiter-
Figure BDA0003410186110002132
试剂)直接添加至补充有血清的培养基中所培养的细胞中。添加试剂引起细胞溶解且产生与所存在的ATP的量成正比例的发光信号。ATP的量与存在于培养物中的细胞的数目成正比。
细胞活力也可例如通过测量四唑盐的减少来测量。在一些实施方案中，所制备的ADC或Mcl-1抑制剂化合物的体外效能和/或细胞活力可使用如本文所提供的实例中所述的MTT细胞活力分析进行评定。在一些实施方案中，在此分析中，通过代谢活性细胞，部分地通过去氢酶的作用使黄色四唑MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑溴化物)还原以产生还原等效物，诸如NADH及NADPH。所得胞内紫甲
Figure BDA0003410186110002133
可随后经溶解，且通过分光光度方式定量。
在某些方面中，本发明提供通过破坏Mcl-1和/或其一种或多种上游调节剂或下游靶标的表达和/或活性使癌细胞或组织的生长得到杀灭、抑制或调节的方法。该方法可用于任何受试者，其中破坏Mcl-1表达和/或活性提供治疗益处。可受益于破坏Mcl-1表达和/或活性的受试者包括但不限于患有或处于患有癌症(诸如肿瘤)或血液癌的风险中的受试者。在一些实施方案中，癌症为乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性疾病、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，癌症为淋巴瘤或胃癌。
示例性方法包括使细胞与有效量(即足以杀灭细胞的量)的如本文所述的ADC接触的步骤。该方法可用于例如体外、体内、离体或原位培养物中的细胞。例如，表达CD74的细胞(例如，肿瘤或转移性病灶的活检收集的细胞；来自所确立癌细胞系的细胞；或重组细胞)可在培养基中体外培养，且接触步骤可受将ADC添加至培养基来影响。该方法使得杀死表达CD74的细胞，尤其包括表达CD74的癌细胞。或者，可通过任何适合施用途径(例如静脉内、皮下或与肿瘤组织直接地接触)将ADC向受试者施用以获得体内作用。
所公开的ADC治疗性组合物的体内作用可以在适合动物模型中评估。例如，可使用异种癌症模型，其中将癌症外植体或所传代的异种移植组织引入诸如裸鼠或SCID小鼠的免疫受损动物中(Klein等人(1997)Nature Med.3:402-8)。可使用测量对肿瘤形成、肿瘤消退或转移的抑制作用的分析及类似分析测量功效。
也可使用评估通过诸如细胞凋亡的机制促进肿瘤死亡的体内分析。在一些实施方案中，可以检查来自用治疗性组合物治疗的肿瘤携带小鼠的异种移植物中细胞凋亡病灶的存在且与未治疗的对照异种移植物携带小鼠相比较。在经治疗小鼠的肿瘤中发现细胞凋亡位点的范围提供关于该组合物治疗功效的指示。
本文进一步提供治疗病症，例如癌症的方法。本文所述的组合物，例如本文所公开的ADC可出于治疗目的向非人类哺乳动物或人类受试者施用。治疗方法包括向患有或疑似患有癌症的受试者施用治疗有效量的包含Mcl-1抑制剂的组合物，例如ADC，其中抑制剂连接至结合于(1)在癌细胞上表达，(2)对于结合可及，和/或(3)相较于非癌细胞，定位于或主要表达在癌细胞表面上的抗原的靶向抗体。
示例性实施方案为治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所公开的组合物，例如ADC、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性ADC、组合物或药物组合物中的任一种)。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，癌症为肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症为乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性疾病、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，癌症为淋巴瘤或胃癌。
另一示例性实施方案为将Mcl-1抑制剂递送至表达CD74的细胞的方法，其包括将Mcl-1抑制剂缀合至免疫特异性结合于CD74表位的抗体且使该细胞暴露于ADC。表达指示本发明的ADC的CD74的示例性癌细胞包括多发性骨髓瘤细胞。
在某些方面中，本发明进一步提供减少或抑制肿瘤(例如表达CD74的肿瘤)的生长的方法，其包含施用治疗有效量的ADC或包含ADC的组合物。在一些实施方案中，该治疗足以减少或抑制患者的肿瘤的生长、减少转移性病灶的数目或尺寸、减小肿瘤负荷、减小原发肿瘤负荷、降低侵袭性、延长存活时间和/或维持或改善生活质量。在一些实施方案中，肿瘤为对单独施用时的ADC的抗体或抗原结合片段(例如抗CD74抗体)具有耐药性或难以用其治疗，和/或肿瘤为对单独施用时的Mcl-1抑制剂药物部分具有耐药性或难以用其治疗。
示例性实施方案为减少或抑制受试者的肿瘤的生长的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的ADC、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性ADC、组合物或药物组合物中的任一种)。在一些实施方案中，肿瘤表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，肿瘤为乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，肿瘤为胃癌。在一些实施方案中，与在治疗不存在的情况下的生长相比，施用ADC、组合物或药物组合物将肿瘤的生长减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
另一示例性实施方案为延迟或减慢受试者的肿瘤的生长的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的ADC、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性ADC、组合物或药物组合物中的任一种)。在一些实施方案中，肿瘤表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，肿瘤为乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，肿瘤为胃癌。在一些实施方案中，与在治疗不存在的情况下的生长相比，施用ADC、组合物或药物组合物将肿瘤的生长延迟或减慢至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
在某些方面中，本发明进一步提供减少癌细胞群体(例如表达CD74的癌细胞群体)或减慢癌细胞群体的扩增的方法，其包含施用治疗有效量的ADC或包含ADC的组合物。
示例性实施方案为减少受试者的癌细胞群体或减慢受试者的癌细胞群体的扩增的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的ADC、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性ADC、组合物或药物组合物中的任一种)。在一些实施方案中，癌细胞群体表达靶抗原CD74。在一些实施方案中，癌细胞群体来自肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌细胞群体来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性疾病、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施方案中，癌细胞群体来自淋巴瘤或胃癌。在一些实施方案中，与在治疗不存在的情况下的群体相比，施用ADC、组合物或药物组合物将癌细胞群体减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些实施方案中，与在治疗不存在的情况下的扩增相比，施用ADC、组合物或药物组合物将癌细胞群体的扩增减慢至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
本文还提供确定患有或疑似患有癌症的受试者是否对用所公开的ADC及组合物进行的治疗有反应的方法。示例性实施方案为确定患有或疑似患有癌症的受试者是否对用ADC、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性ADC、组合物或药物组合物中的任一种)进行的治疗有反应的方法，该方法通过提供来自受试者的生物样品；使样品与ADC接触；及检测ADC与样品中的癌细胞的结合。在一些实施方案中，样品组织活检样品、血液样品或骨髓样品。在一些实施方案中，该方法包括提供来自受试者的生物样品；使样品与ADC接触；及检测样品中的癌细胞死亡的一种或多种标记物(例如一种或多种细胞凋亡标记物的表达增加、培养物中的癌细胞群体的扩增减少等)。
本文进一步提供所公开的ADC及组合物的治疗用途。示例性实施方案为用于治疗患有或疑似患有癌症(例如表达CD74的癌症)的受试者的ADC、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性ADC、组合物或药物组合物中的任一种)。另一示例性实施方案为使用ADC、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性ADC、组合物或药物组合物中的任一种)治疗患有或疑似患有癌症(例如表达CD74的癌症)的受试者。另一示例性实施方案为在制备用以治疗患有或疑似患有癌症(例如表达CD74的癌症)的受试者的药物的方法中使用ADC、组合物或药物组合物(例如本文所公开的示例性ADC、组合物或药物组合物中的任一种)。用于鉴别患有表达靶抗原CD74的癌症的受试者的方法为本领域中已知的，且可用于鉴别适合于用所公开的ADC化合物或组合物治疗的患者。
另外，本发明的ADC可向表达ADC能够与其结合的抗原的非人类哺乳动物施用以用于兽医学目的或作为人类疾病的动物模型。就后者而言，这类动物模型可用于评估所公开的ADC的治疗功效(例如测施用剂量及时程)。
用于实践前述方法的治疗性组合物可以配制成包含适合于所需递送方法的药学上可接受的载体的药物组合物。示例性实施方案为包含本发明的ADC及药学上可接受的载体的药物组合物，例如适用于所选施用方式，例如静脉内施用的药物组合物。药物组合物也可包含适用于治疗或预防例如癌症一种或多种额外非活性剂和/或治疗剂(例如标准护理剂等)。药物组合物也可包含一种或多种载体、赋形剂和/或稳定剂组分及其类似物。配制这类药物组合物及适合制剂的方法为本领域中已知的(参见例如〝Remington'sPharmaceutical Sciences”,Mack Publishing Co.,Easton,PA)。
适合载体包括在与治疗组合物组合时保留治疗组合物的抗肿瘤功能，且一般对患者的免疫系统无反应性的任何材料。药学上可接受的载体包括生理上相容的任何及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、生理盐水、磷酸盐缓冲生理生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇、甲磺酸盐等以及其组合中的一或多者。在许多情况下，该组合物中包括等渗剂，例如糖；多元醇，诸如甘露糖醇、山梨糖醇；或氯化钠。药学上可接受的载体可进一步包含极少量辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，由此可增加ADC的保存期限或有效性。
本发明的药物组合物可通过本领域中已知的多种方法施用。施用途径和/或模式可视所需结果而变化。在一些实施方案中，治疗性制剂经溶解且经由能够将治疗性组合物递送至癌症部位的任何途径施用。可能有效的施用途径包括但不限于肠胃外(例如静脉内、皮下)、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮内、器官内、原位等。在一些实施方案中，施用为静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内。药学上可接受的载体应适用于施用途径，例如静脉内或皮下施用(例如通过注射或输注)。视施用途径而定，可将活性化合物(即ADC)和/或任何另外的治疗剂涂布在材料中以保护化合物免受可能使化合物失活的酸作用及其他天然条件影响。施用可为全身或局部的。
本文所公开的治疗性组合物可在制备及储存条件下无菌且稳定，且可呈各种形式。此类形式包括例如液体、半固体及固体剂型，诸如液体溶液(例如可注射溶液及可输注溶液)、分散液或悬浮液、锭剂、丸剂、粉剂、脂质体及栓剂。该形式取决于预期的施用模式及治疗性应用。在一些实施方案中，所公开的ADC可以并入适合于肠胃外施用的药物组合物中。可注射溶液可以由在燧石(flint)或琥珀色小瓶、安瓿或预填充注射器、或其他已知的递送或储存装置中的液体或冻干剂型构成。在一些实施方案中，ADC或药物组合物中的一种或多种是以干燥经灭菌冻干粉末或无水浓缩物形式供应于气密密封式容器中且可复原(例如用水或生理盐水)至适当浓度以向受试者施用。
通常，治疗有效量或生效量的所公开的组合物，例如所公开的ADC用于本发明的药物组合物中。组合物，例如包含ADC的组合物可通过本领域中已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。使用前述方法治疗癌症的剂量及施用方案将随该方法及目标癌症而变化，且一般将取决于本领域中所理解的多种其他因素。
可调整单独或与至少一种额外非活性和/或活性治疗剂组合的本文所公开的组合物，例如包含ADC的组合物的剂量方案以提供最佳所需反应(例如治疗反应)。例如，可一次性施用一种或两种药剂的单次快速注射，可在预定时间段内施用数个分次剂量，或一种或两种药剂的剂量可如由治疗情况的紧急状态指示按比例增加或减少。在一些实施方案中，治疗涉及经由可接受的施用途径单次快速注射或重复施用ADC制剂。在一些实施方案中，每日、每周、每月或其间任何时间段向患者施用ADC。对于任何特定受试者，特定剂量方案可根据受试者的需求及治疗临床医师的专业判断随时间调整。肠胃外组合物可以单位剂型形式配制以易于施用且使剂量均一。如本文所用的单位剂型是指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的实体不连续单元；各单元含有与所需医药载体结合，经计算以产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。
包含ADC和/或任何另外的治疗剂的组合物的剂量值可基于活性化合物的独特特征及待达成的特定治疗效果进行选择。医师或兽医可以比达成所要治疗效果所需水平更低的水平开始药物组合物中所采用的ADC的剂量且逐渐增加剂量直至达成所要效果。一般而言，有效剂量的用于治疗癌症的本发明的组合物可视许多不同因素而变化，包括施用方式、靶部位、患者生理状态、患者为人类或动物、所施用的其他药物及治疗为预防性或治疗性的。所选剂量浓度也可视多种药代动力学因素而定，包括所采用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康及先前病史及类似因素。可滴定治疗剂量以使安全及功效优化。
本文所提供的化合物的毒性及治疗功效可通过标准的医药学程序在细胞培养物或动物模型中测定。例如，可测定LD50、ED50、EC50及IC50，且可按治疗指数计算毒性与治疗效果之间的剂量比率(LD50/ED50)。自体内分析获得的资料可用于估计或配制一系列用于人类的剂量。例如，本文所公开的组合物及方法可首先在异种癌症模型(例如NCI-H929多发性骨髓瘤小鼠模型)中进行评估。
在一些实施方案中，ADC或包含ADC的组合物在单一情况下施用。在其他实施方案中，ADC或包含ADC的组合物在多个情况下施用。单次剂量间的时间间隔可为例如每日、每周、每月或每年。基于测量患者中所施用药剂(例如ADC)的血液含量，时间间隔也可为不规则的，以维持药剂的相对一致血浆浓度。ADC或包含ADC的组合物的施用剂量及频率也可视治疗为预防性或治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时间段内，可以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对较短时间间隔下的相对较高剂量，直至疾病的进展降低或终止，及优选直至患者展现出疾病的一种或多种症状的部分或完全改善。其后，可向患者施用较低的，例如预防性方案。
以上治疗方法可以与多种额外手术、化学疗法或放射疗法方案中的任一组合。在一些实施方案中，本文所公开的ADC或组合物与一种或多种另外的治疗剂(例如一种或多种化学治疗剂：一种或多种标准护理剂)一起共配制和/或共施用以用于所治疗的特定病症。
还提供用于本文所述的治疗性和/或诊断性应用中的试剂盒。这类试剂盒可包含载体、包装或经分隔以接收一个或多个容器(诸如小瓶、管等)的容器，各容器包含待用于本文所公开的方法的单个要素中的一种。标签可存在于容器上以指示试剂盒内的ADC或组合物用于特定疗法或非治疗性应用，诸如预后、预防性、诊断性或实验室应用。标签也可指示关于体内或体外用途，诸如本文所述的用途的指导。在插页或标签上也可包括指导及或其他信息，该插页或标签是包括在试剂盒中或之上。标签可位于容器之上或与容器相关。当将形成标签的字母、数字或其他字符模制或蚀刻至容器自身中时，标签可在容器上。当标签存在于也保持容器的贮器或载体其内时，标签可例如以包装插页形式与容器相关。标签可指示试剂盒内的ADC或组合物是用于诊断或治疗病症，诸如本文所述的癌症。
在一些实施方案中，试剂盒包含ADC或包含ADC的组合物。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含一种或多种额外组分，包括但不限于使用说明书；其他药剂，例如治疗剂(例如标准护理剂)；用于制备ADC的装置、容器或其他材料以用于施用；药学上可接受的载体及用于向受试者施用ADC的装置、容器或其他材料。使用说明书可包括治疗性应用的指南，该指南包括例如患有或疑似患有癌症的患者中的建议剂量和/或施用模式。在一些实施方案中，试剂盒包含ADC及ADC的使用说明书以用于治疗、预防和/或诊断癌症。
组合疗法
在一些实施方案中，本发明提供治疗方法，其中本文所公开的抗体-药物缀合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用。本文公开了示例性组合伴体。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含PD-1抑制剂。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是选自PDR001(Novartis)、纳武单抗(Nivolumab)(Bristol-Myers Squibb)、派姆单抗(Pembrolizumab)(Merck&Co)、匹地利珠单抗(Pidilizumab)(CureTech)、MEDI0680(Medimmune)、REGN2810(Regeneron)、TSR-042(Tesaro)、PF-06801591(Pfizer)、BGB-A317(Beigene)、BGB-108(Beigene)、INCSHR1210(Incyte)或AMP-224(Amplimmune)。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为PDR001。PDR001也称为斯帕塔利单抗(Spartalizumab)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含LAG-3抑制剂。在一些实施方案中，LAG-3抑制剂是选自LAG525(Novartis)、BMS-986016(Bristol-Myers Squibb)或TSR-033(Tesaro)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含TIM-3抑制剂。在一些实施方案中，TIM-3抑制剂为MBG453(Novartis)、TSR-022(Tesaro)、LY-3321367(Eli Lily)、Sym23(Symphogen)、BGB-A425(Beigene)、INCAGN-2390(Agenus)、BMS-986258(BMS)、RO-7121661(Roche)或LY-3415244(Eli Lilly)
在某些实施方案中，本文所述的组合包含PDL1抑制剂。在一个实施方案中，PDL1抑制剂选自FAZ053(Novartis)、阿特珠单抗(atezolizumab)(Genentech)、德瓦鲁单抗(durvalumab)(Astra Zeneca)或阿维鲁单抗(avelumab)(Pfizer)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含GITR促效剂。在一些实施方案中，GITR促效剂为GWN323(NVS)、BMS-986156、MK-4166或MK-1248(Merck)、TRX518(LeapTherapeutics)、INCAGN1876(Incyte/Agenus)、AMG 228(Amgen)或INBRX-110(Inhibrx)。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含IAP抑制剂。在一些实施方案中，IAP抑制剂包含LCL161或国际申请公开第WO 2008/016893号中所公开的化合物。
在一个实施方案中，组合包含mTOR抑制剂(例如，RAD001)(也称为依维莫司(everolimus)))。
在一个实施方案中，组合包含HDAC抑制剂，例如LBH589。LBH589也称为帕比司他(panobinostat)。
在一实施例中，组合包含IL-17抑制剂，例如，CJM112。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含雌激素受体(ER)拮抗剂。在一些实施方案中，雌激素受体拮抗剂与PD-1抑制剂、CDK4/6抑制剂或两者组合使用。在一些实施方案中，组合用于治疗ER阳性(ER+)癌症或乳腺癌(例如，ER+乳腺癌)。
在一些实施方案中，雌激素受体拮抗剂为选择性雌激素受体降解剂(SERD)。SERD为结合至受体且导致受体例如降解或下调的雌激素受体拮抗剂(Boer K.等人,(2017)Therapeutic Advances in Medical Oncology 9(7):465-479)。ER为对于人类生殖系统的例如生长、发育及生理重要的激素活化转录因子。ER通过例如激素雌激素(17β雌二醇)活化。ER表达及信号传导牵涉到癌症(例如，乳腺癌)，例如，ER阳性(ER+)乳腺癌。在一些实施方案中，SERD是选自LSZ102、氟维司群(fulvestrant)、布莱恩司群(brilanestrant)或埃拉司群(elacestrant)。
在一些实施方案中，SERD包含国际申请公开第WO 2014/130310号中公开的化合物，该文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，SERD包含LSZ102。LSZ102具有化学名称：(E)-3-(4-((2-(2-(1,1-二氟乙基)-4-氟苯基)-6-羟基苯并[b]噻吩-3-基)氧基)苯基)丙烯酸。在一些实施方案中，SERD包含氟维司群(CAS登记号：129453-61-8)或国际申请公开第WO 2001/051056号中公开的化合物，该文献以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，SERD包含埃拉司群(CAS登记号：722533-56-4)或美国专利第7,612,114号中公开的化合物，该文献以全文引用的方式并入。埃拉司群也称为RAD1901、ER-306323或(6R)-6-{2-[乙基({4-[2-(乙基氨基)乙基]苯基}甲基)氨基]-4-甲氧基苯基}-5,6,7,8-四氢萘-2-醇。埃拉司群为经口生物可用的非类固醇组合选择性雌激素受体调节剂(SERM)及SERD。也例如在Garner F等人,(2015)Anticancer Drugs 26(9):948-56中公开埃拉司群。在一些实施方案中，SERD为布莱恩司群(CAS登记号：1365888-06-7)或国际申请公开第WO 2015/136017号中公开的化合物，该文献以全文引用的方式并入。
在一些实施方案中，SERD选自RU 58668、GW7604、AZD9496、巴多昔芬(bazedoxifene)、哌喷昔芬(pipendoxifene)、阿佐昔芬(arzoxifene)、OP-1074或阿考比芬(acolbifene)，例如如McDonell等人(2015)Journal of Medicinal Chemistry 58(12)4883-4887所公开。
其他示例性雌激素受体拮抗剂公开于例如WO 2011/156518、WO 2011/159769、WO2012/037410、WO 2012/037411及US 2012/0071535中，这类文献全部以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含细胞周期素依赖性激酶4或6(CDK4/6)的抑制剂。在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂与PD-1抑制剂、雌激素受体(ER)拮抗剂或两者组合使用。在一些实施方案中，组合用于治疗ER阳性(ER+)癌症或乳腺癌(例如，ER+乳腺癌)。在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂选自瑞博西尼(ribociclib)、玻玛西尼(abemaciclib)(Eli Lilly)或帕博西尼(palbociclib)。
在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂包含瑞博西尼(CAS登记号：1211441-98-3)或美国专利第8,415,355号及第8,685,980号中公开的化合物，这类文献以全文引用的方式并入。
在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂包含国际申请公开第WO 2010 020675号及美国专利第8,415,355号及第8,685,980号中公开的化合物，这类文献以全文引用的方式并入。
在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂包含瑞博西尼(CAS登记号：1211441-98-3)。瑞博西尼也称为LEE011、
Figure BDA0003410186110002251
或7-环戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺。
在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂包含玻玛西尼(CAS登记号：1231929-97-7)。玻玛西尼也称为LY835219或N-[5-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]-2-吡啶基]-5-氟-4-[4-氟-2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-苯并咪唑-6-基]-2-氨基嘧啶。玻玛西尼为对CDK4及CDK6具选择性的CDK抑制剂，且公开于例如Torres-Guzman R等人(2017)Oncotarget10.18632/oncotarget.17778中。
在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂包含帕博西尼(CAS登记号：571190-30-2)。帕博西尼也称为PD-0332991、
Figure BDA0003410186110002252
或6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(1-哌嗪基)-2-吡啶基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮。帕博西尼以11nM的IC50抑制CDK4且以16nM的IC50抑制CDK6，且公开于例如Finn等人(2009)Breast Cancer Research 11(5):R77中。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含趋化因子(C-X-C模体)受体2(CXCR2)的抑制剂。在一些实施方案中，CXCR2抑制剂是选自6-氯-3-((3,4-二氧代-2-(戊-3-基氨基)环丁-1-烯-1-基)氨基)-2-羟基-N-甲氧基-N-甲基苯磺酰胺、达尼利辛(danirixin)、瑞帕利辛(reparixin)或纳瓦利辛(navarixin)。
在一些实施方案中，CSF-1/1R结合剂是选自巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)抑制剂，例如，针对M-CSF的单克隆抗体或Fab(例如，MCS110)、CSF-1R酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-((2-(((1R,2R)-2-羟基环己基)氨基)苯并[d]噻唑-6-基)氧基)-N-甲基吡啶甲酰胺或BLZ945)、受体酪氨酸激酶抑制剂(RTK)(例如，吡昔替尼(pexidartinib))或靶向CSF-1R的抗体(例如，埃玛图单抗(emactuzumab)或FPA008)。在一些实施方案中，CSF-1/1R抑制剂为BLZ945。在一些实施方案中，CSF-1/1R结合剂为MCS110。在其他实施方案中，CSF-1/1R结合剂为吡昔替尼。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含c-MET抑制剂。C-MET(一种在多种肿瘤细胞类型中过表达或突变的受体酪氨酸激酶)在肿瘤细胞增殖、存活、侵袭、转移及肿瘤血管生成中起关键作用。c-MET的抑制可诱导过表达c-MET蛋白或表达经组成性活化的c-MET蛋白的肿瘤细胞中的细胞死亡。在一些实施方案中，c-MET抑制剂是选自卡马替尼(capmatinib)(INC280)、JNJ-3887605、AMG 337、LY2801653、MSC2156119J、克唑替尼(crizotinib)、提瓦替尼(tivantinib)或格瓦替尼(golvatinib)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含转型生长因子β(也称为TGF-β、TGFβ、TGFb或TGF-β，在本文中可互换使用)抑制剂。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂是选自夫苏木单抗(fresolimumab)或XOMA 089。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含腺苷A2a受体(A2aR)拮抗剂(例如，A2aR路径的抑制剂，例如，腺苷抑制剂，例如，A2aR或CD-73的抑制剂)。在一些实施方案中，A2aR拮抗剂与PD-1抑制剂以及CXCR2抑制剂、CSF-1/1R结合剂、LAG-3抑制剂、GITR促效剂、c-MET抑制剂或IDO抑制剂中的一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种或全部)组合使用。在一些实施方案中，组合用于治疗胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌或黑色素瘤(例如，难治性黑色素瘤)。在一些实施方案中，A2aR拮抗剂是选自PBF509(NIR178)(Palobiofarma/Novartis)、CPI444/V81444(Corvus/Genentech)、AZD4635/HTL-1071(AstraZeneca/Heptares)、韦帕迪兰(Vipadenant)(Redox/Juno)、GBV-2034(Globavir)、AB928(Arcus Biosciences)、茶碱(Theophylline)、伊曲茶碱(Istradefylline)(Kyowa Hakko Kogyo)、托扎耐特(Tozadenant)/SYN-115(Acorda)、KW-6356(Kyowa Hakko Kogyo)、ST-4206(LeadiantBiosciences)或普雷迪南(Preladenant)/SCH 420814(Merck/Schering)。在不希望受理论束缚的情况下，据信，在一些实施方案中，A2aR的抑制导致IL-1b上调。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和/或色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)的抑制剂。在一些实施方案中，IDO抑制剂与PD-1抑制剂以及TGF-β抑制剂、A2aR拮抗剂、CSF-1/1R结合剂、c-MET抑制剂或GITR促效剂中的一种或多种(例如，两种、三种、四种或全部)组合使用。在一些实施方案中，组合用于治疗胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌或黑色素瘤(例如，难治性黑色素瘤)。在一些实施方案中，IDO抑制剂是选自(4E)-4-[(3-氯-4-氟苯氨基)-亚硝基亚甲基]-1,2,5-恶二唑-3-胺(也称为艾帕斯塔(epacadostat)或INCB24360)、吲哚莫德(indoximod)(NLG8189)、(1-甲基-D-色氨酸)、α-环己基-5H-咪唑并[5,1-a]异吲哚-5-乙醇(也称为NLG919)、吲哚莫德、BMS-986205(先前为F001287)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含半乳糖凝集素(例如，半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3)抑制剂。在一些实施方案中，组合包含半乳糖凝集素-1抑制剂及半乳糖凝集素-3抑制剂。在一些实施方案中，组合包含靶向半乳糖凝集素-1及半乳糖凝集素-3两者的双特异性抑制剂(例如，双特异性抗体分子)。在一些实施方案中，半乳糖凝集素抑制剂与一种或多种本文所述的治疗剂组合使用。在一些实施方案中，半乳糖凝集素抑制剂是选自抗半乳糖凝集素抗体分子、GR-MD-02(Galectin Therapeutics)、半乳糖凝集素-3C(MandalMed)、Anginex或OTX-008(OncoEthix,Merck)。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含MEK抑制剂。在一些实施方案中，MEK抑制剂是选自曲美替尼(Trametinib)、司美替尼(selumetinib)、AS703026、BIX 02189、BIX02188、CI-1040、PD0325901、PD98059、U0126、XL-518、G-38963或G02443714。在一些实施方案中，MEK抑制剂为曲美替尼。
在一个实施方案中，本文所述的组合包括介白素-1β(IL-1β)抑制剂。在一些实施方案中，IL-1β抑制剂是选自康纳单抗(canakinumab)、吉伏珠单抗(gevokizumab)、阿那白滞素(Anakinra)或利纳西普(Rilonacept)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含IL-15/IL-15RA复合物。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Ra复合物是选自NIZ985(Novartis)、ATL-803(Altor)或CYP0150(Cytune)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含小鼠双微体2同源物(MDM2)抑制剂。MDM2的人类同源物也称为HDM2。在一些实施方案中，本文所述的MDM2抑制剂也称为HDM2抑制剂。在一些实施方案中，MDM2抑制剂是选自HDM201或CGM097。
在一个实施方案中，MDM2抑制剂包含(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-(甲基(((1r,4S)-4-(4-甲基-3-氧代哌嗪-1-基)环己基)甲基)氨基)苯基)-1,2-二氢异喹啉-3(4H)-酮(也称为CGM097)或PCT公开第WO 2011/076786号中所公开的化合物以治疗病症(例如，本文所述的病症)。在一个实施方案中，本文所公开的治疗剂与CGM097组合使用。
在一些实施方案中，本文所述的组合包含低甲基化剂(HMA)。在一个一些实施方案中，HMA选自地西他滨(decitabine)或阿扎胞苷(azacitidine)。
在某些实施方案中，本文所述的组合包含作用于Bcl2家族的促存活蛋白质的抑制剂。在某些实施方案中，本文所述的组合包含Bcl-2抑制剂。在一些实施方案中，Bcl-2抑制剂为维奈托克：
Figure BDA0003410186110002281
在一个实施方案中，Bcl-2抑制剂选自WO 2013/110890及WO 2015/011400中所述的化合物。在一些实施方案中，Bcl-2抑制剂包含纳维克拉斯(navitoclax)(ABT-263)、ABT-737、BP1002、SPC2996、APG-1252、甲磺酸奥巴克拉(obatoclax mesylate)(GX15-070MS)、PNT2258、Zn-d5、BGB-11417或奥利默森(oblimersen)(G3139)。在一些实施方案中，Bcl-2抑制剂为(S)-5-(5-氯-2-(3-(N-吗啉基甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)苯基)-N-(5-氰基-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-羟基苯基)-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺)，化合物A1：
Figure BDA0003410186110002291
在一些实施方案中，Bcl-2抑制剂为N-(4-羟基苯基)-3-[6-[(3S)-3-(N-吗啉基甲基)-3,4-二氢-1H-异喹啉-2-羰基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基]-N-苯基-5,6,7,8-四氢吲哚嗪-1-甲酰胺，化合物A2：
Figure BDA0003410186110002292
在一个实施方案中，本文所公开的抗体-药物缀合物或组合适用于体内治疗癌症。例如，组合可用于抑制癌性肿瘤的生长。组合也可与以下中的一或多者组合使用：标准护理治疗(例如，用于癌症或感染性病症)、疫苗(例如，治疗性癌症疫苗)、细胞疗法、放射疗法、手术或任何其他治疗剂或模式，以治疗本文的病症。例如，为实现免疫的抗原特异性增强，该组合可与所关注的抗原一起施用。本文所公开的组合可以任一顺序或同时施用。
另外的实施方案
本发明提供接头-药物基团、抗体-药物缀合物、接头基团及缀合方法的以下额外实施方案。
接头-药物基团
在一些实施方案中，本发明的接头-药物基团可为具有式(A')的结构的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003410186110002301
其中：
R1为反应性基团；
L1为桥接间隔子；
Lp为二价肽间隔子；
G-L2-A为自降解间隔子；
R2为亲水性部分；
L2为键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002302
Figure BDA0003410186110002303
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为间隔子部分；且
D为药物部分，其在例如自本文所公开的抗体药物缀合物或免疫缀合物释放时能够抑制Mcl-1蛋白的活性。
本发明的接头-药物基团的某些方面及实例提供于所列举的实施方案的以下清单中。应认识到，在各实施方案中指定的特点可与其他指定特点组合，以提供本发明的其他实施方案。
实施方案1.式(A')化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为反应性基团；
L1为桥接间隔子；
Lp为包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔子；
G-L2-A为自降解间隔子；
R2为亲水性部分；
L2为键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002311
Figure BDA0003410186110002312
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为间隔子部分；且
D为如本文所定义的药物部分，例如MCl-1抑制剂。
实施方案2.式(A')化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为反应性基团；
L1为桥接间隔子；
Lp为包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔子；
Figure BDA0003410186110002313
基团选自：
Figure BDA0003410186110002314
其中
Figure BDA0003410186110002315
的*是指附接至D(例如，附接至药物部分的N或O)的点；
Figure BDA0003410186110002316
的***是指附接至Lp的点；
R2为亲水性部分；
L2为键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002317
Figure BDA0003410186110002321
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为间隔子部分；且
D为如本文所定义的药物部分，例如MCl-1抑制剂。
实施方案3.式(A')的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(B')的结构：
Figure BDA0003410186110002322
其中：
R1为反应性基团；
L1为桥接间隔子；
Lp为包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔子；
R2为亲水性部分；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002323
Figure BDA0003410186110002324
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为间隔子部分；且
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A。
实施方案4.式(A')或如实施方案1至3中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为
Figure BDA0003410186110002331
-ONH2、-NH2、
Figure BDA0003410186110002332
Figure BDA0003410186110002333
-N3、
Figure BDA0003410186110002334
-SH、-SR3、-SSR4、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、
Figure BDA0003410186110002335
C(O)NHNH2、
Figure BDA0003410186110002336
Figure BDA0003410186110002337
Figure BDA0003410186110002341
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；
*-C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；
*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；
*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；
*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；
*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；
*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；
*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；
*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**；或
*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，
其中L1的*是指附接至Lp的点，且L1的**是指附接至R1的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002342
基团取代的C2-C6烷基；
各R3独立地选自H及C1-C6烷基；
R4为2-吡啶基或4-吡啶基；
各R5独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；
各R6独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；
各R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、-C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基及-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
X1为
Figure BDA0003410186110002351
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为二价肽间隔子，其包含选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸及酪氨酸；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002352
Figure BDA0003410186110002353
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002354
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；且
L3的*是指附接至R2的点；
且
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A。
实施方案5.式(A')或如实施方案1至4中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为
Figure BDA0003410186110002361
-ONH2、
Figure BDA0003410186110002362
Figure BDA0003410186110002363
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点，且L1的**是指附接至R1的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002364
Figure BDA0003410186110002365
Figure BDA0003410186110002371
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002372
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002373
基团取代的C2-C6烷基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002374
Figure BDA0003410186110002375
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A。
实施方案6.式(A')或如实施方案1至5中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为
Figure BDA0003410186110002381
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点，且L1的**是指附接至R1的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002382
(ValCit)，其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002383
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002391
基团取代的C2-C6烷基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002392
Figure BDA0003410186110002393
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
且
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A。
实施方案7.式(A')或如实施方案1至6中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R1为
Figure BDA0003410186110002394
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点，且L1的**是指附接至R1的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002401
(ValCit)，其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002402
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**或-NHC(＝O)NH-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002403
基团取代的C2-C6烷基；
A为键或-OC(＝O)*，其中*指示附接至D的点；
且
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A。
实施方案8.式(A')或如实施方案1至7中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为
Figure BDA0003410186110002404
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点，且L1的**是指附接至R1的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002411
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002412
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**或-C(＝O)N(X-R2)-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002413
基团取代的C2-C6烷基；
A为键或-OC(＝O)*，其中*指示附接至D的点；
且
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A。
实施方案9.式(A')或如实施方案1至8中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为选自表2的反应性基团。
实施方案10.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为
Figure BDA0003410186110002421
-ONH2、-NH2、
Figure BDA0003410186110002422
Figure BDA0003410186110002423
-N3、
Figure BDA0003410186110002424
-SH、-SR3、-SSR4、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、
Figure BDA0003410186110002425
-C(O)NHNH2、
Figure BDA0003410186110002426
Figure BDA0003410186110002427
Figure BDA0003410186110002431
实施方案11.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为
Figure BDA0003410186110002432
-ONH2、-NH2、
Figure BDA0003410186110002433
Figure BDA0003410186110002434
-N3、
Figure BDA0003410186110002435
-SH、-SR3、-SSR4、-S(＝O)2(CH＝CH2)、
-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、
Figure BDA0003410186110002436
-C(O)NHNH2、
Figure BDA0003410186110002437
实施方案12.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为
Figure BDA0003410186110002441
-ONH2、
Figure BDA0003410186110002442
Figure BDA0003410186110002443
实施方案13.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为
Figure BDA0003410186110002444
-ONH2、
Figure BDA0003410186110002445
Figure BDA0003410186110002446
实施方案14.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为
Figure BDA0003410186110002447
实施方案15.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为-ONH2。
实施方案16.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R1为
Figure BDA0003410186110002448
实施方案17.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为
Figure BDA0003410186110002451
实施方案18.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002452
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案19.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002453
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案20.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002454
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案21.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002461
其中各R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案22.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002462
其中各R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案23.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002463
其中
Xa为-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-，且各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案24.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002471
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案25.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002472
其中
Xb为-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-，且各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案26.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002473
实施方案27.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002474
实施方案28.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002481
实施方案29.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002482
实施方案30.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002483
实施方案31.式(A')或如实施方案1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其具有表A中的化合物的结构。
实施方案32.一种具有式(C')的结构的式(A')的接头-药物基团的接头，
Figure BDA0003410186110002484
其中
L1为桥接间隔子；
Lp为二价肽间隔子；
G-L2-A为自降解间隔子；
R2为亲水性部分；
L2为键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002491
Figure BDA0003410186110002492
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点，
且
L3为间隔子部分。
实施方案33.如实施方案32的接头，其中：
L1为桥接间隔子；
Lp为包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔子；
G-L2-A为自降解间隔子；
R2为亲水性部分；
L2为键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002493
Figure BDA0003410186110002494
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点，
且
L3为间隔子部分。
实施方案34.如实施方案32或33的接头，其中：
L1为桥接间隔子；
Lp为包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔子；
Figure BDA0003410186110002495
基团选自：
Figure BDA0003410186110002501
其中
Figure BDA0003410186110002502
的*是指附接至D(例如，附接至药物部分的N或O)的点；
Figure BDA0003410186110002503
的***是指附接至Lp的点；
R2为亲水性部分；
L2为键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002504
Figure BDA0003410186110002505
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点，
且
L3为间隔子部分。
实施方案35.如实施方案32至34中任一项的接头，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*是指附接至Lp的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002506
基团取代的C2-C6烷基；
各R3独立地选自H及C1-C6烷基；
X1为
Figure BDA0003410186110002511
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为二价肽间隔子，其包含选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸及酪氨酸；
A为为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002512
Figure BDA0003410186110002513
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002514
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点。
实施方案36.如实施方案32至35中任一项的接头，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002521
Figure BDA0003410186110002522
Figure BDA0003410186110002523
其中Lp的*是指附接至L1的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002524
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002531
基团取代的C2-C6烷基；
且
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002532
Figure BDA0003410186110002533
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点。
实施方案37.如实施方案32至36中任一项的接头，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002541
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002542
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002543
基团取代的C2-C6烷基；
且
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002544
Figure BDA0003410186110002545
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点。
实施方案38.如实施方案32至37中任一项的接头，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002551
其中Lp的*是指附接至L1的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002552
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**或-NHC(＝O)NH-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002553
基团取代的C2-C6烷基；
且
A为键或-OC(＝O)*，其中*指示附接至D的点。
实施方案39.如实施方案32至38中任一项的接头，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002561
其中Lp的*是指附接至L1的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002562
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**或-C(＝O)N(X-R2)-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002563
基团取代的C2-C6烷基；
且
A为键或-OC(＝O)*，其中*指示附接至D的点。
实施方案40.具有式(D')的结构的式(C')的接头，
Figure BDA0003410186110002571
其中
L1为桥接间隔子；
Lp为二价肽间隔子；
R2为亲水性部分；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002572
Figure BDA0003410186110002573
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点，
且
L3为间隔子部分。
实施方案41.如实施方案40的接头，其中：
L1为桥接间隔子；
Lp为包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔子；
R2为亲水性部分；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002574
Figure BDA0003410186110002575
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点，
且
L3为间隔子部分。
实施方案42.如实施方案40或41的接头，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*是指附接至Lp的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002581
基团取代的C2-C6烷基；
各R3独立地选自H及C1-C6烷基；
X1为
Figure BDA0003410186110002582
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为二价肽间隔子，其包含选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸及酪氨酸；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002583
Figure BDA0003410186110002584
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002591
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点。
实施方案43.如实施方案40至42中任一项的接头，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002592
Figure BDA0003410186110002601
Figure BDA0003410186110002602
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002603
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002604
基团取代的C2-C6烷基；
且
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002605
Figure BDA0003410186110002611
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点。
实施方案44.如实施方案40至43中任一项的接头，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自
Figure BDA0003410186110002612
的二价肽间隔子，其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002613
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002621
基团取代的C2-C6烷基；
且
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002622
Figure BDA0003410186110002623
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点。
实施方案45.如实施方案40至44中任一项的接头，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002624
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002625
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**或-NHC(＝O)NH-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002631
基团取代的C2-C6烷基；
且
A为键或-OC(＝O)*，其中*指示附接至D的点。
实施方案46.如实施方案40至45中任一项的接头，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002632
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002633
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**或-C(＝O)N(X-R2)-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002641
基团取代的C2-C6烷基；
且
A为键或-OC(＝O)*，其中*指示附接至D的点。
实施方案47.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002642
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案48.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002643
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案49.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002651
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案50.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002652
其中各R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案51.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002653
其中各R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案52.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002661
其中
Xa为-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-，且各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案53.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002662
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案54.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002663
其中
Xb为-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-，且各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH。
实施方案55.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002664
实施方案56.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002671
实施方案57.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002672
实施方案58.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002673
实施方案59.如实施方案32至46中任一项的接头，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002674
出于说明的目的，本文中描绘的通用反应方案提供合成本发明化合物以及关键中间体的潜在途径。关于单个反应步骤的更详细描述，参见以下实施例部分。尽管特定起始物质及试剂描述于方案中且在下文论述，但其他起始物质及试剂可容易经替代以提供多种衍生物和/或反应条件。另外，通过下文所述的方法制备的许多化合物可根据本发明使用本领域技术人员公知的常规化学方法进行进一步修饰。
借助于实施例，式(B')化合物的通用合成在以下显示于方案1中。
方案1
Figure BDA0003410186110002681
本发明的抗体药物缀合物
本发明提供抗体药物缀合物，在本文中也称为免疫缀合物，其包含含有一个或多个亲水性部分的接头。
本发明的抗体药物缀合物具有式(E')的结构：
Figure BDA0003410186110002682
其中：
Ab为抗体或其片段；
R100为偶联基团；
L1为桥接间隔子；
Lp为二价肽间隔子；
G-L2-A为自降解间隔子；
R2为亲水性部分；
L2为键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002691
Figure BDA0003410186110002692
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为间隔子部分；
D为如本文所定义的药物部分，例如MCl-1抑制剂，且可包含N或O，其中D可经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A，
且
y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
本发明的抗体药物缀合物的某些方面及实例提供于所列举的实施方案的以下清单中。应认识到，在各实施方案中指定的特点可与其他指定特点组合，以提供本发明的其他实施方案。
实施方案60.式(E')免疫缀合物，其中：
Ab为抗体或其片段；
R100为偶联基团；
L1为桥接间隔子；
Lp为包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔子；
G-L2-A为自降解间隔子；
R2为亲水性部分；
L2为键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002693
Figure BDA0003410186110002694
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为间隔子部分；
D为如本文所定义的药物部分，其中D经由A至D(例如药物部分的N或O)的直接键连接至A，
且
y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案61.式(E')或如实施方案60的免疫缀合物，其中：
Ab为抗体或其片段；
R100为偶联基团；
L1为桥接间隔子；
Lp为包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔子；
Figure BDA0003410186110002701
基团选自：
Figure BDA0003410186110002702
其中
Figure BDA0003410186110002703
的*是指附接至D(例如，附接至药物部分的N或O)的点；
Figure BDA0003410186110002704
的***是指附接至Lp的点；
R2为亲水性部分；
L2为键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002705
Figure BDA0003410186110002706
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为间隔子部分；
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A，
且
y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案62.式(E')或如实施方案60至61中任一项的免疫缀合物，其具有式(F')的结构，
Figure BDA0003410186110002711
其中：
Ab为抗体或其片段；
R100为偶联基团；
L1为桥接间隔子；
Lp为包含二至四个氨基酸残基的二价肽间隔子；
R2为亲水性部分；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002712
Figure BDA0003410186110002713
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为间隔子部分；
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A，
且
y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案63.式(D')或如实施方案60至62中任一项的免疫缀合物，其中：
Ab为抗体或其片段；
R100为
Figure BDA0003410186110002721
Figure BDA0003410186110002722
-S-、-C(＝O)-、-ON＝***、-NHC(＝O)CH2-***、-S(＝O)2CH2CH2-***、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-***、-NHS(＝O)2CH2CH2- ***、-NHC(＝O)CH2CH2-***、-CH2NHCH2CH2-***、-NHCH2CH2-***、
Figure BDA0003410186110002723
Figure BDA0003410186110002724
Figure BDA0003410186110002731
Figure BDA0003410186110002732
其中R100的***是指附接至Ab的点；
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*是指附接至Lp的点，及L1的**是指附接至R100的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002733
基团取代的C2-C6烷基；
各R3独立地选自H及C1-C6烷基；
R4为2-吡啶基或4-吡啶基；
各R5独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；
各R6独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；
各R7独立地选自H、C1-6烷氧基、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、-C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基及-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
X1为
Figure BDA0003410186110002741
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为二价肽间隔子，其包含选自以下的氨基酸残基：缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸及酪氨酸；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002742
Figure BDA0003410186110002743
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002744
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A，
且
y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案64.式(D')或如实施方案60至63中任一项的免疫缀合物，其中：
Ab为抗体或其片段；
R100为
Figure BDA0003410186110002751
Figure BDA0003410186110002752
其中R100的***是指附接至Ab的点；
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点，且L1的**是指附接至R100的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002761
Figure BDA0003410186110002762
Figure BDA0003410186110002763
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002764
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002771
基团取代的C2-C6烷基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002772
Figure BDA0003410186110002773
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A，
且
y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案65.式(E')或如实施方案60至64中任一项的免疫缀合物，其中：
Ab为抗体或其片段；
R100为
Figure BDA0003410186110002774
其中R100的***是指附接至Ab的点；
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点，且L1的**是指附接至R100的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002775
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002781
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个取代的C2-C6烷基A为键、-OC(＝O)-*、
Figure BDA0003410186110002782
OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A，
且
y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案66.式(E')或如实施方案60至65中任一项的免疫缀合物，其中：
Ab为抗体或其片段；
R100为
Figure BDA0003410186110002791
其中R100的***是指附接至Ab的点；
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点，且L1的**是指附接至R100的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002792
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002793
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**或-NHC(＝O)NH-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002801
基团取代的C2-C6烷基；
A为键或-OC(＝O)*，其中*指示附接至D的点；
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A，
且
y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案67.式(E')或如实施方案60至66中任一项的免疫缀合物，其中：
Ab为抗体或其片段；
R100为
Figure BDA0003410186110002802
其中R100的***是指附接至Ab的点；
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-，其中L1的*是指附接至Lp的点，且L1的**是指附接至R100的点；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各t独立地选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002803
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至G的-NH-基团的点；
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002811
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**或-C(＝O)N(X-R2)-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点；
R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110002812
基团取代的C2-C6烷基；
A为键或-OC(＝O)*，其中*指示附接至D的点；
D为如本文所定义的药物部分，且包含N或O，其中D经由A至药物部分的N或O的直接键连接至A，
且
y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案68.式(E')或如实施方案60至63中任一项的免疫缀合物，其中
R100为
Figure BDA0003410186110002813
Figure BDA0003410186110002814
-S-、-C(＝O)-、-ON＝***、-NHC(＝O)CH2-***、-S(＝O)2CH2CH2-***、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-***、-NHS(＝O)2CH2CH2- ***、-NHC(＝O)CH2CH2-***、-CH2NHCH2CH2-***、-NHCH2CH2-***、
Figure BDA0003410186110002821
Figure BDA0003410186110002822
Figure BDA0003410186110002823
其中R100的***是指附接至Ab的点。
实施方案69.式(E')或如实施方案60至63中任一项的免疫缀合物，其中
R100为
Figure BDA0003410186110002824
Figure BDA0003410186110002825
其中R100的***是指附接至Ab的点。
实施方案70.式(E')或如实施方案60至63中任一项的免疫缀合物，其中
R100为
Figure BDA0003410186110002826
Figure BDA0003410186110002827
其中R100的***是指附接至Ab的点。
实施方案71.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002831
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH，且y为1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案72.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002832
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH，且y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案73.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002841
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH，且y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案74.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002842
其中
各R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH，且y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案75.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002851
其中
各R独立地选自H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH，且y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案76.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002852
其中
Xa为-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-，且各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH，且y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案77.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002861
其中
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH，且y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案78.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002862
其中Xb为-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-，且各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH，且y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案79.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002863
其中y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案80.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002871
其中y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案81.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002872
其中y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案82.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002873
其中y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
实施方案83.式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其具有以下结构：
Figure BDA0003410186110002881
其中y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
本发明的接头药物基团、接头及抗体药物缀合物的某些方面及实施例提供于额外所列举的实施方案的以下清单中。应认识到，在各实施方案中指定的特点可与其他指定特点组合，以提供本发明的其他实施方案。
实施方案84.式(A')或如实施方案1至2中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至39中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至61中任一项的免疫缀合物，其中：
G为
Figure BDA0003410186110002882
其中G的*是指附接至L2的点，且G的**是指附接至L3的点，且G的***是指附接至Lp的点。
实施方案85.式(A')或如实施方案1至2中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至39中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至61中任一项的免疫缀合物，其中：
G为
Figure BDA0003410186110002883
其中G的*是指附接至L2的点，且G的**是指附接至L3的点，且G的***是指附接至Lp的点。
实施方案86.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*是指附接至Lp的点，且如果存在，则L1的**是指附接至R1的点，或如果存在，则L1的**是指附接至R100的点。
实施方案87.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*是指附接至Lp的点，且如果存在，则如果存在，则L1的**是指附接至R1的点，或如果存在，则L1的**是指附接至R100的点。
实施方案88.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；或*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**，其中L1的*是指附接至Lp的点，且如果存在，则L1的**是指附接至R1的点，或如果存在，则L1的**是指附接至R100的点。
实施方案89.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其中：
L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**或*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**，其中L1的*是指附接至Lp的点，且如果存在，则L1的**是指附接至R1的点，或如果存在，则L1的**是指附接至R100的点。
实施方案90.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其中L1为*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**，其中L1的*是指附接至Lp的点，且如果存在，则L1的**是指附接至R1的点，或如果存在，则L1的**是指附接至R100的点。
实施方案91.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其中L1为*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**，其中L1的*是指附接至Lp的点，且如果存在，则L1的**是指附接至R1的点，或如果存在，则L1的**是指附接至R100的点。
实施方案92.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其中L1为*-C(＝O)(CH2)m-**，其中L1的*是指附接至Lp的点，且如果存在，则L1的**是指附接至R1的点，或如果存在，则L1的**是指附接至R100的点。
实施方案93.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项的免疫缀合物，其中L1为*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**，其中L1的*是指附接至Lp的点，且如果存在，则L1的**是指附接至R1的点，或如果存在，则L1的**是指附接至R100的点。
实施方案94.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至93中任一项的免疫缀合物，其中Lp为酶促可裂解二价肽间隔子。
实施方案95.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至94中任一项的免疫缀合物，其中Lp为二价肽间隔子，其包含选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸及酪氨酸。
实施方案96.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至95中任一项的免疫缀合物，其中Lp为包含两个至四个氨基酸残基的二价肽间隔子。
实施方案97.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至96中任一项的免疫缀合物，其中Lp为二价肽间隔子，其包含两个至四个各自独立地选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸及酪氨酸。
实施方案98.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至97中任一项的免疫缀合物，其中：
Lp为选自以下的二价肽间隔子：
Figure BDA0003410186110002921
Figure BDA0003410186110002922
Figure BDA0003410186110002923
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至式(B')的-NH-基团的点，或Lp的**是指附接至式(A')的G的点。
实施方案99.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至98中任一项的免疫缀合物，其中：
Lp为
Figure BDA0003410186110002924
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至式(B')的-NH-基团的点，或Lp的**是指附接至式(A')的G的点。
实施方案100.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至98中任一项的免疫缀合物，其中：
Lp为
Figure BDA0003410186110002931
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至式(B')的-NH-基团的点，或Lp的**是指附接至式(A')的G的点。
实施方案101.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至98中任一项的免疫缀合物，其中：
Lp为
Figure BDA0003410186110002932
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至式(B')的-NH-基团的点，或Lp的**是指附接至式(A')的G的点。
实施方案102.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至98中任一项的免疫缀合物，其中：
Lp为
Figure BDA0003410186110002933
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至式(B')的-NH-基团的点，或Lp的**是指附接至式(A')的G的点。
实施方案103.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至98中任一项的免疫缀合物，其中：
Lp为
Figure BDA0003410186110002941
其中Lp的*是指附接至L1的点，且Lp的**是指附接至式(B')的-NH-基团的点，或Lp的**是指附接至式(A')的G的点。
实施方案104.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至103中任一项的免疫缀合物，其中L2为键、亚甲基或C2-C3亚烯基。
实施方案105.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至104中任一项的免疫缀合物，其中L2为键或亚甲基。
实施方案106.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至105中任一项的免疫缀合物，其中L2为键。
实施方案107.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至105中任一项的免疫缀合物，其中L2为亚甲基。
实施方案108.式(A')或如实施方案1至30中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至83中任一项、或如实施方案84至107中任一项的免疫缀合物，其中：
A为键、-OC(＝O)-、-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基。
实施方案109.式(A')或如实施方案1至30中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至83中任一项、或如实施方案84至107中任一项的免疫缀合物，其中A为键或-OC(＝O)。
实施方案110.式(A')或如实施方案1至30中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至83中任一项、或如实施方案84至109中任一项的免疫缀合物，其中A为键。
实施方案111.式(A')或如实施方案1至30中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至83中任一项、或如实施方案84至109中任一项的免疫缀合物，其中A为-OC(＝O)。
实施方案112.式(A')或如实施方案1至30中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至83中任一项、或如实施方案84至107中任一项的免疫缀合物，其中：
A为
Figure BDA0003410186110002951
实施方案113.式(A')或如实施方案1至30中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至83中任一项、或如实施方案84至107中任一项的免疫缀合物，其中：
A为-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-，其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基。
实施方案114.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至113中任一项的免疫缀合物，其中：
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002961
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-**、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点。
实施方案115.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至114中任一项的免疫缀合物，其中：
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002962
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键；
且
L3的*是指附接至R2的点。
实施方案116.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至115中任一项的免疫缀合物，其中：
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002971
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为三唑基，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点。
实施方案117.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至115中任一项的免疫缀合物，其中：
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002972
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NH-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)-**、-C(＝O)NRb-**、-C(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)-**、-CH2NRbC(＝O)NH-**、-CH2NRbC(＝O)NRb-**、-NHC(＝O)-**、-NHC(＝O)O-**、-NHC(＝O)NH-**、-OC(＝O)NH-**、-S(O)2NH-**、-NHS(O)2-**、-C(＝O)-、-C(＝O)O-**或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点。
实施方案118.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至115中任一项的免疫缀合物，其中：
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002981
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键、三唑基或***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点。
实施方案119.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至115中任一项的免疫缀合物，其中：
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002991
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为键；
且
L3的*是指附接至R2的点。
实施方案120.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至115中任一项的免疫缀合物，其中：
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110002992
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为三唑基，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点。
实施方案121.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至115中任一项的免疫缀合物，其中：
L3为具有结构
Figure BDA0003410186110003001
的间隔子部分，
其中
W为-CH2O-**、-CH2N(Rb)C(＝O)O-**、-NHC(＝O)CH2NHC(＝O)O-**、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-**、-C(＝O)N(X-R2)-**，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基，且其中W的**是指附接至X的点；
X为***-CH2-三唑基-*，其中X的***是指附接至W的点，且X的*是指附接至R2的点；
且
L3的*是指附接至R2的点。
实施方案122.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至121中任一项的免疫缀合物，其中R2为亲水性部分，其选自聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure BDA0003410186110003002
基团取代的C2-C6烷基。
实施方案123.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中R2为糖。
实施方案124.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中R2为寡糖。
实施方案125.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中R2为多肽。
实施方案126.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中R2为聚亚烷基二醇。
实施方案127.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中R2为具有结构-(O(CH2)m)tR'的聚亚烷基二醇，其中R'为OH、OCH3或OCH2CH2C(＝O)OH，m为1-10且t为4-40。
实施方案128.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中R2为具有结构-((CH2)mO)tR”-的聚亚烷基二醇，其中R”为H、CH3或CH2CH2C(＝O)OH，m为1-10且t为4-40。
实施方案129.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中R2为聚乙二醇。
实施方案130.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中R2为具有结构-(OCH2CH2)tR'的聚乙二醇，其中R'为OH、OCH3或OCH2CH2C(＝O)OH且t为4-40。
实施方案131.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中R2为具有结构-(CH2CH2O)tR”-的聚乙二醇，其中R”为H、CH3或CH2CH2C(＝O)OH且t为4-40。
实施方案132.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中：
R2为
Figure BDA0003410186110003021
Figure BDA0003410186110003022
Figure BDA0003410186110003023
其中R2的*是指附接至X或L3的点。
实施方案133.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中：
R2为
Figure BDA0003410186110003024
Figure BDA0003410186110003031
其中R2的*是指附接至X或L3的点。
实施方案134.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中：
R2为
Figure BDA0003410186110003032
其中R2的*是指附接至X或L3的点。
实施方案135.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至122中任一项的免疫缀合物，其中：
R2为
Figure BDA0003410186110003033
其中R2的*是指附接至X或L3的点。
实施方案136.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至135中任一项的免疫缀合物，其中：
X1为
Figure BDA0003410186110003034
实施方案137.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至135中任一项的免疫缀合物，其中：
X1为
Figure BDA0003410186110003041
实施方案138.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至137中任一项的免疫缀合物，其中：
各m独立地选自1、2、3、4及5。
实施方案139.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至137中任一项的免疫缀合物，其中：
各m独立地选自1、2及3。
实施方案140.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至139中任一项的免疫缀合物，其中：
各n独立地选自1、2、3、4及5。
实施方案141.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至139中任一项的免疫缀合物，其中：
各n独立地选自1、2及3。
实施方案142.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至141中任一项的免疫缀合物，其中：
各t独立地选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30。
实施方案143.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至141中任一项的免疫缀合物，其中：
各t独立地选自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。
实施方案144.式(A')或如实施方案1至17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(C')或如实施方案32至46中任一项的接头及式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至141中任一项的免疫缀合物，其中：
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
实施方案145.式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至144中任一项的免疫缀合物，其中y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14。
实施方案146.式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至144中任一项的免疫缀合物，其中y为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
实施方案147.式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至144中任一项的免疫缀合物，其中y为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
实施方案148.式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至144中任一项的免疫缀合物，其中y为1、2、3、4、5、6、7或8。
实施方案149.式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至144中任一项的免疫缀合物，其中y为1、2、3、4、5或6。
实施方案150.式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至144中任一项的免疫缀合物，其中y为1、2、3或4。
实施方案151.式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至144中任一项的免疫缀合物，其中y为1或2。
实施方案152.式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至144中任一项的免疫缀合物，其中y为2。
实施方案153.式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至144中任一项的免疫缀合物，其中y为4。
实施方案154.式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至144中任一项的免疫缀合物，其中y为6。
实施方案155.式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至144中任一项的免疫缀合物，其中y为8。
实施方案156.式(A')或如实施方案1至30中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、式(E')或如实施方案60至70中任一项、或如实施方案84至155中任一项的免疫缀合物，其中在自免疫缀合物释放时，D为MCl-1抑制剂。
其他接头基团
适用于制备本文所公开的MCl-1抑制剂的ADC或免疫缀合物的接头基团的其他实例包括诸如以下的国际申请公开中所公开的那些：WO2018200812、WO2017214456、WO2017214458、WO2017214462、WO2017214233、WO2017214282、WO2017214301、WO2017214322、WO2017214335、WO2017214339、WO2016094509、WO2016094517及WO2016094505，其中的每一者的内容以其全文引用的方式并入。
例如，本文所公开的MCl-1抑制剂的免疫缀合物可具有选自以下的接头-有效负载(“-L-D”)结构：
Figure BDA0003410186110003061
其中：
Lc为接头组分，且各Lc独立地选自如本文所公开的接头组分；
x选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20的整数；
y选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20的整数；
p选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10的整数；
D为本文所公开的MCl-1抑制剂；
且各裂解元件(CE)独立地选自自降解间隔子及对选自以下的裂解敏感的基团：酸诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解、糖苷酶诱导的裂解、磷酸二酯酶诱导的裂解、磷酸酶诱导的裂解、蛋白酶诱导的裂解、脂肪酶诱导的裂解或二硫键裂解。
在一些实施方案中，L具有选自以下的结构，或L包含选自以下的结构组分：
Figure BDA0003410186110003071
Figure BDA0003410186110003072
Figure BDA0003410186110003081
Figure BDA0003410186110003091
在一些实施方案中，Lc为接头组分，且各Lc独立地选自
Figure BDA0003410186110003101
在一些实施方案中，接头L包含选自以下的接头组分：
-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)OC(R12)2(CH2)mNR11C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)mO(CH2)mC(＝O)-；-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)X4C(＝O)NR11(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)X4C(＝O)NR11(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；-**C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)mO(CH2)mC(＝O)-；-**C(＝O)O(CH2)mX6C(＝O)X4C(＝O)NR11(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；-**C(＝O)X4C(＝O)X6(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-；-**C(＝O)(CH2)mX6C(＝O)X1aX2aC(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O))X5C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mNR11C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5((CH2)mO)n(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5(CH2)mNR11((CH2)mO)n(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)(CH2)mNR11((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)X5(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mNR11(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mNR11(CH2)mC(＝O)X2aX1aC(＝O)-；-**C(＝O)O(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mNR11C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)nX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；-**C(＝O)O((CH2)mO)n(CH2)mC(＝O)NR11(CH2)m-；-**C(＝O)O(CH2)mC(R12)2-；-**C(＝O)OCH2)mC(R12)2SS(CH2)mNR11C(＝O)(CH2)m-及-**C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NR11(CH2)m-，其中：**是指附接至药物部分(D)的点，且另一端可连接至R100，即如本文所述的偶联基团；
其中：
X1a为
Figure BDA0003410186110003121
其中*是指附接至X2A的点；
X2a选自
Figure BDA0003410186110003122
Figure BDA0003410186110003131
Figure BDA0003410186110003132
其中*是指附接至X1A的点；
X3为
Figure BDA0003410186110003133
X4为-O(CH2)nSSC(R12)2(CH2)n-或-(CH2)nC(R12)2SS(CH2)nO-；
X5为
Figure BDA0003410186110003134
其中**是指朝向药物部分的定向；
X6为
Figure BDA0003410186110003135
其中**是指朝向药物部分的定向；
各R11独立地选自H及C1-C6烷基；
各R12独立地选自H及C1-C6烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
缀合方法
本发明提供将本发明的接头-药物基团缀合至抗体或抗体片段以制备包含具有一个或多个亲水性部分的接头的抗体药物缀合物的多种方法。
用于形成式(E')的抗体药物缀合物的通用反应方案显示于以下方案2中：
方案2
Figure BDA0003410186110003141
其中：RG2为与相容性R1基团反应以形成相应R100基团的反应性基团(这类基团在表2及表3中说明)。D、R1、L1、Lp、Ab、y及R100如本文所定义。
方案3进一步说明用于形成式(E')的抗体药物缀合物的此通用方法，其中抗体包含与R1基团(如本文所定义)反应以经由R100基团(如本文所定义)将接头-药物基团共价附接至抗体的反应性基团(RG2)。仅出于说明的目的，方案3显示具有四个RG2基团的抗体。
方案3
Figure BDA0003410186110003142
在一个方面中，接头-药物基团经由抗体中的经修饰的半胱氨酸残基结合于抗体(参见例如WO2014/124316)。方案4说明用于形成式(E')的抗体药物缀合物的这一方法，其中由抗体中经工程化的半胱氨酸残基产生的游离巯基与R1基团(其中R1为马来酰亚胺)反应以经由R100基团(其中R100为丁二酰亚胺环)将接头-药物基团共价附接至抗体。仅出于说明的目的，方案4显示具有四个游离巯基的抗体。
方案4
Figure BDA0003410186110003151
在另一方面中，接头-药物基团经由抗体中的赖氨酸残基结合于抗体。方案5说明用于形成式(E')的抗体药物缀合物的此方法，其中来自抗体中的半胱氨酸残基的游离氨基与R1基团(其中R1为NHS酯、五氟苯基或四氟苯基)反应以经由R100基团(其中R100为酰胺)将接头-药物基团共价附接至抗体。仅出于说明的目的，方案5显示具有四个氨基的抗体。
方案5
Figure BDA0003410186110003161
在另一方面中，接头-药物基团通过在抗体的天然存在的二硫桥键处形成肟桥缀合于抗体。肟桥通过以下形成：首先通过使抗体的链间二硫桥键还原且使用1,3-二卤丙酮(例如，1,3-二氯丙酮)再桥接而形成酮桥。与包含羟基胺的接头-药物基团的后续反应进而形成肟连接(肟桥)，其将接头-药物基团附接至抗体(参见例如WO2014/083505)。方案6说明用于形成式(E')的抗体药物缀合物的此方法。
方案6
Figure BDA0003410186110003171
用于形成式(F')的抗体药物缀合物的通用反应方案显示于以下方案7中：
方案7
Figure BDA0003410186110003172
其中：RG2为与相容性R1基团反应以形成相应R100基团的反应性基团(这类基团在表2及表3中说明)。D、R1、L1、Lp、Ab、y及R100如本文所定义。
方案8进一步说明用于形成式(F')的抗体药物缀合物的此通用方法，其中抗体包含与R1基团(如本文所定义)反应以经由R100基团(如本文所定义)将接头-药物基团共价附接至抗体的反应性基团(RG2)。仅出于说明的目的，方案8显示具有四个RG2基团的抗体。
方案8
Figure BDA0003410186110003181
在一个方面中，接头-药物基团经由抗体中的经修饰的半胱氨酸残基缀合于抗体(参见例如WO2014/124316)。方案9说明用于形成式(F')的抗体药物缀合物的此方法，其中由抗体中经工程化的半胱氨酸残基产生的游离巯基与R1基团(其中R1为马来酰亚胺)反应以经由R100基团(其中R100为丁二酰亚胺环)将接头-药物基团共价附接至抗体。仅出于说明的目的，方案9显示具有四个游离巯基的抗体。
方案9
Figure BDA0003410186110003182
在另一方面中，接头-药物基团经由抗体中的赖氨酸残基缀合于抗体。方案10说明用于形成式(F')的抗体药物缀合物的此方法，其中来自抗体中的赖氨酸残基的游离氨基与R1基团(其中R1为NHS酯、五氟苯基或四氟苯基)反应以经由R100基团(其中R100为酰胺)将接头-药物基团共价附接至抗体。仅出于说明的目的，方案10显示具有四个氨基的抗体。
方案10
Figure BDA0003410186110003191
在另一方面中，接头-药物基团通过在抗体的天然存在的二硫桥键处形成肟桥缀合于抗体。肟桥通过以下形成：首先通过使抗体的链间二硫桥键还原且使用1,3-二卤丙酮(例如，1,3-二氯丙酮)再桥接而形成酮桥。与包含羟基胺的接头-药物基团的后续反应进而形成肟连接(肟桥)，其将接头-药物基团附接至抗体(参见例如WO2014/083505)。方案11说明用于形成式(F')的抗体药物缀合物的此方法。
方案11
Figure BDA0003410186110003201
还提供针对用于评估本发明的抗体缀合物的分析方法的一些方面的方案。这类分析方法及结果可表明缀合物具有有利特性，例如使其更易于制备、更易于向患施用者、更有效和/或对患者潜在更安全的特性。一个实例为通过尺寸排阻色谱(SEC)测定分子尺寸，其相对于样品中存在的高分子量污染物(例如二聚体、多聚体或聚集抗体)或低分子量污染物(例如抗体片段、降解产物或单个抗体链)的量测定样品中所需抗体物质的量。一般而言，归因于例如聚集体对抗体样品的其他特性(诸如但不限于清除率、免疫原性及毒性)的影响，需要具有较高量的单体及较低量的例如聚集抗体。另一实例为通过疏水性相互作用色谱(HIC)测定疏水性，其中相对于一组具有已知特性的标准抗体评定样品的疏水性。一般而言，由于疏水性对抗体样品的其他特性(诸如但不限于聚集、随时间的聚集、对表面的粘附性、肝毒性、清除率及药代动力学暴露量)的影响，需要具有低疏水性。参见Damle,N.K.,NatBiotechnol.2008；26(8):884-885；Singh,S.K.,Pharm Res.2015；32(11):3541-71。当通过疏水性相互作用色谱测量时，较高疏水性指数评分(即由HIC柱进行的洗脱较快)反映缀合物的较低疏水性。如以下实施例中所示，大部分所测试的抗体缀合物显示大于0.8的疏水性指数。在一些实施方案中，提供如通过疏水性相互作用色谱所测定疏水性指数为0.8或更大的抗体缀合物。
实施例
以下实施例提供本发明的说明性实施方案。一般本领域技术人员将认识到，可在不改变本发明的精神或范围的情况下进行大量修改及变化。这类修改及变化涵盖于本发明的范围内。所提供的实施例不以任何方式限制本发明。
实施例1.接头、接头-有效负载及其前体的合成及表征。
示例性接头、接头-有效负载及其前体使用此实施例中所述的示例性方法合成。
缩写：
CuI 碘化铜(I)
DCC 二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DEA N-乙基乙胺
DIPEA：N,N-二异丙基乙胺
DMF：二甲基甲酰胺
DMSO：二甲亚砜
EEDQ 2-乙氧基-2H-喹啉-1-甲酸乙酯
Fmoc-Cit-OH (2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-5-脲基-戊酸
HBTU：六氟磷酸(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲
HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑
THF 四氢呋喃
MgSO4 硫酸镁
NH4Cl 氯化铵
NMP N-甲基吡咯烷酮
Pd(PPh3)2Cl2 二氯-三(三苯膦)钯
PBr3 三溴膦
Pt/C 10％铂/碳10％
SOCl2 亚硫酰氯
TBAI 碘化四丁基铵
TFA 三氟乙酸
材料、方法及通用程序：
所有获自商业来源的试剂均未经进一步纯化即使用。无水溶剂获自商业来源且未经进一步干燥即使用。快速色谱在具有预填充硅胶盒(Macherey-Nagel ChromabondFlash)的CombiFlash Rf(Teledyne ISCO)上进行。使用涂布有Merck Type 60F254硅胶的5×10cm的板进行薄层色谱。微波加热在CEM
Figure BDA0003410186110003221
仪器中进行。
在400MHz Bruker Avance或500MHz Avance Neo质谱仪上使用DMSO-d6或CDCl3作为溶剂进行1H-NMR测量。1H NMR数据为化学位移值的形式，以百万分率(ppm)给出，使用溶剂的残余峰(对于DMSO-d6为2.50ppm及对于CDCl3为7.26ppm)作为内标。分裂谱称为：s(单峰)、d(二重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、quint(五重峰)、m(多重峰)、br s(宽单峰)、br t(宽三重峰)、dd(二重峰的二重峰)、td(二重峰的三重峰)、dt(三重峰的二重峰)、ddd(二重峰的二重峰的二重峰)。IR测量在配备有ATR Golden Gate装置(SPECAC)的Bruker Tensor 27上进行。HRMS测量在LTQ OrbiTrap Velos Pro质谱仪(ThermoFisher Scientific)上进行。将样品以大约0.01至0.05mg/mL的范围内的浓度溶解于CH3CN/H2O(2/1:v/v)中，且通过以0.1mL/min的流速注射2μL引入源中。ESI电离参数如下：3.5kV及350℃转移离子毛细管。所有谱均在正离子模式下采集，其中分辨率为30,000或60,000，使用锁定质量。
HRMS测量在LTQ OrbiTrap Velos Pro质谱仪(ThermoFisher Scientific GmbH,Bremen,Germany)上进行。将样品以大约0.01至0.05mg/mL的范围内的浓度溶解于CH3CN/H2O(2/1:v/v)中，且通过以0.1mL/min的流速注射2μL引入源中。ESI电离参数如下：3.5kV及350℃转移离子毛细管。所有谱均在正离子模式下采集，其中分辨率为30 000或60 000，使用锁定质量。
Figure BDA0003410186110003231
-MS：
Figure BDA0003410186110003232
-MS数据使用具有以下参数(表4)的仪器采集：
表4.
Figure BDA0003410186110003233
-MS参数
Figure BDA0003410186110003234
制备型HPLC：
制备型HPLC(〝Prep-HPLC”)数据使用具有以下参数(表5)的仪器采集：
表5.Prep-HPLC参数
Figure BDA0003410186110003235
使用三种制备型HPLC方法：
a.TFA方法：溶剂：A水+0.05％TFA，B乙腈+0.05％TFA，在15至30CV中梯度5至100％B
b.NH4HCO3方法：溶剂：A水+0.02M NH4HCO3，B乙腈/水80/20+0.02M NH4HCO3，在15至30CV中梯度5至100％B
c.中性方法：溶剂：A水，B乙腈，在15至30CV中梯度5至100％B
将含有纯化合物的所有级分合并，且直接冷冻干燥以得到无定形粉末状的化合物。
制备型SFC纯化：
制备型手性SFC在PIC溶液Prep200系统上进行。将样品以150mg/mL的浓度溶解于乙醇中。流动相等度保持在40％乙醇/CO2。仪器装配有Chiralpak IA柱及3mL的环。ABPR(自动背压调节器)设定为100巴。
L23-P3的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(2-叠氮基乙氧基)乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110003241
步骤1：(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺
向2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸(购自Broadpharm，1.4g，6mmol)于THF(20mL)中的溶液中添加1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(690mg，6mmol)及N,N'-二环己基碳二亚胺(1.2g，6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将沉淀物滤出，且浓缩过滤物，得到(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸酯(1.9g，6mmol)，其未经进一步纯化即立即使用。
向(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸酯(1.6g；4.85mmol)于DMF(15mL)中的溶液中添加(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(1.96g；5.17mmol)。将混合物在室温下搅拌2h且浓缩。将残余物在水(20mL)及乙腈(5mL)中稀释，且在室温下搅拌过夜。混合物使用中性方法通过反相C18色谱纯化，得到(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(1.07g，1.8mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.95(s,1H),8.3(d,1H),7.55(d,2H),7.46(d,1H),7.22(d,2H),5.98(t,1H),5.4(s,1H),5.08(t,1H),4.43(d,2H),4.4(q,1H),4.33(dd,1H),3.95(s,2H),3.6(m,10H),3.38(t,2H),3(m,2H),2(m,1H),1.7/1.6(2m,2H),1.5-1.3(m,2H),0.89/0.82(2d,6H)。
步骤2：(4-硝基苯基)碳酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲酯
向(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(100mg，0.168mmol)于DMF(30mL)中的溶液中添加DIPEA(32μL，0.179mmol)及双(4-硝基苯基)碳酸酯(100mg，0.329mmol)。将混合物在室温下搅拌4h且浓缩至干。将残余物通过硅胶色谱(甲醇/二氯甲烷的梯度)纯化，得到(4-硝基苯基)碳酸4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲酯(65mg，0.088mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.95(s,1H),8.3(d,1H),7.55(d,2H),7.46(d,1H),7.22(d,2H),5.98(t,1H),5.4(s,1H),5.08(t,1H),4.43(d,2H),4.4(q,1H),4.33(dd,1H),3.95(s,2H),3.6(m,10H),3.38(t,2H),3(m,2H),3.02-2.95(m,2H),2(m,1H),1.7(m,1H),1.6(m,1H),0.89(d,3H),0.82(d,3H)。
步骤3：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸L23-P3
向((2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-(2-哌嗪-1-基乙氧基)苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸P3(147mg，0.17mmol)于DMF(16mL)中的溶液中依次添加DIPEA(85μL，0.51mmol)、(4-硝基苯基)碳酸4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲酯(136mg，0.179mmol)、2,6-二甲基吡啶(99μL，0.85mmol)及HOAt(7mg，0.05mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，且通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上，且使用NH4HCO3方法纯化，得到L23-P3(110mg，0.074mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.05(s,1H),8.87(d,1H),8.59(s,1H),8.32(d,1H),7.67(br s,1H),7.59(d,2H),7.52(dd,1H),7.45(td,1H),7.44(d,1H),7.36(dl,1H),7.29(m,2H),7.27(d,2H),7.2(t,2H),7.19(d,1H),7.14(d,1H),7.13(t,1H),7.03(t,1H),6.99(d,1H),6.71(t,1H),6.24(dl,1H),5.99(t,1H),5.48(dd,1H),5.41(br s,1H),5.23(m,2H),4.97(s,2H),4.39(m,1H),4.32(dd,1H),4.21(m,2H),3.95(m,2H),3.75(s,3H),3.65-3.50(m,10H),3.34(m,2H),3.02/2.95(m,2H),2.73(t,2H),2.49/2.3(m,2H),2.45(m,4H),2.3(m,4H),2(m,1H),1.82(s,3H),1.7/1.59(m,2H),1.44/1.37(m,2H),0.87(d,3H),0.82(d,3H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ158.3,152.9,131.6,131.6,131.3,131.3,131,129,128.8,121,120.8,119.5,116.4,116.1,112.8,112.4,111.2,74.5,70.1,69.3,67.7,66.4,57,56.7,56.2,53.7,53.2,50.4,43.6,39,32.8,31.6,29.6,27.3,19.3,17.7。IR波长(cm-1)：3500-2500、2106、1656。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1479.5422/1479.5405(测量值/理论值)。
L24-P1的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003271
步骤1：(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(溴甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺
在0℃下向(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(330mg，0.55mmol；根据L23-P3的合成的步骤1获得)于THF(10mL)中的溶液中逐滴添加三溴化磷1M于二氯甲烷(1mL，1mmol)中的溶液。在0℃下将混合物搅拌1h，且添加精细研磨的NaHCO3(100mg)。搅拌10min之后，将反应物用乙酸乙酯稀释且过滤。将有机层经硫酸镁干燥且浓缩。残余物(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(溴甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(283mg，0.43mmol)未经进一步纯化即使用。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝＝595.3200/595.3198(测量值/理论值)。
步骤2：((2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸L24-P1
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯二氯水合物(P1)(345mg，0.355mmol)于DMF(1mL)中的溶液中依次添加(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(溴甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(233mg，0.355mmol)及DIPEA(50μL，0.304mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。添加氢氧化锂单水合物(15mg，3.55mmol)于水(0.5mL)中的溶液，且将反应物在室温下搅拌24h。反应混合物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到L24-P1(80mg，0.054mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ13.2(m,1H),10.25(m,1H),8.88(d,1H),8.6(s,1H),8.36(d,1H),7.72(d,2H),7.63(d,1H),7.52(dd,1H),7.46(t,1H),7.44(m,1H),7.43(m,2H),7.37(d,1H),7.3(dd,2H),7.21(t,2H),7.2(d,1H),7.15(d,1H),7.15(t,1H),7.03(t,1H),7(t,1H),6.72(t,1H),6.22(d,1H),6(t,1H),5.52(m,2H),5.49(dd,1H),5.25(dd,2H),4.5(br s,2H),4.39(m,1H),4.32(m,1H),4.25(m,2H),3.95(br s,2H),3.76(s,3H),3.4/3.24(m,4H),3.35(m,2H),3.28/2.51(m,2H),3.04/2.83(m,4H),3.02/2.96(m,2H),2.92(m,2H),2.87(s,3H),1.99(m,1H),1.83(s,3H),1.69/1.61(m,2H),1.46/1.38(m,2H),0.88/0.82(m,6H)。13C NMR(125MHz,dmso-d6):δ134.2,131.4,131.3,131.3,131.2,130.7,128.7,120.9,120.5,119.2,116.3,115.8,112.7,112.3,111,74,70.2,69.6,67.8,58.9,56.9,56.1,55.4,54,50.5,46.6,44.9,39,32.7,31.6,29.8,27.5,19.7/18.4,18。IR波长(cm-1)：3700-2200、3000-2000、2109、1662、1250-1050。HR-ESI+:m/z[M+Na]+＝1473.5656/1473.5628(测量值/理论值)。
L13-C4的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-[4-(膦酰基甲基)苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110003291
步骤1：(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-N-[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-3-甲基-丁酰胺的合成
向(2S)-2-氨基-N-[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-3-甲基-丁酰胺(0.9g，3.07mmol；根据L18-C3的合成的步骤3获得)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(购自Broadpharm，2g，3.07mmol)于DMF(20mL)中的溶液中依次添加DIPEA(1mL，6.13mmol)、3-(乙基亚氨基亚甲基氨基)丙基-二甲基-铵；氯化物(EDC)(0.65g，3.37mmol)及[二甲基氨基(三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)亚甲基]-二甲基-铵；六氟磷酸(HATU)(1.28g，3.37mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜且通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-N-[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-3-甲基-丁酰胺(1.64g，1.81mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.82(m,1H),8.14(d,1H),7.87(d,1H),7.54(d,2H),7.23(d,2H),5.08(t,1H),4.43(d,2H),4.39(m,1H),4.2(m,1H),3.65-3.44(m,48H),3.39(t,2H),2.50-2.30(m,2H),1.97(m,1H),1.31(d,3H),0.87/0.84(m,6H)。IR波长(cm-1)：3600-3200、3287、2106、1668、1630、1100。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝919.5265/919.5234(测量值/理论值)。
步骤2：(4-硝基苯基)碳酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲酯
向(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-N-[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-3-甲基-丁酰胺(210mg，0.228mmol)于THF及二氯甲烷(分别为5及2.5mL)的混合物中的溶液中依次添加吡啶(30μL，0.479mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(97mg，0.479mmol)。将反应物在室温下搅拌3h，且添加其他部分的氯甲酸4-硝基苯酯(40mg，0.197mmol)及吡啶(30μL，0.479mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌55h，且蒸发至干。将残余物通过硅胶色谱(MeOH/二氯甲烷的梯度)纯化，得到(4-硝基苯基)碳酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲酯(118mg，0.110mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.00(s,1H),8.31(d,2H),8.19(d,1H),7.88(d,1H),7.64(d,2H),7.58(d,2H),7.41(d,2H),5.25(s,2H),4.39(m,1H),4.21(m,1H),3.63-3.47(m,48H),3.39(t,2H),2.50-2.35(m,2H),1.98(m,1H),1.31(d,3H),0.89/0.85(m,6H)。IR波长(cm-1)：3278、2108、1763、1633、1526、1525、1350、1215、1110。
步骤3：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-[4-(膦酰基甲基)苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(L13-C4)
向(4-硝基苯基)碳酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲酯(52mg，47.6μmol)于DMF(5mL)中的溶液中依次添加(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-(2-哌嗪-1-基乙氧基)苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-[4-(膦酰基甲基)苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸C4(36.7mg，39.7μmol)及DIPEA(26μL，108μmol)。将反应物在室温下搅拌1h且通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到L13-C4(36mg，19μmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.1(br s,1H),8.81(br s,1H),8.55(m,1H),8.32(br s,1H),8.19(d,2H),8.02(brs,1H),7.66(m,1H),7.58(d,2H),7.37(d,1H),7.29(dd,2H),7.28(d,2H),7.25(d,2H),7.19(t,2H),7.17(d,1H),7.08(t,1H),6.96(d,1H),6.68(t,1H),6.21(d,1H),5.5(m,1H),5.22(m,2H),4.96(s,2H),4.4(m,1H),4.2(dd,1H),4.18(m,2H),3.62/3.41(m,24H),3.5(m,4H),3.38(m,2H),3.28(m,4H),2.87(m,2H),2.7(m,2H),2.48/2.36(m,2H),2.41(m,4H),1.99(m,1H),1.79(s,3H),1.3(d,3H),0.87/0.83(m,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ130.7,130.7,130.6,130.3,129,128.4,127.4,121,119.6,116.3,116.1,112.1,70.2/67.3,69.5,67.5,66.4,58.2,56.4,53.2,50.3,49.6,43.8,36.3,31,19,18.5,17.8.19F NMR(376MHz,dmso-d6):δ-112.4.31P NMR(200MHz,dmso-d6):δ17.8。IR波长(cm-1)：3290、2102、1698、1651、1237、1094、833、756。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1867.7129/1867.7154(测量值/理论值)。
L19-C3的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110003321
步骤1：(4-硝基苯基)碳酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲酯
向N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(1g，1.66mmol)于THF/二氯甲烷混合物(分别为100及30mL)中的悬浮液中依次添加吡啶(269μL，3.32mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(670mg，3.30mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜，且添加另一部分氯甲酸4-硝基苯酯(335mg，1.66mmol)。将反应物在室温下搅拌3h，浓缩，且将残余物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/庚烷的梯度)纯化，得到(4-硝基苯基)碳酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲酯(658mg，0.97mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.07(m,1H),8.31(d,2H),8.19(d,1H),7.89(d,2H),7.74(t,2H),7.64(d,2H),7.57(d,2H),7.41(m,2H),7.41(d,2H),7.4(m,1H),7.32(t,2H),5.24(s,2H),4.43(m,1H),4.36-4.19(m,3H),3.92(dd,1H),2(m,1H),1.32(d,3H),0.9/0.87(m,6H)。IR波长(cm-1)：3350-3200、1760、1690、1670、1630、1523、1290。
步骤2：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-(2-哌嗪-1-基乙氧基)苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸C3(100mg，0.116mmol)于DMF(1mL)中的溶液中依次添加(4-硝基苯基)碳酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲酯(87mg，0.128mmol)及DIPEA(38μL，0.232mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜且浓缩。使残余物溶于水中，过滤，得到(2R)-2-[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(110mg，0.078mmol)，其未经进一步纯化即用于下一步骤中。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.05(br s,1H),8.88(d,1H),8.57(s,1H),8.23(d,1H),7.88(d,2H),7.75(m,1H),7.74(2d,2H),7.58(d,2H),7.53(dd,1H),7.45(m,1H),7.45(d,1H),7.41(m,1H),7.4(m,2H),7.31(m,2H),7.29(m,2H),7.26(d,2H),7.2(t,2H),7.18(m,1H),7.14(d,1H),7.11(t,1H),7.03(t,1H),6.98(d,1H),6.69(t,1H),6.2(d,1H),5.46(d,1H),5.22(m,2H),4.97(s,2H),4.42(t,1H),4.26(m,2H),4.21(m,1H),4.2(m,2H),3.91(m,1H),3.75(s,3H),3.35/2.45(m,2H),3.29(m,4H),2.73(t,2H),2.44(m,4H),1.99(m,1H),1.8(s,3H),1.29(d,3H),0.88/0.85(m,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ158.3,152.7,131.6,131.4,131.3,131.1,131.1,128.9,128.5,128,127.6,125.8,120.9,120.5,120.5,119.4,116.4,116,112.7,112.2,111.1,69.4,67.8,66.5,66.1,60.7,56.8,56.1,53.2,49.6,47.1,43.8,33.3,30.9,19.7,18.9,18.1。
步骤3：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
在0℃下向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(176mg，0.125mmol)于DMF(3mL)中的溶液中逐滴添加哌啶(300μL，1.25mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h且浓缩。将残余物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(130mg，0.11mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.2(s,1H),8.9(d,1H),8.6(dl,1H),8.55(s,1H),7.85(d,1H),7.6(d,2H),7.55(dd,1H),7.45(m,2H),7.25(d,2H),7.25(m,4H),7.2(m,3H),7.15(d,1H),7.1(t,1H),7.05(t,1H),6.95(d,1H),6.65(t,1H),6.15(d,1H),5.4(dd,1H),5.2(m,2H),4.95(s,2H),4.45(m,1H),4.2(m,2H),3.75(s,3H),3.4/2.35(m,2H),3.3(m,5H),2.6(t,2H),2.4(m,4H),2(m,3H),1.8(s,3H),1.3(d,3H),0.9/0.85(m,6H)。IR波长(cm-1)：3600-2500、1678。
步骤4：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸L19-C3
向2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(50mg，0.042mmol)于DMF(0.3mL)中的溶液中依次添加DIPEA(14μL，0.085mmol)、[二甲基氨基-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-亚甲基]-二甲基-铵；四氟硼酸(14mg，0.046mmol)及2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸(28mg，0.12mmol)于DMF(0.5mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌2h且通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到L19-C3(22mg，0.016mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.02(s,1H),8.88(d,1H),8.4(d,1H),7.72(br s,1H),7.58(s,1H),7.58(d,2H),7.53(d,1H),7.45(d,1H),7.45(t,1H),7.38(d,1H),7.29(dd,2H),7.27(d,2H),7.2(t,2H),7.18(d,1H),7.14(d,1H),7.11(t,1H),7.03(t,1H),6.98(d,1H),6.7(t,1H),6.21(d,1H),5.46(dd,1H),5.23(m,2H),4.97(s,2H),4.4(m,1H),4.29(dd,1H),4.22(m,2H),3.94(s,2H),3.75(s,3H),3.65-3.53(m,10H),3.35(m,2H),3.3(m,4H),3.3/2.5(m,2H),2.73(t,2H),2.44(m,4H),2(m,1H),1.81(s,3H),1.3(d,3H),0.88/0.82(m,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ158,152.7,131.4,131.4,131.3,131.1,131.1,128.9,128.6,120.9,120.7,119.5,116.2,112.5,112.1,111.1,70.4,70.4,69.7,67.5,66.2,56.8,56.7,56.1,53.3,50.4,49.5,43.8,31.7,19.5,0.82,18.3,18.2.19F NMR(376MHz,dmso-d6):δ-112.3。IR波长(cm-1)：3294、2104、1697、1663、1288、1238、1120、1076、1051、1020、833、755。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1395.5083/1395.5070(测量值/理论值)。
L15-C5的制备：
(2R)-3-[2-[[2-[3-[[[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙氧基-羟基-磷酰基]氧基-羟基-磷酰基]氧基甲基]苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-丙酸
Figure BDA0003410186110003361
步骤1：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-[3-(膦酰氧基甲基)苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；双2,2,2-三氟乙酸
在-40℃下在氩气下向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-[3-(羟基甲基)苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(110mg，0.123mmol；根据WO 2016/207216制备)于THF(0.5mL)中的溶液中逐滴添加二磷酰基氯化物(51μL，0.368mmol)。将反应混合物在-40℃下搅拌30min。在-40℃下添加另一部分二磷酰基氯化物(10μL，0.074mmol)，且将反应物在-40℃下搅拌20min，通过添加碳酸钾(0.1mL)的饱和水溶液淬灭且使其温热至室温。将pH调整至10，通过添加碳酸钾(粉末)，且将反应物在室温下搅拌20min。在0℃下通过缓慢添加2M HCl水溶液将反应混合物酸化至pH 2，用二氯甲烷萃取(4次。将合并的有机层浓缩，用二噁烷(3mL)稀释，且添加氢氧化锂单水合物(17mg，0.403mmol)于水(0.3mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌4天，通过4M HCl水溶液(0.4mL，0.4mmol)中和，且蒸发。将残余物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-[3-(膦酰氧基甲基)苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；作为2TFA盐(41mg，43μmol)的2,2,2-三氟乙酸。MS(ESI)m/z[M+2H]/2+＝487.5.
步骤2：磷酸二氢2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙酯
向3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(200mg，0.311mmol)于二氯甲烷(2mL)中的溶液中添加1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(79mg，0.684mmol)、3-(乙基亚氨基亚甲基氨基)丙基-二甲基-铵；氯化物(107mg，0.56mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，用二氯甲烷稀释，用NaHCO3的饱和水溶液分配且用二氯甲烷萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥且浓缩至大约1mL。将残余物用DMF(1mL)稀释，添加二氢磷酸2-氨基乙酯(30mg，0.214mmol)，且将反应混合物在80℃下搅拌过夜，用二氯甲烷稀释，用水洗涤。将水层分离，且冷冻干燥，得到磷酸二氢2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙酯(165mg，0.2mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ3.45-3.65(m,53H),3.26-3.39(m,2H),3.12(m,2H),2.27(t,2H)。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝767.3697/767.3686(测量值/理论值)。
步骤3：(2R)-3-[2-[[2-[3-[[[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙氧基-羟基-磷酰基]氧基-羟基-磷酰基]氧基甲基]苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-丙酸(L15-C5)
向磷酸二氢2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙酯(49mg，0.064mmol)于DMF(0.2mL)中的溶液中依次添加二(咪唑-1-基)甲酮(11mg，0.066mmol)、三乙胺(17μL，0.066mmol)及
Figure BDA0003410186110003381
分子筛(50mg)。将反应物在室温下搅拌2h。通过过滤移除固体，且将过滤物用氯化锌(23mg，0.172mmol)及(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-[3-(膦酰氧基甲基)苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；双2,2,2-三氟乙酸(41mg，0.043mmol)处理。将混合物加热至50℃过夜。将反应混合物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到L15-C5(11mg，6μmol)。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1703.5962/1703.5959(测量值/理论值)。
L17-C3的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R,4S,5R)-6-叠氮基-2,3,4,5-四羟基-己基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003382
在室温下向(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(230mg，0.194mmol；根据L19-C3的制备的步骤5获得)及6-脱氧-6-叠氮基-D-半乳糖(120mg，0.584mmol；根据Ekholm等人,ChemMedChem 2016,11,2501-2505获得)于含有1％DIPEA(20mL)的DMSO/水80/20的混合物中的溶液中添加氰基硼氢化钠(24mg，0.389mmol)。将反应混合物在65℃下加热48h。随后在室温下添加另一份氰基硼氢化钠(24mg，0.389mmol)及6-脱氧-6-叠氮基-D-半乳糖(120mg，0.584mmol)。将反应混合物在65℃下再加热48h，且通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到L17-C3(38mg，28μmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ13.2(br s,1H),10.2(s,1H),8.88(d,1H),8.85(d,1H),8.62(s,1H),8.53(br s,1H),7.63(d,1H),7.59(d,2H),7.52(d,1H),7.45(t,1H),7.42(d,1H),7.33(dd,2H),7.33(d,2H),7.27(d,1H),7.27(d,1H),7.21(t,2H),7.15(t,1H),7.04(t,1H),7.01(d,1H),6.73(t,1H),6.21(d,1H),5.51(d,1H),5.28/5.22(m,2H),5.04(br s,2H),4.52(m,1H),4.49(m,2H),4.12(m,1H),3.89(m,1H),3.78(m,1H),3.76(s,3H),3.63(m,6H),3.42/3.21(m,2H),3.38(m,1H),3.37(m,1H),3.28/2.52(m,2H),3.22(m,4H),2.96(m,2H),2.21(m,1H),1.86(s,3H),1.36(d,3H),1.03/0.94(m,6H)。13C NMR(125MHz,dmso-d6):δ157.8,152.5,131.4,131.3,131.3,130.6,129.1,129,128.8,120.8,120.6,119.4,116.2,116.1,112.3,111.3,111.3,74.2,71.3,70.4,69.5,69.2,67.1,65.6,64.5,64.5,56.2,54.8,54.2,51.9,50.3,49.9,32.7,29.4,19.3,18.9,18.19F NMR(470MHz,dmso-d6):δ-74.4,-112.1。IR波长(cm-1)：2200-3500、2104、1669、1181、1132、798、758、720。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1369.4918/1369.4913(测量值/理论值)。
L24-P7的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-乙基-苯基]-6-丙-1-炔基-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003401
向(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(2-叠氮基乙氧基)乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(溴甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(72mg，0.109mmol)于THF(5mL)中的溶液中依次添加(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-乙基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-丙-1-炔基-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸P7(30mg，0.036mmol)及DIPEA(19μL，0.108mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，且通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到L24-P7(25mg，18μmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.25(s,1H),8.85(d,1H),8.62(s,1H),8.35(d,1H),7.72(d,2H),7.6(d,1H),7.5(d,1H),7.45(t,1H),7.43(d,2H),7.4(d,1H),7.22(d,1H),7.17(m,1H),7.15(m,1H),7.13(d,1H),7.02(t,1H),7(d,1H),6.78(t,1H),6.3(d,1H),5.98(br s,1H),5.5(dd,1H),5.4(br s,1H),5.28/5.2(m,2H),4.5(br s,2H),4.38(m,1H),4.3(dd,1H),4.25(m,2H),3.94(br s,2H),3.74(s,3H),3.70/3.50(m,10H),3.50(m,8H),3.35(t,2H),3.22/2.5(m,2H),3.0(m,2H),2.95(t,2H),2.9(br s,3H),2.55/2.4(m,2H),2.0(s,3H),1.98(m,1H),1.70/1.30(m,4H),0.88/0.82(m,6H),0.72(t,3H)。IR波长(cm-1)：3321、2111、1660、1188、1124、798、756、719。HR-ESI+:m/z[M+H-CF3COOH]+＝1409.59077/1409.5903(测量值/理论值)。
L24-P6的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-[2-(羟基甲基)苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003411
向(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(溴甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(55.3mg，84μmol)于DMF(1mL)中的溶液中依次添加(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-[2-(羟基甲基)苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(53.2mg，59μmol；根据EP 2 886 545合成)及DIPEA(44μL，0.252mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h且在减压下浓缩。将残余物用二噁烷(1mL)稀释，且添加氢氧化锂单水合物(14mg，0.0334mmol)于水(0.3mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜，通过添加1M HCl水溶液(0.33mL，0.33mmol)中和，在减压下浓缩。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到L24-P6(47mg，32μmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.27(s,1H),8.94(d,1H),8.61(s,1H),8.38(d,1H),7.93(d,1H),7.73(d,2H),7.68(t,1H),7.66(d,1H),7.5(t,1H),7.45(d,1H),7.43(d,2H),7.38(d,1H),7.37(m,1H),7.3(dd,2H),7.21(d,1H),7.2(t,2H),7.16(t,1H),7.02(d,1H),6.72(t,1H),6.21(d,1H),6.01(m,1H),5.5(d,1H),5.4(m,1H),5.3(m,2H),4.8(s,2H),4.39(m,1H),4.32(dd,1H),4.25(m,2H),3.95(s,2H),3.57(m,16H),3.42/3.26(m,2H),3.36(m,2H),3.29/2.51(m,2H),3.11/2.92(m,8H),2.98(m,2H),2.97(m,2H),1.99(m,1H),1.83(s,3H),1.68/1.62(m,2H),1.45/1.39(m,2H),0.88/0.82(m,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ158.2,152.1,134.2,131.4,131.3,130.9,130.8,130.2,128.7,128.1,127,120.8,119.3,116.3,115.7,112.2,111,74,70.5,70.1,69.5,67.7,62.3,58.8,57.2,55.5,54.1,50.5,46.6,38.9,32.5,31.5,29.6,27.6,19.6,18.6,18.3.19FNMR(376MHz,dmso-d6):δ-74.6,-112.5。IR波长(cm-1)：3303、2104、1730、1662、1182、1124、833、796、761。HR-ESI+:m/z[M+2H]/2+＝726.2957/726.2941(测量值/理论值)。
L20-C6的制备：
(2R)-3-[2-[[2-[2-[[2-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]-甲基-氨基]乙基-甲基-氨甲酰基]氧基甲基]苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-丙酸
Figure BDA0003410186110003421
步骤1：(2R)-3-[2-[[2-[2-[[2-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]乙基-甲基-氨甲酰基]氧基甲基]苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-丙酸乙酯
向((2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-[2-(羟基甲基)苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(50mg，55μmol；根据EP 2886 545合成)于二氯甲烷(0.5mL)中的溶液中依次添加氯甲酸4-硝基苯酯(19mg，94μmol)及DIPEA(69μL，0.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，添加且N-甲基-N-[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(54mg，0.287mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，在减压下浓缩。通过硅胶色谱(甲醇/二氯甲烷的梯度)纯化残余物，得到(2R)-3-[2-[[2-[2-[[2-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]乙基-甲基-氨甲酰基]氧基甲基]苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-丙酸乙酯(30mg，27μmol)。1HNMR(500MHz,dmso-d6):δ9.00(d,1H),8.58(s,1H),7.98(m,1H),7.61(d,1H),7.51(t,1H),7.48(d,1H),7.45(t,1H),7.31(dd,2H),7.31(d,1H),7.22(t,2H),7.18(t,1H),7.17(d,1H),7.02(d,1H),6.76(t,1H),6.32(d,1H),5.52(dd,1H),5.47(br s,2H),5.26(m,2H),4.2(m,2H),4.07(m,2H),3.24/3.17(2m,4H),3.17/2.6(2m,2H),2.77/2.64(m,6H),2.7(m,2H),2.49/2.28(m,8H),2.12(br s,3H),1.87(s,3H),1.3(3s,9H),1.07(t,3H)。13C NMR(125MHz,dmso-d6):δ158.2,152.4,131,130.1,130.1,129,128.3,128.2,121.5,121.4,120.9,116.3,115.8,112,111.1,74.1,69.2,68.1,65.6,61.2,56.8,55.2,53.1,46.5,45.9,34.5,32.4,28.3,17.4,14.9.19F NMR(470MHz,dmso-d6):δ-112.2。IR波长(cm-1)：1750、1693、1221/1160/1120、834/756。
步骤2：2R)-3-[2-[[2-[2-[[2-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]-甲基-氨基]乙基-甲基-氨甲酰基]氧基甲基]苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-丙酸L20-C6
在0℃下向(2R)-3-[2-[[2-[2-[[2-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]乙基-甲基-氨甲酰基]氧基甲基]苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-丙酸乙酯(25mg，22μmol)于二氯甲烷(0.5mL)中的溶液中添加°三氟乙酸(35μL，447mmol)。将反应混合物在室温下搅拌6h且在减压下浓缩。用DMF(0.5mL)稀释残余物，且依次添加(4-硝基苯基)碳酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲酯(20mg，22μmol；根据L23-P3的制备的步骤3获得)及DIPEA(78μL，0.447mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，在减压下浓缩，用二噁烷(0.5mL)稀释，且添加氢氧化锂单水合物(3.7mg，89μmol)于水(0.3mL)中的溶液。将反应物在室温下搅拌过夜，在0℃下通过逐滴添加1M HCl水溶液来中和，直至pH 7，且在减压下浓缩。
将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到L20-C6(13mg，8μmol)。1H NMR(500MHz,dmso-d6):δ8.88(m,1H),8.54(s,1H),7.97(d,1H),7.77(m,1H),7.6(d,2H),7.5(m,1H),7.47(m,1H),7.46(m,1H),7.41(d,1H),7.29(dd,2H),7.21(t,2H),7.19(d,1H),7.18(m,2H),7.12(t,1H),6.97(d,1H),6.7(t,1H),6.19(d,1H),5.49(d,1H),5.45(m,4H),5.23(m,2H),4.89(m,2H),4.4(m,1H),4.32(dd,1H),4.22(m,2H),3.94(s,2H),3.56(m,10H),3.39/2.44(m,2H),3.34(t,2H),3.28(m,4H),2.99(m,2H),2.75/2.7(m,6H),2.73(m,2H),2.5/2.37(m,8H),2.18(s,3H),2.04(m,1H),1.81(s,3H),1.74/1.62(m,2H),1.46/1.38(m,2H),0.86/0.8(m,6H)。13C NMR(125MHz,dmso-d6):δ158.3,152.9,131.5,131.4,131.3,131,130,128.3,128.3,128,127.7,120.8,119.3,116.2,115.6,112.1,111.1,75.3,70.5,70.2,69.2,67.6,66.6,65.4,57.2,56.7,55.1/52.9,54,50.5,46.5,45.1,39.1,34.4,31.5,29.6,27.4,19.9,18.2,18.19F NMR(470MHz,dmso-d6):δ-112.5。IR波长(cm-1)：3323、2106、1691、1660、1220、1120、1051、759。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1609.6517/1609.6500(测量值/理论值)。
L22-C1的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003451
步骤1：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；双-2,2,2-三氟乙酸
向N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(200mg，0.388mmol)于DMF(20mL)中的溶液中依次添加三苯膦(152mg，0.581mmol)及N-溴丁二酰亚胺(103mg，0.581mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，且添加(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸C1(302mg，345mmol)及DIPEA(120μL，0.691mmol)。将反应物在室温下搅拌2h，且添加二乙胺(49μL，486mmol)。将反应物在室温下搅拌24h，在减压下浓缩且通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；双-2,2,2-三氟乙酸(253mg，0.220mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.4(s,1H),8.89(d,1H),8.75(d,1H),8.61(s,1H),8.08(large,3H),7.72(d,2H),7.63(d,1H),7.52(d,1H),7.46(t,1H),7.45(d,2H),7.39(d,1H),7.31(dd,2H),7.21(d,1H),7.21(t,2H),7.15(d,1H),7.15(t,1H),7.04(t,1H),7.01(d,1H),6.72(t,1H),6.22(d,1H),5.5(dd,1H),5.25(m,2H),4.53(m,2H),4.52(m,1H),4.28(m,2H),3.76(s,3H),3.62(m,1H),3.43/3.29(m,4H),3.28/2.5(m,2H),3.13/2.94(m,4H),3.01(m,2H),2.9(br s,3H),2.07(m,1H),1.84(d,3H),1.36(d,3H),0.95(d,6H)。13C NMR(125MHz,dmso-d6):δ253,158.2,134.3,131.5,131.4,131.4,131.3,131,128.9,121.1,120.6,119.5,116.3,115.9,113,112.3,111.1,74.1,69.8,67.5,58.7,57.9,56.5,55.4,49.8,46.5,45.2,32.9,30.4,18.6,18.4,18.3.19F NMR(470MHz,dmso-d6):δ-74,-112.6。
步骤2：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；双-2,2,2-三氟乙酸L22-C1
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；双-2,2,2-三氟乙酸(150mg，0.130mmol)于DMF(0.4mL)中的溶液中添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(60mg，194mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h，在减压下浓缩且通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到L22-C1(67mg，37μmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.14(s,1H),8.88(d,1H),8.61(s,1H),8.22(d,1H),7.84(d,1H),7.73(d,2H),7.63(d,1H),7.52(dd,1H),7.45(td,1H),7.44(d,2H),7.38(d,1H),7.31(dd,2H),7.21(d,1H),7.21(t,2H),7.15(t,1H),7.14(d,1H),7.02(t,1H),7.01(d,1H),7(s,2H),6.71(t,1H),6.21(d,1H),5.5(dd,1H),5.25(m,2H),4.53(br s,2H),4.38(m,1H),4.25(m,2H),4.19(dd,1H),3.76(s,3H),3.58(m,2H),3.54(t,2H),3.48(m,2H),3.43/3.3(m,4H),3.28/2.51(m,2H),3.16/2.98(m,4H),3.04(m,2H),2.91(br s,3H),2.43/2.33(m,2H),1.93(m,1H),1.84(s,3H),1.31(d,3H),0.87/0.82(m,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ158,152.8,135.2,134,131.4,131.3,131.3,131.2,131,128.9,120.8,120.6,119.3,116.3,115.8,112.4,112.3,111.1,74.2,69.6,67.4,67.4,67.1,67,58.4,57.9,56.2,55.2,49.7,46.5,45.1,37.1,36.3,32.7,30.9,19.6,18.5,18.2,18.2.19F NMR(376MHz,dmso-d6):δ-74.6,-112.2。IR波长(cm-1)：2000-3500,1760/1705,1733,1668,1180/1128,829/798/758/720/696。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1345.4944/1345.4954(测量值/理论值)
L9-C9的制备：
3-[4-[[2-[(2R)-2-羧基-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-乙基]苯氧基]甲基]嘧啶-2-基]苯磺酸酯；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003471
步骤1：(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺
向3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸(855mg，4.01mmol)于THF(42mL)中的溶液中添加N,N'-二环己基甲烷二亚胺(1.05g，5.08mmol)及1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(510mg，4.43mmol)。将反应混合物在室温下搅拌20h。将沉淀物通过过滤移除，且将过滤物添加至(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(1.27g，3.35mmol)于DMF(42mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌20h，用二乙醚(250mL)稀释。通过过滤回收固体，得到白色固体状的(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(1.81g；3.15mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.87(s,1H),8.05(d,1H),7.82(d,1H),7.53(d,2H),7.21(d,2H),7.00(s,2H),5.95(t,1H),5.39(s,2H),5.07(t,1H),4.41(d,2H),4.34-4.40(m,1H),4.18-4.22(m,1H),3.42-3.65(m,4H),2.88-3.02(m,2H),2.73(s,2H),2.28-2.45(m,2H),1.91-1.99(m,1H),1.53-1.75(m,2H),1.30-1.147(m,2H),0.85(d,3H),0.81(d,3H)。13C NMR(125MHz,dmso-d6):δ171.05,170.83,170.32,170.09,158.82,137.49,137.37,134.50,126.88,118.81,66.66,66.53,62.57,57.49,53.06,36.74,35.76,30.51,29.31,26.79,25.20,19.16,18.07.MS(ESI)m/z[M+H]+＝575.2。
步骤2：(2S)-N-[4-(溴甲基)苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺
在0℃下在氩气下向(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-N-[4-(羟基甲基)苯基]-5-脲基-戊酰胺(37.2mg，65μmol)于THF(1mL)中的溶液中逐滴添加三溴化磷(45μL，97mmol)。将反应物在0℃下搅拌1h，且在室温下搅拌2h。反应进程之后为UPLC-MS：等分试样用大量过量吗啉/乙腈处理，随后形成相应吗啉加合物。将反应物用THF(3mL)稀释，通过添加2滴NaHCO3的饱和溶液来淬灭，在室温下搅拌5min，经硫酸镁干燥且过滤。含有粗(2S)-N-[4-(溴甲基)苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺(理论上45mg，65μmol)的残余物直接用于下一步骤中。MS(ESI)m/z[M+H]+＝662.62(吗啉加合物)
步骤3：3-[4-[[2-[(2R)-2-羧基-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-乙基]苯氧基]甲基]嘧啶-2-基]苯磺酸酯L9-C9
向(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(3-磺酸基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸C9(15mg，16mmol)于DMF(0.8mL)中的溶液中添加(2S)-N-[4-(溴甲基)苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺(自步骤2理论上45mg粗产物，65μmol)于THF(1mL)及DIPEA(14μL，81μmol)中的溶液。在50℃下加热下将反应物在室温下搅拌2h。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到L9-C9(5.2mg，3.5μmol)。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1481.4917/1481.4896(测量值/理论值)。
L9-C13的制备：
(2R)-2-[6-(3-氨基-4,5-二氟-苯基)-(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003501
该程序正如在L9-C9的合成过程中，用(2R)-2-{[(5Sa)-6-(3-氨基-4,5-二氟苯基)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸C13置换步骤3中所用的C9，且使用TFA方法进行纯化。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.2(s),8.9(d,1H),8.6(s,1H),8.12(d),7.8(d),7.7(d,2H),7.6(d,1H),7.5(d,1H),7.45(d,2H),7.42(m,1H),7.32(d,1H),7.2(d,1H),7.18(m,1H),7.18(m,1H),7.02(d,1H),7(s,2H),7(m,1H),6.75(t,1H),6.65(d,1H),6.25(d,1H),6.15(dd,1H),5.98(m,1H),5.48(dd,1H),5.4(br s,1H),5.24(dd,2H),4.51(br s,2H),4.38(m,1H),4.28(m,2H),4.22(m,1H),3.80-3.40(m,8H),3.75(s,3H),3.26(m,4H),3.1(m,2H),2.98(m,4H),2.9(br s,3H),2.9/2.5(2m,2H),2.43/2.3(2m,2H),1.92(m,1H),1.88(s,3H),1.70-1.30(m,4H),0.82(2d,6H)。19F NMR(470MHz,dmso-d6):δ-74.3,-139.3,-160.4。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1464.5482/1464.5449(测量值/理论值)。
L14-C3的制备：
(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-[(5Sa)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(2-叠氮基乙氧基)乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]哌嗪-1-羰基]氧基甲基]苯基]乙基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸
Figure BDA0003410186110003511
步骤1：2-碘-4-硝基-苯甲酸
向2-氨基-4-硝基-苯甲酸(10.0g，54.90mmol)于乙腈(280mL)中的溶液中添加对甲苯磺酸单水合物(32.0g，168.2mmol)。将混合物在室温下搅拌15min，随后在15min内逐滴添加亚硝酸钠(8.00g，115.9mmol)及碘化钾(24.0g，144.6mmol)于水(140mL)中的溶液中的溶液。将反应混合物搅拌19h。反应完成后，将混合物用硫代硫酸钠(13.02g，82.36mmol)淬灭且用盐酸3M(25mL)的水溶液酸化。将水层用乙酸乙酯(2×250mL)萃取，且将合并的有机层用盐酸1M(100mL)的水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干。使所得残余物溶于二氯甲烷(1L)中，且用HCl 1M(100mL)的水溶液洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干，得到呈橙色粉末状的2-碘-4-硝基-苯甲酸(15.0g，51.2mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ13.8(br s,1H),8.64(s,1H),8.27(d,1H),7.86(d,1H)。
步骤2：(2-碘-4-硝基-苯基)甲醇
向2-碘-4-硝基-苯甲酸(5.0g，17.06mmol)于THF(70mL)中的溶液中添加硼烷1M于THF(85mL，85.0mmol)中的溶液。将反应混合物在65℃下搅拌4h。反应完成后，使反应混合物冷却至室温，且利用添加甲醇(200mL)淬灭。将混合物在室温下搅拌30min，随后浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈黄色固体状的(2-碘-4-硝基-苯基)甲醇(3.38g，12.11mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ8.54(d,1H),8.29(dd,1H),7.70(d,1H),5.82(t,1H),4.47(d,2H)。
步骤3：(4-氨基-2-碘-苯基)甲醇
在80℃下向(2-碘-4-硝基-苯基)甲醇(3.70g，13.26mmol)于乙醇(100mL)及水(25mL)中的溶液中依次添加铁(3.70g，66.25mmol)及氯化铵(800mg，14.96mmol)。将反应混合物搅拌3小时。反应完成后，将反应混合物经
Figure BDA0003410186110003521
过滤，用乙醇洗涤且浓缩至干。使所得残余物溶于乙酸乙酯(100mL)中，且用碳酸氢钠(100mL)的饱和溶液洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干，得到呈黄色油状的(4-氨基-2-碘-苯基)甲醇(2.48g，9.95mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ7.02-7.10(m,2H),6.57(d,1H),5.16(s,2H),4.97(t,1H),4.28(d,2H)。
步骤4：4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯胺
向(4-氨基-2-碘-苯基)甲醇(3.51g，13.37mmol)于二氯甲烷(150mL)中的溶液中添加咪唑(0.95g，13.95mmol)。将混合物冷却至0℃，随后经过15分钟逐滴添加叔丁基-氯-二甲基-硅烷(2.40mL，13.85mmol)于二氯甲烷(150mL)中的溶液。移除冰浴，且将反应混合物在室温下搅拌16h。反应完成后，将反应混合物用甲醇(20mL)淬灭且浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈黄色油状的4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯胺(3.64g；10.03mmol；75％)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ7.05(s,1H),7.03(d,1H),6.55(d,1H),5.24(s,2H),4.46(s,2H),0.88(s,9H),0.06(s,6H)。
步骤5：(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酸
向(2S)-2-氨基丙酸(3.22g，36.09mmol)于水(90mL)中的溶液中依次添加碳酸钠(7.29g，68.74mmol)及(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酸酯(15.0g，34.37mmol)于二甲氧基乙烷(90mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌16h。反应完成后，用盐酸1M的水溶液将混合物酸化直至pH＝1，随后将水层用乙酸乙酯(3×500mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干，得到粗产物，将其用二乙醚(50mL)研磨，得到呈白色固体状的(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酸(11.25g，27.41mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6)δ12.48(s,1H),8.21(d,1H),7.89(d,2H),7.72-7.79(m,2H),7.28-7.46(m,5H),4.15-4.32(m,4H),3.90(t,1H),1.90-2.02(m,1H),1.28(d,3H),0.86-0.90(m,6H)。
步骤6：N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
向(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酸(1.50g，3.65mmol)于二氯甲烷(18mL)及甲醇(18mL)中的溶液中依次添加4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯胺(1.33g，3.65mmol)及2-乙氧基-2H-喹啉-1-甲酸乙酯(1.36g，5.48mmol)。将无色悬浮液在室温下搅拌16h。浓缩至干后，将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)且随后通过C18色谱(甲醇/水的梯度)纯化，得到呈白色固体状的N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(1.18g，1.56mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.05(s,1H)。8.16-8.24(m,2H),7.88(d,2H),7.71-7.77(m,2H),7.55(d,1H),7.37-7.48(m,3H),7.27-7.37(m,3H),4.56(s,2H),4.38(t,1H),4.18-4.33(m,3H),3.91(t,1H),2.08-2.20(m,1H),1.30(d,3H),0.83-0.95(m,15H),0.06(s,6H)。
步骤7：(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三苯甲氧基-6-(苯甲氧基甲基)四氢吡喃-2-酮
将(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三苯甲氧基-6-(苯甲氧基甲基)四氢吡喃-2-醇(30.0g，55.49mmol)于DMSO(120mL)中的悬浮液在室温下搅拌30min(直至完全溶解)，随后经过15min在室温下逐滴添加乙酸酐(90mL)。将米色溶液搅拌16h，随后冷却至0℃，且缓慢添加盐酸1M(100mL)的水溶液。将反应混合物在室温下搅拌20min，随后蒸发乙酸。用水(200mL)及乙酸乙酯(200mL)稀释所得残余物。将水层用乙酸乙酯(2×200mL)萃取，且合并的有机层用水(2×500mL)、用碳酸氢钠(2×500mL)的饱和溶液洗涤，随后经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干，得到粗产物。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈无色油状的(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三苯甲氧基-6-(苯甲氧基甲基)四氢吡喃-2-酮(25.05g，46.51mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ7.19-7.39(m,20H),4.85(d,1H),4.57-4.72(m,5H),4.46-4.56(m,3H),4.36(d,1H),3.98-4.05(m,1H),3.84-3.92(m,1H),3.65-3.76(m,2H)。
步骤8：(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三苯甲氧基-6-(苯甲氧基甲基)-2-(2-三甲基硅烷基乙炔基)四氢吡喃-2-醇
在-78℃下在20min内向三甲基硅烷基乙炔(24mL，168.6mmol)于THF(325mL)中的溶液中添加丁基锂2.5M于己烷(59.41mL，148.5mmol)中的溶液。将无色溶液在-78℃下搅拌45min，且随后在0℃下搅拌45min。使反应混合物冷却至-78℃，且经过45min逐滴添加(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三苯甲氧基-6-(苯甲氧基甲基)四氢吡喃-2-酮(25.0g，46.41mmol)于THF(325mL)中的溶液。将反应混合物在此温度下搅拌4h，随后用水(200mL)淬灭。将水层用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干，得到呈米色油状的(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三苯甲氧基-6-(苯甲氧基甲基)-2-(2-三甲基硅烷基乙炔基)四氢吡喃-2-醇(29.56g，46.41mmol)，其以比率4/6含有两种非对映异构体。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ7.13-7.43(m,20H),4.87-4.99(m,1H),4.65-4.83(m,4H),3.43-3.57(m,3H),3.70-3.85(m,2H),3.55-3.68(m,3H),3.43-3.53(m,2H),0.11-0.22(m,9H)。
步骤9：三甲基-[2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-3,4,5-三苯甲氧基-6-(苯甲氧基甲基)四氢吡喃-2-基]乙炔基]硅烷
在20min内在-15℃下向(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三苯甲氧基-6-(苯甲氧基甲基)-2-(2-三甲基硅烷基乙炔基)四氢吡喃-2-醇(29.56g，46.42mmol)于乙腈(83mL)及二氯甲烷(193mL)中的溶液中添加三乙基硅烷(44.98mL，278.5mmol)于乙腈/二氯甲烷(37mL/18mL)的混合物中的溶液，随后经过30min在-15℃下添加三氟化硼二乙基醚合物(23.53mL，185.7mmol)于乙腈(37mL)中的溶液。将无色溶液在相同温度下搅拌5h，随后用水(500mL)稀释。将水层用乙酸乙酯(2×500mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干，得到呈棕色油状的三甲基-[2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-3,4,5-三苯甲氧基-6-(苯甲氧基甲基)四氢吡喃-2-基]乙炔基]硅烷(28.82g，46.41mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ7.10-7.44(m,20H),4.93(d,1H),4.67-4.86(m,4H),4.43-4.57(m,3H),4.16-4.28(m,1H),3.42-3.68(m,6H),0.15(s,9H)。
步骤10：(2R,3R,4R,5S,6S)-3,4,5-三苯甲氧基-2-(苯甲氧基甲基)-6-乙炔基-四氢吡喃
向三甲基-[2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-3,4,5-三苯甲氧基-6-(苯甲氧基甲基)四氢吡喃-2-基]乙炔基]硅烷(28.80g，46.39mmol)于甲醇(1.12L)及二氯甲烷(240mL)中的溶液中添加氢氧化钠1M(80mL)的水溶液。将米色溶液在室温下搅拌1h，随后用盐酸1M的水溶液酸化直至pH＝1，且用水(500mL)稀释。蒸发甲醇，且随后用乙酸乙酯(2×1L)萃取水层。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈无色油状的(2R,3R,4R,5S,6S)-3,4,5-三苯甲氧基-2-(苯甲氧基甲基)-6-乙炔基-四氢吡喃(20.00g，36.45mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ3.42-3.67(m,7H),4.17(d,1H),4.44-4.56(m,3H),4.67-4.86(m,4H),4.90(d,1H),7.15-7.40(m,20H)。
步骤11：(2S,3R,4R,5S,6R)-2-乙炔基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-3,4,5-三醇
在室温下经过5min向(2R,3R,4R,5S,6S)-3,4,5-三苯甲氧基-2-(苯甲氧基甲基)-6-乙炔基-四氢吡喃(20.00g，36.45mmol)于乙硫醇(400mL)中的溶液中逐滴添加三氟化硼二乙基醚合物(147.8mL，1166mmol)。将米色溶液在室温下搅拌16h，随后冷却至0℃，且配备有含有次氯酸钠的饱和水溶液的气阱。在0℃下在1h内逐滴添加碳酸氢钠的饱和水溶液(500mL)(形成二氧化碳)。浓缩至干后，粗产物通过硅胶色谱(甲醇/二氯甲烷的梯度)纯化，得到呈白色固体状的(2S,3R,4R,5S,6R)-2-乙炔基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-3,4,5-三醇(4.05g，21.52mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ5.28(d,1H),4.99(d,1H),4.91(d,1H),4.52(t,1H),3.77(d,1H),3.60-3.69(m,1H),3.35-3.43(m,1H),3.32(s,1H),2.97-3.13(m,4H)。
步骤12：(2S,3S,4R,5R,6S)-6-乙炔基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸甲酯
向(2S,3R,4R,5S,6R)-2-乙炔基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-3,4,5-三醇(4.05g，21.52mmol)于碳酸氢钠(81mL)及THF(81mL)的饱和水溶液的溶液中添加(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基(168mg，1.08mmol)。使黄色悬浮液冷却至0℃，且在30min内逐份添加1,3-二溴-5,5-二甲基-咪唑啶-2,4-二酮(12.31g，43.04mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌4h，随后利用添加甲醇(40mL)淬灭。在此温度下搅拌30min后，添加碳酸钾(10mL)及二氯甲烷(100mL)的饱和水溶液。用水(2×200mL)萃取有机层，随后将经合并的水层用盐酸3M的水溶液酸化直至pH＝1且浓缩至干。使所得残余物溶于甲醇(100mL)中及盐酸3M(20mL)的水溶液中。将混合物浓缩至干，且与甲醇(4×100mL)一起共蒸发几次。将粗产物通过硅胶色谱(甲醇/二氯甲烷铈显影剂的梯度)纯化，得到呈米色固体状的(2S,3S,4R,5R,6S)-6-乙炔基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸甲酯(3.00g，13.88mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ5.46(d,1H),5.32(d,1H),5.18(d,1H),3.93-4.00(m,1H),3.75(dd,1H),3.65(s,3H),3.40-3.44(m,1H),3.31(s,1H),3.09-3.19(m,2H)。
步骤13：(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-乙炔基-四氢吡喃-2-甲酸甲酯
向(2S,3S,4R,5R,6S)-6-乙炔基-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸甲酯(3.00g，13.88mmol)于DMF(37.5mL)及吡啶(12.5mL)中的溶液中添加N,N-二甲基吡啶-4-胺(84.8mg，0.693mmol)。使反应混合物冷却至0℃，随后在5min内逐滴添加乙酸酐(20.0mL，213mmol)。将无色溶液在室温下搅拌3h，随后用盐酸1M(200mL)的水溶液稀释。将水层用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。合并的有机层用盐酸1M(2×200mL)的水溶液，随后用碳酸钾(200mL)的饱和水溶液洗涤，随后经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干，得到粗产物。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷铈显影剂的梯度)纯化，得到呈白色固体状的(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-乙炔基-四氢吡喃-2-甲酸甲酯(4.60g，13.44mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ5.33(t,1H),4.93-5.01(m,2H),4.70(d,1H),4.44(d,1H),3.67(s,1H),3.64(s,3H),2.02(s,3H),1.94-2.01(m,6H)。
步骤14：(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯
向(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-乙炔基-四氢吡喃-2-甲酸甲酯(496mg，1.45mmol)于DMF(7.3mL)中的溶液中依次添加N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(730mg，0.966mmol)、DIPEA(738μL，4.47mmol)、碘化铜(18.4mg，96.6mmol)及二氯-双-(三苯膦)钯(II)(67.8mg，96.6mmol)。将黄色溶液用氩气吹扫，随后在室温下搅拌16h。用水(100mL)稀释后，用乙酸乙酯(2×100mL)萃取水层。合并的有机层用水(2×200mL)且用氯化铵(2×200mL)的饱和水溶液洗涤，随后经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈黄色固体状的(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(782mg，0.806mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.09(s,1H)。8.20(d,1H),7.89(d,2H),7.70-7.78(m,3H),7.55(d,1H),7.32-7.46(m,4H),7.27-7.32(m,2H),5.41(t,1H),4.96-5.14(m,3H),4.67(s,2H),4.51(d,1H),4.36-4.44(m,1H),4.16-4.32(m,3H),3.88-3.95(m,1H),3.64(s,3H),1.94-2.07(m,10H),1.30(d,3H),0.84-0.93(m,15H),0.08(s,6H)。
步骤15：(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯
将(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(750mg，0.773mmol)于THF(15mL)中的溶液用氩气吹扫。添加干燥铂5％/碳(75mg，50％w/w)。将反应混合物依次用氩气、用H2吹扫且在H2气氛(P atm)下在室温下搅拌16h。将反应混合物经
Figure BDA0003410186110003581
垫过滤，用THF洗涤，随后浓缩至干。将完整顺序(添加干燥铂5％/碳(75mg，50％w/w)，在室温下在H2气氛(1bar)下搅拌16h且经
Figure BDA0003410186110003582
垫过滤)再进行4次。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈白色固体状的(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(470mg，0.483mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.90(s,1H),8.16(d,1H),7.89(d,2H),7.70-7.78(m,2H),7.37-7.49(m,4H),7.27-7.32(m,3H),7.23(d,1H),5.29(t,1H),4.95(t,1H),4.78(t,1H),4.60(s,2H),4.34-4.44(m,2H),4.16-4.32(m,3H),3.88-3.95(m,1H),3.72-3.79(m,1H),3.64(s,3H),2.69-2.78(m,1H),2.50-2.60(m,1H),1.92-2.03(m,10H),1.55-1.75(m,2H),1.30(d,3H),0.84-0.93(m,15H),0.05(s,6H)。
步骤16：(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯
向(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(470mg，0.483mmol)于THF(540μL)及水(540μL)中的溶液中添加乙酸(1.6mL，28.28mmol)。将无色溶液在室温下搅拌16h，随后用水(100mL)稀释。将水层用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。合并的有机层用水(2×200mL)且用碳酸氢钠的饱和水溶液(200mL)洗涤，随后经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈白色固体状的(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(354mg，0.412mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.87(s,1H),8.16(d,1H),7.89(d,2H),7.70-7.78(m,2H),7.37-7.50(m,4H),7.27-7.37(m,3H),7.25(d,1H),5.29(t,1H),4.91-4.98(m,2H),4.78(t,1H),4.34-4.44(m,4H),4.16-4.32(m,3H),3.88-3.95(m,1H),3.72-3.79(m,1H),3.64(s,3H),2.64-2.73(m,1H),2.50-2.60(m,1H),1.92-2.03(m,10H),1.69-1.79(m,1H),1.52-1.65(m,1H),1.30(d,3H),0.84-0.93(m,6H)。
步骤17：(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰氧基甲基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯
向(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(310mg，0.361mmol)于THF(7.75mL)中的溶液中依次添加吡啶(146μL，1.80mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(182mg，0.901mmol)。将白色悬浮液在室温下搅拌16h，随后浓缩至干，得到粗产物。将粗产物通过硅胶色谱(的梯度乙酸乙酯/二氯甲烷)纯化，得到呈白色固体状的(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰氧基甲基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(257mg，0.251mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.04(s,1H),8.31(d,2H),8.20(d,1H),7.89(d,2H),7.66-7.78(m,2H),7.56(d,2H),7.28-7.52(m,8H),5.31(t,1H),5.25(s,2H),4.96(t,1H),4.79(t,1H),4.40(d,2H),4.16-4.32(m,3H),3.88-3.95(m,1H),3.74-3.83(m,1H),3.61(s,3H),2.74-2.84(m,1H),2.60-2.71(m,1H),1.90-2.03(m,10H),1.72-1.83(m,1H),1.58-1.71(m,1H),1.30(d,3H),0.82-0.94(m,6H)。LC-MS:MS(ESI)m/z[M+Na]+＝1047.6。
步骤18：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[2-[(2SR,3SR,4RS,5SR,6SR)-3,4,5-三乙酰氧基-6-]甲氧羰基]-四氢吡喃-2-基]乙基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-(2-哌嗪-1-基乙氧基)苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(C3)(118mg，0.121mmol)于二甲基甲酰胺(3.0mL)中的溶液中依次添加(3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰氧基甲基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(130mg，0.127mmol)于二甲基甲酰胺(3.0mL)及DIPEA(60μL，0.363mmol)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌2h。获得呈二甲基甲酰胺中的溶液形式的(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[2-[(2SR,3SR,4RS,5SR,6SR)-3,4,5-三乙酰氧基-6-]甲氧羰基]-四氢吡喃-2-基]乙基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸，且与此类似地用于下一步骤中。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1745.6+1747.6。
步骤19：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[2-[(2SR,3SR,4RS,5SR,6SR)-3,4,5-三乙酰氧基-6-]甲氧羰基]-四氢吡喃-2-基]乙基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向2SR,3SR,4RS,5RS,6SR)-6-[2-[(5Sa)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]哌嗪-1-羰基]氧基甲基]苯基]乙基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸(0.121mmol)于来自步骤18的DMF(3.0mL)中的溶液中依次添加甲醇(2mL)及氢氧化锂单水合物(64.0mg，1.52mmol)于水(2ml)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1h。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到呈白色粉末状的(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[2-[(2SR,3SR,4RS,5SR,6SR)-3,4,5-三乙酰氧基-6-]甲氧羰基]-四氢吡喃-2-基]乙基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(124mg，0.0895mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1384.3+1386.3。
步骤20：(2,3,4,5,6-五氟苯基)2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸酯2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸
向2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸(75mg，0.342mmol)THF(500μL)中的溶液中的溶液中添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(75.5mg，0.410mmol)于THF(500μL)中的溶液及N,N'-二环己基甲烷二亚胺(84.7mg，0.410mmol)于THF(500μL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌15h，且反应过程之后为UPLC-MS。通过在小的一次性玻璃料上简单过滤悬浮液获得为THF溶液的(2,3,4,5,6-五氟苯基)2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸酯。此溶液未经进一步纯化即用于下一步骤中。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M-N2+H]+＝372.3。
步骤21：(2SR,3SR,4RS,5RS,6SR)-6-[2-[(5Sa)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]哌嗪-1-羰基]氧基甲基]苯基]乙基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸L14-C3
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[2-[(2SR,3SR,4RS,5SR,6SR)-3,4,5-三乙酰氧基-6-]甲氧羰基]-四氢吡喃-2-基]乙基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(118mg，0.085mmol)于DMF(500μL)中的溶液中依次添加(2,3,4,5,6-五氟苯基)2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸酯(0.342mmol)于来自步骤20的THF及DIPEA(42.2μL，0.256mmol)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到呈白色粉末状的L14-C3。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1599.0+1601.2。IR波长(cm-1)：3263、2105、1652、1600、1284/1240/1089、756。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.98(s),8.85(d,1H),8.52(s,1H),8.38(d,1H),7.93(d,1H),7.56(d,1H),7.5(t,1H),7.49(d,1H),7.47(d,1H),7.44(d,1H),7.42(s,1H),7.3(dd,2H),7.22(d,1H),7.2(t,2H),7.19(t,1H),7.13(d,1H),7.08(t,1H),7.02(t,1H),6.95(d,1H),6.65(t,1H),6.11(d,1H),5.43(d,1H),5.27/5.2(m,2H),4.93(br s,2H),4.38(m,1H),4.35/4.2(2m,2H),4.3(m,1H),3.94(s,2H),3.75(s,3H),3.58(m,10H),3.57(m,1H),3.51/2.29(2dd,2H),3.35(m,2H),3.25(m,4H),3.2(m,1H),3.2(m,1H),3.06(m,1H),2.96(m,1H),2.75(m,2H),2.72/2.5(m,2H),2.41(m,4H),2(m,1H),1.99/1.6(m,2H),1.8(s,3H),1.3(d,3H),0.88/0.82(2d,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ158.2,152.7,131.9,131.4,131.4,131.3,131.1,131,127.8,120.6,120.5,120.1,116.8,116.3,116,112.6,112,111.6,79.6,79.6,78.5,76.8,74.2,73.1,70.3,70.3,69.3,66.3,65.1,56.8,56.3,56.1,52.6,50.3,49.4,43.8,34.2,33.5,31.7,28,19.6/18.4,18.2,18.19F NMR(376MHz,dmso-d6):δ-112.5。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1599.5724(1599.5704)(测量值/理论值)
L18-C3的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-(2-叠氮基乙氧基)乙酰基]氨基]-3-磺基-丙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110003631
步骤1：N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
向(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酸(6.0g，14.6mmol；根据L14-C3的制备的步骤5获得)于二氯甲烷(70mL)及甲醇(30mL)中的溶液中依次添加(4-氨基苯基)甲醇(2.16g，17.5mmol)及2-乙氧基-2H-喹啉-1-甲酸乙酯(5.42g，21.93mmol)。将红色溶液在室温下搅拌16h(几分钟后沉淀)。反应完成后，用二乙醚(70mL)稀释反应混合物。将所得沉淀物滤出且干燥，得到呈米色固体状的N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(5.16g，10.01mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.91(s,1H),8.15(d,1H),7.89(d,2H),7.70-7.78(m,2H),7.53(d,2H),7.38-7.46(m,3H),7.29-7.35(m,2H),7.23(d,2H),5.08(t,1H),4.37-4.50(m,3H),4.16-4.34(m,3H),3.91(t,1H),1.92-2.02(m,1H),1.30(d,3H),0.83-0.91(m,6H)。
步骤2：(2S)-2-氨基-N-[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-3-甲基-丁酰胺
向N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(5.16g，10.01mmol)于DMF(120mL)中的溶液中添加哌啶(52mL，525mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h，随后蒸发哌啶，且用水(500mL)稀释所得溶液。将所得固体滤出，且将过滤物用二乙醚(2×500mL)洗涤两次。将水层浓缩至干，得到粗反应混合物。将粗产物通过硅胶色谱(甲醇(含有7M氨)/二氯甲烷的梯度)纯化，得到呈米色固体状的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-3-甲基-丁酰胺(2.02g，6.89mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.0(s,1H),8.17(s,1H),7.53(d,2H),7.23(d,2H),5.12(t,1H),4.39-4.52(m,3H),2.96-3.02(m,1H),1.86-1.97(m,1H),1.70(br s,2H),1.29(d,3H),0.88(d,3H),0.78(d,3H)。
步骤3：[(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-氧代-3-钠氧基-丙基]磺酰基氧基钠
向[(2R)-2-氨基-3-氧代-3-钠氧基-丙基]磺酰基氧基钠单水合物(3.00g，12.98mmol)于水(127mL)中的溶液中添加碳酸钠(4.13g，38.94mmol)。在15min内在室温下逐滴添加甲基氯甲酸9H-芴-9-基酯(3.69g，14.28mmol)于二噁烷(127mL)中的溶液。将混合物在此温度下搅拌4h。反应完成后，用HCl 1M的水溶液将混合物中和至pH＝7，用碳酸氢钠的饱和水溶液(50mL)稀释且浓缩至干。将粗产物通过C18反相色谱，使用中性方法纯化，得到呈白色固体状的[(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-氧代-3-钠氧基-丙基]磺酰基氧基钠(4.4g，10.11mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ7.88(d,2H)。7.70(d,2H),7.39-7.44(m,2H),7.29-7.36(m,2H),6.71(s,1H),3.84-4.25(m,4H),2.73-2.91(m,2H)。
步骤4：[(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-[[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基]-3-氧代-丙基]磺酰基氧基钠
向(2S)-2-氨基-N-[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-3-甲基-丁酰胺(1.19g，4.04mmol)于DMF(395mL)中的溶液中依次添加[(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-氧代-3-钠氧基-丙基]磺酰基氧基钠(4.40g，10.11mmol)、DIPEA(6.01mL，36.38mmol)及HBTU(3.83g，10.11mmol)。将白色悬浮液在室温下搅拌22h，且随后冷却至0℃。用水(1.5L)、用碳酸钠的饱和溶液(20mL)且用固体氯化钠稀释，得到白色乳液，将其过滤且将过滤物浓缩至干，得到粗产物。将粗产物通过反相C18色谱(甲醇/水的梯度)纯化，得到呈米色固体状的[(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-[[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基]-3-氧代-丙基]磺酰基氧基钠(936mg，1.36mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.39(s,1H)。8.25-8.31(m,1H),8.11-8.17(m,1H),7.89(d,2H),7.70(d,2H),7.64(d,2H),7.50-7.55(m,1H),7.38-7.46(m,2H),7.29-7.35(m,2H),7.20(d,2H),5.07(s,1H),4.51(s,1H),4.42(s,2H),4.19-4.33(m,4H),4.01(s,1H),2.90-3.10(m,2H),2.08-2.20(m,1H),1.31(d,3H),0.8-0.93(m,6H)。
步骤5：(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-[[(1S)-2-甲基-1-[[(1S)-1-甲基-2-[4-[(4-硝基苯氧基)羰氧基甲基]苯氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]丙基]氨基]-3-氧代-丙烷-1-磺酸酯
向[(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-[[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羟基甲基)苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基]-3-氧代-丙基]磺酰基氧基钠(600mg，0.87mmol)于THF(24mL)中的悬浮液中添加DIPEA(432μL，2.61mmol)，随后添加氯甲酸4-硝基苯酯(439mg，2.17mmol)。将混合物在室温下搅拌4h。添加额外的氯甲酸4-硝基苯酯(439mg，2.17mmol)，且将反应混合物在室温下再搅拌16h。添加额外的氯甲酸4-硝基苯酯(439mg，2.17mmol)。在室温下搅拌5h后，将浓缩至干且通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)，且随后通过反相C18色谱，使用中性方法纯化，得到呈白色固体状的(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-[[(1S)-2-甲基-1-[[(1S)-1-甲基-2-[4-[(4-硝基苯氧基)羰氧基甲基]苯氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]丙基]氨基]-3-氧代-丙烷-1-磺酸酯(303mg，0.32mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.52(s,1H),8.25-8.37(m,3H),8.06-8.24(m,4H),7.89(d,2H),7.76(d,2H),7.70(d,2H),7.49-7.61(m,3H),7.35-7.45(m,4H),7.26-7.35(m,2H),5.23(s,2H),4.48(s,1H),4.20-4.33(m,4H),4.01(s,1H),3.57-3.66(m,2H),3.10-3.18(m,2H),2.90-3.10(m,2H),2.08-2.20(m,1H),1.33(d,3H),1.21-1.26(m,15H),0.86-0.92(m,6H)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M-H]-:830.5。
步骤6：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)丁酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-(2-哌嗪-1-基乙氧基)苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸(C3)(128mg，0.149mmol)于DMF(1.5mL)中的溶液中依次添加(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-[[(1S)-2-甲基-1-[[(1S)-1-甲基-2-[4-[(4-硝基苯氧基)羰氧基甲基]苯氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]丙基]氨基]-3-氧代-丙烷-1-磺酸酯(150mg，0.156mmol)于DMF(1.5mL)及DIPEA(77μl，0.468mmol)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌2h，且反应过程之后为UPLC-MS。获得呈二甲基甲酰胺中的溶液的形式的(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)丁酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸，其与此类似地用于下一步骤中。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1553.2+1555.3。
步骤7：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基丁酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)丁酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(0.156mmol)于前述步骤中获得的二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中添加哌啶(30.6μL，0.312mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到呈白色粉末状的(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基丁酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(148mg＝0.111mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1331.4+1333.5。
步骤8：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸L18-C3
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基丁酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(148mg，0.111mmol)于DMF(1.5mL)中的溶液中依次添加(2,3,4,5,6-五氟苯基)2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸酯(0.596mmol；根据L14-C3的制备的步骤20获得)于THF(1mL)及DIPEA(74μL，0.447mmol)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到呈白色粉末状的L18-C3(60mg，0.0389mmol)。IR波长(cm-1)：3288、2101、1659、1237、1039、833、755。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ(m,10H),9.42(s,1H),8.88(d,1H),8.58(s,1H),8.32(d,1H),8.18(d,1H),8.12(d,1H),7.71(m,1H),7.7(d,2H),7.54(dd,1H),7.46(td,1H),7.39(d,1H),7.29(dd,2H),7.25(d,2H),7.21(t,2H),7.18(d,1H),7.15(d,1H),7.13(t,1H),7.04(t,1H),6.99(d,1H),6.71(t,1H),6.22(d,1H),5.47(m,1H),5.23(AB,2H),4.98(s,2H),4.71(q,1H),4.3(m,1H),4.24/4.19(2m,2H),3.97(dd,1H),3.92(m,2H),3.76(s,3H),3.37(t,2H),3.31(m,4H),3.12/2.97(2dd,2H),2.74(t,2H),2.45(m,4H),2.15(m,1H),1.81(s,3H),1.33(d,3H),0.91(2d,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ157.9,152.3,131.3,131.2,131.1,131,130.7,128.9,128.6,120.7,120.4,119.6,116.4,112.7,112,111.3,70.6,70.3,69.4,67.5,66.3,59.7,56.7,56.1,53.4,52.5,50.8,50.4,49.9,44,29.9,19.6,17.8,17.6.19F NMR(376MHz,dmso-d6):δppm 112.3.HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1546.503(1546.5009)(测量值/理论值)。
L16-C3的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-6-氨基-2-[[(2S)-2-[[2-(2-叠氮基乙氧基)乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]己酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110003691
步骤1：(2S)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-[[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]己酸
向(2S)-2-氨基-6-(叔丁氧羰基氨基)己酸(2.96g，12mmol)及碳酸氢钠(1.01g，12mmol)于水(30mL)中的溶液中添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酸酯(5.0g，11.5mmol)于二甲氧基乙烷(30mL)中的溶液，添加THF(15mL)以提高溶解性。将反应混合物在室温下搅拌16h。添加氢氯酸1M(15mL)的水溶液，且用乙酸乙酯(3×75mL)萃取水层。合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干，得到粗化合物。用超声处理的二氯甲烷/戊烷研磨，得到呈白色固体状的(2S)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-[[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]己酸(4.9g，8.63mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ12.48(s,1H),7.89(d,2H),7.74(t,2H),7.28-7.44(m,6H),6.73(s,1H),4.10-4.33(m,5H),3.9(t,1H),2.82-2.90(m,2H),1.52-1.73(m,2H),1.34(s,9H),1.22-1.31(m,4H),0.83-0.91(m,6H)。
步骤2：N-[1-[[(1S)-5-(叔丁氧羰基氨基)-1-[[4-(羟基甲基)苯基]氨甲酰基]苯基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
向(2S)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-[[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]己酸(1.5g，2.64mmol)于二氯甲烷(19mL)及甲醇(9.5mL)中的溶液中添加(4-氨基苯基)甲醇(651.0mg，5.28mmol)/甲醇(1.5mL)。随后添加2-乙氧基-2H-喹啉-1-甲酸乙酯(1.31g，5.28mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h，随后浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(甲醇/二氯甲烷的梯度)纯化，得到呈淡红色固体状的N-[1-[[(1S)-5-(叔丁氧羰基氨基)-1-[[4-(羟基甲基)苯基]氨甲酰基]苯基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(544mg，0.80mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.93(s,1H)。8.01(d,1H),7.89(d,2H),7.74(t,2H),7.52(d,2H),7.37-7.45(m,3H),7.32(t,2H),7.22(d,2H),6.71(s,1H),5.08(br s,1H),4.43(d,2H),4.21-4.40(m,4H),3.92(t,1H),2.83-2.91(m,2H),1.94-2.01(m,1H),1.55-1.74(m,2H),1.21-1.42(m,4H),1.33(s,9H),0.87(t,6H)。
步骤3：(4-硝基苯基)碳酸[4-[[(2S)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-[[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]己酰基]氨基]苯基]甲酯
向N-[1-[[(1S)-5-(叔丁氧羰基氨基)-1-[[4-(羟基甲基)苯基]氨甲酰基]苯基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(600.0mg，0.892mmol)于THF(19mL)中的溶液中添加吡啶(361μL，4.46mmol)，随后添加氯甲酸4-硝基苯酯(448mg，2.22mmol)。将混合物在室温下搅拌16h，随后浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈淡粉色固体状的(4-硝基苯基)碳酸[4-[[(2S)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-[[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]己酰基]氨基]苯基]甲酯(524mg；0.62mmol；70％)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.13(s,1H),8.31(d,2H),8.1(d,1H),7.89(d,2H),7.74(t,2H),7.63(d,2H),7.57(d,2H),7.28-7.45(m,7H),6.72(s,1H),5.24(s,2H),4.35-4.42(m,1H),4.27-4.33(m,1H),4.22(s,2H),3.92(t,1H),2.83-2.91(m,2H),1.96-2.00(m,1H),1.58-1.73(m,2H),1.20-1.30(m,4H),1.33(s,9H),0.86(t,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ171.22,170.67,156.1,155.5,155.27,151.92,145.15,143.87,143.75,140.68,139.34,129.43,129.31,127.6,127.03,125.38,125.32,122.58,120.07,119.11,77.28,70.23,65.67,60.11,54.89,53.43,46.67,31.69,30.39,29.22,28.23,22.74,19.19,18.26.LC-MS:MS(ESI)m/z[M+Na]+＝837.4。
步骤4：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]己酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-(2-哌嗪-1-基乙氧基)苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸C3(166.3mg，0.170mmol)于DMF(1.5mL)中的溶液中依次添加(4-硝基苯基)碳酸[4-[[(2S)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-[[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]己酰基]氨基]苯基]甲酯(150mg，0.179mmol)于DMF(1.5mL)及DIPEA(85μl，0.510mmol)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到呈白色粉末状的(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]己酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(134mg，0.0859mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1559.1+1561.3,[M+Na]+:1581.0+1583.2。IR波长(cm-1)：3309、1698、1238、1162、757、744。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.05(s,1H),8.87(d,1H),8.6(m,1H),8.06(d,1H),7.88(d,2H),7.74(2d,2H),7.64(m,1H),7.57(d,2H),7.52(dd,1H),7.44(t,1H),7.43(d,1H),7.4(t,2H),7.35(d,1H),7.3(t,2H),7.3(dd,2H),7.26(d,2H),7.2(t,2H),7.18(d,1H),7.14(d,1H),7.12(t,1H),7.03(t,1H),6.99(d,1H),6.72(t,1H),6.71(m,1H),6.24(d,1H),5.49(dd,1H),5.23(m,2H),4.97(s,2H),4.38(m,1H),4.29/4.23(m,2H),4.22(m,1H),4.2(m,2H),3.92(dd,1H),3.74(s,3H),3.29(m,4H),3.29/2.5(2dd,2H),2.87(m,2H),2.74(t,2H),2.45(m,4H),1.99(m,1H),1.82(s,3H),1.68/1.6(2m,2H),1.36/1.28(2m,4H),1.32(s,9H),0.86(2d,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ158,131.4,131.2,131.2,131,130.8,128.9,128.5,127.9,127.5,125.6,120.8,120.5,120.4,119.3,116,115.9,112.4,112.2,111.2,74.1,69.2,67.9,66.7,66.2,60.6,56.6,56.2,53.8,53,47.1,43.7,40,32.6,32.2,30.6,29.8/23.2,28.5,18.8,18.1.19F NMR(376MHz,dmso-d6):δ-112.
步骤5：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-6-(叔丁氧羰基氨基)己酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]己酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(134mg，0.0859mmol)于二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中添加哌啶(17μL，0.172mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到呈白色粉末状的(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-6-(叔丁氧羰基氨基)己酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(88mg，0.0658mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1337.4+1339.4,[M+Na]+＝1359.4+1361.4。IR波长(cm-1)：3307、1683、1290、1238、1162、835、754。1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 10.23(s,1H),8.88(d,1H),8.53(m,1H),8.47(br,1H),7.86(d,1H),7.58(d,2H),7.54(d,1H),7.48(d,1H),7.45(t,1H),7.27(dd,2H),7.25(d,2H),7.19(t,2H),7.18(d,1H),7.14(d,1H),7.08(t,1H),7.03(t,1H),6.96(t,1H),6.72(t,1H),6.67(t,1H),6.14(d,1H),5.42(d,1H),5.21(m,2H),4.97(s,2H),4.4(m,1H),4.21(m,2H),3.75(s,3H),3.42/2.35(m,2H),3.29(m,4H),3.24(m,1H),2.87(q,2H),2.72(t,2H),2.43(m,4H),1.99(m,1H),1.78(s,3H),1.7/1.61(2m,2H),1.36(m,2H),1.34(s,9H),1.26(m,2H),0.89/0.82(2d,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δppm 158.4,131.3,131.2,131.1,131,128.4,128,120.8,120.6,120.4,119.7,116.1,115.9,112.7,111.7,111.2,76.2,69.2,67.4,66.3,59.2,56.6,56.3,53.6,53.1,43.8,40.1,33.2,32.4,31.3,29.3,28.8,22.9,19.7/17.5,17.9.19F NMR(376MHz,dmso-d6):δppm-112.4。
步骤6：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-6-(叔丁氧羰基氨基)己酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-6-(叔丁氧羰基氨基)己酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(82mg，0.0613mmol)于DMF(500μL)中的溶液中依次添加(2,3,4,5,6-五氟苯基)2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸酯(0.245mmol；根据L14-C3的制备的步骤20获得)于THF及DIPEA(30.4μL，0.184mmol)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到呈白色粉末状的(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-6-(叔丁氧羰基氨基)己酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(60mg，0.0386mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1552.2+1554.2,[M+Na]+＝1574.1+1576.3。
步骤7：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-6-氨基-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]己酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸L16-C3
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-6-(叔丁氧羰基氨基)己酰基]氨基]苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(23mg，0.0148mmol)于二氯甲烷(3mL)中的溶液中添加2,2,2-三氟乙酸(400μl，4.57mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到呈白色粉末状的L16-C3(5mg，0.00344mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1552.4+1554.5,[M+Na]+＝1574.4+1576.4。IR波长(cm-1)：3250、2250-3500、2102、1660、1288、1238、1121、833、755。1HNMR(400MHz,dmso-d6):δppm 10.24(s,1H),8.85(d,1H),8.49(s,1H),8.49(d,1H),7.98(d,1H),7.6(d,2H),7.55(d,1H),7.51(d,1H),7.5(d,1H),7.46(t,1H),7.26(d,2H),7.25(dd,2H),7.18(t,2H),7.17(d,1H),7.14(d,1H),7.05(t,1H),7.02(t,1H),6.89(d,1H),6.6(t,1H),6.05(d,1H),5.32(d,1H),5.21/5.15(m,2H),5.02/4.96(m,2H),4.36(q,1H),4.31(dd,1H),4.2(m,2H),3.94(s,2H),3.77(s,3H),3.58(m,10H),3.46/2.28(d+t,2H),3.34(t,2H),3.29(m,4H),2.8(m,2H),2.67(t,2H),2.43(m,4H),2.01(m,1H),1.75(s,3H),1.69/1.6(2m,2H),1.51(m,2H),1.31(m,2H),0.86/0.8(2d,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δppm 157.9,153.7,131.4,131.4,131.3,131.1,130.9,129.3,127.6,120.9,120.4,119.8,116.2,116.1,112.6,111.8,111.8,78.1,70.5,70.4,69.3,66.6,66.6,56.9,56.5,56.3,54,52.3,50.4,44,39,33.8,32.2,31.8,28.2,23.1,19.7/18.1,18.3.19F NMR(376MHz,dmso-d6):δppm-112.6.HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1452.5661(1452.5648)(测量值/理论值)。
L21-C1的制备：
(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-[2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]乙基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸酯
Figure BDA0003410186110003751
步骤1：叔丁基-[(2-碘-4-硝基-苯基)甲氧基]-二甲基-硅烷
向(2-碘-4-硝基-苯基)甲醇(172g，61.64mmol；根据L14-C3的制备的步骤2获得)于二氯甲烷(300mL)中的溶液中添加咪唑(5.04g，73.97mmol)。将混合物冷却至0℃，随后在15min内逐滴添加叔丁基-氯-二甲基-硅烷(11.15g，73.97mmol)于二氯甲烷(300mL)中的溶液。移除冰浴，且将反应混合物在室温下搅拌16h。反应完成后，将反应混合物用甲醇(20mL)淬灭且浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈白色固体状的叔丁基-[(2-碘-4-硝基-苯基)甲氧基]-二甲基-硅烷(19.65g，49.96mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ8.57(s,1H),8.31(d,1H),7.66(d,1H),4.67(s,2H),0.92(s,9H),0.14(s,6H)。
步骤2：(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸硅烷酯
向叔丁基-[(2-碘-4-硝基-苯基)甲氧基]-二甲基-硅烷化合物(3.0g，7.63mmol)于DMF(55mL)中的溶液中依次添加(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-乙炔基-四氢吡喃-2-甲酸甲酯(3.39g，9.92mmol；根据L14-C3的制备的步骤13获得)、DIPEA(5.80mL，35.09mmol)、碘化铜(145mg，0.763mmol)及二氯-双-(三苯膦)钯(II)(535mg，0.763mmol)。将黄色溶液用氩气吹扫，且在室温下搅拌16h。用水(300mL)稀释后，将水层用乙酸乙酯(2×300mL)萃取。合并的有机层用水(2×300mL)洗涤，随后经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈米色固体状的(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(4.01g，6.60mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ8.32(dd,1H),8.19(d,1H),7.75(d,1H),5.45(t,1H),5.16(t,1H),5.02-5.07(m,2H),4.82(s,2H),4.55(d,1H),3.65(s,3H),1.98-2.07(m,9H),0.92(m,9H),0.14(s,6H)。
步骤3：(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-(羟基甲基)-5-硝基-苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯
向(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(4.01g，6.60mmol)于THF(48mL)及水(48mL)中的溶液中添加乙酸(193mL，3.36mol)。将无色溶液在室温下搅拌2天，随后用水(300mL)稀释。将水层用二氯甲烷(2×300mL)萃取。合并的有机层用水(2×300mL)且用碳酸氢钠的饱和水溶液(400mL)洗涤，随后经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈白色固体状的(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-(羟基甲基)-5-硝基-苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(2.67g，5.41mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ8.29(dd,1H),8.15(d,1H),7.79(d,1H),5.68(t,1H),5.45(t,1H),5.16(t,1H),5.02-5.07(m,2H),4.62(d,2H),4.55(d,1H),3.65(s,3H),1.98-2.07(m,9H)。
步骤4：(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-氨基-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯
(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-(羟基甲基)-5-硝基-苯基]乙炔基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(2.67g，5.41mmol)于THF(59mL)中的溶液用氩气吹扫。添加干燥的铂/碳5％(1.34g，50％w/w)。将反应混合物依次用氩气、用H2吹扫，且在H2气氛(P atm)下在室温下搅拌2天。将反应混合物经
Figure BDA0003410186110003771
垫过滤，用乙酸乙酯/甲醇9/1的溶液(500mL)洗涤，随后浓缩至干。重复所有顺序(添加干燥的铂/碳5％(1.34g，50％w/w)，在室温下在H2(P atm)下搅拌16h，且经
Figure BDA0003410186110003772
垫过滤)以使得转化完成。将粗产物通过硅胶色谱(乙酸乙酯/环己烷的梯度)纯化，得到呈白色固体状的(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-氨基-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(1.12g，2.40mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ6.93(d,1H)。6.67-6.33(m,2H),5.30(t,1H),4.96(t,1H),4.88(s,2H),4.81(t,1H),4.61(t,1H),4.39(d,1H),4.29-4.24(m,2H),3.78-3.72(m,1H),3.65(s,3H),2.65-2.54(m,2H),2.07-1.98(m,9H),1.79-1.68(m,1H),1.63-1.52(m,1H)。
步骤5：(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯
向(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-氨基-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(1.00g，2.14mmol)于DMF(21mL)中的溶液中依次添加(2S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-5-脲基-戊酸(589mg，2.14mmol)、DIPEA(707μl，4.28mmol)及HBTU(1.22g，3.21mmol)。将反应混合物在室温下搅拌72小时。反应完成后，将混合物用水(100mL)稀释且浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(甲醇/二氯甲烷的梯度)纯化，得到呈米色固体状的(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(1.05g，1.45mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.82(s,1H),7.35-7.42(m,2H),7.24(d,1H),6.95(d,1H),5.94(t,1H),5.37(s,2H),5.30(t,1H),4.91-4.99(m,2H),4.79(t,1H),4.36-4.42(m,3H),4.01-4.08(m,1H),3.76(t,1H),3.65(s,3H),2.95-3.04(m,2H),2.54-2.65(m,2H),1.98-2.07(m,9H),1.68-1.79(m,1H),1.49-1.63(m,3H),1.30-1.42(m,11H)。
步骤6：(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯
在0℃下向化合物(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(950mg，1.31mmol)于二氯甲烷(7.5mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1.9mL，25.6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h。反应完成后，将反应混合物浓缩至干且与甲苯(2×50mL)一起共蒸发，得到粗化合物。
向此粗产物于DMF(13mL)的溶液中依次添加(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酸(467mg，1.38mmol)、DIPEA(867μl，5.24mmol)及HBTU(845mg，2.23mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。反应完成后，添加碳酸氢盐的饱和水溶液(20mL)，且将混合物在室温下搅拌1h，用水(100mL)稀释且浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(甲醇/二氯甲烷的梯度)，且随后通过反相C18色谱，使用中性方法纯化，得到呈白色固体状的(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(680mg，0.720mmol)。LC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝946.3.1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ9.90(s,1H)。8.07(d,2H),7.89(d,2H),7.74(t,2H),7.44-7.38(m,3H),7.36-7.28(m,3H),7.24(d,1H),5.94(t,1H),5.37(s,2H),5.30(t,1H),4.99-4.92(m,2H),4.79(t,1H),4.42-4.36(m,4H),4.32-4.19(m,3H),3.94-3.90(m,1H),3.76(t,1H),3.65(s,3H),2.99-2.94(m,2H),2.65-2.54(m,2H),2.07-1.98(m,10H),1.70-1.55(m,4H),1.46-1.36(m,2H),0.89-0.84(m,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δ171.19,170.33,169.58,169.45,169.27,167.77,158.81,156.12,143.89,143.76,140.69,139.48,137.54,134.88,128.44,127.62,127.06,125.35,120.08,119.42,116.65,75.78,74.61,72.65,71.20,69.49,65.68,60.49,60.10,53.14,52.40,46.68,32.32,30.43,29.54,27.19,26.77,20.39,20.34,20.24,19.22,18.25。
步骤7：(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-(溴甲基)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯
向化合物(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(154mg，0.163mmol)于THF(8.2mL)中的溶液中依次添加三苯膦(85.4mg，0.326mmol)及1-溴吡咯烷-2,5-二酮(58.0mg，0.326mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h。反应过程之后为UPLC-MS：在形成相应甲醚之后，等分试样通过大量过量MeOH处理。预期溴衍生物在UPLC-MS条件下为稳定的。5h后添加三苯膦(85.4mg，0.326mmol)及1-溴吡咯烷-2,5-二酮(58.0mg，0.326mmol)，且将反应混合物在室温下搅拌15h。所获粗(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-(溴甲基)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯与此类似地用于下一步骤中。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+Ome-Br+H]+＝960.7。
步骤8：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[2-[(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-]甲氧羰基]-四氢吡喃-2-基]乙基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[2-(溴甲基)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]乙基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(0.167mmol)于来自前述步骤(步骤7)的DMF中的溶液中依次添加(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-(2-哌嗪-1-基乙氧基)苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(C1)(143mg，0.163mmol)及DIPEA(114μL，0.652mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15h，且反应过程之后为UPLC-MS(等分试样通过大量过量MeOH处理)。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[2-[(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-]甲氧羰基]-四氢吡喃-2-基]乙基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(21.3mg，0.0111mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1802.9+1804.9。IR波长(cm-1)：1755、1672、1226、1201、1130。1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm13.3(br s,1H),10.2(s,1H),8.88(d,1H),8.61(s,1H),8.14(d,1H),7.88(d,2H),7.73(dd,2H),7.65(d,1H),7.63(d,1H),7.62(m,1H),7.54(br s,1H),7.51(dd,1H),7.45(t,1H),7.4(t,2H),7.38(m,1H),7.32(t,2H),7.3(dd,2H),7.2(d,1H),7.2(t,2H),7.15(t,1H),7.15(d,1H),7.03(t,1H),7.01(dd,1H),6.72(t,1H),6.22(d,1H),6(br s,1H),5.51(dd,1H),5.34(t,1H),5.3(br s,2H),5.27/5.21(m,2H),4.98(t,1H),4.85(t,1H),4.57/4.49(m,2H),4.39(m,1H),4.35(d,1H),4.27(m,2H),4.26(m,2H),4.23(m,1H),3.93(t,1H),3.76(s,3H),3.71(m,1H),3.64(s,3H),3.4(m,4H),3.29/2.51(2dd,2H),3.13/2.94(2m,4H),3(m,2H),2.98(m,2H),2.93(br s,3H),2.81(m,2H),1.99/1.95(3s,9H),1.98(m,1H),1.84(s,3H),1.77/1.59(2m,2H),1.64(2m,2H),1.41(2m,2H),0.88/0.85(2d,6H)。13C NMR(100MHz,dmso-d6):δppm 158.1,152.9,135.6,131.5,131.4,131.3,131.2,131,128.9,128.1,127.5,125.7,120.9,120.6,120.4,120.3,117,116,116,112.8,112.2,111.2,75.6,74.9,73.8,72.9,71.4,69.6,69.4,67.5,66.1,60.4,58.3,56,55.4,53.9,52.8,47.2,46.2,44.3,39,32.8,32.8,31,29.6,27.4,27.2,21.1,19.5/18.7,18.1.19F NMR(376MHz,dmso-d6)δppm-74,-112.
步骤9：(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-[(5Sa)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]苯基]乙基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[2-[(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-]甲氧羰基]-四氢吡喃-2-基]乙基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(21.3mg，0.0111mmol)于甲醇(6.0mL)中的溶液中添加氢氧化锂单水合物(4.66mgμL，0.111mmol)于水(4ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌60h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-[(5Sa)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]苯基]乙基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸(47.8mg，0.029mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1440.6+1442.6.
步骤10：(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-[2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]乙基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸；2,2,2-三氟乙酸酯L21-C1
向(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-[(5Sa)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]苯基]乙基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸(47.1mg，0.0282mmol)于DMF(1.5mL)中的溶液中依次添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(购自Broadpharm，13.1mg，0.0423mmol)于DMF(500μL)及DIPEA(17.2μL，0.0988mmol)中的溶液。
将反应混合物在室温下搅拌1h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的L21-C1(65mg，0.0310mmol)。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1635.6093(1635.6068)(测量值/理论值)。
L9-C1的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003831
步骤1：N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(溴甲基)苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
使N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(溴甲基)苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(150mg，0.249mmol)于THF(3.8ml)中的溶液冷却至0℃。在0℃下逐滴添加三溴膦(1M于二氯甲烷中)(374μL，0.249mmol)。将反应物在0℃下搅拌5min，且在室温下搅拌1h。反应过程之后为UPLC-MS(等分试样通过大量过量MeOH处理)。将反应混合物用乙酸乙酯(3ml)稀释且用碳酸氢钠的饱和水溶液(1×6ml)洗涤。将有机层经硫酸镁干燥，过滤。添加DMF(10ml)且蒸发乙酸乙酯及THF。N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(溴甲基)苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯的所得溶液原样地用于下一步骤中。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+Na]+＝686.5+688.6。
步骤2：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向的溶液中N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(溴甲基)苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(0.249mmol)于来自前述步骤(步骤1)的DMF中依次添加DMF(10ml)、(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-(2-哌嗪-1-基乙氧基)苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(C1)(218mg，0.249mmol)及DIPEA(130μL，0.748mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15h，且反应过程之后为UPLC-MS(等分试样通过大量过量MeOH处理)。(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸于DMF中的所得溶液原样地用于下一步骤中。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+Na]+＝1458.7+1460.7。
步骤3：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；双2,2,2-三氟乙酸
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(0.249mmol)于前述步骤(步骤2)中获得的二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中添加哌啶(49.3μL，0.499mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；双2,2,2-三氟乙酸(31.2mg＝0.0213mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+Na]+＝1236.7+1238.7。
步骤4：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸L9-C1
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(31.2mg，0.0213mmol)于DMF(1.5mL)中的溶液中依次添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(23.8mg，0.0768mmol)于DMF(500μL)及DIPEA(31.2μL，0.179mmol)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌15h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的L9-C1(6mg，0.00303mmol)。HR-ESI+:m/z[M]+＝1431.5437(1431.5433)(测量值/理论值)。
L9-C8的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(3-磺酸基氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003861
步骤1：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(3-磺酸基氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(溴甲基)苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(0.0230mmol；根据L9-C1的制备的步骤1获得)于DMF(3mL)中的溶液中依次添加DMF(5ml)、铵；[3-[4-[[2-[(2R)-2-羧基-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-乙基]苯氧基]甲基]嘧啶-2-基]苯基]硫酸酯(C8)(22mg，0.0230mmol)及DIPEA(12μL，0.069mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15h，且反应过程之后为UPLC-MS(等分试样通过大量过量MeOH处理)。(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸于DMF中的所得溶液用于下一步骤中。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M-SO3H]+＝1444.8+1446.7。
步骤2：(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(3-磺酸基氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；双2,2,2-三氟乙酸
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(3-磺酸基氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(0.0230mmol)于前述步骤(步骤1)中获得的二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中添加哌啶(9μL，0.0920mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的[3-[4-[[2-[(2R)-2-[5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-2-羧基-乙基]苯氧基]甲基]嘧啶-2-基]苯基]硫酸酯；双2,2,2-三氟乙酸(10.0mg＝0.00633mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M-SO3]+＝1224.12。
步骤3：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(3-磺酸基氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
向(2R)-2-[(5Sa)-5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(3-磺酸基氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(10mg，0.00653mmol)于DMF(1mL)中的溶液中依次添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(3.1mg，0.00980mmol)于DMF(500μL)及DIPEA(4μL，0.0229mmol)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌15h，且反应过程之后为UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的L9-C8(6mg，0.00401mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+Na]+＝1519.5+1521.2,[M+H-SO3]+1417.7+1419.6.HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1497.486(1497.4845)(测量值/理论值)。
L9-C10的制备：
(2R)-2-[(5Sa)5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-[4-氟-3-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003881
程序正如在L9-C9的合成过程中，用(2R)-2-[((5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-[4-氟-3-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]-3-(2-{[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸C10置换步骤3中所用的C9，且使用TFA方法以用于纯化。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1529.543/1529.5413(测量值/理论值)。
L9-C11的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(4-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸。
Figure BDA0003410186110003891
程序正如在L9-C9的合成过程中，用(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(4-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸C11替代步骤3中所用的C9，且使用TFA方法以用于纯化。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1431.5442/14.31.5433(测量值/理论值)。
L9-C12的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2,2,2-三氟乙基)吡唑-3-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003892
程序正如在L9-C9的合成过程中，用(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-基]甲氧基}苯基)丙酸C12替代步骤3中所用的C9，使用TFA方法以用于纯化。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1395.5048/1395；5045(测量值/理论值)。
L9-C14的制备：
(2R)-2-[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(3-羟基-2-甲氧基-苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯
Figure BDA0003410186110003901
步骤1：(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基-3-磺酸基氧基-苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
将500mg(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基]丙酸乙酯(0.60mmol，WO2016/207216制剂1)及202mg(3-羟基-2-甲氧基-苯基)硼酸(1.20mmol)溶解于9mL 1,4-二噁烷中，随后添加42mg Pd(PPh3)2Cl2(0.06mmol)、588mg Cs2CO3(1.80mmol)及9mL水，且将混合物在N2气氛下在70℃下搅拌直至转化完成。随后将其用水稀释，用2MHCl水溶液中和，且用DCM萃取。将经合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。粗酯经由使用庚烷、EtOAc及0.7M NH3溶液于MeOH中作为洗脱剂的快速色谱纯化，获得非对映异构体的混合物。随后将其溶解于23.6mL吡啶中，添加0.97mL SO3×嘧啶(5.98mmol)，随后将混合物在70℃下搅拌直至转化完成。随后将其在减压下浓缩，且溶解于2mL二噁烷中，随后添加200mg KOH(3.57mmol)及1mL水。将混合物在室温下搅拌直至水解完成。随后将其用2M HCl水溶液中和，且直接注射于使用25mM NH4HCO3水溶液及MeCN作为洗脱剂的prep-RP-HPLC上。收集较晚洗脱的非对映异构体作为标题产物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.92(d,1H),8.63(s,1H),7.68(dd,1H),7.63(d,1H),7.34(d,1H),7.30(dd,2H),7.29(d,1H),7.20(t,2H),7.16(t,1H),7.15(d,1H),7.10(t,1H),7.02(d,1H),6.73(t,1H),6.38(d,1H),5.50(dd,1H),5.29/5.23(d+d,2H),4.21/4.16(m+m,2H),3.84(s,3H),3.25/2.55(dd+dd,2H),3.18-2.75(m,10H),2.65(brs,3H),1.82(s,3H)。C47H44N6O10S2ClF的HRMS计算值:970.2233；实测值971.2297(M+H)。
步骤2：(2R)-2-[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(3-羟基-2-甲氧基-苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯L9-C14
向(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基-3-磺酸基氧基-苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(20.0mg；0.0206mmol于DMF(309μL)中的溶液中依次添加(2S)-N-[4-(氯甲基)苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺(17.5mgL；0.0206mmol)、DIPEA(10.8μL；0.0618mmol)及TBAI(1mg；0.0027mmol)。将反应混合物在70℃下搅拌18小时。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的L9-C14(10.5mg；0.00725mmol)。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1448.5437/1448.5466[测量值/理论值]。
L9-P15的制备：
(11R,20R)-23,26-二氯-20-[[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]甲基]-3-(4-氟苯基)-14-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]-24,25-二甲基-10,18,21-三氧杂-4-硫杂-6,8-二氮杂五环[20.2.2.12,5.113,17.09,28]二十八烷-1(24),2,5(28),6,8,13,15,17(27),22,25-十烯-11-甲酸；2,2,2-三氟乙酸酯
Figure BDA0003410186110003921
向(11R,20R)-23,26-二氯-3-(4-氟苯基)-14-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]-24,25-二甲基-20-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-10,18,21-三氧杂-4-硫杂-6,8-二氮杂五环[20.2.2.12,5.113,17.09,28]二十八烷-1(25),2,5(28),6,8,13,15,17(27),22(26),23-十烯-11-甲酸P15(根据获得WO 2019/035914；10.0mg；0.0105mmol)于DMF(630μL)中的溶液中依次添加(2S)-N-[4-(溴甲基)苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺(10.0mg；0.0158mmol)、DIPEA(5.5μL；0.0315mmol)及TBAI(0.5mg，0.0010mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的L9-P15(11.9mg，0.00733mmol)。HR-ESI+:m/z[M-CF3CO2]+＝1507.5183/1507.5155
L9-P16的制备：
(11R,20R)-23,26-二氯-14-[[2-[4-[[(2S)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基甲基]-4-氟-环己基]嘧啶-4-基]甲氧基]-20-[[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]甲基]-3-(4-氟苯基)-24,25-二甲基-10,18,21-三氧杂-4-硫杂-6,8-二氮杂五环[20.2.2.12,5.113,17.09,28]二十八烷-1(25),2,5(28),6,8,13,15,17(27),22(26),23-十烯-11-甲酸；2,2,2-三氟乙酸酯
Figure BDA0003410186110003931
向(11R,20R)-23,26-二氯-14-[[2-[4-[[(2S)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基甲基]-4-氟-环己基]嘧啶-4-基]甲氧基]-3-(4-氟苯基)-24,25-二甲基-20-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-10,18,21-三氧杂-4-硫杂-6,8-二氮杂五环[20.2.2.12,5.113,17.09,28]二十八烷-1(24),2,5(28),6,8,13,15,17(27),22,25-十烯-11-甲酸P16(根据获得WO 2019/035911；14.7mg；0.0137mmol)于DMF(1mL)中的溶液中依次添加(2S)-N-[4-(溴甲基)苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺(13.1mg；0.0205mmol)及DIPEA(7.1μL；0.0410mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将粗产物通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上，使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的L9-P16(7.9mg；0.00420mmol)。IR(cm-1):3327,1768/1706,1666,1199/1118,831/798。HR-ESI+:m/z[M-CF3CO2]+＝1631.6071/1631.6054[测量值/理论值]
L9-P17的制备：
(11R,20R)-23,26-二氯-14-[[2-[4-[[(2S)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基]环己基]嘧啶-4-基]甲氧基]-20-[[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]甲基]-3-(4-氟苯基)-24,25-二甲基-10,18,21-三氧杂-4-硫杂-6,8-二氮杂五环[20.2.2.12,5.113,17.09,28]二十八烷-1(24),2,5(28),6,8,13,15,17(27),22,25-十烯-11-甲酸；2,2,2-三氟乙酸酯
Figure BDA0003410186110003941
向(11R,20R)-23,26-二氯-14-[[2-[4-[[(2S)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基]环己基]嘧啶-4-基]甲氧基]-3-(4-氟苯基)-24,25-二甲基-20-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-10,18,21-三氧杂-4-硫杂-6,8-二氮杂五环[20.2.2.12,5.113,17.09,28]二十八烷-1(24),2,5(28),6,8,13,15,17(27),22,25-十烯-11-甲酸P17(根据获得WO2019/035911；14.5mg；0.0139mmol)于DMF(1mL)中的溶液中依次添加(2S)-N-[4-(溴甲基)苯基]-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰胺(13.3mg；0.0208mmol)及DIPEA(7.3μL；0.0417mmol)。将反应混合物在室温下搅拌8小时。将粗产物通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的L9-P17(7.0mg，0.00437mmol)。IR(cm-1):3700-2400,1771/1738/1705,1665,1194/1128.HR-ESI+:m/z[M-CF3CO2]+＝1599.6013/1599.5992.HR-ESI+:m/z[M-CF3CO2+H]2+＝800.3049/800.3035[测量值/理论值]
L25-P1的制备：
2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]-5-[[(2S)-2-[[1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨甲酰基]环丁烷羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸酯；2,2,2-三氟乙酸
Figure BDA0003410186110003951
步骤1：1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨甲酰基]环丁烷甲酸叔丁酯
向1-叔丁氧羰基环丁烷甲酸(58.6mg；0.293mmol)于DCM(5.85ml)中的溶液中依次添加1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]吡咯-2,5-二酮(53.9mg；0.293mmol)、EDC(84.2mg；0.439mmol)、HOBt(59.3mg；0.439mmol)及DIPEA(204μL；1.17mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。反应过程通过UPLC-MS监测。将反应混合物浓缩至干且溶解在DMF(1ml)中，将溶液通过X-Bridge柱C18，通过将反应混合物直接沉积在柱上，且使用TFA方法纯化，得到标题化合物(57.3mg；0.156mmol)。IR(cm-1):3390,1697/1666.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm7.5(t,1H),7.02(s,2H),3.55/3.5(2t,4H),3.38(t,2H),3.17(q,2H),2.33(m,4H),1.77(m,2H),1.38(s,9H)。UPLC-MS:MS(ESI):m/z[M+Na]+＝389.26[M+H-tBu]+＝311.22
步骤2：1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨甲酰基]环丁烷甲酸
向1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨甲酰基]环丁烷甲酸叔丁酯(7mg；0.0191mmol)于DCM(0.175mL)中的溶液中添加TFA(51.2μL；0.668mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3.5小时，随后浓缩至干，获得呈无色油状的标题化合物(5.8mg；0.0187mmol)。将粗产物用于下一步骤中。UPLC-MS:MS(ESI):m/z[M+H]+＝311.35,[M+Na]+＝333.37
步骤3：(2,3,4,5,6-五氟苯基)1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨甲酰基]环丁烷甲酸酯
向1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨甲酰基]环丁烷甲酸(18.2mg；0.0587mmol)于THF(3mL)中的溶液中依次添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(13.0mg；0.0704mmol)及DCC(14.5mg；0.0704mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15小时，且反应过程通过UPLC-MS监测。反应混合物为悬浮液，将沉淀物滤出且用THF(1ml)洗涤，得到(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨甲酰基]环丁烷甲酸酯于THF中的溶液。粗产物溶液用于步骤9中。UPLC-MS:MS(ESI):m/z[M+H]+＝477.28,[M+Na]+＝499.23
步骤4：(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸甲酯
向(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸P1(5.0g；5.712mmol)于DCM(25mL)及甲醇(25mL)中的溶液中逐滴添加重氮甲基(三甲基)硅烷(2M于Et2O中)的溶液(5.712mL；11.42mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，且反应过程通过UPLC-MS监测。反应完成后，通过缓慢添加乙酸淬灭直至黄色变为红色，且浓缩至干，得到粗产物。将粗产物通过硅胶色谱(甲醇/DCM的梯度)纯化，得到标题化合物(4.52g；5.082mmol)。UPLC-MS:MS(ESI):m/z[M+H]+＝889.27+891.6,[M+Na]+＝911.31,[M+2H]2+＝445.59.IR(cm-1):1753,1238/1053.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 8.6(s,1H),8.45(d,1H),7.6(d,1H),7.52(dd,1H),7.45(td,1H),7.3(m,3H),7.25-7.1(m,5H),7.02(t+d,2H),6.78(t,1H),6.31(dd,1H),5.52(dd,1H),5.25(AB,2H),4.2(m,2H),3.78/3.65(2s,6H),3.2/2.58(2dd,2H),2.71(t,2H),2.5/2.3(2ml,8H),2.12(s,3H),1.88(s,3H)。
步骤5：5-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸
向Fmoc-Cit-OH(2.224g；5.596mmol)于DCM(22.2mL)及甲醇(22.2mL)中的溶液中依次添加5-氨基-2-(羟基甲基)苯磺酸钠(1.89mg；8.395mmol)及EEDQ(2.768g；11.19ml)。将反应混合物在室温下搅拌25小时，随后浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(甲醇/DCM的梯度)纯化，得到呈白色粉末状的标题化合物(2.81g；4.823mmol)。IR(cm-1):3700-3000,1660(大),1180.1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 10.02(s,1H),7.88(m,3H),7.76(2t,2H),7.7(dd,1H),7.61(d,1H),5.99(t,1H),5.38(m,2H),5.03(t,1H),4.72(d,2H),4.3-4.2(m,3H),4.15(m,1H),3.06-2.90(m,2H),1.75-1.30(m,4H)。UPLC-MS:MS(ESI):m/z[M+H]+＝583.42,[M+Na]+＝565.31.
步骤6：2-(氯甲基)-5-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸
在室温下向5-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸(543.6mg；0.933mmol)于NMP(5mL)中的溶液中添加SOCl2(68.1μL；0.933mmol)于NMP(200μL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌15min，且反应过程通过UPLC-MS监测。为获得完全反应，SOCl2添加(68μL)应再进行7次。在真空下蒸发过量SOCl2，且将残余物通过将反应混合物直接沉积在Oasis柱上，使用TFA方法纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(362mg；0.512mmol)。UPLC-MS:MS(ESI):m/z[M+H]+＝601.19+603.23[M+Na]+＝622.93
步骤7：2-[[4-[2-[2-氯-4-[6-(4-氟苯基)-4-[(1R)-2-甲氧基-1-[[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]甲基]-2-氧代-乙氧基]噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]-5-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸酯
向来自步骤6的2-(氯甲基)-5-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸(195.6mg；0.277mmol)于NMP(10mL)的溶液中的溶液中依次添加来自步骤4的(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸甲酯(123mg；0.138mmol)、DIPEA(385μL，2.213mmol)及TBAI(10mg，0.027mmol)。将反应混合物在70℃下搅拌12小时，且反应过程通过UPLC-MS监测。NMP中的溶液中的粗产物直接用于下一步骤中。UPLC-MS:MS(ESI):m/z[M+H]+＝1231.12+1233.45,[M+2H]2+＝616.34+617.37
步骤8：5-[[(2S)-2-氨基-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]苯磺酸酯；2,2,2-三氟乙酸
向2-[[4-[2-[2-氯-4-[6-(4-氟苯基)-4-[(1R)-2-甲氧基-1-[[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]甲基]-2-氧代-乙氧基]噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]-5-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸酯于NMP中的前述溶液中添加氢氧化锂单水合物(82.2mg；1.106mmol)于水(4mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1.5小时，且反应过程通过UPLC-MS监测。将粗产物溶液通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上，使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的标题化合物(45.6mg；0.0374mmol)。UPLC-MS:MS(ESI):m/z[M+H]+＝1217.46,[M+Na]+＝1241.16,[M+2H]2+＝609.61
步骤9：2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]-5-[[(2S)-2-[[1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨甲酰基]环丁烷羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸酯L25-P1
向5-[[(2S)-2-氨基-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[4-[2-[4-[4-[(1R)-1-羧基-2-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]乙氧基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-氯-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]苯磺酸酯(22.6mg；0.0186mmol)于DMF(1.4mL)中的溶液中依次添加(2,3,4,5,6-五氟苯基)1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨甲酰基]环丁烷甲酸酯(来自步骤3)(26.8mg；0.0562mmol)及DIPEA(12.9μL；0.0742mmol)的THF溶液。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将粗产物溶液通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上，且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的L25-P1(7.5mg；0.0050mmol)。IR(cm-1):3321,1705/1624,1666,1581,1180/1124,833/798/756/719/696。1H NMR(400/500MHz,dmso-d6)δppm 10.4(s),8.88(d,1H),8.61(s,1H),8.13(df,1H),7.92(dd,1H),7.78(d),7.74(t),7.63(d,1H),7.52(dd,1H),7.47(d,1H),7.46(t,1H),7.38(d,1H),7.3(dd,2H),7.23(d,1H),7.21(t,2H),7.16(t,1H),7.14(d,1H),7.03(t,1H),7.01(d,1H),7(s,2H),6.73(t,1H),6.22(d,1H),5.99(m),5.55(sl),5.5(dd,1H),5.25(AB,2H),5.1(sl,2H),4.37(m,1H),4.33(m,2H),3.76(s,3H),3.7(m,10H),3.55(m,2H),3.5(m,2H),3.42(m,2H),3.28/2.52(2dd,2H),3.21(m,2H),3.04(sl,3H),2.97(m,2H),2.4(m,4H),1.85(w,3H),1.74/1.62(2m,2H),1.73(m,2H),1.43/1.35(2m,2H)。13C NMR(400/500MHz,dmso-d6)δppm 157.5,152.8,135.4,134.9,131.5,131.4,131.4,131.2,131.1,128.7,121,120.6,119.2,119.2,116.3,116,112.8,112.2,111,74,69.5,68.9,67.4,66.6,56.2,55.3/46.5,54.1,45.7,39.4,39.2,37.2,32.9,29.7,29.7,27.3,18,16.19F NMR(400/500MHz,dmso-d6)δppm-74.6,-112.2.HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1509.4867/1509.4851[测量值/理论值]
L26-P1的制备：
(2R)-2-[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸酯；2,2,2-三氟乙酸酯
Figure BDA0003410186110004001
步骤1：3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙-1-炔
在0℃下向2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基乙氧基]乙醇(1.95g；6.50mmol)于THF(25.0mL)中的溶液中添加氢化钠(260.0mg；6.57mmol)。5分钟后，添加3-溴丙-1-炔于甲苯(1.42mL；13.14mmol)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1小时，且在室温下搅拌2天，且反应过程通过UPLC-MS监测。随后，过滤反应混合物，且将过滤物浓缩至干，且通过硅胶色谱(梯度DCM/甲醇)纯化，得到呈无色油状的标题化合物(1.74g；4.12mmol)。1H NMR(CDCl3):2.43(t,1H,J＝2.4Hz),3.37(s,3H),3.53-3.55(m,2H),3.64-3.70(m,30H),4.20(d,2H,J＝2.4Hz)。
步骤2：N-[(1S)-1-[[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
向[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯胺(10.0g；27.52mmol)于甲醇(70mL)及DCM(140mL)中的溶液中依次添加Fmoc-Cit-OH(12.0g；30.28mmol)及EEDQ(8.17g；33.03mmol)。将反应混合物在室温下搅拌14小时。反应完成后，将所得残余物通过使用DCM/甲醇(100/0to 88/12)作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(17.09g；21.97mmol)。1H NMR(DMSO):δ0.09(s,6H),0.91(s,9H),1.38-1.48(m,2H),1.59-1.68(m,2H),2.93-3.05(m,2H),4.06-4.15(m,2H),4.20-4.29(m,3H),4.56(s,2H),5.41(s,2H),5.98(t,1H,J＝5.5Hz),7.30-7.43(m,5H),7.55(dd,1H,J＝8.8,2.1Hz),7.69(d,1H,J＝7.8Hz),7.74(dd,1H,J＝7.2,3.4Hz),7.89(d,1H,J＝7.5Hz),8.25(d,1H,J＝1.5Hz),10.12(s,1H)。
步骤3：(2S)-2-氨基-N-[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯基]-5-脲基-戊酰胺
向N-[(1S)-1-[[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(17.08g；23.00mmol)于THF(120mL)中的溶液中添加二甲胺2M/THF(44.5mL；89.00mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15小时。浓缩至干后，所得残余物通过使用水/乙腈(98/02至0/100)作为洗脱剂的C18柱色谱纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(5.47g；10.50mmol)。1H NMR(DMSO):δ0.0(s,6H),0.81(s,9H),1.27-1.38(m,3H),1.47-1.53(m,1H),2.83-2.89(m,2H),3.16-3.19(m,1H),4.46(s,2H),5.26(s,2H),5.82(t,1H,J＝5.6Hz),7.24(d,1H,J＝8.5Hz),7.50(dd,1H,J＝8.3,2.0Hz),8.17(d,1H,J＝2.0Hz)。
步骤4：N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
向(2S)-2-氨基-N-[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯基]-5-脲基-戊酰胺(3.00g；5.76mmol)于2-甲基四氢呋喃(240mL)中的溶液中依次添加Fmoc-Val-Osu(8.65g；8.65mmol)及DIPEA(1.90mL；11.53mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15小时。将反应混合物经烧结漏斗过滤，且将回收固体用2-甲基四氢呋喃(2×250mL)洗涤，随后在高真空下干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(3.57g；4.24mmol)。1H NMR(DMSO):δ0.10(s,6H),0.83-0.95(m,15H),1.27-1.52(m,2H),1.52-1.75(m,2H),1.93-2.07(m,1H),2.88-3.09(m,2H),3.93(t,1H,J＝8.0Hz),4.17-4.49(m,4H),4.56(s,2H),5.40(s,2H),5.96(t,1H,J＝5.6Hz),7.27-7.37(m,3H),7.37-7.48(m,3H),7.54(d,1H,J＝8.0Hz),7.74(t,2H,J＝7.2Hz),7.88(d,2H,J＝7.6Hz),8.13(d,1H,J＝7.6Hz),8.22(s,1H),10.11(s,1H)。
步骤5:N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙-1-炔基]苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
向N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-碘-苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(1.23g；1.46mmol)于二甲基甲酰胺(15.40mL)中的溶液中依次添加3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙-1-炔(930.0mg；2.20mmol)及DIPEA(2.47mL；14.92mmol)。用氩气净化3次后，添加Pd(PPh3)2Cl2(220mg；0.307mmol)及CuI(68.0mg；0.36mmol)，且将反应混合物用氩气净化3次。将反应混合物在室温下搅拌3小时，且反应过程通过UPLC-MS监测。将混合物用乙酸异丙酯(200mL)稀释，且用盐水(3×150mL)洗涤。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上且使用中和方法纯化，得到呈淡黄色胶状物的标题化合物(790.0mg；0.70mmol)。1H NMR(DMSO):δ0.08(s,6H),0.85-0.90(m,15H),1.36-1.45(m,2H),1.58-1.71(m,2H),1.97-2.00(m,1H),2.93-3.03(m,2H),3.23(s,3H),3.40-3.43(m,2H),3.49-3.52(m,25H),3.56-3.58(m,2H),3.63-3.66(m,2H),3.93(dd,1H,J＝8.9,6.9Hz),4.23-4.32(m,3H),4.37-4.43(m,3H),4.75(s,2H),5.39(s,2H),5.97(t,1H,J＝6.1Hz),7.30-7.43(m,6H),7.51-7.54(m,1H),7.72-7.78(m,3H),7.88(d,2H J＝7.5Hz),8.12(d,2H,J＝7.4Hz),10.10(s,1H)。
步骤6：N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(羟基甲基)-3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙-1-炔基]苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
向N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙-1-炔基]苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(452mg；0.40mmol)于四氢呋喃(0.60mL)及水(0.90mL)中的溶液中添加乙酸(4.17mL；72.78mmol)。将反应混合物在室温下搅拌22小时，且反应过程通过UPLC-MS监测。浓缩至干后，将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上且使用中和方法纯化，得到呈白色胶状物的标题化合物(327mg，0.32mmol)。1H NMR(DMSO):δ0.87(dd,6H,J＝11.7,6.8Hz),1.36-1.45(m,2H),1.58-1.71(m,2H),1.97-2.00(m,1H),2.93-3.02(m,2H),3.23(s,3H),3.31(s,5H),3.40-3.43(m,2H),3.48-3.53(m,21H),3.54-3.64(m,6H),3.91-3.95(m,1H),4.23-4.42(m,4H),4.56(d,2H,J＝5.5Hz),5.19(t,1H,J＝5.6Hz),5.39(s,2H),5.96(t,1H,J＝5.8Hz),7.30-7.34(m,2H),7.39-7.43(m,4H),7.50-7.52(m,1H),7.72-7.76(s,3H),7.88(d,1H J＝7.5Hz),8.12(d,2H,J＝7.4Hz),10.06(s,1H)。
步骤7：N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(羟基甲基)-3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
向N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(羟基甲基)-3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙-1-炔基]苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(327.0mg；0.32mmol)于THF(3.7mL)中的溶液中添加乙酸(0.37mL)。用氩气净化3次后，添加Pt/C 5％(195mg)，且在用氩气净化3次后，将反应混合物置于氢气气氛下且在室温下搅拌18小时，且反应过程通过UPLC-MS监测。将混合物经PTFE过滤，且将过滤物浓缩至干，随后在二氯甲烷/戊烷(1/4混合物，50mL)中研磨。将沉淀物通过过滤回收，干燥后得到呈白色固体状的标题化合物(130mg；0.13mmol)。1H NMR(DMSO):δ0.85-0.89(m,6H),1.23-1.46(m,2H),1.56-1.76(m,4H),1.97-2.02(m,1H),2.56-2.60(m,2H),2.91-3.04(m,2H),3.23(s,3H),3.38-3.43(m,4H),3.48-3.54(m,30H),3.93(dd,1H,J＝8.9,6.9Hz),4.21-4.31(m,3H),4.38-4.41(m,1H),4.45(d,2H,J＝5.3Hz),4.94(t,1H,J＝5.3Hz),5.37(s,2H),5.95(t,1H,J＝5.8Hz),7.25(d,1H,J＝8.3Hz),7.30-7.34(m,2H),7.39-7.43(s,5H),7.72-7.76(m,2H),7.88(d,1H J＝7.5Hz),8.06(d,2H,J＝7.6Hz),9.88(s,1H)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1026.52
步骤8：N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(溴甲基)-3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
在0℃下向N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(羟基甲基)-3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(60mg；0.0584mmol)于THF(6.6mL)中的溶液中逐滴添加PBr3(1M溶液于THF中)(0.0877mL；0.0877mmol)。随后将溶液在室温下搅拌3小时。在等分试样中添加吗啉以使预期溴化合物反应之后，反应过程通过UPLC-MS监测。该反应与NH4Cl饱和水溶液(50μL)继续反应。5分钟后，将混合物经MgSO4干燥，过滤且用THF(2ml)洗涤，得到呈THF溶液形式的溴标题化合物，其粗产物用于下一步骤中。UPLC-MS分析在甲醇及吗啉添加之后完成。
步骤9：(2R)-2-[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯
向来自前述步骤的N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-(溴甲基)-3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(0.0584mmol)的THF溶液中依次添加DMF(1.5mL)、(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸P1(46.1mg；0.0527mmol)及DIPEA(0.173mL；0.995mmol)。将反应混合物在室温下搅拌20小时，且反应过程通过UPLC-MS监测。含有预期标题化合物及Fmoc去除保护基的化合物(在步骤10中预期)的粗产物用于去除保护基的下一步骤中。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M-Fmoc+H+H]+＝1660.99
步骤10：(2R)-2-[5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸
向前述步骤中在DMF中获得的粗产物中添加哌啶(11.6μL；0.117mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15小时，且反应过程通过UPLC-MS监测。反应完成后，将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上，使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的标题化合物(29.2mg；0.0155mmol)。IR:3600-2300,1672,1602,1541+1516.HR-ESI+:m/z[M-CF3COO]+＝1660.7574(1660.7575理论值
步骤11：(2R)-2-[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸酯；2,2,2-三氟乙酸酯L26-P1
向(2R)-2-[5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯；2,2,2-三氟乙酸(42.5mg；0.0225mmol)于DMF(1.28mL)中的溶液中依次添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(Brodpharm 21854)(7.71mg；0.0247mmol)及DIPEA(19.6μL；0.112mmol)的溶液。将反应混合物在室温下搅拌15小时，且反应过程通过监测UPLC-MS。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的L26-P1(28mg；0.0151mmol)。HR-ESI+:m/z[M-CF3COO]+＝1855.8105(1855.8106理论值
L27-P1的制备：
(2R)-2-[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-3-甲基-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110004061
步骤1：2-(氯甲基)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸酯
在室温下将5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸(300mg；0.4263mmol)溶解于无水NMP(6mL)中。同时制备SOCl2(206μL)于NMP(6mL)中的溶液。向反应物中经过75分钟的时段添加6次SOCl2溶液的900μL溶液。最后一次添加之后，将反应混合物在室温下搅拌15分钟。将粗产物通过将反应混合物直接沉积在Oasis柱上，使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的标题化合物(138mg；0.1971mmol)。1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 10.15+8.1+7.42+6.0(s+2d+m,4H),7.9(m,HH),7.75(m,3H),7.42+7.31(2m,5H),5.23(s,2H),4.4(m,1H),4.3-4.2(m,3H),3.95(dd,1H),3.0(m,2H),2.0(m,1H),1.7+1.6(2m,2H),1.48+1.37(2m,2H),0.88(2d,6H)。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝700.2199/700.2202[测量值/理论值]
步骤2：5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[4-[2-[2-氯-4-[6-(4-氟苯基)-4-[(1R)-2-甲氧基-1-[[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]甲基]-2-氧代-乙氧基]噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]苯磺酸
在室温下向2-(氯甲基)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸酯(82.4mg；0.1177mmol)于无水NMP(2.5mL)的溶液中添加DIEA(94μL；0.540mmol)，随后添加(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸甲酯(60mg；0.067mmol)及TBAI(12.4mg；0.034mmol)。将反应物在80℃下搅拌4小时且在室温下搅拌过夜。随后，再次添加2-(氯甲基)-5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸酯(14mg；0,017mmol)，随后添加TBAI(17μL；0.0337mmol)且将反应物搅拌在80℃下4小时，且随后在室温下搅拌过夜。Fmoc去除保护基步骤在将DEA(53μL；0.515mmol)添加至反应物中且在室温下搅拌过夜的情况下实现。纯化通过将混合物直接注射在用溶液A：H2O/CH3CN/NH4HCO3(1960ml/40/3.16g)与溶液B：CH3CN/H2O/NH4HCO3(1600ml/400ml/3.16g)的梯度洗脱的Oasis上来实现，得到标题化合物(17mg；0.009mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M]+＝1329
步骤3：(2R)-2-[5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[4-[2-[2-氯-4-[6-(4-氟苯基)-4-[(1R)-2-甲氧基-1-[[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]甲基]-2-氧代-乙氧基]噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-3-甲基-苯氧基]乙基]-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基]甲基]苯磺酸(18mg；0.014mmol)于二噁烷/水(1mL/1mL)中的混合物中添加LiOH.H2O(2.3mg；0.054mmol)，且将反应物在室温下搅拌4小时。通过添加HCl1N将溶液调整至pH 6-7，且在减压下蒸发二噁烷。纯化通过将混合物直接注射在用溶液A：H2O/CH3CN/NH4HCO3(1960ml/40/3.16g)与溶液B：CH3CN/H2O/NH4HCO3(1600ml/400ml/3.16g)的梯度洗脱的Oasis上，得到标题化合物(11mg；0.008mmol)。
步骤4：(2R)-2-[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-3-甲基-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸L27-P1
向(2R)-2-[5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(10.5mg；0.007mmol)于DMF(0.4mL)中的溶液中添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸酯(5.7mg；0.018mmol)，且将溶液在室温下搅拌4小时。及溶液通过C18X-Bridge柱，通过将反应混合物直接沉积在柱上，且使用TFA方法纯化，得到L27-P1(10mg；0.006mmol)。HR-ESI+:[M+H]+1511.5018/1511.5002[测量值/理论值]
L28-P1的制备：
(2R)-2-[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯
Figure BDA0003410186110004091
步骤1：N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(氯甲基)-3-甲基-苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
经75分钟的时段向5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸酯(504.1mg；0.816mmol)于NMP(5mL)中的溶液中添加6次SOCl2(60μL；0.816mmol)于NMP(500μL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌15分钟。将粗产物通过将反应混合物直接沉积在Oasis柱上，使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的(337mg)70％标题化合物(384mmol)及30％起始物质(170mmol)的混合物。IR(cm-1):3600-2400,1688+1648,1599,1518,1022.UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝614.17+616.18(Cl)
步骤2：(2R)-2-[5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-甲基-苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯
向(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸甲酯(152mg；0.171mmol)于NMP(4.5ml)中的溶液中依次添加N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(氯甲基)-3-甲基-苯氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(150mg；0.171mmol)、DIPEA(238μL；1.37mmol)及TBAI(76mg；0.205mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌28小时。使反应混合物冷却至室温。随后添加LiOH.H2O(13.7mg，0.342mmol)于水(500μL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌48小时。将粗产物通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上且使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的标题化合物(40mg；0.0325mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M]+＝1230.61+1232.61(Cl)
步骤3：(2R)-2-[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯L28-P1
向(2R)-2-[5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-甲基-苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸酯(6.0mg；0.0049mmol)于DMF(180μL)中的溶液中的溶液中依次添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨甲酰基]氧杂环丁烷-3-甲酸酯(2.3mg；0.0073mmol)及DIPEA(3.0μL；0.017mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1.5小时，且通过UPLC-MS监测。将粗产物通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上，使用TFA方法纯化，得到呈白色粉末状的L28-P1(2.9mg；0.0020mmol)。HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1425.4534/1425.4527[测量值/理论值]
L29-C3的制备：
(2R)-2-[5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(2-叠氮基乙氧基)乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-磺基-苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110004111
步骤1：5-[[(2S)-2-(叔丁氧羰基氨基)丙酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸钠
向Boc-L-Ala-OH(588mg；3.11mmol)于DMF(38.6mL)中的溶液中依次添加HATU(1.77g；4.67mmol)、5-氨基-2-(羟基甲基)苯磺酸钠(771mg；3.42mmol)及DIPEA(1.29mL；7.78mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，随后浓缩至干，且与水一起共蒸发，得到粗反应混合物。将所得残余物通过使用乙酸乙酯/甲醇95:5至80:20作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(1.17g；2.95mmol)。1H NMR(DMSO):δ1.24(s,9H),1.38(m,3H),4.05-1.44(m,1H),4.73(d,2H,J＝4.8Hz),5.04(t,1H,J＝5.6Hz)；6.97-7.02(m,1H),7.33(d,1H,J＝8Hz),7.65-7.70(m,1H),7.83(s,1H),9.91(s,1H)。
步骤2：5-[[(2S)-2-氨基丙酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸酯盐酸盐
将5-[[(2S)-2-(叔丁氧羰基氨基)丙酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸钠(1.17g；2.95mmol；1eq.)悬浮于HCl 4N于二噁烷(10mL)中的溶液中。将混合物在室温下搅拌2小时，随后浓缩至干，得到呈白色固体状的粗产物(982mg；2.95mmol)。1H NMR(DMSO):δ1.45(d,3H,J＝5.6Hz),3.91-4.0(m,1H),4.76(s,2H),7.41(d,1H,J＝7.6Hz),7.66(d,1H,J＝7.6Hz),7.85(s,1H),8.17(s,2H),10.44(s,1H)。
步骤3：5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸酯
向5-[[(2S)-2-氨基丙酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸酯盐酸盐(981mg；2.95mmol)于DMF(34.5mL)中的溶液中添加Fmoc-L-Val-Osu(1.29g；2.95mmol；1eq.)及DIPEA(975μL；5.9mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，随后浓缩至干，且与水一起共蒸发，得到粗产物。将所得残余物通过硅胶柱色谱，使用乙酸乙酯/甲醇95:5至80:20作为洗脱剂纯化，得到呈无色油状的标题化合物(1.28g；2.072mmol)。1H NMR(DMSO):δ0.80-0.92(m,6H),1.30(d,3H,J＝6.4Hz),2.02-2.10(m,1H),4.17-4.31(m,3H),4.37-4.44(m,1H),4.73(d,2H,J＝5.6Hz),5.04(t,1H,J＝6.4Hz),7.28-7.36(m,3H),7.37-7.47(m,3H),7.66(d,1H,J＝8.4Hz),7.71-7.77(m,2H),7.83-7.85(m,1H),7.88(d,2H,J＝7.6Hz),8.14(d,1H,J＝6.4Hz),9.99(s,1H)。
步骤4：5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰氧基甲基]苯磺酸
向5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟基甲基)苯磺酸酯(1.28g；2.07mmol)于THF(65mL)中的悬浮液中添加吡啶(875μL；10.8mmol)，随后添加氯甲酸4-硝基苯酯(1.09g；5.41mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。随后添加额外的氯甲酸4-硝基苯酯(1.09g；5.41mmol；2.5eq.)。在室温下搅拌5小时后，将混合物浓缩至干，随后在30分钟内通过使用水/乙腈90/10至0/100作为洗脱剂第C18柱色谱纯化。移除经合并的管的乙腈，且将其余部分冻干，得到呈白色固体状的标题化合物(650mg；0.83mmol)。1H NMR(DMSO):δ0.88(m,6H),1.31(d,3H,J＝4.8Hz),1.97-2.03(m,1H),3.92(t,1H,J＝6.8Hz),4.23(s,2H),4.24-4.34(m,1H),4.42(t,1H J＝5.6Hz),5.69(s,2H),7.30-7.48(m,6H),7.62(d,2H,J＝8Hz),7.72-7.76(m,3H),7.89(d,2H,J＝6.4Hz),7.94(s,1H),8.18(d,1H,J＝5.6Hz),8.33(d,2H,J＝7.6Hz),10.11(s,1H)。13C NMR(DMSO):δ18.01,18.26,19.21,30.4,46.66,49.05,59.91,65.67,67.82,117.7,119.1,120.06,122.66,125.37,126.33,127.05,127.62,128.0,138.06,140.67,143.77,143.86,145.1,146.23,151.96,155.47,156.12,171.0,171.15.LCMS(2-100ACN/H2O+0.05％TFA):90.41％Tr＝12.7min。阳离子模式检测值578.41。阴离子模式检测值759.17
步骤5：(2S)-2-[[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-磺基-苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]甲基]-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向(2S)-2-[[5-[3-氯-2-甲基-4-(2-哌嗪-1-基乙氧基)苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]甲基]-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸(178.4mg；0.183mmol)于DMF(1.5mL)中的悬浮液中依次添加5-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰氧基甲基]苯磺酸(150mg；0.192mmol)及DIPEA(91μL；0.549mmol)，将混合物在室温下搅拌过夜15分钟。将粗产物通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上，使用NH4HCO3方法纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(176mg，0.118mmol)。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1482.15+1484.56(Cl)
步骤6：(2S)-2-[[5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-磺基-苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]甲基]-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
向(2S)-2-[[5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-磺基-苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]甲基]-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(176mg；0.118mmol)于DMF(1.0mL)中的溶液中添加哌啶(24.17μL；0.237mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将粗产物通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上，使用NH4HCO3方法纯化，得到呈白色粉末状的标题化合物(102mg；0.0809mmol)。IR(cm-1):3620-2680,1683,1235。UPLC-MS:MS(ESI)m/z[M+H]+＝1260.37+1262.37(Cl)。1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 10.20(m,NH),8.90(m,2H),8.90(m,1H),8.60(m,NH),8.60(s,1H),7.90(m,1H),7.78(m,1H),7.70(d,1H),7.55(d,1H),7.48(t,1H),7.45(d,1H),7.3/7.2(m,4H),7.20(m,1H),7.20(d,1H),7.15(t,1H),7.15(d,1H),7.05(t,1H),7.00(d,1H),6.7(t,1H),6.2(d,1H),5.48(s,2H),5.50(m,1H),5.23(s,2H),4.50(m,1H),4.25(m,2H),3.75(s,3H),3.4(m,4H),3.40(m,1H),3.35(m,1H)2.80(m,2H),2.5(m,4H),2.50(m,1H),2.05(m,1H),1.80(s,3H),1.30(d,3H),0.90(dd,6H)
步骤7：(2,3,4,5,6-五氟苯基)2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸酯
向2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸(74mg；0.317mmol)于THF(500μL)中的溶液中依次添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(70mg；0.380mmol)于THF(500μL)中的溶液中及DCC(78.5mg；0.380mmol)于THF(500μL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌18小时。粗悬浮液经由巴斯德移液管(pasteur pipette)中的棉垫过滤，且溶液未经进一步处理即用于步骤8中。
步骤8：(2R)-2-[5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(2-叠氮基乙氧基)乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-磺基-苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸L29-C3
向(2S)-2-[[5-[4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-磺基-苯基]]甲氧羰基]]哌嗪-1-基]乙氧基]-3-氯-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]甲基]-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(100mg；0.0793mmol)于DMF(500μL)中的溶液中依次添加(2,3,4,5,6-五氟苯基)2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸酯于来自步骤7的THF(0.317mmol)及DIPEA(39.3μL；0.238mmol)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌15分钟。将粗产物通过将反应混合物直接沉积在X-Bridge柱上，使用NH4HCO3方法纯化，得到呈白色粉末状的L29-C3(43mg，0.0291mmol)。IR(cm-1)：3257、2102、1663、1236/1082、834/756。1H NMR(400MHz,dmso-d6)δppm 10.03(s,NH),8.87(d,1H),8.59(sNC,1H),8.35(d,NH),7.89(df,1H),7.69(dd,1H),7.66(m,1H),7.53(d,1H),7.45(t,1H),7.36(d,1H),7.29(dd,2H),7.21(d,1H),7.20(t,2H),7.19(d,1H),7.14(d,1H),7.13(m,1H),7.09(m,NH),7.03(t,1H),7.00(d,1H),6.72(t,1H),6.24(d,1H),5.48(dNC,1H),5.44(s,2H),5.23(AB,2H),4.40(t,1H),4.30(dd,1H),4.24(m,2H),3.94(s,2H),3.75(s,3H),3.58(m,10H),3.38(m,4H),3.36(t,2H),3.30(NC,1H),2.75(t,2H),2.50(m,4H),2.50(m,1H),2.00(m,1H),1.51(s,3H),1.30(d,3H),0.88/0.82(2d,6H)。13C NMR(100/126MHz,dmso-d6)δppm 158.2,131.6,131.1,130.9,130.9,130.9,130.9,128.3,126.7,120.7,120.4,119.3,117.9,116.2,112.5,112.1,110.8,70.2,70.2；69.6,67.7,64.0,56.7,56.5,55.8,53.2,50.4,49.2,43.8,31.7,19.7,18.7,18.4,17.8.19F NMR(376/470MHz,dmso-d6)δppm-112.0.HR-ESI+:m/z[M+H]+＝1475.4643/1475.4638；[2M+H+Ca]3+＝996.6289/996.6273；[M+2H]2+＝738.2378/738.2355；[M+H+Na]2+＝749.2255/749.2265。
实施例2.另外的接头、接头-有效负载及其前体的合成及表征。
示例性接头、接头-有效负载及其前体使用此实施例中所述的示例性方法合成。
2-(溴甲基)-4-硝基苯甲酸的合成
Figure BDA0003410186110004161
在室温下向2-甲基-4-硝基苯甲酸(300g，1.5371mol)于CCl4(3000mL)中的搅拌溶液中添加NBS(300.93g，1.6908mol)及AIBN(37.86g，0.2305mol)。将反应混合物在80℃下搅拌16h。通过TLC分析检测反应混合物。将反应混合物用饱和NaHCO3溶液(2L)稀释，且用乙酸乙酯(2×2L)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥且在减压下浓缩。将粗化合物通过使用2-3％乙酸乙酯/石油-醚作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化，且获得2-(溴甲基)-4-硝基苯甲酸。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.35(d,J＝2.0Hz,1H),8.20(q,J＝8.8,2.4Hz,1H),8.12(d,J＝8.8Hz,1H),4.97(s,2H),4.00(s,3H)。
4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸的合成
Figure BDA0003410186110004162
在室温下向2-(溴甲基)-4-硝基苯甲酸(250g，0.9122mol)于ACN(5000mL)中的混合物中添加丙-2-炔-1-醇(255.68g，265.50mL，4.5609mol，d＝0.963g/mL)及Cs2CO3(743.03g，2.2805mol)。将所得混合物加热至80℃16h。将反应混合物经硅藻土垫过滤，用乙酸乙酯(2L)洗涤。将过滤物在减压下浓缩。向所获粗化合物中添加饱和NaHCO3溶液(1L)，且通过使用2N HCl(2L)将水层酸化至pH 2。真空过滤后，获得干燥的4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸。1H NMR(400MHz,DMSO):δ13.61(brs,1H),8.37(d,J＝2.4Hz,1H),8.23(dd,J＝2.4,8.4Hz,1H),8.10(d,J＝8.8Hz,1H),4.95(s,2H),4.37(d,J＝2.4Hz,2H),3.52(t,J＝2.4Hz,1H)
4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004171
在0℃下向4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸(130g，0.5527mol)于MeOH(1300mL)中的搅拌溶液中缓慢添加SOCl2(526.08g，320.78mL，4.4219mol，d＝1.64g/mL)。将反应物在70℃下搅拌4h。在减压下蒸发反应溶剂。将所获残余物溶解于乙酸乙酯(1000mL)中，且用饱和NaHCO3(600mL)、水(500mL)及盐水溶液(500mL)洗涤。将分离的有机层经硫酸钠干燥，过滤且在减压下蒸发，得到4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.56(t,J＝0.8Hz,1H),8.18-8.09(m,2H),5.03(s,2H),4.35(d,J＝2.4Hz,2H),3.96(s,3H),2.49(t,J＝2.4Hz,1H)。
4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004172
在室温下向4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯(110g，0.4414mol)于EtOH(1100mL)及H2O(550mL)的混合物中的溶液中添加Fe粉末(197.21g，3.5310mol)及NH4Cl(188.88g，3.5310mol)。将所得混合物在80℃下加热16h。使反应混合物冷却至室温，且经
Figure BDA0003410186110004173
过滤且用乙酸乙酯(2L)洗涤。将过滤物在减压下浓缩直至体积的一半。向残余物中添加乙酸乙酯(1.5L)，且分离两层，且用乙酸乙酯(2L)萃取水层。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥且在减压下浓缩，获得粗产物。通过SiO2柱色谱(15-20％乙酸乙酯/石油-醚)纯化，得到4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.67(d,J＝8.8Hz,1H),6.78(t,J＝1.6Hz,1H),6.48(q,J＝8.4,2.4Hz,1H),4.79(s,2H),4.25(d,J＝2.4Hz,2H),3.70(d,J＝4.0Hz,3H),3.42(t,J＝2.4Hz,1H)。
(4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)甲醇的合成
Figure BDA0003410186110004174
在0℃下向THF(1000mL)的搅拌溶液中缓慢添加LiAlH4(1M于THF中)(21.23g，798.2mmol，798.2mL)。在0℃下缓慢添加4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯(70g，319.3mmol)于THF(800mL)中的溶液。将反应物在室温下搅拌4h。将反应混合物冷却至0℃，随后非常缓慢地添加水(22mL)，且随后添加20％NaOH(22mL)及水(66mL)。将反应混合物在0℃下搅拌30min。添加无水硫酸钠以吸收过量水。将混合物经
Figure BDA0003410186110004181
过滤。将滤饼用乙酸乙酯(1000mL)及10％MeOH/DCM(500mL)洗涤。将过滤物在减压下浓缩。将所得粗化合物通过SiO2柱色谱(35-40％乙酸乙酯/石油-醚作为洗脱剂)纯化，得到产物(4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)甲醇。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.98(d,J＝8.0Hz,1H),6.56(d,J＝2.4Hz,1H),6.43(dd,J＝2.4,8.0Hz,1H),4.98(s,2H),4.64(t,J＝5.2Hz,1H),4.47(s,2H),4.34(d,J＝5.6Hz,2H),4.15(d,J＝2.4Hz,2H),3.46(t,J＝2.4Hz,1H)。
(S)-(1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004182
向(4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)甲醇(1.92g，10.04摩尔，1.0当量)、(S)-(1-氨基-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(3.99g，10.04摩尔，1.0当量)及(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(4.20g，11.04摩尔，1.1当量)于DMF(10mL)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(2.62mL，15.06摩尔，1.5当量)。在环境温度下搅拌1h后，将混合物倾入水(200mL)中。将所得固体过滤，用水冲洗且在真空下干燥，获得(S)-(1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。LCMS:MH+＝571.5；Rt＝0.93min(2min酸性方法)。
(S)-2-氨基-N-(4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺的合成
Figure BDA0003410186110004191
向(S)-(1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(6.08g，10.65摩尔，1.0当量)中添加二甲胺(2M于THF中，21.31mL，42.62摩尔，4当量)。在环境温度下搅拌1.5小时后，从已形成的胶样残余物倾析上清液溶液。残余物用醚(3×50mL)研磨，且将所得固体过滤，用醚洗涤，且在真空下干燥。获得(S)-2-氨基-N-(4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺。LCMS:MH+349.3；Rt＝0.42min(2min酸性方法)。
((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003410186110004192
向(S)-2-氨基-N-(4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(3.50g，10.04摩尔，1.0当量)、(叔丁氧羰基)-L-缬氨酸(2.62g，12.05mmol，1.2当量)及(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(4.58g，12.05摩尔，1.2当量)于DMF(10mL)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(3.50mL，20.08摩尔，2.0当量)。在环境温度下搅拌2h后，将混合物倾入水(200mL)中，且用EtOAc(3×100mL)萃取所得悬浮液。将合并的有机层经硫酸钠干燥且在真空下浓缩。通过ISCO SiO2色谱(0-20％甲醇/二氯甲烷)纯化后，获得((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.00(s,1H),7.96(d,J＝7.7Hz,1H),7.55(dq,J＝4.9,2.2Hz,2H,aryl),7.32(d,J＝8.9Hz,1H,aryl),6.76(d,J＝8.9Hz,1H),5.95(t,J＝5.8Hz,1H),5.38(s,2H),5.01(t,J＝5.5Hz,1H),4.54(s,2H),4.45(dd,J＝25.2,5.3Hz,3H),4.20(d,J＝2.4Hz,2H),3.83(dd,J＝8.9,6.7Hz,1H),3.49(t,J＝2.4Hz,1H),2.97(dh,J＝26.0,6.5Hz,2H),1.96(h,J＝6.6Hz,1H),1.74-1.50(m,2H),1.39(m,11H),0.84(dd,J＝16.2,6.7Hz,6H)。LCMS:Mna+570.5；Rt＝0.79min(2min酸性方法)。
((S)-1-(((S)-1-((4-(氯甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003410186110004201
在0℃下向((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(2.00公克，3.65mmol，1.0当量)于乙腈(13.3mL)中的溶液中添加亚硫酰氯(0.53mL，7.30mmol，2.0当量)。在冰浴中搅拌一小时后，用水(40mL)稀释溶液，且将所得白色沉淀物通过过滤收集，风干，且在高真空下干燥，得到((S)-1-(((S)-1-((4-(氯甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯。LCMS:Mna+588.5；Rt＝2.17min(5min酸性方法)。
2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲酸的合成
Figure BDA0003410186110004202
向6-硝基异苯并呋喃-1(3H)-酮(90g，502.43mmol，1.00eq)于MeOH(1000mL)中的溶液中添加含KOH(28.19g，502.43mmol，1.00eq)的H2O(150mL)。将棕色混合物在25℃下搅拌1.5h。在减压下浓缩棕色混合物，得到残余物，且溶解于DCM(2000mL)中。向混合物中添加TBDPSCl(296.91g，1.08mol，277.49mL，2.15eq)及咪唑(171.03g，2.51mol，5.00eq)，在25℃下搅拌12h。在减压下浓缩混合物，得到残余物。通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝1/0，1/1)纯化残余物，且获得呈白色固体状的2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲酸。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.13(s,9H)5.26(s,2H)7.34-7.48(m,6H)7.68(brd,J＝8Hz,4H)8.24(br d,J＝8Hz,1H)8.46(br d,J＝8Hz,1H)8.74(s,1H)。
(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)甲醇的合成
Figure BDA0003410186110004211
向2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲酸(41g，94.14mmol，1eq)于THF(205mL)中的混合物中添加BH3.THF(1M,470.68mL，5eq)。将黄色混合物在60℃下搅拌2h。向混合物中添加MeOH(400mL)，且在减压下浓缩，得到残余物。随后添加H2O(200mL)及DCM(300mL)，用DCM(3×200mL)萃取，用盐水(300mL)洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤，且在减压下浓缩，得到残余物。通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝1/0,1/1)纯化残余物。获得呈白色固体状的(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)甲醇。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.10(s,9H)4.58(s,2H)4.89(s,2H)7.32-7.51(m,6H)7.68(dd,J＝8,1.38Hz,4H)7.76(d,J＝8Hz,1H)8.15(dd,J＝8 2.26Hz,1H)8.30(d,J＝2Hz,1H)。
2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲醛的合成
Figure BDA0003410186110004212
向(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)甲醇(34g，80.65mmol，1eq)于DCM(450mL)中的溶液中添加MnO2(56.09g，645.22mmol，8eq)。将黑色混合物在25℃下搅拌36h。向混合物中添加MeOH(400mL)，且在减压下浓缩，得到残余物。随后添加H2O(200mL)及DCM(300mL)，用DCM(3×200mL)萃取，用盐水(300mL)洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤，且在减压下浓缩，得到残余物。通过硅胶色谱(CH2Cl2＝100％)纯化残余物。获得呈白色固体状的2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲醛。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δppm 1.14(s,9H)5.26(s,2H)7.34-7.53(m,6H)7.60-7.73(m,4H)8.13(d,J＝8Hz,1H)8.48(dd,J＝8,2.51Hz,1H)8.67(d,J＝2Hz,1H)10.16(s,1H)。
N-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲基)丙-2-炔-1-胺的合成
Figure BDA0003410186110004221
向2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲醛(12.6g，30.03mmol，1eq)于DCM(130mL)中的溶液中添加丙-2-炔-1-胺(4.14g，75.08mmol，4.81mL，2.5eq)及MgSO4(36.15g，300.33mmol，10eq)，随后将悬浮混合物在25℃下搅拌24小时。溶解一些反应溶液，且用NaBH4处理，TLC显示形成一个新点。将反应混合物过滤，且在减压下浓缩，得到残余物。获得呈黄色固体状的(E)-N-[[2-[[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]甲基]丙-2-炔-1-亚胺。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δppm 1.11(s,9H)2.48(t,J＝2.38Hz,1H)4.52(t,J＝2.13Hz,2H)5.09(s,2H)7.35-7.49(m,6H)7.63-7.72(m,4H)7.79(d,J＝8.53Hz,1H)8.25(dd,J＝8.53,2.51Hz,1H)8.68(d,J＝2.26Hz,1H)8.84(t,J＝1.88Hz,1H)。
将(E)-N-[[2-[[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]甲基]丙-2-炔-1-亚胺(12g，26.28mmol，1eq)溶解于MeOH(100mL)及THF(50mL)中，随后添加NaBH4(1.49g，39.42mmol，1.5eq)，且将黄色混合物在-20℃下搅拌2小时。LCMS显示检测到所要化合物。将反应混合物通过添加MeOH(200mL)淬灭，在-20℃下搅拌，且随后在减压下浓缩，得到残余物。将残余物与EtOAc(500mL)一起溶解，用盐水(150mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤且在减压下浓缩，得到残余物。通过快速硅胶色谱(0-10％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱剂)纯化残余物。获得呈淡黄色油状的N-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲基)丙-2-炔-1-胺。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δppm 1.12(s,9H)2.13(t,J＝2.38Hz,1H)3.33(d,J＝2.51Hz,2H)3.80(s,2H)4.93(s,2H)7.36-7.49(m,6H)7.69(dd,J＝7.91,1.38Hz,4H)7.77(d,J＝8.53Hz,1H)8.16(dd,J＝8.41,2.38Hz,1H)8.24(d,J＝2.26Hz,1H)。
(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004231
向N-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲基)丙-2-炔-1-胺(9g，19.62mmol，1eq)及FMOC-OSU(7.28g，21.59mmol，1.1eq)于二噁烷(90mL)中的溶液中添加饱和NaHCO3(90mL)，且将白色悬浮液在20℃下搅拌12h。将反应混合物用H2O(150mL)稀释，且用EtOAc(150mL×2)萃取。合并的有机层用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤且在减压下浓缩，得到残余物。通过快速硅胶色谱(0-30％乙酸乙酯/石油醚的洗脱剂)纯化残余物。获得呈白色固体状的(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(7.7g，11.08mmol，产率56.48％，纯度98％)。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δppm 1.12(s,9H)2.17(br d,J＝14.31Hz,1H)3.87-4.97(m,9H)6.98-8.28(m,21H)。
(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004241
向(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(5.0g，7.34摩尔，1.0当量)于10％AcOH/CH2Cl2(100mL)中的冰浴冷却的溶液中添加Zn(7.20g，110摩尔，15当量)。移除冰浴，且将所得混合物搅拌2小时，同时将其经
Figure BDA0003410186110004242
垫过滤。将挥发物在真空中移除，且将残余物溶解于EtOAc中，用NaHCO3(饱和)、NaCl(饱和)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩且在ISCO SiO2色谱(0-75％EtOAc/庚烷)之后获得(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。LCMS:MH+＝651.6；Rt＝3.77min(5min酸性方法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004243
向(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.99g，4.59摩尔，1.0当量)及(S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊烷酸(1.72g，4.59摩尔，1.0当量)于CH2Cl2(40mL)中添加2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸乙酯(2.27g，9.18摩尔，2.0当量)。搅拌10min后，添加MeOH(1mL)，且溶液变均匀。将反应物搅拌16h，将挥发物在真空中移除，且在通过ISCO SiO2色谱(0-15％MeOH/CH2Cl2)纯化之后，获得(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。LCMS:MH+＝1008.8；Rt＝3.77min(5min酸性方法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
Figure BDA0003410186110004251
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(1.60g，1.588摩尔，1.0当量)中添加含2M二甲胺的MeOH(30mL，60mmol，37当量)及THF(10mL)。静置3h后，将挥发物在真空中移除，且将残余物用Et2O研磨以移除FMOC去除保护基副产物。向所得固体中添加CH2Cl2(16mL)及吡啶(4mL)，且向非均匀溶液中添加氯甲酸炔丙酯(155uL，1.588mmol，1.0当量)。搅拌30分钟后添加额外的氯甲酸炔丙酯(155uL，1.588mmol，1.0当量)。再搅拌20min后，添加MeOH(1mL)以淬灭残余氯甲酸酯，且将挥发物在真空中移除。在通过ISCO SiO2色谱(0-15％MeOH/CH2Cl2)纯化后，获得(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯。LCMS:MH+＝867.8；Rt＝3.40min(5min酸性方法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
Figure BDA0003410186110004261
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(984mg，1.135摩尔，1.0当量)于THF(7.5mL)中的溶液中添加含1.0M四丁基氟化铵的THF(2.27mL，2.27摩尔，2.0当量)。静置6h后，将挥发物在真空中移除，通过ISCO SiO2色谱(0-40％MeOH/CH2Cl2)纯化残余物，且获得(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯。LCMS:MH+＝629.6；Rt＝1.74min(5min酸性方法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
Figure BDA0003410186110004262
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(205mg，0.326摩尔，1.0当量)于CH2Cl2(10mL)中添加吡啶(158uL，1.96摩尔，5当量)。非均匀混合物在0℃冰浴及亚硫酰氯(71uL，0.98摩尔，3当量)中冷却。在冰浴中搅拌3小时后，反应物通过ISCO SiO2色谱(0-30％MeOH/CH2Cl2)直接纯化，且获得(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯。LCMS:MH+＝647.6；Rt＝2.54min(5min酸性方法)。
2-(羟基甲基)-N-甲基-5-硝基苯甲酰胺的合成
Figure BDA0003410186110004271
向6-硝基异苯并呋喃-1(3H)-酮(500g，2.79mol)于MeOH(1500mL)中的搅拌悬浮液中添加MeNH2(3.00kg，29.94mol，600mL，纯度31.0％)，且在25℃下搅拌1h。将固体过滤，且用水(600mL)洗涤两次，且在高真空下干燥，得到残余物。获得呈白色固体状的产物2-(羟基甲基)-N-甲基-5-硝基苯甲酰胺。LCMS:Rt＝0.537min,MS m/z＝193.2.。1H NMR:400MHzDMSOδ8.57(br d,J＝4.4Hz,1H),8.31(dd,J＝2.4,8.6Hz,1H),8.21(d,J＝2.4Hz,1H),7.86(d,J＝8.8Hz,1H),5.54(t,J＝5.6Hz,1H),4.72(d,J＝5.5Hz,2H),2.78(d,J＝4.4Hz,3H)。
(2-((甲基氨基)甲基)-4-硝基苯基)甲醇的合成
Figure BDA0003410186110004272
将2-(羟基甲基)-N-甲基-5-硝基苯甲酰胺(560g，2.66mol)于THF(5000mL)中的溶液中冷却至0℃，随后逐滴添加BH3-Me2S(506g，6.66mol)(2.0M于THF中)达60min，且加热至70℃5h。LCMS显示起始物质耗尽。完成后，在0℃下将含4M HCl(1200mL)的甲醇添加至反应混合物中，且在65℃下加热8h。将反应混合物冷却至0℃，将固体过滤，且在减压下浓缩。获得呈白色固体状的产物(2-((甲基氨基)甲基)-4-硝基苯基)甲醇(520g)。LCMS:Rt＝0.742min,MS m/z＝197.1[M+H]+。1H NMR:400MHz DMSOδ9.25(br s,2H),8.37(d,J＝2.4Hz,1H),8.14(dd,J＝2.4,8.5Hz,1H),7.63(d,J＝8.4Hz,1H),5.72(br s,1H),4.65(s,2H),4.15(br s,2H),2.55-2.45(m,3H)
1-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)-N-甲基甲胺的合成
Figure BDA0003410186110004281
向冷却至0℃的(2-((甲基氨基)甲基)-4-硝基苯基)甲醇(520g，2.65mol)及咪唑(721g，10.6mol)于DCM(2600mL)中的溶液中逐滴添加TBDPS-CL(1.09kg，3.98mol，1.02L)，且搅拌2h。将混合物倾入冰冷的水(1000mL)中，且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤且在真空下蒸发，得到粗产物。将粗产物通过用乙酸乙酯:石油醚(10/1至1)洗脱的硅胶色谱纯化，得到残余物。获得呈黄色液体状的产物1-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)-N-甲基甲胺。LCMS:产物:Rt＝0.910min,MS m/z＝435.2[M+H]+。1H NMR:400MHz CDCl3δ8.23(d,J＝2.4Hz,1H),8.15(dd,J＝2.4,8.4Hz,1H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.71-7.66(m,4H),7.50-7.37(m,6H),4.88(s,2H),3.65(s,2H),2.39(s,3H),1.12(s,9H)
(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004282
向1-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)-N-甲基甲胺(400g，920.3mmol)于THF(4000mL)中的溶液中添加FMOC-OSU(341.5g，1.01mol)及Et3N(186.2g，1.84mol，256.2mL)，将混合物在25℃下搅拌1h。将混合物倾入水(1600mL)中，且用乙酸乙酯(1000mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤且在真空下蒸发，得到粗产物。将粗产物通过用石油醚:乙酸乙酯(1/0至1/1)洗脱的硅胶色谱纯化，得到呈白色固体状的(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。LCMS:Rt＝0.931min,MS m/z＝657.2[M+H]+.1H NMR:EW16000-26-P1A,400MHz CDCl3δ8.21-7.96(m,1H),7.87-7.68(m,3H),7.68-7.62(m,4H),7.62-7.47(m,2H),7.47-7.28(m,9H),7.26-7.05(m,2H),4.81(br s,1H),4.62-4.37(m,4H),4.31-4.19(m,1H),4.08-3.95(m,1H),2.87(br d,J＝5.2Hz,3H),1.12(s,9H)。
(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004291
将(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(3.0g，4.57mmol，1.0当量)于MeOH(90mL)及EtOAc(30mL)中的溶液脱气且经由三路旋塞阀吹扫至N2气球。重复脱气/N2吹扫2次后，添加10％Pd/C deGussa型(0.486g，0.457摩尔，0.1当量)。将所得混合物脱气且经由三路旋塞阀吹扫至2H2气球。重复脱气/H2吹扫2次后，将反应物在H2气球压力下搅拌4小时。将反应物脱气且吹扫至N2，经硅藻土垫过滤，用MeOH进一步洗脱。在真空中移除挥发物且在高真空中抽吸后，获得(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。LCMS:MH+＝627.7；Rt＝1.59min(2min酸性方法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004292
向(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸酯(2.86g，4.56摩尔，1.0当量)及(S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊烷(9H-芴-9-基)甲酸(1.71g，4.56摩尔，1.0当量)于2:1CH2Cl2/MeOH(60mL)中添加2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸乙酯(2.256g，9.12摩尔，2.0当量)。将均匀溶液搅拌16小时，同时添加额外的(S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊烷酸(0.340g，0.2当量)及2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸乙酯(0.452g，0.4当量)以驱使反应完成。再搅拌5小时后，在真空中移除挥发物，且在通过ISCO SiO2色谱(0-5％MeOH/CH2Cl2)纯化之后，获得(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。LCMS:MH+＝984.1；Rt＝1.54min(2min酸性方法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
Figure BDA0003410186110004301
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.05g，2.085mmol，1.0当量)于THF(10mL)中添加含2.0M二甲胺的MeOH(10.42mL，20.85mmol，10当量)。搅拌16小时后在真空中移除挥发物。将残余物溶解于CH2Cl2(20mL)中，且添加DIEA(0.533mL，4.17mmol，2当量)及氯甲酸炔丙酯(0.264mL，2.71mmol，1.3当量)。在室温下搅拌16小时后，将反应物用CH2Cl2(20mL)稀释，用NaHCO3(饱和)、NaCl(饱和)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩且通过ISCO SiO2色谱(0-15％MeOH/CH2Cl2)纯化，得到(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯。LCMS:MH+＝843.8；Rt＝1.35min(2min酸性方法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
Figure BDA0003410186110004311
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(1.6g，1.90摩尔，1.0当量)于THF(10.0mL)中的0℃溶液中添加含1.0M四丁基氟化铵的THF(3.80mL，3.80摩尔，2.0当量)。温热至室温且搅拌16h后，在真空中移除挥发物，将残余物溶解于EtOAc中，用NaHCO3(饱和)、用NaCl(饱和)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，且通过ISCOSiO2色谱(0-30％MeOH/CH2Cl2)纯化残余物，得到(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯。LCMS:MH+＝605.7；Rt＝0.81min(2min酸性方法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
Figure BDA0003410186110004312
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-酯(350mg，0.579摩尔，1.0当量)于CH2Cl2(10mL)中添加吡啶(0.278mL，3.47摩尔，6当量)。将非均匀混合物在0℃冰浴及亚硫酰氯(0.126mL，1.73摩尔，3当量)中冷却。在冰浴中搅拌3h后，通过ISCO SiO2色谱(0-30％MeOH/CH2Cl2)纯化反应物，且获得(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯。LCMS:MH+＝623.7；Rt＝2.19min(5min酸性方法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004321
向溶解于THF(20mL)中的(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.6g，2.64mmol，1.0当量)中添加含乙酸(0.757mL，13.22mmol，5.0当量)及1.0M TBAF的THF(2.91mL，2.91mmol，1.1当量)。将溶液搅拌72小时，同时在真空中移除挥发物。通过ISCO SiO2色谱(0-30％MeOH/CH2Cl2)纯化之后，获得(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。LCMS:MH+＝745.5；Rt＝1.07min(2min酸性方法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004322
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(200mg，0.269摩尔，1.0当量)于CH2Cl2(10mL)中添加吡啶(0.130mL，1.61摩尔，6当量)。非均匀混合物在0℃冰浴及亚硫酰氯(0.059mL，0.806摩尔，3当量)中冷却。在冰浴中短暂搅拌后，将反应物一边搅拌一边温热至室温2小时。通过ISCO SiO2色谱(0-30％MeOH/CH2Cl2)纯化反应物，且获得(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。LCMS:MH+＝763.2；Rt＝1.18min(2min酸性方法)。
通用程序1
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004331
向溶解于DMF(0.5mL)中的(R)-2-((5-(3-氯-2-甲基-4-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)苯基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙酸盐酸盐(73.8mg，0.81摩尔，1.0当量)及(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苯甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(78mg，0.122摩尔，1.5当量)中添加DIEA(70uL，0.405摩尔，5.0当量)，随后添加四丁基碘化铵(25.4mg，0.069摩尔，0.85当量)。搅拌5h后，将反应物用DMSO(3mL)稀释，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％NH4OH改性剂)纯化。冻干后，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。LCMS:M+＝1486.3；Rt＝2.70min(5min碱性方法)。
通用程序2
1-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004341
向1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(24mg，0.016摩尔，1.0当量)及25-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷(26.5mg，0.065摩尔，4当量)中添加t-BuOH(1mL)。将混合物经由室内真空脱气且经由3路旋塞阀吹扫至N2气球。脱气/吹扫重复3次。添加坏血酸钠的16mg/mL水溶液(297uL，0.024摩尔，1.5当量)，且将溶液脱气且吹扫至N2三次。添加硫酸酯的4mg/mL水溶液(298uL，0.0048摩尔，0.3当量)且将溶液脱气且吹扫至N2三次。在N2下搅拌3h后，将反应物用DMSO(3mL)稀释，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后获得1-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS M+＝2307.0730，Rt＝2.69min(5min酸性方法)。
通用程序3
1-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L1-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004351
向1-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(19mg，0.0082摩尔，1.0当量)中添加25％TFA/CH2Cl2(2mL)。静置45min后，将挥发物在真空中移除，添加CH2Cl2且将挥发物在真空中移除，且开泵。将残余物溶解于DMF(1mL)中，且添加DIEA(22uL，0.124摩尔，15当量)及3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(5.1mg，0.016摩尔，2当量)。静置18h后，溶液用DMSO(3mL)稀释，且通过RP-ISCO金色谱纯化。冻干后，获得1-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L1-P1)。HRMS:M+＝2399.0797，Rt＝2.43min(5min酸运行)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.83(dd,J＝13.82,6.72Hz,6H)1.30-1.52(m,2H)1.55-1.76(m,2H)1.83(s,3H)1.88-2.08(m,1H)2.28-2.46(m,7H)2.73-2.84(m,4H)2.84-3.08(m,8H)3.15-3.27(m,3H)3.43-3.66(m,68H)3.73-3.83(m,7H)4.16-4.30(m,3H)4.32-4.43(m,2H)4.47(br s,6H)4.60(br s,3H)5.16-5.30(m,3H)5.40(br s,2H)5.44-5.52(m,1H)5.99(br t,J＝5.07Hz,1H)6.21(d,J＝6.48Hz,1H)6.71(t,J＝7.40Hz,1H)6.97-7.04(m,2H),7.00(s,2H)7.12-7.23(m,5H)7.27-7.54(m,8H)7.63(d,J＝5.14Hz,1H)7.78-7.94(m,3H)7.99(br s,1H)8.05-8.23(m,2H)8.60(s,1H)8.88(d,J＝5.13Hz,1H)10.24(br s,1H)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004371
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(30mg，0.020摩尔，1.0当量)及1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酸(28.3mg，0.061摩尔，3当量)遵循通用程序2，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2420.0867，Rt＝2.57min(5min酸性方法)。
实施例2：4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L10-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004381
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(30mg，0.012摩尔，1.0当量)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L10-P1)。HRMS:M+＝2515.0879，Rt＝2.43min(5min酸性方法)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.83(dd,J＝13.82,6.72Hz,6H)1.30-1.52(m,2H)1.55-1.76(m,2H)1.83(s,3H)1.88-2.08(m,1H)2.28-2.46(m,7H)2.73-2.84(m,4H)2.84-3.08(m,8H)3.15-3.27(m,3H)3.43-3.66(m,68H)3.73-3.83(m,7H)4.16-4.30(m,3H)4.32-4.43(m,2H)4.47(br s,6H)4.60(br s,3H)5.16-5.30(m,3H)5.40(br s,2H)5.44-5.52(m,1H)5.99(br t,J＝5.07Hz,1H)6.21(d,J＝6.48Hz,1H)6.71(t,J＝7.40Hz,1H)6.97-7.04(m,2H),7.00(s,2H)7.12-7.23(m,5H)7.27-7.54(m,8H)7.63(d,J＝5.14Hz,1H)7.78-7.94(m,3H)7.99(br s,1H)8.05-8.23(m,2H)8.60(s,1H)8.88(d,J＝5.13Hz,1H)10.24(br s,1H)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004391
利用(R)-2-((5-(3-氯-2-甲基-4-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)苯基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙酸盐酸盐(300mg，0.329mmol，1.0当量)及(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(246mg，0.395mmol，1.2当量)遵循通用程序1，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1461.5800，Rt＝2.53min(5min酸性方法)。
1-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004401
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(20mg，0.14mmol，1.0当量)及25-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷(16.8mg，0.041mmol，3.0当量)遵循通用程序2，获得1-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1872.8359，Rt＝2.56min(5min酸性方法)。
1-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L4-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004411
利用1-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(16.9mg，0.009mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得1-(2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L4-P1)。HRMS:M+＝1967.8375，Rt＝2.46min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004421
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(12mg，0.0082mmol，1.0当量)及1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酸(11.5mg，0.025mmol，3.0当量)遵循通用程序2，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1928.8459，Rt＝2.52min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L3-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004431
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(12mg，0.006mmol，1.00当量)遵循通用方案3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L3-P1)。HRMS:M+＝2024.8516，Rt＝2.42min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004441
向溶解于DMF(2mL)中的(R)-2-((5-(3-氯-2-甲基-4-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)苯基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙酸4-甲氧基苯甲酯(160mg，0.161mmol，1.0当量)及(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(153mg，0.201摩尔，1.25当量)添加DIEA(0.056mL，0.321摩尔，2.0当量)，随后添加四丁基碘化铵(65.3mg，0.177摩尔，1.1当量)。静置16h后，添加THF中的2.0二甲胺(0.804mL，1.67mmol，10当量)。静置2h后，将挥发物在真空中移除，添加DMSO(6mL)，且将溶液通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1499.3700；Rt＝2.59min(5min酸性方法)。
1-(4-((R)-2-((R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2-甲基-3-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氧代-2-氮杂二十九基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004451
向溶解于DMF(1.5mL)中的1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(40mg，0.027mmol，1.0当量)及(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)碳酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(30.8mg，0.059摩尔，2.2当量)中添加DIEA(0.009mL，0.053摩尔，2.0当量)。静置1小时后，添加DMSO(3mL)，且将溶液通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后获得1-(4-((R)-2-((R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2-甲基-3-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氧代-2-氮杂二十九基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1909.3800；Rt＝2.92min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((R)-2-((R)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2-甲基-3-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氧代-2-氮杂二十九基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L2-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004461
利用1-(4-((R)-2-((R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2-甲基-3-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氧代-2-氮杂二十九基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(25.3mg，0.013mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((R)-2-((R)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2-甲基-3-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氧代-2-氮杂二十九基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L2-P1)。HRMS:M+＝1884.7900，Rt＝2.50min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004471
向溶解于DMF(2mL)中的1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(150mg，0.093mmol，1.0当量)及79-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-79-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧杂七十九烷酸(134mg，0.102摩尔，1.1当量)中添加DIEA(0.081mL，0.464摩尔，5.0当量)。静置18h后，添加DMSO(6mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2700.8701；Rt＝2.83min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L11-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004481
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(80-羧基-2-甲基-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧杂-2-氮杂八十烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L11-P1)。HRMS:M+＝2674.8201，Rt＝2.44min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004491
利用(R)-2-((5-(3-氯-2-甲基-4-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)苯基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙酸(50mg，0.057mmol，1.0当量)及((S)-1-(((S)-1-((4-(氯甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(34.1mg，0.069mmol，1.2当量)遵循通用程序1，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。LCMS:M+＝1337.2，Rt＝1.11min(2min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓或(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-4-[2-[4-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-4-甲基-哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]-2-甲基-苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(L9-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004501
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(55mg，0.041mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L9-P1)。HRMS:M+＝1431.5400，Rt＝2.50min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004502
利用(R)-2-((5-(3-氯-2-甲基-4-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)苯基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙酸4-甲氧基苯甲酯(85mg，0.085mmol，1.0当量)及((S)-1-(((S)-1-((4-(氯甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(58mg，0.102mmol，1.2当量)遵循通用程序1，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1524.6200，Rt＝2.95min(5min酸性方法)。
1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004511
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(20mg，0.014摩尔，1.0当量)及25-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷(5.8mg，0.014摩尔，1当量)遵循通用程序2，获得1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。LCMS:[(M+)+H+]+2/2＝908.5，Rt＝1.15min(2min酸性方法)。
1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L8-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004521
利用1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(20mg，0.010mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L8-P1)。HRMS:M+＝1908.8097，Rt＝2.37min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004531
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(123.1mg，0.075mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1499.5601，Rt＝2.50min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L7-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004532
利用4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(40mg，0.027摩尔，1.0当量)及1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酸(37.4mg，0.080摩尔，3.0当量)遵循通用程序2，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((1-(26-羧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L7-P1)。HRMS:M+＝1965.5601，Rt＝2.35min(5min酸性方法)。
1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂七十三烷-73-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L5-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004551
遵循利用4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(20.4mg，0.014摩尔，1.0当量)及73-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂七十三烷(28.1mg，0.025摩尔，1.5当量)的通用程序2，获得1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂七十三烷-73-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L5-P1)。HRMS:M+＝2613.2100，Rt＝2.44min(5min酸性方法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
Figure BDA0003410186110004561
涡旋(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟基甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(249mg，0.412摩尔)及碳酸4-硝基苯(4-亚硝基苯)酯(356mg，1.24摩尔，3.0当量)于DMF(2mL)中的溶液直至均匀，且静置16小时。将溶液用DMSO(6mL)稀释且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，无改性剂)纯化。冻干后，获得(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯。LC/MS MH+＝770.7，Rt＝2.45min(5min酸性方法)。
(5-((R)-2-((R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
Figure BDA0003410186110004562
在室温下向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(100mg，0.130mmol)于DMF(1ml)中的溶液中添加N,N'-二甲基-乙二胺(22.90mg，0.260mmol)，随后添加DIPEA(0.113ml，0.650mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。将反应物用DMSO稀释，通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％NH4OH改性剂)纯化。冻干后获得(5-((R)-2-((R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯。LCMS:MH+＝719.9，Rt＝0.73min(2min酸性方法)。
(R)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟-3-羟基苯基)-4-((1-甲氧基-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004571
向(R)-4-(2-(4-(4-(1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟-3-羟基苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓或(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-[4-甲基-4-(3-磺基丙基)哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-羟基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(100mg，0.099摩尔)于MeOH(1.5mL)中的溶液中添加几滴H2SO4(浓)。搅拌过夜后，在真空中移除MeOH，将残余物溶解于DMSO中，通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后，获得(R)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟-3-羟基苯基)-4-((1-甲氧基-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓。HRMS M+＝1027.2900，Rt＝2.31min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(6-(3-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-4-氟苯基)-4-(((R)-1-甲氧基-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004581
在0℃下向(R)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟-3-羟基苯基)-4-((1-甲氧基-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓(50mg，0.049摩尔，1.0当量)于CH2Cl2(1mL)中的溶液中添加TEA(34uL，0.243摩尔，5.0当量)，随后添加氯甲酸4-硝基苯酯(10.8mg，0.054摩尔，1.1当量)。搅拌15min后，添加(5-((R)-2-((R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(66.3mg，0.092摩尔，2.0当量)于DMF(1mL)中的溶液，随后添加DIEA(40uL，0.231摩尔，5.0当量)。搅拌2h后，将挥发物在真空中移除，将溶液用DMSO(3ml)稀释且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后获得4-(2-(4-(6-(3-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-4-氟苯基)-4-(((R)-1-甲氧基-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓。HRMS M+＝1771.6700，Rt＝2.57min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(6-(3-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-4-氟苯基)-4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004591
向4-(2-(4-(6-(3-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-4-氟苯基)-4-(((R)-1-甲氧基-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓(23mg，0.013摩尔，1.0当量)于THF(1mL)中的溶液中添加2N LiOH(0.032mL，0.065摩尔，5当量)。搅拌2h后，将溶液用AcOH中和且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后，获得4-(2-(4-(6-(3-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-4-氟苯基)-4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓。HRMS M+＝1757.6200，Rt＝2.46min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(3-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004601
利用4-(2-(4-(6-(3-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-4-氟苯基)-4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓(17mg，0.0097mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(3-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1852.5200，Rt＝2.29min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(6-(3-(((2-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-4-氟苯基)-4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓(L12-P2)的合成
Figure BDA0003410186110004611
利用4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(3-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓(10mg，0.0054摩尔，1.0当量)及25-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷(4.4mg，0.011摩尔，2当量)遵循通用程序2，获得4-(2-(4-(6-(3-(((2-((((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-4-氟苯基)-4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓(L12-P2)。HRMS:M+＝2261.8601，Rt＝2.24min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(6-(3-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)-4-氟苯基)-4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004621
使用(R)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟-3-羟基苯基)-4-((1-甲氧基-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓(40mg，0.039mmol，1.0当量)及(5-((R)-2-((R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苯甲基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(36.4mg，0.058mmol，1.5当量)遵循通用程序1，其中烷基化之后的改变为完全添加2N LiOH(0.097mL，0.195摩尔，5.0当量)且搅拌2h，随后中和且通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得4-(2-(4-(6-(3-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)-4-氟苯基)-4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1599.5856，Rt＝1.34min(2min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(3-((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)-4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004631
利用4-(2-(4-(6-(3-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)-4-氟苯基)-4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓(46mg，0.029mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(3-((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)-4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1694.5699，Rt＝2.55min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(6-(3-((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)氧基)-4-氟苯基)-4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓(L4-P2)的合成
Figure BDA0003410186110004641
利用4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(3-((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲基)氧基)-4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓(44mg，0.026摩尔，1.0当量)及25-叠氮基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷(21.2mg，0.052摩尔，2当量)遵循通用程序2，获得4-(2-(4-(6-(3-((2-(((((1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷-25-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)氧基)-4-氟苯基)-4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基-1-(3-磺基丙基)哌嗪-1-鎓(L4-P2)。HRMS:M+＝2103.8000，Rt＝2.47min(5min酸性方法)。
通用程序4:
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(39-甲基-38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39-氮杂四十烷-40-基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004651
向溶解于DMF(1mL)中的1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(60mg，0.040mmol，1.0当量)及2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(35.7mg，0.052摩尔，1.3当量)中添加DIPEA(0.035mL，0.200摩尔，5.0当量)。静置18h后，添加DMSO(2mL)，且将溶液通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-70％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(39-甲基-38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39-氮杂四十烷-40-基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:[M+Na]+＝2092.9399；Rt＝2.88min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(39-甲基-38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39-氮杂四十烷-40-基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L32-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004661
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(39-甲基-38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39-氮杂四十烷-40-基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(43.4mg，0.021mmol，1eq)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(39-甲基-38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39-氮杂四十烷-40-基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:[M+Na]+＝2066.8799；Rt＝2.44min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(51-甲基-50-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47-十六氧杂-51-氮杂五十二烷-52-基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004671
利用2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47-十六氧杂五十烷-50-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(44.8mg，0.021mmol，1eq)遵循通用程序4，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(51-甲基-50-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47-十六氧杂-51-氮杂五十二烷-52-基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2246.0400；Rt＝2.88min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(51-甲基-50-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47-十六氧杂-51-氮杂五十二烷-52-基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L31-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004681
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(51-甲基-50-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47-十六氧杂-51-氮杂五十二烷-52-基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(47.5mg，0.021mmol，1eq)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(51-甲基-50-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47-十六氧杂-51-氮杂五十二烷-52-基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2221.0000；Rt＝2.45min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004691
利用2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂七十四烷-74-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(52.6mg，0.043mmol，1.3eq)遵循通用程序4，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2598.2500；Rt＝2.88min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L30-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004701
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(38.8mg，0.014mmol，1eq)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2573.2000；Rt＝2.47min(5min酸性方法)。
1-(2-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-N-甲基-5-氧代戊酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004711
利用5-(叔丁基)1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-谷氨酸(39.0mg，0.075mmol，1.1当量)遵循通用程序4，获得1-(2-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-N-甲基-5-氧代戊酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1906.8101；Rt＝3.03min(5min酸性方法)。
1-(2-(((S)-2-氨基-5-(叔丁氧基)-N-甲基-5-氧代戊酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004721
向溶解于DMSO(2mL)中的11-(2-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-N-甲基-5-氧代戊酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(38.8mg，0.026摩尔，1.0当量)中添加二甲胺(0.192mL，0.384摩尔，20当量)。静置4小时后，添加DMSO(2mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-70％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(2-(((S)-2-氨基-5-(叔丁氧基)-N-甲基-5-氧代戊酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1684.4000；Rt＝2.64min(5min酸性方法)。
通用程序5
1-(2-(((R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-N-甲基-3-磺基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004731
向溶解于DMF(2mL)中的(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(磺基)-D-丙氨酸(55.2mg，0.141mmol，1.3eq)及2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基异脲鎓六氟磷酸盐(V)(41.3mg，0.109摩尔，1.0当量)添加DIPEA(0.024mL，0.138摩尔，8.0当量)。静置10min后，添加1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(200mg，0.109mmol，1.0eq)。静置2.5小时后，添加DMSO(4mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-70％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(2-(((R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-N-甲基-3-磺基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1872.7000；Rt＝3.09min(5min酸性方法)。
1-(2-(((R)-2-氨基-N-甲基-3-磺基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004741
向溶解于THF(2mL)中的1-(2-(((R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-N-甲基-3-磺基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(173mg，0.087摩尔，1.0当量)中添加二甲胺(0.870mL，1.740摩尔，20当量)。静置5小时后，真空移除所有挥发物。用二乙醚研磨固体。添加DMSO(2mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(2-(((R)-2-氨基-N-甲基-3-磺基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1650.5800；Rt＝2.71min(5min酸性方法)。
1-(2-(((R)-2-氨基-N-甲基-3-磺基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L70-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004751
利用1-(2-(((S)-2-氨基-5-(叔丁氧基)-N-甲基-5-氧代戊酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(145mg，0.088mmol，1eq)遵循通用程序3，获得1-(2-(((R)-2-氨基-N-甲基-3-磺基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1625.5601；Rt＝2.32min(5min酸性方法)。
通用程序6
1-(2-(((S)-5-(叔丁氧基)-N-甲基-5-氧代-2-(2-磺基乙酰胺基)戊酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004761
向溶解于DMF(1mL)中的2-磺乙酸(4.83mg，0.035mmol，2.0当量)及2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基异脲鎓六氟磷酸盐(V)(9.85mg，0.026摩尔，1.5当量)中添加DIPEA(0.024mL，0.138摩尔，8.0当量)。静置10min后，添加1-(2-(((S)-2-氨基-5-(叔丁氧基)-N-甲基-5-氧代戊酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(29.1mg，0.017摩尔，1.0)。静置45min后，添加DMSO(2mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-70％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(2-(((S)-5-(叔丁氧基)-N-甲基-5-氧代-2-(2-磺基乙酰胺基)戊酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1806.7000；Rt＝3.10min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((S)-4-羧基-N-甲基-2-(2-磺基乙酰胺基)丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L71-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004771
利用1-(2-(((S)-5-(叔丁氧基)-N-甲基-5-氧代-2-(2-磺基乙酰胺基)戊酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(23.7mg，0.011mmol，1eq)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((S)-4-羧基-N-甲基-2-(2-磺基乙酰胺基)丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1725.5900；Rt＝2.39min(5min酸性方法)。
1-(2-((S)-40-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-42-甲基-38,41-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39,42-二氮杂四十三烷-43-基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004781
利用1-(2-(((S)-2-氨基-5-(叔丁氧基)-N-甲基-5-氧代戊酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(30mg，0.018mmol，1.0eq)及Mal-PEG12-NHS酯(18.31mg，0.027mmol，1.5eq)遵循通用程序4，获得1-(2-((S)-40-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-42-甲基-38,41-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39,42-二氮杂四十三烷-43-基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2255.0400；Rt＝2.97min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-((S)-40-(2-羧基乙基)-42-甲基-38,41-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39,42-二氮杂四十三烷-43-基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L72-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004791
利用1-(2-((S)-40-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-42-甲基-38,41-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39,42-二氮杂四十三烷-43-基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(20.1mg，8.91μmmol，1eq)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-((S)-40-(2-羧基乙基)-42-甲基-38,41-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39,42-二氮杂四十三烷-43-基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:[M]+＝2173.9199；Rt＝2.40min(5min酸性方法)。
1-(2-((2-(双(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)氨基)-N-甲基乙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004801
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(17.0mg，0.011mmol，1.0eq)及双(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)甘氨酸(10.97mg，0.017mmol，1.5eq)遵循通用程序5，获得1-(2-((2-(双(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)氨基)-N-甲基乙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1784.8000；Rt＝3.31min(5min酸性方法)。
1-(2-((2-(双(羧基甲基)氨基)-N-甲基乙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L67-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004811
利用1-(2-((2-(双(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)氨基)-N-甲基乙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(9.2mg，5.12μmmol，1eq)遵循通用程序3，获得1-(2-((2-(双(羧基甲基)氨基)-N-甲基乙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1647.6100；Rt＝2.28min(5min酸性方法)。
通用程序7
1-(2-(((S)-3-氨基-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004821
将溶剂用作DMF储备溶液。向(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(叔丁氧基)-4-氧代丁酸(8.04mg，161μL，0.020mmol，1.2当量)及2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基异脲鎓六氟磷酸盐(V)(6.81mg，681μL，0.018摩尔，1.1当量)中添加DIPEA(22.68μL，0.130摩尔，8.0当量)。静置10min后，添加1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(30mg，353μL，0.016摩尔，1.0当量)。静置45min后，添加二甲胺(163μl，0.326mmol)。静置16小时后，添加DMSO(2mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(2-(((S)-3-氨基-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1670.2300；Rt＝2.69min(5min酸性方法)。
1-(2-(((S)-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代-3-(2-磺基乙酰胺基)丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004831
利用1-(2-(((S)-3-氨基-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(20.6mg，10.23μmol，1eq)遵循通用程序6，获得1-(2-(((S)-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代-3-(2-磺基乙酰胺基)丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1792.6899；Rt＝3.17min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((S)-3-羧基-N-甲基-3-(2-磺基乙酰胺基)丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L79-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004841
利用1-(2-(((S)-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代-3-(2-磺基乙酰胺基)丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(25.3mg，0.012mmol，1eq)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((S)-3-羧基-N-甲基-3-(2-磺基乙酰胺基)丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1711.5699；Rt＝2.48min(5min酸性方法)。
1-(叔丁基)((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)羰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004842
向溶解于中DMF(2mL)的3-羟基丙酸叔丁酯(111mg，0.760mmol，1当量)及双(4-硝基苯基)碳酸酯(289mg，0.950mmol，1.2当量)添加DIPEA(0.221mL，1.267摩尔，2.0当量)。静置1小时后，添加1-(叔丁基)L-天冬氨酸4-苯甲酯(200mg，0.633mmol)。静置16小时后，添加DMSO(4mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(叔丁基)((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)羰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯。HRMS:[M+H]+＝452.4；Rt＝2.68min(5min酸性方法)。
((S)-4-(叔丁氧基)-3-(((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)羰基)氨基)-4-氧代丁酸的合成
Figure BDA0003410186110004851
向溶解于MeOH(2mL)中的1-(叔丁基)((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)羰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯(52.7mg，0.117mmol)中添加氢氧化钯(8.20mg，0.012mmol，0.1当量)。将反应气氛转换为氢气。搅拌16小时后，经硅藻土垫过滤反应混合物。将过滤物真空移除，获得1-(叔丁基)((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)羰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯。
1-(2-((S)-5-(叔丁氧羰基)-2,13,13-三甲基-3,7,11-三氧代-8,12-二氧杂-2,6-二氮杂十四基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004861
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(20mg，235μL，0.011mmol，1eq)及1-(叔丁基)((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)羰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯(7.84mg，204μL，0.022mmol，2当量)遵循通用程序7，获得1-(2-((S)-5-(叔丁氧羰基)-2,13,13-三甲基-3,7,11-三氧代-8,12-二氧杂-2,6-二氮杂十四基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1842.8000；Rt＝3.23min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((S)-3-羧基-3-(((2-羧基乙氧基)羰基)氨基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L102-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004871
利用1-(2-((S)-5-(叔丁氧羰基)-2,13,13-三甲基-3,7,11-三氧代-8,12-二氧杂-2,6-二氮杂十四基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(17.6mg，0.008mmol，1eq)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((S)-3-羧基-3-(((2-羧基乙氧基)羰基)氨基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1705.6200；Rt＝2.41min(5min酸性方法)。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((4-硝基苯氧基)羰基)-L-丝氨酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003410186110004872
向溶解于DMF(2mL)中的(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-丝氨酸叔丁酯(300mg，0.782mmol，1当量)及双(4-硝基苯基)碳酸酯(357mg，1.174mmol，1.5当量)中添加DIPEA(0.136mL，0.782摩尔，1.0当量)。静置16小时后,DMSO(4mL)添加，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((4-硝基苯氧基)羰基)-L-丝氨酸叔丁酯。HRMS:M+＝566.4；Rt＝3.01min(5min酸性方法)。
1-(2-(((((S)-2-氨基-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004881
向N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((4-硝基苯氧基)羰基)-L-丝氨酸叔丁酯(7.14mg，143μL，0.013mmol，1.2当量)及1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(20mg，235μL，0.011mmol，1.0当量)中添加DIPEA(15.1μL，0.087摩尔，8.0当量)。静置16小时后，添加二甲胺(109μl，0.217mmol，20当量)。将反应物在室温下搅拌1小时。添加DMSO(4mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(2-(((((S)-2-氨基-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1686.7200；Rt＝2.71min(5min酸性方法)。
1-(2-(((((S)-3-(叔丁氧基)-3-氧代-2-(2-磺基乙酰胺基)丙氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004891
利用1-(2-(((((S)-2-氨基-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(22.9mg，0.011mmol，1eq)遵循通用程序6，获得1-(2-(((((S)-3-(叔丁氧基)-3-氧代-2-(2-磺基乙酰胺基)丙氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1808.6899；Rt＝3.18min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((((S)-2-羧基-2-(2-磺基乙酰胺基)乙氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L77-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004901
利用1-(2-(((((S)-2-氨基-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(15.3mg，7.11μmol，1eq)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((((S)-2-羧基-2-(2-磺基乙酰胺基)乙氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1727.5800；Rt＝2.47min(5min酸性方法)。
1-(叔丁基)(4-(二乙氧基磷酰基)丁酰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004911
向溶解于DMF(2mL)中的1-(叔丁基)L-天冬氨酸4-苯甲酯(200mg，0.633mmol，1.0当量)及4-(二乙氧基磷酰基)丁酸(213mg，0.950mmol，1.5当量)中添加二环己基甲烷二亚胺(157mg，0.760mmol，1.2当量)、1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-1-醇水合物(146mg，0.950mmol，1.5当量)及DIPEA(0.110mL，0.633mmol，1.0当量)。静置16小时后，添加DMSO(4mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(叔丁基)(4-(二乙氧基磷酰基)丁酰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯。HRMS:[M+H]+＝486.4；Rt＝2.15min(5min酸性方法)。
(S)-4-(叔丁氧基)-3-(4-(二乙氧基磷酰基)丁酰胺基)-4-氧代丁酸的合成
Figure BDA0003410186110004912
向溶解于MeOH(2mL)中的1-(叔丁基)(4-(二乙氧基磷酰基)丁酰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯(YUBI5-040-EXP082-001(100mg，0.206mmol，1.0当量)添加氢氧化钯(14.46mg，0.021mmol，0.1当量)。将反应气氛转换为氢气。搅拌16小时后，经硅藻土垫过滤反应混合物。将过滤物真空移除，获得(S)-4-(叔丁氧基)-3-(4-(二乙氧基磷酰基)丁酰胺基)-4-氧代丁酸。HRMS:[M+H]+＝396.3；Rt＝1.35min(5min酸性方法)。
1-(2-(((S)-4-(叔丁氧基)-3-(4-(二乙氧基磷酰基)丁酰胺基)-N-甲基-4-氧代丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004921
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(30mg，353μL，0.016mmol，1eq)及(S)-4-(叔丁氧基)-3-(4-(二乙氧基磷酰基)丁酰胺基)-4-氧代丁酸(12.87mg，161μl，0.033mmol，2当量)遵循通用程序7，获得1-(2-(((S)-4-(叔丁氧基)-3-(4-(二乙氧基磷酰基)丁酰胺基)-N-甲基-4-氧代丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。MS:M/2+＝940.3；Rt＝2.60min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((S)-3-羧基-3-(4-(二乙氧基磷酰基)丁酰胺基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L103-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004931
利用1-(2-(((S)-4-(叔丁氧基)-3-(4-(二乙氧基磷酰基)丁酰胺基)-N-甲基-4-氧代丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(20mg，0.009mmol，1eq)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((S)-3-羧基-3-(4-(二乙氧基磷酰基)丁酰胺基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1795.6700；Rt＝2.44min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-2,6-二氨基-N-甲基己酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004941
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(20mg，0.011mmol，1eq)及(S)-2,5-双((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)戊酸(7.51mg，0.013mmol，1.2eq)遵循通用程序7，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-2,6-二氨基-N-甲基己酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1627.4000；Rt＝2.48min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-N-甲基-2,6-双(2-磺基乙酰胺基)己酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004951
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-2,6-二氨基-N-甲基己酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(9.7mg，0.0049mmol，1eq)遵循通用程序6，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-N-甲基-2,6-双(2-磺基乙酰胺基)己酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1871.6700；Rt＝3.02min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-N-甲基-2,6-双(2-磺基乙酰胺基)己酰胺基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L78-P1)的合成
Figure BDA0003410186110004961
利用-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-N-甲基-2,6-双(2-磺基乙酰胺基)己酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(15mg，7.55μmol，1eq)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-N-甲基-2,6-双(2-磺基乙酰胺基)己酰胺基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1846.6000；Rt＝2.49min(5min酸性方法)。
1-(叔丁基)((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-羰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯的合成
Figure BDA0003410186110004962
向溶解于DMF(3.2mL)中的(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-甲酸(344mg，0.950mmol)及1-(叔丁基)L-天冬氨酸4-苯甲酯(300mg，0.950mmol)中添加DIPEA(0.165mL，0.950mmol，1.0当量)、1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-1-醇水合物(154mg，0.997mmol，1.05当量)，且添加3-(((乙基亚氨基)亚甲基)氨基)-N,N-二甲基丙-1-胺盐酸盐(191mg，0.997mmol，1.05当量)。静置16小时后，添加DMSO(4mL)，且通过RP-HPLCISCO金色谱(10-70％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(叔丁基)((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-羰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯。HRMS:M+＝641.5；Rt＝2.55min(5min酸性方法)。
(S)-4-(叔丁氧基)-4-氧代-3-((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丁酸的合成
Figure BDA0003410186110004971
向溶解于MeOH(2mL)中的1-(叔丁基)((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-羰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯(100mg，0.160mmol，1.0eq)添加氢氧化钯(11.26mg，0.016mmol，0.1当量)。将反应气氛转换为氢气。搅拌16小时后，经硅藻土垫过滤反应混合物。将过滤物真空移除，获得(S)-4-(叔丁氧基)-4-氧代-3-((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丁酸。HRMS:[M-H]-＝532.3，Rt＝1.71min(5min酸性方法)。
1-(2-(((S)-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代-3-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004981
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(30mg，0.016mmol，1.0eq)和(S)-4-(叔丁氧基)-4-氧代-3-((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丁酸(12.2mg，968μL，0.023mmol，1.4eq)遵循通用程序7，获得1-(2-(((S)-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代-3-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2014.7800；Rt＝3.21min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-3-羧基-N-甲基-3-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110004991
向溶解于DCM(32mL)中的1-(2-(((S)-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代-3-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(22.7mg，0.009摩尔，1.0当量)中添加TFA(0.67mL)。搅拌45min后，真空移除溶剂，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-3-羧基-N-甲基-3-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1738.6200；Rt＝2.30min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-3-羧基-N-甲基-3-((2R,3R,4R,5S,6S)-3,4,5,6-四羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005001
向溶解于THF(1mL)及MeOH(1mL)中的1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-3-羧基-N-甲基-3-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4,5,6-四乙酰氧基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(22.7mg，0.009摩尔，1.0当量)中添加氢氧化锂(5.04mg，0.120mmol，10当量)。搅拌2小时后，真空移除溶剂。添加水(1mL)、TFA(0.2mL)、MeCN(1mL)及DMSO(4mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-70％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-3-羧基-N-甲基-3-((2R,3R,4R,5S,6S)-3,4,5,6-四羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1570.5900；Rt＝2.02min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((S)-3-羧基-N-甲基-3-((2R,3R,4R,5S,6S)-3,4,5,6-四羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L68-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005011
向溶解于DMF(1mL)中的1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((S)-3-羧基-N-甲基-3-((2R,3R,4R,5S,6S)-3,4,5,6-四羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(10.8mg，0.0056摩尔，1.0当量)及3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(5.25mg，0.017mmol，3.5当量)中添加DIPEA(7.86μL，0.045mmol，8当量)。静置1.5小时后，添加DMSO(2mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-70％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((S)-3-羧基-N-甲基-3-((2R,3R,4R,5S,6S)-3,4,5,6-四羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺基)丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1765.6500；Rt＝2.31min(5min酸性方法)。
1-(叔丁基)((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯的合成
Figure BDA0003410186110005021
向溶解于DMF(2mL)中的三乙酸((3R,4S,5S,6S)-2-羟基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯(254mg，0.760mmol，1.2当量)及双(4-硝基苯基)碳酸酯(289mg，0.950mmol，1.5当量)中添加DIPEA(0.221mL，1.267mmol，2.0当量)。静置1小时后，添加1-(叔丁基)L-天冬氨酸4-苯甲酯(200mg，0.633mmol，1.0当量)。静置16小时后，添加DMSO(6mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-70％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(叔丁基)((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯。HRMS:[M-H]-＝638.4；Rt＝2.61min(5min酸性方法)。
(3S)-4-(叔丁氧基)-4-氧代-3-(((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)丁酸的合成
Figure BDA0003410186110005022
向溶解于MeOH(2mL)中的1-(叔丁基)((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)-L-天冬氨酸4-苯甲酯(50mg，0.078mmol，1.0eq)中添加氢氧化钯(5.49mg，7.82μmol，0.1当量)。将反应气氛转换为氢气。搅拌16小时后，经硅藻土垫过滤反应混合物。将过滤物真空移除，获得(3S)-4-(叔丁氧基)-4-氧代-3-(((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)丁酸。HRMS:[M-H]-:548.4，Rt＝1.79min(5min酸性方法)。
1-(2-(((3S)-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代-3-(((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005031
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(30mg，0.016mmol，1.0eq)及(3S)-4-(叔丁氧基)-4-氧代-3-(((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)丁酸(12.5mg，0.250mL，0.023mmol，1.4eq)遵循通用程序7，获得1-(2-(((3S)-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代-3-(((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2030.7900；Rt＝3.19min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((3S)-3-羧基-N-甲基-3-(((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005041
向溶解于DCM(2mL)中的1-(2-(((3S)-4-(叔丁氧基)-N-甲基-4-氧代-3-(((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)丁酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(25.8mg，10.86μmol，1.0当量)中添加TFA(0.67mL)。搅拌2小时后，真空移除溶剂，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((3S)-3-羧基-N-甲基-3-(((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1754.6200；Rt＝2.31min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((3S)-3-羧基-3-(((((3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005051
向溶解于THF(1mL)及MeOH(1mL)中的1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((3S)-3-羧基-N-甲基-3-(((((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(26mg，0.012mmol，1.0当量)中添加氢氧化锂(5.20mg，0.124mmol，10当量)。搅拌2小时后，真空移除溶剂。添加水(1mL)、TFA(0.2mL)、MeCN(1mL)及DMSO(4mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-70％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((3S)-3-羧基-3-(((((3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1614.5800；Rt＝2.04min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((3S)-3-羧基-3-(((((3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L69-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005061
向溶解于DMF(1mL)中的1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((3S)-3-羧基-3-(((((3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(10mg，5.11μmol，1.0当量)及3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4.75mg，0.015mmol，3.5当量)中添加DIPEA(7.12μl，0.041mmol，8当量)。静置1.5小时后，添加DMSO(2mL)，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-70％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((3S)-3-羧基-3-(((((3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1809.6300；Rt＝2.32min(5min酸性方法)。
1-(2-((3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005071
将1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(45mg，0.026mmol)、1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十三烷-13-酸(12mg，0.030mmol)、HBTU(12mg，0.032mmol)及DIPEA(0.023mL，0.13mmol)于DMF(1mL)中的混合物在室温下搅拌30min。添加Me2NH(2M于THF中，0.065mL，0.13mmol)，且将混合物在室温下搅拌1h。添加额外量的Me2NH(2M于THF中，0.1mL，0.2mmol)。将混合物在室温下继续搅拌1h，用DMSO(3mL)稀释，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(2-((3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1658.7200，Rt＝2.57min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2-甲基-3,13-二氧代-15-膦酰基-6,9-二氧杂-2,12-二氮杂十五基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005081
将3-磷酸丙酸(11mg，0.071mmol、HBTU(27mg，0.071mmol)及DIPEA(0.060mL，0.34mmol)于DMF(0.5mL)中的混合物在室温下搅拌10min。将混合物添加至1-(2-((3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-甲基丙酰胺基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(40mg，0.021mmol)及DIPEA(0.010mL，0.057mmol)于DMF(0.5mL)中的溶液中。将混合物在室温下搅拌2天。用DMSO(3mL)稀释混合物，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2-甲基-3,13-二氧代-15-膦酰基-6,9-二氧杂-2,12-二氮杂十五基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1794.7100，Rt＝2.78min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2-甲基-3,13-二氧代-15-膦酰基-6,9-二氧杂-2,12-二氮杂十五基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L41-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005091
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2-甲基-3,13-二氧代-15-膦酰基-6,9-二氧杂-2,12-二氮杂十五基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓遵循通用程序3(除了利用TFA/CH2Cl2的第一步骤后的产物通过RP-HPLC ISCO金色谱[MeCN/H2O，0.1％NH4OH改性剂]纯化)，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2-甲基-3,13-二氧代-15-膦酰基-6,9-二氧杂-2,12-二氮杂十五基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1769.4500，Rt＝2.33min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,44,44-十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42-十四氧代-43-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十五烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005101
向1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(43.6mg，0.025mmol，1.0当量)、3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,42,42-十四烷甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十三氧代-41-氧杂-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氮杂四十三烷酸(25.9mg，0.025mmol，1.0当量)及HATU(10.5mg，0.028mmol，1.1当量)于DMF(0.25mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(22μL，0.126mmol，5.0当量)。将所得溶液在环境温度下搅拌1小时。将反应物用1mL DMSO稀释且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,44,44-十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42-十四氧代-43-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十五烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS M+2508.1499Rt＝2.78min(5min酸性方法)。
1-(2-(41-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十一烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L35-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005121
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,44,44-十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42-十四氧代-43-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十五烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(50.4mg，0.019mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得1-(2-(41-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氮杂四十一烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+2427.0400,rt＝2.30min.(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,62,62-二十一甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧代-61-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂六十三烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005131
向1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(31.9mg，0.018mmol，1.0当量)、3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,60,60-二十甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58-十九氧代-59-氧杂-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54-十八氮杂六十一烷酸(26.8mg，0.018mmol，1.0当量)及HATU(7.7mg，0.020mmol，1.1当量)于DMF(0.25mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(16μL，0.092mmol，5.0当量)。将所得溶液在环境温度下搅拌1小时。将反应物用1mL DMSO稀释且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,62,62-二十一甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧代-61-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂六十三烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS M+2934.3601Rt＝2.73min(5min酸性方法)。
1-(2-(59-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十九氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂五十九烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L36-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005141
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,62,62-二十一甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧代-61-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂六十三烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(45.5mg，0.015mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得1-(2-(59-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十九氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56-十九氮杂五十九烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+2853.2766,rt＝2.20min.(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,80,80-二十七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十六氧代-79-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂八十一烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005161
向1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(27.8mg，0.016mmol，1.0当量)、3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,78,78-二十六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧代-77-氧杂-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氮杂七十九烷酸(30.2mg，0.016mmol，1.0当量)及HATU(6.7mg，0.018mmol，1.1当量)于DMF(0.25mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(14μL，0.080mmol，5.0当量)。将所得溶液在环境温度下搅拌1小时。将反应物用1mL DMSO稀释且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,80,80-二十七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十六氧代-79-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂八十一烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS M+3360.5798Rt＝2.68min(5min酸性方法)。
1-(2-(77-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十五氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂七十七烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L37-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005181
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,80,80-二十七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十六氧代-79-氧杂-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂八十一烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(41.3mg，0.012mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得1-(2-(77-羧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十五氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氮杂七十七烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+3279.4678,rt＝2.21min。(5min酸性方法)。
1-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003410186110005191
在0℃下向2-叠氮基乙-1-醇(105mg，1.21mmol)于CH2Cl2(15ml)中添加氯磺酰异氰酸酯(sulfurisocyanatidic chloride)(0.105ml，1.21mmol)。将混合物在0℃下搅拌30min。随后添加含TEA(0.336ml，2.41mmol)及1-氨基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸叔丁酯(518mg，1.27mmol)的CH2Cl2(1mL)。将混合物在0℃下搅拌1h，且在室温下搅拌2h，随后用饱和NH4Cl及1N HCl(2.4mL)淬灭。用CH2Cl2(5×)萃取水层。有机层经无水Na2SO4干燥，过滤且经由旋转蒸发来浓缩，得到澄清油状物。经由快速色谱(0-15％MeOH/CH2Cl2，ELSD检测)纯化，得到呈澄清油状物的1-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸叔丁酯(474mg，0.788mmol)：LCMS:M+NH4+＝619.5，Rt＝0.94min(酸性，2min)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.33(s,1H),7.76(s,1H),4.28-4.20(m,2H),3.60(td,J＝5.6,5.0,2.9Hz,4H),3.55-3.45(m,22H),3.16-3.04(m,2H),2.46-2.38(m,2H),1.41(s,9H)。
1-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸的合成
Figure BDA0003410186110005192
在0℃下向1-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸叔丁酯(145mg，0.241mmol)于CH2Cl2(1mL)中添加TFA(1mL，12.98mmol)。将混合物在室温下搅拌1.45h，随后经由旋转蒸发来浓缩，在25℃水浴下搅拌，且在高真空中干燥30min。残余物与无水甲苯(3×2mL)共沸干燥，且在真空中干燥过夜，得到呈澄清油状物的1-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸(147mg，89重量％，按理论产量计)：LCMS:M+＝546.3,0.65min(酸性，2min，ELSD)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.30(s,1H),7.77-7.71(m,1H),4.25-4.19(m,2H),3.63-3.55(m,4H),3.54-3.45(m,22H),3.07(q,J＝6.0Hz,2H),2.47-2.40(m,2H)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐的合成
Figure BDA0003410186110005201
在0℃下向1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(321mg，0.210mmol)中添加25％TFA/CH2Cl2(12.3mL，40.0mmol)。将反应混合物升温至Rt，搅拌1h，随后在高真空下在RT水浴下浓缩。将粗产物用DMSO(3mL)稀释，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(150g，10-80％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后获得呈白色粉末状的1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(224mg，0.158mmol)：HRMS:M+＝1304.5100,Rt＝2.15min(5min酸性)
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐的合成
Figure BDA0003410186110005211
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(164mg，0.115mmol)及Mal-Peg1-NHS ester(72mg，0.23mmol)遵循通用程序3，获得呈白色粉末状的4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(170mg，0.105mmol)，HRMS:M+＝1499.5699，Rt＝2.45min(5min酸性)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.16(s,1H),8.81(d,J＝5.1Hz,1H),8.54(s,1H),8.07(d,J＝7.2Hz,1H),7.75(d,J＝8.5Hz,1H),7.69(d,J＝6.9Hz,2H),7.56(d,J＝5.1Hz,1H),7.45(dd,J＝7.5,1.8Hz,1H),7.42-7.29(m,3H),7.24(dd,J＝8.9,5.4Hz,2H),7.18-7.05(m,5H),6.99-6.91(m,4H),6.65(t,J＝7.4Hz,1H),6.15(d,J＝7.0Hz,1H),5.91(s,1H),5.43(dd,J＝9.8,3.5Hz,1H),5.23-5.12(m,2H),4.54(d,J＝11.2Hz,4H),4.33-4.09(m,7H),3.69(s,3H),3.42-2.78(m,32H,与DMSO重叠),2.39-2.20(m,2H),1.91-1.81(m,1H),1.77(s,3H),1.46(dd,J＝93.8,31.3Hz,3H),0.76(dd,J＝13.8,6.7Hz,6H)；19F NMR(376MHz,DMSO-d6):-112.18ppm
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((1-(2-(((N-(20-羧基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)氨磺酰基)氨甲酰基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(L59-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005231
利用4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(32mg，0.021mmol)及1-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸(26.2mg，0.043mmol)遵循通用程序2，获得呈白色粉末状的4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((1-(2-(((N-(20-羧基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)氨磺酰基)氨甲酰基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐：HRMS:M+＝2044.7700，Rt＝2.36min(5min酸性)。
3-(2-(2-(2-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸的合成
Figure BDA0003410186110005241
在0℃下向2-叠氮基乙-1-醇(105mg，1.21mmol)于CH2Cl2(15ml)中添加氯磺酰异氰酸酯(0.105ml，1.21mmol)。将混合物在0℃下搅拌30min。在0℃下添加TEA(0.336ml，2.41mmol)及3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(401mg，工业纯度>80％，1.447mmol)于CH2Cl2(1mL)中。在0℃下搅拌1h后，随后在室温下搅拌1h，用饱和NH4Cl及1N HCl(2.4mL)淬灭混合物。用CH2Cl2(5×)萃取水层。有机层经无水Na2SO4干燥，过滤且经由旋转蒸发来浓缩，得到澄清油状物。在通过快速色谱(0-15％MeOH于CH2Cl2中，ELSD检测)纯化之后，获得呈粘稠澄清油状物的3-(2-(2-(2-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(356mg，0.910mmol)：LCMS:MS+NH4+＝487.4，Rt＝0.90min(酸性，2min，ELSD)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.31(s,1H),7.78-7.70(m,1H),4.26-4.19(m,2H),3.58(td,J＝5.6,5.0,3.7Hz,4H),3.53-3.39(m,10H),3.10-3.03(m,2H),2.44-2.39(m,2H),1.40(s,9H)。
在0℃下向3-(2-(2-(2-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(162mg，0.345mmol)于CH2Cl2(1mL)中添加TFA(1mL，13.0mmol)。在室温下搅拌2h后，混合物利用25℃下的水浴经由旋转蒸发来浓缩。残余物在高真空中干燥30min，与无水甲苯(3×2mL)共沸蒸馏，且在真空中过夜，得到呈粘稠油状物的3-(2-(2-(2-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(139mg，0.335mmol)：LCMS:MS+NH4+＝431.4，Rt＝0.62min(酸性，2min,ELSD)：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(d,J＝15.4Hz,1H),7.78-7.69(m,1H),4.27-4.15(m,2H),3.67-3.54(m,8H),3.49-3.42(m,4H),3.07(q,J＝6.0Hz,2H),2.47-2.39(m,4H)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((1-(2-(((N-(2-(2-(2-(2-羧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨甲酰基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(L60-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005251
利用4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(15mg，10μmol)及3-(2-(2-(2-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(12mg，0.029mmol)遵循通用程序2，获得呈白色粉末状的4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((1-(2-(((N-(2-(2-(2-(2-羧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨甲酰基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐：HRMS:MS+＝1912.7000，Rt＝2.38min(5min酸性)。
三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯的合成
Figure BDA0003410186110005261
将(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(1535mg，7.48mmol)、Ag2CO3(8248mg，14.96mmol)及一片结晶碘于CH2Cl2(6mL)中的混合物与粉末状的4A分子筛(1400mg)一起搅拌15min。向混合物中添加三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-溴四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯(2050mg，4.99mmol)于CH2Cl2(6.00ml)中，也在添加之前与粉末状4A分子筛(1400mg)一起搅拌15min。所得混合物覆盖有铝箔，且在室温下搅拌60h，且随后经硅藻土过滤，用EtOAc洗涤。将过滤物浓缩，得到澄清油状物，将其通过快速色谱(0-10％MeOH于CH2Cl2中，ELSD检测)纯化，在浓缩适当的洗脱级分之后得到所需的三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯及二乙酸(2S,3aR,5R,6R,7S,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-2-甲基四氢-5H-[1,3]二氧杂环戊并[4,5-b]吡喃-6,7-二酯的47/53％混合物的粘稠油状物(640mg)：LCMS:MS+＝536.4，Rt＝0.96min(2min,酸，ELSD)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.77(s,2H),5.78(s,2H),5.76(s,1H),5.28(t,J＝9.5Hz,1H),5.04(t,J＝3.1Hz,1H),4.91(t,J＝9.7Hz,1H),4.87-4.74(m,3H),4.38(ddd,J＝5.2,3.1,0.9Hz,1H),4.24-4.10(m,3H),4.07-3.96(m,2H),3.92(dt,J＝8.8,4.1Hz,1H),3.80(dt,J＝11.2,4.4Hz,1H),3.68-3.60(m,1H),3.57-3.45(m,7H),3.38(td,J＝6.2,1.5Hz,7H),3.07(dt,J＝6.1,3.0Hz,4H),2.08(s,3H),2.06(s,3H),2.04(s,6H),2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.95(s,3H),1.65(s,3H),1.39(s,19H)。
三乙酸(2R,3R,4S,5R,6S)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯的合成
Figure BDA0003410186110005271
在0℃下向三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯及二乙酸(2S,3aR,5R,6R,7S,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-2-甲基四氢-5H-[1,3]二氧杂环戊并[4,5-b]吡喃-6,7-二酯(622mg，1.161mmol)于CH2Cl2(16mL)中的47/53％混合物中添加TFA(4.0mL，52mmol)。将反应混合物升温至Rt且搅拌1h。浓缩混合物，且将残余物在真空下干燥60min，得到浅黄色油状物。将粗产物用DMSO(4mL)稀释且通过RP-HPLC ISCO金色谱(5-60％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂，ELSD检测)纯化。冻干适当洗脱级分后，获得呈白色粉末状的三乙酸(2R,3R,4S,5R,6S)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯作为TFA盐(195mg，0.355mmol)：LCMS:MS+＝436.4，Rt＝0.58min(酸性，2min)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.72(s,3H),5.27(t,J＝9.4Hz,1H),4.92(t,J＝9.6Hz,1H),4.86-4.75(m,2H),4.22-4.15(m,1H),4.07-3.94(m,3H),3.89-3.53(m,14H，与DMSO混合物),3.03-2.91(m,2H),2.03(s,3H),2.01(s,3H),1.99(s,3H),1.94(s,3H)。
(N-(2-(2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨基甲酸2-叠氮基乙酯的合成
Figure BDA0003410186110005272
在0℃下向三乙酸2-叠氮基乙-1-醇(16mg，0.18mmol)于CH2Cl2(2.5ml)中添加氯磺酰异氰酸酯(0.016ml，0.184mmol)。将混合物在0℃下搅拌1h，随后添加TEA(0.128ml，0.919mmol)及(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯作为TFA盐(116mg，0.211mmol)于CH2Cl2(1.5mL)中。在0℃下搅拌1h后，随后在室温下搅拌1h后，用饱和NH4Cl及1N HCl(0.919mL，0.919mmol)淬灭混合物。用CH2Cl2(5×)萃取水层。将有机层经过无水Na2SO4，过滤且经由旋转蒸发来浓缩，得到呈澄清油状物的三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯(121mg)：LCMS:MS+＝628，Rt＝0.85min(酸性，2min,ELSD)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(s,1H),7.79-7.71(m,1H),5.26(t,J＝9.5Hz,1H),4.90(t,J＝9.7Hz,1H),4.85-4.73(m,2H),4.25-4.14(m,3H),4.06-3.94(m,2H),3.79(ddd,J＝11.3,5.3,3.8Hz,1H),3.68-3.40(m,8H),3.16-3.00(m,3H),2.02(s,3H),2.00(s,3H),1.98(s,3H),1.94(s,3H)。
将以上产物溶解于二噁烷(3ml)中且在0℃下冷却。添加LiOH.H2O(0.5M于水中，2.94ml，1.47mmol)。将所得澄清溶液在室温下搅拌1h，且随后在0℃下用HCl(5N,0.147mL，0.735mmol)淬灭。混合物在20℃水浴下经由旋转蒸发来浓缩以移除大部分二噁烷。通过prep HPLC(Sunfire 5μm 30×50mm柱，2-12％乙腈，具有0.1％FA于水中。流速：75mL/min，MS 459.3，476.3检测)纯化残余溶液(约3mL)，在经由冻干移除适当洗脱级分的溶剂后得到呈半固体状的(N-(2-(2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨基甲酸2-叠氮基乙酯(64mg，0.14mmol)：LCMS:M+NH4+＝477.3,MS-＝458(酸性，2min,ELSD)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(s,1H),7.71(s,1H),4.96(d,J＝4.9Hz,1H),4.89(dd,J＝13.7,4.8Hz,2H),4.47(t,J＝5.9Hz,1H),4.22(t,J＝5.0Hz,2H),4.15(d,J＝7.8Hz,1H),3.90-3.81(m,1H),3.67(ddd,J＝12.0,5.7,2.0Hz,1H),3.62-3.39(m,8H),3.19-2.90(m,6H)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(2-(((N-(2-(2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨甲酰基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(L63-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005291
利用4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(36mg，0.022mmol)及(N-(2-(2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨基甲酸2-叠氮基乙酯(22mg，0.048mmol)遵循通用程序2，获得呈白色粉末状的4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(2-(((N-(2-(2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨甲酰基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐：HRMS:MS+＝1958.6899，Rt＝2.31min(5min酸性)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),10.16(s,1H),8.81(d,J＝5.2Hz,1H),8.54(s,1H),8.07(d,J＝13.5Hz,2H),7.74(d,J＝8.6Hz,1H),7.68(q,J＝4.3,2.7Hz,3H),7.56(d,J＝5.1Hz,1H),7.45(dd,J＝7.6,1.8Hz,1H),7.42-7.28(m,3H),7.23(ddd,J＝8.5,5.4,2.6Hz,2H),7.17-7.04(m,5H),6.99-6.91(m,4H),6.65(t,J＝7.4Hz,1H),6.14(dd,J＝7.6,1.8Hz,1H),5.93(s,1H),5.43(dd,J＝9.8,3.6Hz,1H),5.23-5.11(m,2H),4.59(dd,J＝11.3,7.4Hz,8H),4.42-4.06(m,12H),3.53-3.17(m,27H,与DMSO重叠),3.09-2.80(m,17H,与DMSO重叠),2.39-2.20(m,3H),1.86(h,J＝6.9Hz,1H),1.77(s,3H),1.68-1.21(m,5H),0.76(dd,J＝13.8,6.8Hz,6H)；19F NMR(376MHz,DMSO-d6):-112.18ppm。
三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯的合成
Figure BDA0003410186110005301
将(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(1046mg，4.20mmol)、Ag2CO3(4627mg，8.39mmol)及一片结晶碘于CH2Cl2(3mL)中的混合物与粉末状4A分子筛(700mg)一起搅拌15min。向混合物中添加三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-溴四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯(1150mg，2.80mmol)于CH2Cl2(3.00mL)中(也与粉末状4A分子筛(700mg)一起搅拌15min)。所得混合物覆盖有铝箔，且在室温下搅拌60h，随后经硅藻土过滤，用EtOAc洗涤。将过滤物浓缩，得到澄清油状物。经由快速色谱(20-100％EtOAc于庚烷中，ELSD检测)纯化，得到呈粘稠油状物的三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯及二乙酸(2S,3aR,5R,6R,7S,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氧基)-2-甲基四氢-5H-[1,3]二氧杂环戊并[4,5-b]吡喃-6,7-二酯的28/72％混合物(307mg，0.529mmol):LCMS:MS+＝580.4，Rt＝0.96min(酸，2min,仅ELSD)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.74(s,3H),5.76(s,8H),5.26(t,J＝9.5Hz,1H),5.02(t,J＝3.1Hz,3H),4.90(t,J＝9.7Hz,1H),4.84-4.72(m,5H),4.37(ddd,J＝5.2,3.1,0.9Hz,3H),4.18(dd,J＝12.2,5.0Hz,1H),4.11(d,J＝4.5Hz,5H),4.08-3.94(m,4H),3.91(dt,J＝8.6,4.1Hz,3H),3.85-3.75(m,1H),3.66-3.58(m,1H),3.58-3.51(m,7H),3.42-3.31(m,14H),3.06(q,J＝5.9Hz,8H),2.07(s,7H),2.05(s,7H),2.02(s,10H),1.99(d,J＝1.0Hz,6H),1.99(s,3H),1.94(s,3H),1.63(s,7H),1.38(s,36H),1.18(t,J＝7.1Hz,4H)。
三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯的合成
Figure BDA0003410186110005311
在0℃下向三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯及二乙酸(2S,3aR,5R,6R,7S,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氧基)-2-甲基四氢-5H-[1,3]二氧杂环戊并[4,5-b]吡喃-6,7-二酯(323mg，0.557mmol)于CH2Cl2(8mL)中的混合物中添加TFA(1.9mL，25mmol)。在室温下搅拌45min后，浓缩混合物，且将残余物在真空下干燥60min，得到浅黄色油状物。经由快速色谱(0-20％MeOH/CH2Cl2，以及0.2％NH4OH改性剂于MeOH中，ELSD检测)纯化，得到呈澄清油状物的三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯(82mg，0.171mmol)。LCMS:MS+＝480.4，Rt＝0.61min(酸性，2min,ELSD)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.76(s,2H),5.28(t,J＝9.4Hz,1H),4.93(t,J＝9.7Hz,1H),4.86-4.75(m,2H),4.20(dd,J＝12.2,5.0Hz,1H),4.08-3.95(m,2H),3.88-3.79(m,1H),3.67-3.53(m,11H,与DMSO重叠),3.00(q,J＝5.5Hz,2H),2.04(s,3H),2.02(s,3H),2.00(s,3H),1.96(s,3H)。
(N-(2-(2-(2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨基甲酸2-叠氮基乙酯的合成
Figure BDA0003410186110005321
在0℃下向2-叠氮基乙-1-醇(12.5mg，0.144mmol)于CH2Cl2(2mL)中添加氯磺酰异氰酸酯(0.012ml，0.14mmol)。将混合物在0℃下搅拌45min，随后添加TEA(0.040ml，0.29mmol)及三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯(77mg，0.16mmol)/CH2Cl2(1mL)。在0℃下搅拌1h后，随后在室温下搅拌1h，用饱和NH4Cl及1NHCl(0.29mL)淬灭混合物。用CH2Cl2(5×)萃取水层。有机层经无水Na2SO4干燥，过滤且经由旋转蒸发来浓缩，得到呈澄清油状物的三乙酸(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酯(75mg)：LCMS:0.97min,MS+＝672.4,96,Rt-0.87min(酸性，2min,ELSD)。
在0℃下向以上产物于二噁烷(4mL)中添加LiOH.H2O(0.5M于水中，3.45ml，1.72mmol)。将所得澄清溶液在室温下搅拌1h，且随后利用20℃水浴经由旋转蒸发来浓缩。通过prep HPLC(Sunfire 5μm 30×50mm柱，2-12％乙腈，具有0.1％FA于水中。流速：75mL/min.，MS 503.5，520.3检测)纯化残余物，冻干后得到呈澄清薄膜状的(N-(2-(2-(2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨基甲酸2-叠氮基乙酯(22mg，0.044mmol)：LCMS:MS+＝504.3，Rt＝0.52min(酸性，2min,ELSD)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.31(s,1H),7.74(s,1H),4.96(d,J＝4.9Hz,1H),4.89(dd,J＝12.5,4.8Hz,2H),4.47(t,J＝5.9Hz,1H),4.22(t,J＝5.0Hz,2H),4.15(d,J＝7.8Hz,1H),3.93-3.82(m,1H),3.67(dd,J＝11.2,5.8Hz,1H),3.62-3.40(m,12H),3.17-2.90(m,6H)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(2-(((N-(2-(2-(2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨甲酰基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(L62-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005331
利用4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(32mg，0.020mmol)及(N-(2-(2-(2-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2＝基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨基甲酸2-叠氮基乙酯(21mg，0.042mmol)遵循通用程序2，得到呈白色粉末状的4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-(2-(((N-(2-(2-(2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨甲酰基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐：HRMS:MS+＝2002.7100，Rt＝2.37min(5min酸性).
3,3'-((3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰基)氮烷二基)二丙酸二-叔丁酯的合成
Figure BDA0003410186110005341
向3,3'-氮烷二基二丙酸二-叔丁酯(403mg，1.47mmol)、3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(505mg，1.62mmol)及DIPEA(0.309mL，1.77mmol)于CH2Cl2(3mL)中的混合物中添加N-(二甲基胺丙基)-N'-乙基-碳二亚胺盐酸盐HCl(367mg，1.92mmol)。在室温下搅拌2h后，混合物用饱和NH4Cl淬灭，且用CH2Cl2(3×)萃取。经合并的有机相用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤且浓缩。通过快速色谱(0-50％EtOAc/庚烷)纯化所得粗产物，得到呈白色泡沫状的3,3'-((3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰基)氮烷二基)二丙酸二-叔丁酯(290mg，0.511mmol):LCMS:MS+＝567.5，Rt＝1.32min(酸，2min)；PMR:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.94-7.88(m,2H),7.70(d,J＝7.5Hz,2H),7.47-7.40(m,2H),7.40-7.31(m,2H),7.22(t,J＝5.7Hz,1H),4.31(d,J＝6.8Hz,2H),4.26-4.18(m,1H),3.56-3.03(m,8H),2.50-2.38(m,4H),1.41(s,9H),1.40(s,9H)。
3,3'-((3-氨基丙酰基)氮烷二基)二丙酸二-叔丁酯,1-(9H-芴-9-基)-N,N-二甲基甲胺的合成
Figure BDA0003410186110005351
向3,3'-((3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰基)氮烷二基)二丙酸二-叔丁酯(288mg，0.508mmol)于CH2Cl2中(3mL)添加二甲胺(2N于THF中，1mL，2mmol)。将混合物在室温下搅拌1h。添加更多二甲胺(2N于THF中，1mL，2mmol)。再搅拌4h后，浓缩混合物且通过快速色谱(0-25％MeOH/CH2Cl2，37min，0.2％NH4OH改性剂于MeOH中，ELSD检测)纯化残余物，得到呈浅棕色油状物的3,3'-((3-氨基丙酰基)氮烷二基)二丙酸二-叔丁酯、1-(9H-芴-9-基)-N,N-二甲基甲胺(62mg，0.472mmol):LCMS:MS+＝345.4，Rt＝0.76min(acidc,2min,ELSD)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.05(s,2H),3.51(t,J＝7.2Hz,2H),3.43(t,J＝7.3Hz,2H),3.31(s,2H),2.79(t,J＝6.4Hz,2H),2.55-2.45(m,17H,与DMSO重叠),2.41(t,J＝7.3Hz,2H),1.41(s,9H),1.40(s,9H)。
3,3'-((3-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)丙酰基)氮烷二基)二丙酸的合成
Figure BDA0003410186110005352
在0℃下向2-叠氮基乙-1-醇(16mg，0.18mmol)于CH2Cl2(2.5ml)中添加氯磺酰异氰酸酯(0.016ml，0.18mmol)。将混合物在0℃下搅拌30min，随后TEA(0.051ml，0.37mmol)及3,3'-((3-氨基丙酰基)氮烷二基)二丙酸二-叔丁酯(73mg，0.21mmol)于CH2Cl2(1mL)中。在0℃下搅拌1h且随后在室温下搅拌1h后，混合物用饱和NH4Cl及1N HCl(0.37mL)淬灭。用CH2Cl2(5×)萃取水层。有机层经无水Na2SO4干燥，过滤且经由旋转蒸发来浓缩。通过快速色谱(0-10％MeOH/CH2Cl2，ELSD及UV214检测)纯化所得残余物，得到呈粘稠澄清油状物的3,3'-((3-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)丙酰基)氮烷二基)二丙酸二-叔丁酯(70mg，0.13mmol)：LCMS MS+＝537.4，Rt＝1.08min(酸性，2min,ELSD)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.39(s,1H),7.65-7.59(m,1H),4.28-4.23(m,2H),3.63-3.59(m,2H),3.54-3.47(m,2H),3.47-3.38(m,2H),3.18-3.09(m,2H),2.61-2.54(m,4H),2.43(dd,J＝8.5,6.0Hz,2H),1.43(s,9H),1.42(s,9H)。
在0℃下向以上产物于CH2Cl2(2ml)中添加TFA(2ml)。在室温下搅拌1.5h后，将混合物在25℃水浴下经由旋转蒸发来浓缩。残余物在高真空中干燥30min，随后与无水甲苯(3×3mL)共沸蒸馏，且进一步在高真空中干燥过夜，得到呈白色固体状的3,3'-((3-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)丙酰基)氮烷二基)二丙酸(72mg，77重量％，按理论产量计。将其直接用下一步骤中)：LCMS MS+＝425.3，Rt＝0.52min(酸性，2min,ELSD)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.28(s,1H),11.35(s,1H),7.58(t,J＝5.8Hz,1H),4.26-4.20(m,2H),3.61-3.55(m,2H),3.50(t,J＝7.4Hz,2H),3.42(t,J＝7.4Hz,2H),3.12(q,J＝6.8Hz,2H),2.56(dd,J＝15.1,7.4Hz,4H),2.43(t,J＝7.4Hz,2H),2.08(s,1H)。
1-(2-(((1-(2-(((N-(3-(双(2-羧基乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨磺酰基)氨甲酰基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(L61-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005371
利用4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐(20mg，0.012mmol)及3,3'-((3-((N-((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨磺酰基)氨基)丙酰基)氮烷二基)二丙酸(15mg，0.027mmol)遵循通用程序2，获得呈白色粉末状的1-(2-(((1-(2-(((N-(3-(双(2-羧基乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨磺酰基)氨甲酰基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓三氟乙酸盐：HRMS:MS+＝1923.6500Rt＝2.34min(5min酸性)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.21(s,1H),10.16(s,1H),8.81(d,J＝5.1Hz,1H),8.54(s,1H),8.08(d,J＝13.7Hz,2H),7.77-7.50(m,5H),7.47-7.20(m,6H),7.18-7.04(m,5H),6.99-6.90(m,4H),6.65(t,J＝7.4Hz,1H),6.14(dd,J＝7.6,1.7Hz,1H),5.92(s,1H),5.43(dd,J＝9.8,3.5Hz,1H),5.24-5.11(m,3H),4.65-4.51(m,9H),4.45-3.81(m,52H,与DMSO重叠),3.68(s,3H),3.54-2.77(m,31H),2.39-2.20(m,5H),1.86(q,J＝6.8Hz,1H),1.77(s,3H),1.69-1.00(m,6H),0.76(dd,J＝13.9,6.8Hz,6H)；19F NMR(376MHz,DMSO-d6):-112.16ppm。
1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十七烷-37-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005381
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(87.5mg，0.063摩尔，1.0当量)及mPEG12-Azide(73.3mg，0.125mmol，2当量)遵循通用程序2，获得1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十七烷-37-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1889.8544，Rt＝2.19min(5min酸性方法)。
1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十七烷-37-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L104-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005391
利用1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十七烷-37-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(22mg，0.011mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十七烷-37-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2084.9099，Rt＝2.45min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005401
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(155mg，0.119mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1499.5699，Rt＝2.39min(5min酸性方法)。
1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47-十六氧杂四十九烷-49-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L34-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005411
利用4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(50mg，0.033摩尔，1.0当量)及m-PEG16-叠氮基(来自Broadpharm BP-23558)(50.8mg，0.067mmol，2当量)遵循通用程序2，获得1-(2-(((1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47-十六氧杂四十九烷-49-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2261.0196，Rt＝2.28min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005421
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(87.5mg，0.063摩尔，1.0当量)和1-叠氮基-1-脱氧-β-D-乳酸吡喃糖(22.99mg，0.063mmol，1当量)遵循通用程序2，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1671.6400，Rt＝1.95min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((1-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L46-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005431
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(35mg，0.020mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((1-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1866.6899，Rt＝2.28min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((6S,9S,12S)-9-异丙基-2,2-二甲基-4,7,10-三氧代-6-(丙-2-炔-1-基)-12-(3-脲基丙基)-3-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005441
向Boc-丙炔基-Gly-OH(40mg，0.188mmol，1当量)及HATU(71.3mg，0.188mmol，1当量)于DMF(0.5ml)中的混合物中添加DIPEA(65.5μl，0.375mmol，2当量)。将混合物在室温下搅拌30min。随后将1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(245mg，0.188mmol，1当量)于DMF(1ml)中的溶液添加至反应混合物中。将反应混合物搅拌在室温下30min。将粗产物用C18柱(100个卡匣，MeCN/水，具有0.1％甲酸，对于15CV为0-100％)分离，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((6S,9S,12S)-9-异丙基-2,2-二甲基-4,7,10-三氧代-6-(丙-2-炔-1-基)-12-(3-脲基丙基)-3-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1499.6000，Rt＝2.91min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-氨基戊-4-炔酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005451
在0℃冰水浴下，向4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(4-((6S,9S,12S)-9-异丙基-2,2-二甲基-4,7,10-三氧代-6-(丙-2-炔-1-基)-12-(3-脲基丙基)-3-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(56mg，0.037mmol)中添加TFA(25％于DCM中)2mL，随后将反应混合物升温至RT且搅拌1h。在高真空下浓缩粗产物。随后将混合物溶解于MeOH中，且通过C-18柱(50g卡匣，MeCN/水，具有0.1％甲酸，对于16CV为0-100％)纯化，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-氨基戊-4-炔酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝1399.5400，Rt＝2.17min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-氨基-3-(1-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓的合成
Figure BDA0003410186110005461
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-氨基戊-4-炔酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(44mg，0.031mmol，1.0当量)及1-叠氮基-1-脱氧-β-D-乳酸吡喃糖(69.2mg，0.188mmol，6eq)遵循通用程序2，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-氨基-3-(1-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2133.7800，Rt＝1.95min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((1-((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((2S,5S,8S)-8-((1-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-15-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-4,7,10-三氧代-2-(3-脲基丙基)-13-氧杂-3,6,9-三氮杂十五酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L47-P1)的合成
Figure BDA0003410186110005471
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-氨基-3-(1-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((1-((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)苯甲基)-4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(19mg，0.009mmol，1.0当量)遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(((1-((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-4-((2S,5S,8S)-8-((1-((2R,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟基甲基)-5-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-15-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-4,7,10-三氧代-2-(3-脲基丙基)-13-氧杂-3,6,9-三氮杂十五酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2328.8301，Rt＝2.15min(5min酸性方法)。
1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓
Figure BDA0003410186110005481
将1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十五烷-75-酸(50mg，0.044mmol)、双(4-硝基苯基)碳酸酯(13mg，0.043mmol)及DIPEA(20μL，0.12mmol)于THF(2mL)中的混合物在室温下搅拌2h。通过向其吹入氮气将混合物浓缩。使所得固体残余物溶于DMF(1mL)中。添加1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(50mg，0.029mmol)及DIPEA(100μL，0.573mmol)。将混合物在室温下搅拌5min。用DMSO(2mL)稀释混合物，且通过RP-HPLC ISCO金色谱(MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化溶液。冻干后，获得1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓。HRMS:M+＝2671.2700，Rt＝2.88min(5min酸性方法)。
4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L42-P1)
Figure BDA0003410186110005501
利用1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)苯甲基)-4-(2-(2-氯-4-(6-(4-氟苯基)-4-(((R)-1-((4-甲氧基苯甲基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)-1-氧代丙-2-基)氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-甲基苯氧基)乙基)-1-甲基哌嗪-1-鎓遵循通用程序3，获得4-(2-(4-(4-((R)-1-羧基-2-(2-((2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)乙氧基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯-3-甲基苯氧基)乙基)-1-(2-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(L42-P1)。HRMS:M+＝2646.7700，Rt＝2.38min(5min酸性方法)。
以下化合物使用类似于上文所述的程序制备。
Figure BDA0003410186110005502
Figure BDA0003410186110005511
Figure BDA0003410186110005521
Figure BDA0003410186110005531
在下文描述用于制备L43-P1、L44-P1及L45-P1中的聚乙二醇的合成方法。
2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十四氧杂-3-氮杂七十八烷-78-酸的合成
Figure BDA0003410186110005532
向1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十五烷-75-酸(100mg，0.087mmol，1.0当量)及DIPEA(24.8mg，34μL，0.192mmol，2.2当量)于二氯甲烷(0.5mL)中的搅拌溶液中添加乙酸酐(8.9mg，8.25μL，1.0当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌1.5小时。在减压下移除溶剂。使所得残余物溶于DMSO(1mL)中且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后获得2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十四氧杂-3-氮杂七十八烷-78-酸(62.3mg，0.052mmol，产率60％)。LC/MS[M-H]-1187.3Rt＝0.75min.(2min酸性方法)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.86(s,1H),3.60(t,J＝6.4Hz,3H),3.50(d,J＝4.9Hz,91H),3.40(t,J＝5.9Hz,2H),3.18(q,J＝5.8Hz,2H),2.44(t,J＝6.4Hz,2H),1.80(s,3H)。
4-氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77-二十五氧杂-5-氮杂八十烷-80-酸的合成
Figure BDA0003410186110005541
向1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十五烷-75-酸(100mg，0.087mmol，1.0当量)及DIPEA(24.8mg，34μL，0.192mmol，2.2当量)于二氯甲烷(0.5mL)中的搅拌溶液中添加氯甲酸乙酯(9.5mg，8.34μL，1.0当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌1.5小时。在减压下移除溶剂。使所得残余物溶于DMSO(1mL)中且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后获得4-氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77-二十五氧杂-5-氮杂八十烷-80-酸(75mg，0.062mmol，产率71％)。LC/MS[M-H]-1217.3Rt＝0.81min.(2min酸性方法)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.03(s,1H),3.97(q,J＝7.1Hz,2H),3.60(t,J＝6.4Hz,2H),3.50(d,J＝5.0Hz,92H),3.40(t,J＝6.1Hz,2H),3.11(q,J＝5.9Hz,2H),2.45(q,J＝6.5Hz,2H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H,).
4-氧代-2,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77-二十五氧杂-5-氮杂八十烷-80-酸的合成
Figure BDA0003410186110005551
向1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十五烷-75-酸(100mg，0.087mmol，1.0当量)及DIPEA(24.8mg，34μL，0.192mmol，2.2当量)于二氯甲烷(0.5mL)中的搅拌溶液中添加甲氧基乙酰氯(11.36mg，9.57μL，1.2当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌1.5小时。在减压下移除溶剂。使所得残余物溶于DMSO(1mL)中且通过RP-HPLC ISCO金色谱(10-100％MeCN/H2O，0.1％TFA改性剂)纯化。冻干后获得4-氧代-2,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77-二十五氧杂-5-氮杂八十烷-80-酸(69mg，0.057mmol，产率65％)。LC/MS[M-H]-1217.4Rt＝0.75min.(2min酸性方法)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.68(s,1H),3.79(s,2H),3.60(t,J＝6.4Hz,2H),3.51(s,92H),3.43(t,J＝6.0Hz,2H),3.30(s,3H),3.26(q,J＝6.0Hz,2H),2.44(t,J＝6.4Hz,2H)。
实施例3.Mcl-1有效负载的合成及表征
使用此实施例中所述的示例性方法合成示例性有效负载。
C1的制备：
(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸
Figure BDA0003410186110005561
C1根据WO 2015/097123中的实施例30制备。
C2的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-[4-甲基-4-(3-磺基丙基)哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-羟基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110005562
步骤A：5-溴-4-氯-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶
将4.49g 5-溴-4-氯-6-碘-噻吩并[2,3-d]嘧啶(11.96mmol；根据WO 2015/097123获得，制剂1a)及4.31g(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)硼酸(17.94mmol)溶解于60mLTHF中，随后添加134mg Pd(Oac)2(0.60mmol)、508mg tBuXPhos(1.20mmol)、11.69g Cs2CO3(35.88mmol)及60mL水，且将混合物在N2气氛下在70℃下搅拌直至观察不到进一步转换。随后将其用水稀释，用2M HCl水溶液中和，且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。粗产物经由使用庚烷及EtOAc作为洗脱剂的快速色谱纯化，得到5-溴-4-氯-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.02(s,1H),7.64(dd,J＝7.9,2.1Hz,1H),7.47(dd,J＝11.0,8.5Hz,1H),7.36(m,1H),5.63(m,1H),3.81(m,1H),3.61(m,1H),1.94-1.78(m,3H),1.69-1.50(m,3H)。13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ:166.6,153.9,153.1,152.7,144.3,139.2,127.7,126.6,124.2,119.9,117.1,100.7,97.2,61.6,29.5,24.5,18.2.C17H13N2O2SBrClF的HRMS计算值:441.9554；实测值442.9624(M+H)。
步骤B：(2R)-2-[5-溴-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯
将3.09g 5-溴-4-氯-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶(6.97mmol)，3.28g(2R)-2-羟基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(8.02mmol；根据WO 2015/097123获得，制剂3bs)溶解于70mL叔丁醇中，随后添加6.82gCs2CO3(20.9mmol)且将混合物在N2气氛下在70℃下搅拌直至观察不到进一步转换。随后将其用水稀释，用2M HCl水溶液中和，且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。将粗产物经由使用庚烷及EtOAc作为洗脱剂的快速色谱纯化，得到呈非对映异构体的混合物的(2R)-2-[5-溴-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯。C40H36N4O7SBrF的HRMS计算值:814.1472；实测值815.1539(M+H)。
步骤C：(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯
将3.65g(2R)-2-[5-溴-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(4.47mmol)及2.12g 1-[2-[2-氯-3-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)苯氧基]乙基]-4-甲基-哌嗪(5.36mmol；根据WO 2015/097123获得，制剂5b)溶解于22mL二噁烷中，随后添加315mg PdCl2×AtaPhos(0.45mmol)、4.37g Cs2CO3(13.41mmol)及22mL水，且将混合物在N2气氛下在70℃下搅拌直至转化完成。随后将其用水稀释，用2M HCl水溶液中和，且用EtOAc萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。粗产物经由使用EtOAc及MeOH，随后使用DCM及MeOH作为洗脱剂的快速色谱纯化，得到呈两个非对映异构体对的混合物的(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯。C54H56N6O8SClF的HRMS计算值:1002.3553；实测值1003.3614及1003.3622(M+H)。
步骤D：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
将3.47g(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(3.46mmol)溶解于35mL二噁烷中，随后添加1.45gLiOH×H2O(34.6mmol)及35mL水。将混合物在室温下搅拌直至水解完成。随后将其用水稀释，用2M HCl水溶液酸化至pH 4，且用DCM萃取。经合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。阻转异构体经由使用25mM NH4HCO3水溶液及MeCN作为洗脱剂的制备型反相色谱纯化及分离。将稍后洗脱的阻转异构体对分离成(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸。C52H52N6O8SClF的HRMS计算值:974.3240；实测值975.3303(M+H)。
步骤E：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(4-甲氧基苯基)甲酯
将2.39g(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(2.45mmol)，1.13g DTBAD(4.91mmol)及1.29gPPh3(4.91mmol)溶解于49mL甲苯中，随后添加0.61mL PMB-OH(4.91mmol)且将反应混合物在50℃下搅拌直至转化完成。随后将混合物用DCM稀释，且随后在减压下浓缩，且随后经由使用庚烷及EtOAc作为洗脱剂的快速色谱纯化，得到呈非对映异构体的混合物的(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(4-甲氧基苯基)甲酯。C60H60N6O9SClF的HRMS计算值:1094.3815；实测值1095.3880(M+H)。
步骤F:(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-[4-甲基-4-(3-磺基丙基)哌嗪-4-鎓-1-基]乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-羟基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(C2)
将600mg(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟-3-四氢吡喃-2-基氧基-苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸(4-甲氧基苯基)甲酯(0.548mmol)溶解于11mLMeCN中，随后添加0.48mL氧硫杂环戊烷2,2-二氧化物(5.48mmol)，且将混合物在N2气氛下在60℃下搅拌直至转化完成。随后将其在减压下浓缩，溶解于8mL DCM中，随后添加2.2mLTFA，且在室温下搅拌混合物直至THP及PMB完全裂解。随后将其浓缩(移除加热浴)。将其溶解于10mL THF中，且在减压下在30℃浴中再次浓缩。将粗产物经由使用5mM NH4HCO3水溶液及MeCN作为洗脱剂的制备型反相色谱纯化，获得C2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:13.19(brs,1H),10.16(br s,1H),8.89(d,J＝5.2Hz,1H),8.58(s,1H),7.68(br s,1H),7.52(dd,J＝7.5,1.8Hz,1H),7.46(m,1H),7.33(d,J＝8.3Hz,1H),7.22-7.09(m,4H),7.06-7.00(m,2H),6.86(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),6.74(t,J＝7.4Hz,1H),6.66(m,1H),6.23(d,J＝6.7Hz,1H),5.46(dd,J＝9.8,3.3Hz,1H),5.27(d,J＝15.2Hz,1H),5.22(d,J＝15.2Hz,1H),4.23(m,2H),3.76(s,3H),3.46(m,2H),3.41-3.23(m,5H),2.97(s,3H),2.94-2.77(m,6H),2.48(m,1H),2.45(t,J＝7.0Hz,2H),2.00-1.90(m,2H),1.86(s,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:170.8,166.2,165.9,164.7,157.7,157.2,155.4,153.6,152.7,152.3,149.9,145.1,137.0,135.9,131.0,130.8,130.3,129.2,128.34,128.32,128.2,128.0,122.0,120.5,120.1,118.8,118.2,116.6,115.6,112.2,111.9,110.6,73.3,69.0,67.3,59.2,59.1,55.71,55.68,47.6,46.1,31.8,18.1,17.6.C50H50N6O10S2ClF的HRMS计算值:1012.2703；实测值1013.2775(M+H)。
C3的制备：
(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸
Figure BDA0003410186110005601
C3根据WO 2015/097123中的实施例744制备。
C4的制备：
(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸
Figure BDA0003410186110005611
步骤1：(2R)-2-[5-溴-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基]丙酸乙酯
向(2R)-3-[2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基]-2-羟基-丙酸乙酯(25g，74.2mmol)于THF中(38mL)的溶液中依次添加5-溴-6-(4-氟苯基)-4-碘-噻吩并[2,3-d]嘧啶(23g，67.5mmol)及碳酸铯(67g，203mmol)。将反应在回流下加热过夜，且蒸发挥发物。残余物用乙酸乙酯及水(分别为500及400mL)稀释，且过滤溶液。将有机层分离，用盐水洗涤，经硫酸镁干燥且在真空下浓缩。通过硅胶色谱(乙酸乙酯/石油醚的梯度)纯化残余物，得到呈浅橙色固体状的(2R)-2-[5-溴-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基]丙酸乙酯。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ8.83(d,1H),8.65(s,1H),7.75(m,2H),7.71(d,1H),7.48(d,1H),7.45(m,2H),7.25(t,1H),7.06(d,1H),6.95(t,1H),5.75(dd,1H),5.28(2*d,2H),4.18(q,2H),3.6/3.3(2*dd,2H),1.12(t,3H)。IR波长(cm-1):1749.
步骤2：(4-溴-2-氯-3-甲基-苯氧基)-三异丙基-硅烷
经1h向4-溴-2-氯-3-甲基-酚(100g，482mmol)于二氯甲烷(1.5L)中的溶液中逐滴添加咪唑(82g，1.2mol)及氯(三异丙基)硅烷(102mL，482mmol)。将反应物在室温下搅拌1h，且添加水(500mL)。有机层用盐水(200mL洗涤)，经硫酸镁干燥且浓缩。残余物未经进一步纯化即使用。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.48(s,1H),7.2(dd,1H),6.7(d,1H),1.3(m,3H),1.1(2s,18H)。
步骤3：叔丁基-[2-氯-3-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)苯氧基]-二甲基-硅烷
在-78℃下在氩气下经30min向(4-溴-2-氯-3-甲基-苯氧基)-三异丙基-硅烷(27.2g，71.9mmol)于THF中(350mL)的溶液中逐滴添加正丁基锂1.6M于THF(49.5mL，79.9mmol)中的溶液。将反应物在-78℃下搅拌2h，且经30min逐滴添加2-异丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环(16.1g，86.4mmol)于THF(50mL)中的溶液。在-78℃下搅拌2h后，通过缓慢添加水(20mL)将反应混合物淬灭，且温热至室温，用水(200mL)稀释，且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥且在真空下浓缩。残余物未经进一步纯化即使用。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ7.5(d,1H),6.82(d,1H),2.52(s,3H),1.32(m,3H),1.3(s,12H),1.08(s,18H)。
步骤4：2-氯-3-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)苯酚
在室温下向叔丁基-[2-氯-3-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)苯氧基]-二甲基-硅烷(25.4g，59.8mmol)于THF(750mL)中的溶液中逐滴添加四丁基氟化铵1M于THF(90mL，90mmol)中的溶液。将反应混合物搅拌2h，浓缩，用乙酸乙酯稀释，用水分配，且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥且在真空下浓缩。通过硅胶色谱(的梯度乙醇/二氯甲烷)纯化残余物，得到2-氯-3-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)苯酚。1H NMR(400MHz,dmso-d6):δ10.4(m,1H),7.4(d,1H),6.8(d,1H),2.5(s,3H),1.3(s,12H)。IR波长(cm-1):3580-3185,1591,857,827。
步骤5：(2R)-2-{[(5Sa)-5-(3-氯-4-羟基-2-甲基苯基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-{2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基}丙酸乙酯
向(2R)-2-[5-溴-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基]丙酸乙酯(43.8g，61.2mmol)及2-氯-3-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)苯酚(19.7g，73.5mmol)于THF/H2O 1/1(800mL)的混合物中的溶液中添加碳酸铯(40g，122mmol)。通过鼓泡氩气通过溶液20min将反应物脱气，且添加双(二-叔丁基(4-二甲基氨基苯基)膦)二氯钯(II)(4.35g，6.1mmol)。将反应混合物在氩气下在80℃下加热过夜。将反应物用水稀释，用乙酸乙酯分配，且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥且在真空下浓缩。通过硅胶色谱(甲醇/二氯甲烷的梯度)纯化残余物，得到呈非对映异构体85/15(aS/aR或Sa/Ra)的混合物的(2R)-2-[5-(3-氯-4-羟基-2-甲基-苯基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基]丙酸乙酯。任选地纯的aS(或Sa)通过制备型SFC纯化获得。
步骤6：4-(2-{2-氯-4-[4-{[(2R)-3-{2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基}-1-乙氧基-1-氧代丙-2-基]氧基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-3-甲基苯氧基}乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下在氩气下向三苯膦(2.66g，10mmol)于THF中的溶液中添加偶氮二甲酸二异丙酯(2.33g，10mmol)。搅拌15min后，添加4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2.33g，10mmol)于THF(8mL)中的溶液。将反应物在室温下搅拌1h，随后逐滴添加(2R)-2-[(5Sa)-5-(3-氯-4-羟基-2-甲基-苯基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基]丙酸(3.57g，5mmol)于THF(8mL)中的溶液。将反应物在室温下搅拌96h且浓缩。通过硅胶色谱(甲醇(含有7M氨)/二氯甲烷的梯度)纯化残余物，得到4-(2-{2-氯-4-[4-{[(2R)-3-{2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基}-1-乙氧基-1-氧代丙-2-基]氧基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-3-甲基苯氧基}乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.95(d,1H),8.58(s,1H),8.32(d,2H),7.58(d,1H),7.41(dd,2H),7.32(d,1H),7.29(dd,2H),7.22(t,2H),7.21(d,1H),7.19(t,1H),7.05(d,1H),6.75(t,1H),6.31(dd,1H),5.53(dd,1H),5.29(dd,2H),4.2(m,2H),4.05(q,2H),3.97(m,4H),3.3(m,2H),3.2(t,4H),3.19/2.59(m,2H),2.72(t,2H),2.4(t,4H),1.87(s,3H),1.37(s,9H),1.18(t,6H),1.05(t,3H)。13C NMR(125MHz,CDCl3):δ158,152,131,131,130,130,128,127,120.5,116,116,112,110,73,68.5,67,62,61,56,52,43,32,32,28,17,16,14。
步骤7：4-(2-{2-氯-4-[4-{[(2R)-3-{2-[(2-{4-[(二乙氧基磷酰基)甲基]苯基}嘧啶-4-基)甲氧基]苯基}-1-乙氧基-1-氧代丙-2-基]氧基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-3-甲基苯氧基}乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向4-(2-{2-氯-4-[4-{[(2R)-3-{2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基}-1-乙氧基-1-氧代丙-2-基]氧基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-3-甲基苯氧基}乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(337mg，0.367mmol)及[4-(二乙氧基磷酰基甲基)苯基]硼酸(200mg，0.735mmol)于二噁烷(2.5mL)中的溶液中添加水(2.5mL)及碳酸铯(241mg，0.735mmol)。通过鼓泡氩气通过溶液30min将反应混合物脱气，添加双(三苯膦)钯(II)二氯化物(2.5mg，3.6μmol)，且在90℃下在密封容器中通过微波辐射将反应混合物加热3h。将反应物用乙酸乙酯及水稀释。将水层用乙酸乙酯萃取，且合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥且在真空下浓缩。通过硅胶色谱(甲醇/二氯甲烷的梯度)纯化残余物，得到4-(2-{2-氯-4-[4-{[(2R)-3-{2-[(2-{4-[(二乙氧基磷酰基)甲基]苯基}嘧啶-4-基)甲氧基]苯基}-1-乙氧基-1-氧代丙-2-基]氧基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-3-甲基苯氧基}乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。1H NMR(500MHz,dmso-d6):δ8.95(d,1H),8.58(s,1H),8.32(d,2H),7.58(d,1H),7.41(dd,2H),7.32(d,1H),7.29(dd,2H),7.22(t,2H),7.21(d,1H),7.19(t,1H),7.05(d,1H),6.75(t,1H),6.31(dd,1H),5.53(dd,1H),5.29(2*d,2H),4.2(m,2H),4.05(q,2H),3.97(m,4H),3.3(m,2H),3.2(t,4H),3.19/2.59(2*dd,2H),2.72(t,2H),2.4(t,4H),1.87(s,3H),1.37(s,9H),1.18(t,6H),1.05(t,3H)。13C NMR(125MHz,dmso-d6)δ158,152,131,131,130,130,128,127,120.5,116,116,112,110,73,68.5,67,62,61,56,52,43,32,32,28,17,16,14
步骤8：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-(2-哌嗪-1-基乙氧基)苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-[4-(膦酰基甲基)苯基]嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸的合成
向4-(2-{2-氯-4-[4-{[(2R)-3-{2-[(2-{4-[(二乙氧基磷酰基)甲基]苯基}嘧啶-4-基)甲氧基]苯基}-1-乙氧基-1-氧代丙-2-基]氧基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-5-基]-3-甲基苯氧基}乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(540mg，0.486mmol)于二氯甲烷(5mL)中的溶液中添加溴三甲基硅烷(186μL，1.46mmol)。将反应混合物加热至回流过夜。在室温下添加另一份溴三甲基硅烷(186μL，1.46mmol)，且将反应在回流下加热20h且浓缩至干。使残余物溶于甲醇中，在室温下搅拌3h且浓缩，得到棕色黏滞油状物，将其用二噁烷(4mL)及水(4mL)稀释。逐份添加氢氧化锂单水合物(100mg，24mmol)，且将反应混合物在室温下搅拌1h，在45℃下加热3h且浓缩。将残余物用水(5mL)稀释，通过逐滴添加2M HCl水溶液酸化至pH 2。将沉淀物过滤，用THF洗涤且通过C18反相prep-HPLC，通过将反应混合物直接沉积在Xbridge柱上且使用NH4HCO3方法纯化，得到C4。1H NMR(500MHz,dmso-d6):δ8.88(br d,1H),8.25(d,2H),7.75(t,1H),7.59(s,1H),7.52(d,1H),7.35(d,2H),7.23(dd,2H),7.18(d,1H),7.15(t,2H),7.11(t,1H),7.02(d,1H),6.82(d,1H),6.64(m,1H),5.51(d,1H),5.28/5.07(m,2H),3.82/3.55(2m,2H),3.35/2.55(br s,2H),2.81(d,2H),2.55(m,4H),2.4/2.27(2m,2H),2.21(m,4H),1.65(br s,3H)。13C NMR(125MHz,dmso-d6):δ131.5,130.2,129.7,127.4,127.2,120.3,115.9,115.3,111.9,110.3,75.1,69.2,67.3,56.4,49.9,42.4,40,38.9,18.1.31P NMR(200MHz,dmso-d6):δ15HR-ESI+:m/z[M+H]+＝925.2356/925.2346(测量值/理论值)
C5的制备：
(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(4-羟基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸
Figure BDA0003410186110005661
C5根据WO 2016/207216中的实施例3制备。
C6的制备：
(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-[2-({2-[2-(羟基甲基)苯基]嘧啶-4-基}甲氧基)苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110005662
C6根据WO 2015/097123中的实施例728制备。
C7的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-乙基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-丙-1-炔基-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110005663
步骤A：(2R)-2-(5-碘-6-丙-1-炔基-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯
将5.0g 4-氯-5-碘-6-丙-1-炔基-噻吩并[2,3-d]嘧啶(15.0mmol；根据WO 2015/097123获得，制剂2f)及6.10g(2R)-2-羟基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(15.0mmol；根据WO 2015/097123获得，制剂3bs)溶解于150mL叔丁醇中，随后添加14.7g Cs2CO3(45.0mmol)且将混合物在N2气氛下在50℃下搅拌直至观察不到进一步转换。随后添加水及盐水且用EtOAc萃取混合物。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。将粗产物经由使用庚烷及EtOAc作为洗脱剂的快速色谱纯化，得到(2R)-2-(5-碘-6-丙-1-炔基-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.89(d,J＝5.1Hz,1H),8.59(s,1H),7.62(d,J＝5.2Hz,1H),7.55(dd,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.51(dd,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.43(m,1H),7.26(m,1H),7.11(m,2H),7.02(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),6.94(td,J＝7.4,0.8Hz,1H),5.79(dd,J＝9.1,4.6Hz,1H),5.31(d,J＝14.9Hz,1H),5.26(d,J＝14.9Hz,1H),4.13(m,2H),3.76(s,3H),3.60(dd,J＝13.8,4.5Hz,1H),3.33(m,1H),2.21(s,3H),1.10(t,J＝7.1Hz,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:169.4,166.5,165.7,164.8,161.3,157.7,155.8,153.6,132.2,131.0,130.8,128.3,124.0,120.9,120.1,115.5,112.2,112.0,110.5,98.9,79.5,74.4,74.3,69.1,61.1,55.7,13.9,4.6.
步骤B：2-氯-3-乙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)苯酚
将33.7g[2-氯-3-乙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)苯氧基]-三异丙基-硅烷(76.9mmol；根据WO 2015/097123获得，制剂5e)溶解于600mL THF中且冷却至0℃，随后逐滴添加92.3mL TBAF(92.3mmol，1M溶液于THF中)且将混合物搅拌直至转化完成。随后将其用盐水稀释，用柠檬酸酸化，随后用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。将粗产物经由使用庚烷及EtOAc作为洗脱剂的快速色谱纯化，得到2-氯-3-乙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)苯酚。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.63(d,J＝8.2Hz,1H),6.86(d,J＝8.2Hz,1H),5.87(s,1H),3.09(q,J＝7.44Hz,2H),1.33(s,12H),1.15(t,J＝7.44Hz,3H)。
步骤C：(2R)-2-[5-(3-氯-2-乙基-4-羟基-苯基)-6-丙-1-炔基-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯
将353mg(2R)-2-(5-碘-6-丙-1-炔基-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(0.50mmol)及282mg 2-氯-3-乙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)苯酚(0.55mmol)溶解于2mL二噁烷中，随后添加35mg PdCl2×AtaPhos(0.05mmol)、326mg Cs2CO3(1.00mmol)及1mL水，且将混合物在N2气氛下在100℃下在微波反应器中搅拌20分钟。随后将其用盐水稀释，用1M HCl水溶液酸化至pH 5，且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。将粗产物经由使用庚烷及EtOAc作为洗脱剂的快速色谱纯化。随后将其经由使用5mM NH4HCO3水溶液及MeCN作为洗脱剂的制备型反相色谱进一步纯化，得到呈阻转异构体的2:1混合物的(2R)-2-[5-(3-氯-2-乙基-4-羟基-苯基)-6-丙-1-炔基-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.35/10.29(s,1H),8.93(d,J＝5.1Hz,1H),8.59/8.57(s,1H),7.63/7.60(d,J＝5.1Hz,1H),7.54-6.93(m,8H),6.84/6.74(t,J＝7.5Hz,1H),6.43/6.18(dd,J＝7.5,1.4Hz,1H),5.51/5.40(m,1H),5.30-5.16(m,2H),4.17-3.99(m,2H),3.76/3.75(s,3H),3.34-3.14(m,1H),2.93-2.35(m,3H),2.02/1.98(s,3H),1.08/1.04(t,J＝7.0Hz,3H),0.94/0.76(t,J＝7.5Hz,3H)。
步骤D：(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-乙基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-丙-1-炔基-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸，C7
将322mg(2R)-2-[5-(3-氯-2-乙基-4-羟基-苯基)-6-丙-1-炔基-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(0.44mmol)、190mg 2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙醇(1.32mmol)及346mg PPh3(1.32mmol)溶解于10mL无水甲苯中，随后添加304mg DTBAD(1.32mmol)且将混合物在N2气氛下在50℃下搅拌直至观察不到进一步转换。随后在减压下浓缩混合物，且经由使用庚烷、EtOAc及MeOH作为洗脱剂的快速色谱纯化残余物，随后经由使用5mM NH4HCO3水溶液及MeCN作为洗脱剂的制备型反相色谱进一步纯化，获得酯中间体。将其溶解于2mL二噁烷中，随后添加84mg LiOH×H2O(2.00mmol)及1mL水。将混合物在50℃下搅拌直至水解完成。随后将其用盐水稀释，用2MHCl水溶液中和，且用DCM萃取。经合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。限制构型异构物经由使用5mM NH4HCO3水溶液及MeCN作为洗脱剂的制备型反相色谱纯化及分离。将稍后洗脱的限制构型异构物分离为C7。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.88(d,J＝5.2Hz,1H),8.60(s,1H),7.76(d,J＝5.0Hz,1H),7.54(dd,J＝7.6,1.8Hz,1H),7.46(m,1H),7.26(d,J＝8.5Hz,1H),7.20-7.13(m,3H),7.04(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.78(t,J＝7.5Hz,1H),6.32(dd,J＝7.4,1.5Hz,1H),5.48(dd,J＝9.7,2.9Hz,1H),5.27(d,J＝15.0Hz,1H),5.19(d,J＝15.0Hz,1H),4.23(m,2H),3.76(s,3H),3.31(m,1H),2.75(m,2H),2.47(m,1H),2.64-2.36(m,10H),2.22(s,3H),2.01(s,3H),0.74(t,J＝7.5Hz,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:165.95,165.89,164.7,157.8,157.2,155.3,154.0,141.6,135.6,131.0,130.8,130.1,128.4,128.0,127.2,121.4,120.1,117.8,112.2,111.7,97.2,74.9,68.9,67.1,56.1,55.7,54.0,32.7,24.4,13.1,4.4.C45H45N6O6SCl的HRMS计算值:832.2810；实测值833.2878(M+H)。
C8的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(3-磺酸基氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110005701
将210mg(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(3-羟基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(0.24mmol；根据WO 2016/207216获得，制剂2)溶解于9.3mL吡啶中，随后添加0.38mL SO3×吡啶(2.36mmol)，且将混合物在70℃下搅拌直至转化完成。随后就混合物在减压下浓缩，且将残余物溶解于2mL二噁烷中，随后添加200mg KOH(3.56mmol)及1mL水。将混合物在70℃下搅拌直至Et酯的水解完成。随后将其用5M HCl水溶液中和，且经由使用25mM NH4HCO3水溶液及MeCN作为洗脱剂的制备型反相色谱(直接注射)纯化，得到C8。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.93(d,J＝5.1Hz,1H),8.63(s,1H),8.27(m,1H),8.13(m,1H),7.61(d,J＝5.1Hz,1H),7.43(t,J＝7.8Hz,1H),7.33(d,J＝7.8Hz,1H),7.32-7.27(m,3H),7.23-7.13(m,4H),7.05(d,J＝7.8Hz,1H),6.73(t,J＝7.5Hz,1H),6.31(dd,J＝7.5,1.3Hz,1H),5.51(dd,J＝9.8,3.5Hz,1H),5.34(d,J＝15.2Hz,1H),5.27(d,J＝15.2Hz,1H),4.24-4.08(m,2H),3.26(dd,J＝14.3,3.4Hz,1H),3.10-2.52(m,14H),1.82(s,3H)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:170.8,166.5,166.4,162.8,162.7,158.3,155.3,154.0,153.6,152.9,137.8,136.8,135.9,131.12,131.05,130.4,130.3,129.1,128.5,128.2,127.8,124.4,123.5,122.7,121.9,120.5,120.2,118.8,116.0,115.9,112.0,110.5,73.5,69.1,67.2,55.4,43.1,31.8,17.5.C46H42N6O9S2ClF的HRMS计算值:940.2127；实测值941.2191(M+H)。
C9的制备：
2R)-2-{[5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(3-磺酸基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸
Figure BDA0003410186110005711
将750mg(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[(2-甲基磺酰基嘧啶-4-基)甲氧基]苯基]丙酸乙酯(0.89mmol；根据WO 2015/097123获得，制剂10a)溶解于9mL THF中，随后添加726mg[3-(2,2-二甲基丙氧基磺酰基)苯基]硼酸(2.67mmol)、62mg Pd(PPh3)4(0.05mmol)及509mg噻吩-2-羰氧基铜(2.67mmol)，且将混合物在75℃下搅拌直至转化完成。随后将其在减压下浓缩，且经由使用庚烷、EtOAc及0.7M NH3溶液于MeOH中作为洗脱剂的快速色谱纯化。随后将其溶解于20mL 1,1,1,3,3,3-六氟丙-2-醇中，添加4.5mL TFA且将混合物在80℃下搅拌直至磺酸酯的水解完成。将混合物在减压下浓缩，且随后溶解于5mL二噁烷中，随后添加210mg LiOH×H2O(5.00mmol)及2mL水。将混合物在室温下搅拌直至水解完成。随后将其用盐水稀释，用2M HCl水溶液中和，且用DCM萃取。经合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。所形成阻转异构体经由使用25mM NH4HCO3水溶液及MeCN作为洗脱剂的制备型反相色谱纯化及分离，随后使用0.1％TFA水溶液及MeCN作为洗脱剂进一步纯化，得到C9。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:13.19(br s,1H),9.48(br s,1H),8.94(d,J＝5.1Hz,1H),8.74(t,J＝1.6Hz,1H),8.65(s,1H),8.37(dt,J＝7.8,2.9Hz,1H),7.78(dt,J＝7.6,1.5Hz,1H),7.60(d,J＝5.1Hz,1H),7.51(t,J＝7.7Hz,1H),7.29(m,3H),7.22-7.14(m,3H),7.13-7.05(m,2H),6.74(t,J＝7.5Hz,1H),6.38(d,J＝7.6Hz,1H),5.53(dd,J＝9.6,3.6Hz,1H),5.37(d,J＝15.3Hz,1H),5.31(d,J＝15.3Hz,1H),4.2(m,2H),3.50-2.88(m,11H),2.76(s,3H),2.61(dd,J＝14.2,9.7Hz,1H),1.79(s,3H)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:170.8,166.5,163.0,162.7,161.1,158.4,155.4,153.3,152.9,148.6,136.6,136.0,131.1,130.1,129.0,128.5,128.3,128.1,127.9,125.3,124.4,121.9,120.5,118.8,116.2,116.0,115.9,112.1,110.5,73.2,69.1,66.5,55.0,51.7,49.7,42.1,31.5,17.5.C46H42N6O8S2ClF的HRMS计算值:924.2178；实测值925.2274(M+H)。
C10的制备：
(2R)-2-[(5Sa)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-[4-氟-3-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110005721
将250mg(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-碘-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(0.27mmol；根据WO 2015/097123获得，制剂30)及79mg[4-氟-3-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基]硼酸(0.40mmol)溶解于1mL THF中，随后添加3.0mg PdOAc2(0.013mmol)、5.7mgtBuXPhos(0.013mmol)、174mg Cs2CO3(0.53mmol)及0.27mL水，且将混合物在70℃下在N2气氛下搅拌2小时。随后将其用盐水稀释，且用2-MeTHF萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。粗酯产物经由使用庚烷、EtOAc及0.7M NH3溶液于MeOH中作为洗脱剂的快速色谱纯化。随后将其溶解于5.3mL二噁烷中，随后64mg LiOH×H2O(1.52mmol)及1.3mL水添加。将混合物在室温下搅拌直至水解完成。随后将其用盐水稀释，用2M HCl水溶液中和，且用DCM萃取。将经合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。阻转异构体经由使用25mM NH4HCO3水溶液及MeCN作为洗脱剂的制备型反相色谱纯化及分离。将稍后洗脱的阻转异构体分离为C10。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.91(d,J＝5.2Hz,1H),8.57(s,1H),7.82(d,J＝5.1Hz,1H),7.53(dd,J＝7.5,1.7Hz,1H),7.45(m,2H),7.27(dd,J＝11.0,8.6Hz,1H),7.22(d,J＝8.6Hz,1H),7.16-7.09(m,3H),7.03(t,J＝7.5Hz,1H),6.98(d,J＝8.3Hz,1H),6.92(m,1H),6.69(t,J＝7.4Hz,1H),6.16(d,J＝7.2Hz,1H),5.47(dd,J＝10.3,2.6Hz,1H),5.25(d,J＝15.1Hz,1H),5.19(d,J＝15.1Hz,1H),4.75-4.53(m,2H),4.21(t,J＝5.5Hz,2H),3.75(s,3H),3.41(d,J＝12.0Hz,1H),2.77-2.30(m,12H),2.24(s,3H),1.81(s,3H)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:171.3,166.2,166.0,164.6,163.5,157.9,157.2,155.3,153.7,153.1,152.1,150.5,144.6,135.8,131.0,.130.8,130.7,129.6,129.1,128.4,128.1,127.8,125.4,123.7,122.0,120.4,120.1,118.8,117.0,116.7,115.6,112.2,111.7,110.5,74.8,68.9,67.2,65.6,56.0,55.7,53.8,52.0,44.6,32.7,17.5.C49H45N6O7SClF4的HRMS计算值:972.2695；实测值973.2761(M+H)。
C11的制备：
(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(4-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸
Figure BDA0003410186110005741
C11根据WO 2015/097123中实施例107的制备。
C12的制备
(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-基]甲氧基}苯基)丙酸
Figure BDA0003410186110005742
C12根据WO 2015/097123中的实施例77制备。
C13的制备
(2R)-2-[(5Sa)-6-(3-氨基-4,5-二氟-苯基)-5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸
Figure BDA0003410186110005751
将250mg(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-碘-噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]苯基]丙酸乙酯(0.27mmol；根据WO 2015/097123获得，制剂30)及102mg 2,3-二氟-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)苯胺(0.41mmol)溶解于1mL THF中，随后添加3.0mgPdOAc2(0.013mmol)，5.7mg tBuXPhos(0.013mmol)，174mg Cs2CO3(0.53mmol)及0.27mL水，且将混合物在N2气氛下在70℃下搅拌2小时。随后将其用盐水稀释，且用2-MeTHF萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。粗酯产物经由使用庚烷、EtOAc及0.7M NH3溶液于MeOH中作为洗脱剂的快速色谱纯化。随后将其溶解于0.7mL二噁烷中，随后添加60mg LiOH×H2O(1.43mmol)及0.18mL水。将混合物在室温下搅拌直至水解完成。随后将其用盐水稀释，用2M HCl水溶液中和，且用DCM萃取。将经合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。限制构型异构物经由使用25mM NH4HCO3水溶液及MeCN作为洗脱剂的制备型反相色谱纯化及分离。将稍后洗脱的阻转异构体分离为C13。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.89(d,J＝5.2Hz,1H),8.56(s,1H),7.76(d,J＝5.0Hz,1H),7.53(dd,J＝7.6,1.8Hz,1H),7.45(m,1H),7.36(d,J＝8.6Hz,1H),7.20(d,J＝8.7Hz,1H),7.13(m,2H),7.03(td,J＝7.5,1.0Hz,1H),6.99(d,J＝8.1Hz,1H),6.71(t,J＝7.3Hz,1H),6.62(m,1H),6.21(d,J＝7.5,1.3Hz,1H),6.12(m,1H),5.73(s,2H),5.46(dd,J＝10.1,3.1Hz,1H),5.25(d,J＝15.1Hz,1H),5.19(d,J＝15.2Hz,1H),4.22(m,2H),3.75(s,3H),3.35(m,1H),2.73(m,2H),2.65-2.35(m,9H),2.22(s,3H),1.85(s,3H)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:171.1,166.0,165.3,163.3,157.8,157.2,155.3,153.7,152.9,149.0,138.9,137.1,135.8,131.0,130.8,130.4,128.7,128.4,128.1,127.8,125.2,122.0,120.4,120.1,118.9,115.6,112.2,111.9,110.6,103.2,74.5,68.9,67.1,56.0,55.7,53.9,52.1,44.7,32.6,17.6.C47H44N7O6SClF2的HRMS计算值:907.2730；实测值908.2803(M+H)。
C14的制备
(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(3-羟基-2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸
Figure BDA0003410186110005761
将210mg(2R)-2-[5-[3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基-3-[2-[(2-氯嘧啶-4-基)甲氧基]苯基]丙酸乙酯(0.25mmol，WO2016/207216制剂1)及84mg(3-羟基-2-甲氧基-苯基)硼酸(0.50mmol)溶解于3.8mL 1,4-二噁烷中，随后添加18mg Pd(PPh3)2Cl2(0.025mmol)、240mg Cs2CO3(0.75mmol)及3.8mL水，且将混合物在N2气氛下在70℃下搅拌直至转化完成。随后将其用水稀释，用2M HCl水溶液中和，且用DCM萃取。将经合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，且在减压下浓缩过滤物。经由使用庚烷、EtOAc及含0.7M NH3溶液的MeOH作为洗脱剂的快速色谱纯化粗酯，获得非对映异构体的混合物。将其溶解于2mL二噁烷中，随后添加245mg LiOH×H2O(5.85mmol)及1mL水。将混合物在室温下搅拌直至水解完成。随后将其用2M HCl水溶液中和，且直接注入使用0.1％TFA水溶液及MeCN作为洗脱剂的prep-RP-HPLC上。将稍后洗脱的非对映异构体收集为C14。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.53(brs,1H),8.91(d,1H),8.56(s,1H),7.79(d,1H),7.42(d,1H),7.26(m,2H),7.19(d,1H),7.18(m,2H),7.12(t,1H),7.06(dd,1H),6.98(m,1H),6.98(m,1H),6.97(d,1H),6.68(t,1H),6.16(d,1H),5.47(m,1H),5.27/5.20(d+d,2H),4.26/4.19(m+m,2H),3.76(s,3H),3.38/2.42(dd+dd,2H),2.74(m,2H),2.55(br.,4H),2.47(br.,4H),2.25(s,3H),1.80(s,3H)。C47H44N6O7SClF的HRMS计算值:890.2665；实测值891.2721(M+H)。
P15的制备
(11R,20R)-23,26-二氯-3-(4-氟苯基)-14-[[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基]-24,25-二甲基-20-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-10,18,21-三氧杂-4-硫杂-6,8-二氮杂五环[20.2.2.12,5.113,17.09,28]二十八烷-1(25),2,5(28),6,8,13,15,17(27),22(26),23-十烯-11-甲酸
Figure BDA0003410186110005771
P15根据WO 2019/035914中的实施例116制备。
P16的制备
(11R,20R)-23,26-二氯-14-[[2-[4-[[(2S)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基甲基]-4-氟-环己基]嘧啶-4-基]甲氧基]-3-(4-氟苯基)-24,25-二甲基-20-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-10,18,21-三氧杂-4-硫杂-6,8-二氮杂五环[20.2.2.12,5.113,17.09,28]二十八烷-1(24),2,5(28),6,8,13,15,17(27),22,25-十烯-11-甲酸
Figure BDA0003410186110005781
P16根据WO 2019/035911中的实施例28制备。
P17的制备
(11R,20R)-23,26-二氯-14-[[2-[4-[[(2S)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基]环己基]嘧啶-4-基]甲氧基]-3-(4-氟苯基)-24,25-二甲基-20-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-10,18,21-三氧杂-4-硫杂-6,8-二氮杂五环[20.2.2.12,5.113,17.09,28]二十八烷-1(24),2,5(28),6,8,13,15,17(27),22,25-十烯-11-甲酸
Figure BDA0003410186110005782
P17根据WO 2019/035911中的实施例44制备。
实施例4：抗CD74 ADC的缀合及分析性表征
示例性抗体-药物缀合物(ADC)使用下文所述的示例性方法合成。用于制备示例性ADC的抗体抗CD74(米拉珠单抗)由缩写Ab M、CD74或CD74_CysmAb(表6)定义。术语〝CysmAb”是指在抗体重链中用于经由马来酰亚胺基将接头-有效负载缀合至抗体的半胱氨酸突变。本文所用的所有全长的缀合CD74 Ab含有经工程化的半胱氨酸突变E152C及S375C(根据EU系统编号)。
表6.用于合成示例性ADC的抗体
Figure BDA0003410186110005791
缀合
方法C1：通过在Biorad适当大小的一次性柱中混合，抗体以10mg Ab比1ml树脂的比率于PBS中结合在rmp蛋白A树脂(GE Healthcare)上30分钟。为了使反应性半胱氨酸去封闭，将半胱氨酸盐酸盐单水合物添加至20mM的最终浓度。将混合物在室温下搅动30分钟，随后在真空歧管上用50个柱体积的PBS将树脂洗涤5次。随后将树脂重悬浮于含有250nMCuCl2的相等体积的PBS中，且孵育1小时30分钟。在真空歧管上将再氧化抗体用50个柱体积的PBS洗涤5次，且重悬浮于相等体积的PBS中。向混合物中添加10倍摩尔过量的20mM接头-有效负载溶液及等体积的DMSO。在室温下孵育反应物2小时。为了监测缀合，将20μl树脂浆料移除，离心，移除上清液，且随后用40μl抗体洗脱缓冲液(Thermo Fisher Scientific)洗脱。通过反相色谱法，使用Agilent PLRP-S 4000A 5um，4.6×50mm柱(缓冲液A为水，0.1％TFA，缓冲液B乙腈，0.1％TFA，柱保持在80℃，流速1.5ml/min)分析上清液。通过在真空歧管上用50个柱体积PBS将树脂洗涤5次来消除过量接头-有效负载之后，将ADC用抗体洗脱缓冲液自蛋白A洗脱出，且用1/10体积的1M Tris pH 9.0中和。所有示例性ADC通过在PBS 1×pH7.4(Sigma Life Science,P3813,10PAK)中透析进行缓冲液交换，使用Vivaspin 20，50KD，PES(Sartorius Stedim,VS2031)进行浓缩，经由0.2μm无菌PES过滤器，25mm(Whatmann,G896-2502)进行无菌过滤，且在4℃下储存。在抗体的5mg的范围内进行缀合。所有示例性ADC由分析型尺寸排阻色谱Superdex 200Increase 5/150GL(GE Healthcare,28990945)表征以测定单体百分比及LC-MS以用于DAR测定(表16)。
方法C2.在适当大小的可一次性柱中混合的情况下，以PBS中10Ab与1ml树脂的比率将抗体与RMP蛋白A树脂(GE)一起孵育15分钟。将半胱氨酸HCl添加至最终浓度为20mM，且在搅动下在室温下孵育30min以使得反应性半胱氨酸去封闭。在真空歧管上用50个柱体积的PBS快速洗涤树脂。随后将树脂重悬浮于含有250nM CuCl2的相等体积的PBS中。通过获取时间点监测抗体链间二硫键的再形成。在各时间点，移除25μL树脂浆液，添加1μL 20mM MC-valcit-MMAE，且将管轻弹数次。将树脂短暂离心，移除上清液，且随后用50μL抗体洗脱缓冲液(Thermo)洗脱。将树脂成粒，且通过反相色谱法，使用Agilent PLRP-S 4000A 5um，4.6×50mm柱(缓冲液A为水，0.1％TFA，缓冲液B乙腈，0.1％TFA，柱保持在80℃，流速1.5ml/min)分析上清液。一旦确定抗体已重新形成其链间二硫键，用10个柱体积的PBS洗涤树脂，且将树脂重悬浮于相等体积的PBS中，且添加8-12当量的含接头-有效负载的DMSO，其中最终浓度为10％DMSO于反应物中，且随后在室温下孵育3小时。随后用50个柱体积的PBS洗涤树脂。将ADC用抗体洗脱缓冲液自蛋白A树脂洗脱出。随后对ADC进行缓冲液交换成PBS或其他适合的缓冲液，且如果需要移除聚集体，则进行用以移除聚集体的制备型尺寸排阻色谱(S200Increase；GE)。进行以下分析-分析型SEC以测定单体百分比，质谱测定DAR，LAL测试测定内毒素负载，且通过A280，利用抗体的消光系数及分子测量定蛋白质浓度。
方法C3(药物物质中间体(DSi)制备)。将200mg的10mg/ml的抗体(1.36μM)与20ml沉降RMP蛋白A树脂(GE Lifesciences,17513803)一起孵育且搅动15分钟。将半胱氨酸HCl单水合物添加至最终浓度为20mM，且在搅动下在室温下孵育30min以使得反应性半胱氨酸去封闭。在真空歧管上用50个柱体积的PBS快速洗涤树脂。随后将树脂重悬浮于含有250nMCuCl2的相等体积的PBS中。通过获取时间点监测抗体链间二硫键的再形成。在各时间点，移除25μL树脂浆液，添加1μL 20mM MC-valcit-MMAE，且将管轻弹数次。将树脂短暂离心，移除上清液，且随后用50μL抗体洗脱缓冲液(Thermo)洗脱。将树脂成粒，且通过反相色谱法，使用Agilent PLRP-S 4000A 5um，4.6×50mm柱(缓冲液A为水，0.1％TFA，缓冲液B乙腈，0.1％TFA，柱保持在80℃，流速1.5ml/min；梯度0分钟-30％B，5分钟-45％B，6.5min-100％B，8分钟-100％B，10分钟-30％)分析上清液。添加CuCl2之后60分钟时，通过在真空歧管上用50个柱体积的PBS洗涤来移除，且随后添加20ml PBS以重悬浮且通过重力排出。抗体用100ml抗体洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱，且随后进行缓冲液交换成1×PBS pH7.2。随后使用离心浓缩器，使用Amicon Ultra-15，50KDa，再生纤维素(Millipore,UFC0905024)将材料浓缩成6.6mg/ml，等分成5mg等分试样，且在液氮中速冻，且在-80℃下储存直至使用。
(CD74-L5-P1)：将120mg抗体(0.816微摩尔，1.0当量)与12ml沉降RMP蛋白A树脂(GE Lifesciences,17513803)一起孵育且搅动15分钟。将半胱氨酸HCl单水合物添加至最终浓度为20mM，且在搅动下在室温下孵育30min以使得反应性半胱氨酸去封闭。在真空歧管上用50个柱体积的PBS快速洗涤树脂。随后将树脂重悬浮于含有250nM CuCl2的相等体积的PBS中。通过获取时间点监测抗体链间二硫键的再形成。在各时间点，移除25μL树脂浆液，添加1μL 20mM MC-valcit-MMAE，且将管轻弹数次。将树脂短暂离心，移除上清液，且随后用50μL抗体洗脱缓冲液(Thermo,24001)洗脱。将树脂成粒，且通过反相色谱法，使用AgilentPLRP-S 4000A 5um，4.6×50mm柱(缓冲液A为水，0.1％TFA，缓冲液B乙腈，0.1％TFA，柱保持在80℃，流速1.5ml/min；梯度0分钟-30％B，5分钟-45％B，6.5min-100％B，8分钟-100％B，10分钟-30％)分析上清液。添加CuCl2之后60分钟时，通过在真空歧管上用50个柱体积的PBS洗涤来移除，且随后添加12ml PBS以重悬浮。向树脂及抗体的此浆料中添加L5-P1(365μl 20mM溶液于DMSO中，6.528微摩尔，8当量)。随后将所得混合物在环境温度下孵育3小时。随后用50个柱体积的PBS洗涤树脂。将ADC用抗体洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)自树脂洗脱出。随后通过透析将ADC进行缓冲液交换成1×PBS(20×PBS,TeknovaP0191)，且进行用以移除聚集体的Dulbecco'sPBS pH 7.2(Hyclone SH30028.03)中洗脱的制备型尺寸排阻色谱利用HiLoad 26/600Superdex 200pg(GE Healthcare,28989336)进行。随后将材料使用离心浓缩器，使用超滤器Ultra-15，50KDa，再生纤维素(Millipore,UFC0905024)浓缩成8mg/ml，且经由0.22μm无菌PVDF过滤器，25mm(Millapore,SLGV013SL)无菌过滤，且在4℃下储存。最终产量为74.1mg(0.504μmol)。进行以下分析：分析型尺寸排阻色谱(SEC)测定单体百分比，质谱(MS)测定DAR，LAL测试测定内毒素负载，且通过A280，利用抗体的消光系数及分子测量定蛋白质浓度。指示重链的主要质量的HRMS数据(蛋白质方法)为54294da，得到DAR为4.4，如通过比较DAR1、DAR2及DAR3种类的峰的MS强度所计算。如通过比较210及280nm下的高分子量的峰吸收率的面积与单体ADC的峰吸收率的面积所测定，SEC指示</＝1％聚集。
(CD74-L7-P1)：将20mg抗体(0.136微摩尔，1.0当量)与2ml沉降RMP蛋白A树脂(GELifesciences,17513803)一起孵育且搅动15分钟。将半胱氨酸HCl单水合物添加至最终浓度为20mM，且在搅动下在室温下孵育30min以使得反应性半胱氨酸去封闭。在真空歧管上用50个柱体积的PBS快速洗涤树脂。随后将树脂重悬浮于含有250nM CuCl2的相等体积的PBS中。通过获取时间点监测抗体链间二硫键的再形成。在各时间点，移除25μL树脂浆液，添加1μL 20mM MC-valcit-MMAE，且将管轻弹数次。将树脂短暂离心，移除上清液，且随后用50μL抗体洗脱缓冲液(Thermo)洗脱。将树脂成粒，且通过反相色谱法，使用Agilent PLRP-S4000A 5um，4.6×50mm柱(缓冲液A为水，0.1％TFA，缓冲液B乙腈，0.1％TFA，柱保持在80℃，流速1.5ml/min；梯度0分钟-30％B，5分钟-45％B，6.5min-100％B，8分钟-100％B，10分钟-30％)分析上清液。添加CuCl2之后60分钟时，通过在真空歧管上用50个柱体积的PBS洗涤来移除，且随后添加2ml PBS以重悬浮。向树脂及抗体的此浆料中添加L7-P1(55μl 20mM溶液于DMSO中，1.088微摩尔，8当量)。随后将所得混合物在环境温度下孵育3小时。随后用50个柱体积的PBS洗涤树脂。将ADC用抗体洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)自树脂洗脱出。随后通过透析将ADC进行缓冲液交换成1×PBS(20×PBS,TeknovaP0191)，且进行Dulbecco's PBS pH 7.2(Hyclone SH30028.03)中洗脱的制备型尺寸排阻色谱以移除聚集体，利用HiLoad 16/600Superdex 200pg(GE Healthcare,28989335)进行。随后将材料使用离心浓缩器，使用超滤器Ultra-15，50KDa，再生纤维素(Millipore,UFC0905024)浓缩成4.5mg/ml，且经由0.22μm无菌PVDF过滤器，25mm(Millapore,SLGV013SL)无菌过滤，且在4℃下储存。最终产率为1.6mg(0.00681μmol)。进行以下分析：分析型尺寸排阻色谱(SEC)测定单体百分比，质谱(MS)测定DAR，LAL测试测定内毒素负载，且通过A280，利用抗体的消光系数及分子测量定蛋白质浓度。指示重链的主要质量的HRMS数据(蛋白质方法)为54562da，得到DAR为3.8，如通过比较DAR1、DAR2及DAR3种类的峰的MS强度所计算。如通过比较210及280nm下的高分子量的峰吸收率的面积与单体ADC的峰吸收率的面积所测定，SEC指示1.8％聚集。
分析方法
液相色谱-质谱法(LC/MS)I
通用方法：示例性ADC的药物与抗体比率(DAR)通过液相色谱-质谱法(LC/MS)，根据以下方法(即，LC-I、LCII及LC-III)中的一种测定。对于所有LC方法，流动相A为纯化的MS级水(Biosolve,Dieuze,France,00232141B1BS)，流动相B为MS级乙腈(Biosolve,Dieuze,France,0001204101BS)，且流动相D为补充有1％甲酸(FA)的纯化的MS级水(Honeywell/Fluka,Bucharest,Romania,56302)。将流动相D固定在10％以维持0.1％FA流动相组成且将柱温度设定为80℃。通用MS方法针对所合成的所有ADC进行优化，除了一种ADC，其中原始MS按顺序使用以测定平均DAR(参见MS-I及下表16)。
通用方法(1)：示例性ADC的药物与抗体比率(DAR)通过液相色谱-质谱法(LC/MS)，根据以下方法进行测定。对于所有LC方法，流动相A为纯化的MS级水(Honeywell,LC015-1)，流动相B为MS级80％异丙醇(Honeywell LC323-1):20％乙腈(Honeywell,LC015-1)，LC323-1)，补充有1％甲酸(FA)(Thermo Scientific,85178)。柱温度设定为80℃。针对所有ADC合成使通用MS方法优化。用于分析的柱为Agilent PLRP-S 4000A；2.1×150mm，8um(Agilent,PL1912-3803)。所用流速为0.3ml/min。所用梯度为0-0.75分钟95％A，0.76-1.9分钟75％A，1.91-11.0分钟50％A，11.01-11.50 10％A，11.51-13.50分钟95％A，13.51-18分钟95％Aona Acquitty Bio H级Quarernary UPLC(Waters)。MS系统为Xevo G2-XS QToF ESI质谱仪(Waters)，且数据在1.5-11分钟采集及质量在15000-80000道尔顿之间进行分析。通过对未缀合及缀合的给定种类(mAb或结合片段)的集成式MS(总离子电流)或UV(280nm)峰面积进行求和，由将各面积乘以所附接药物的数目加权，自去卷积光谱或UV谱图测定DAR。将求和、加权的面积除以总面积总和，且结果产生全ADC的最终平均DAR值。
LC-I：将ADC负载于MassPREP Micro脱盐柱(2.1×5.0mm，Waters,Saint-Quentin-en-Yvelines,France,186004032)上。对于完整质量分析，在5％流动相B下以0.5ml/min的流率使脱盐步骤进行0.5分钟。在5％B 0.51分钟至90％B 2.0分钟的梯度下以0.2ml/min的流率进行洗脱步骤。在5％B至90％B下以0.5ml/min的流率将两个洗涤步骤设定为2.1min至2.7min及2.8min至3.4min。最后，在5％B 3.5min(0.5ml/min)下将调节步骤使用0.5min。
对于在还原条件下的ADC分析，在5％B下以0.2ml/min的流速进行脱盐步骤0.5min。随后，以10％B下0.51min至80％B下7.61min的梯度以0.2ml/min的流率开始洗脱步骤。两个洗涤步骤设定为8.1min至8.6min及8.7min至9.2min，5％B至90％B(0.5ml/min)。最终，在5％B 9.3min下以0.5ml/min的流率进行调节步骤0.5min。
LC-II：ADC负载于MabPac RP柱(2.1×100mm，4μm，Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL,088647)上。对于完整与还原条件中的分析，在20％B下以0.4mL/min的流率进行脱盐步骤1.4min。随后，洗脱步骤以20％B下1.5min至70％B下11.5min的梯度以0.3ml/min的流率进行。洗涤步骤设定为在90％B下11.75min至13.75min，流率为0.5ml/min。最后，在20％B下14.0min以0.4ml/min的流率使用调节步骤1.0min。
LC-III：ADC负载于Bioresolve RP mAb Polyphenyl，450A，2.7μm，2.1×150mm(Waters,Saint-Quentin-en-Yvelines,France,186008946)上。对于完整与还原条件中的分析，在20％B下以0.4mL/min的流率进行脱盐步骤1.4min。洗脱步骤以20％B下1.5min至70％B下11.5min的梯度以0.3ml/min的流率进行。洗涤步骤设定为在90％B下11.75min至13.75min，流率为0.5ml/min。最后，在20％B下14.0min以0.4ml/min的流率使用调节步骤1.0min。
LC-IV：ADC负载于Bioresolve RP mAb Polyphenyl，450A，2.7μm，2.1×150mm(Waters,Saint-Quentin-en-Yvelines,France,186008946)上。对于完整与还原条件中的分析，在20％B下以0.6mL/min的流率进行脱盐步骤1.5min。洗脱步骤以20％B下1.5min至50％B下16.5min的梯度以0.6ml/min的流率进行。洗涤步骤设定为在90％B下16.8min至18.8min，流率为0.6ml/min。最后，在20％B下19.1min以0.6ml/min的流率(总运行时间＝21分钟)使用调节步骤1.9min。
MS-I：ADC与MS相容性缓冲液进行缓冲液交换，且直接输注至配备有基于自动芯片的nanoESI源(Triversa Nanomate,Advion Biosciences,Ithaca,NY,USA)的杂合Q-TOF MS仪器(Synapt G2-S HDMS,Waters,Manchester,UK)中。调节仪器MS参数以保留气相中的原始3D结构且确保有效离子去溶剂化及传输。
LC-MS分析使用配备有Xevo G2 XS Q-TOF ESI质谱仪(Waters,Manchester,UK)的Waters UPLC H级Bio色谱系统进行。ADC在完整条件(未预先处理)中或在用5mM(最终浓度)的DTT(Thermo Scientific,Rockford,IL,20291)还原之后分析。随后，使用前述LC-IV分析经处理的ADC(表16)。使用MassLynxTM采集软件(Waters,Manchester,UK)采集分析物的电喷雾-电离飞行时间质谱。随后，使用MassLynxTM软件的最大熵(MaxEnt)方法对所提取强度对比m/z光谱进行去卷积以视所用处理而测定各完整抗体种类或各还原抗体片段的质量。最后，通过对未结合及结合给定种类(mAb或结合片段)的集成式MS(总离子电流)或UV(280nm)峰面积进行求和来自去卷积光谱或UV谱图测定DAR。对于通过UV谱图进行的DAR测定，各种类的相对面积乘以所附接药物的数目。将各种类的和、加权的面积除以总相对面积百分比的总和，且结果产生所有ADC的最终平均DAR值的估算值。对于通过去卷积光谱的进行DAR测定，鉴别出的各种类的百分比通过来自去卷积光谱的强度峰值进行计算。所获百分比乘以所附接药物的数目。求和结果产生所有ADC的最终平均DAR值的估算值。
液相色谱-质谱法(LC/MS)II
LC/MS数据使用具有以下参数(表7)的仪器采集：
表7.参数
Figure BDA0003410186110005861
Figure BDA0003410186110005871
用于产生LC/MS数据的方法如下(表8-10)：
表8. 2分钟酸性方法
Figure BDA0003410186110005872
表9. 2分钟碱性方法
Figure BDA0003410186110005873
Figure BDA0003410186110005881
表10. 5分钟酸性方法
Figure BDA0003410186110005882
高分辨率质谱法(HRMS)
HRMS数据使用具有以下参数(表11)的仪器采集：
表11.参数
Figure BDA0003410186110005883
Figure BDA0003410186110005891
用于产生接头/有效负载及合成中间体的HRMS数据的方法如下(表7及8)：
表12. 5分钟酸性方法
Figure BDA0003410186110005892
表13. 2分钟酸性方法
Figure BDA0003410186110005893
Figure BDA0003410186110005901
用于产生ADC的HRMS数据的方法如下(表14)：
表14.蛋白质方法
Figure BDA0003410186110005902
尺寸排阻色谱(SEC)I
进行尺寸排阻色谱(SEC)以测定ADC的质量及纯化之后的聚集百分比(％)。该分析在分析型柱Superdex 200Increase 5/150GL(GE Healthcare,28990945)上，在100％PBSpH 7.4(Sigma,P3813,10PAK)的等度条件下，流速为0.45ml/min进行12分钟。ADC样品的聚集体洗脱级分％基于280nm下峰面积吸光度进行定量。计算是基于280nm的高分子量洗脱剂除以高分子量及单体洗脱剂的相同波长下的峰面积吸光度的总和之间的比率乘以100％。
进行尺寸排阻色谱(SEC)(1)以测定ADC的质量及纯化之后的聚集百分比(％)。该分析在分析型柱Superdex 200Increase 5/150GL(GE Healthcare,28990945)上，在PBS pH7.2((Hyclone SH30028.03))的等度条件下，补充有150mM NaCl及1mM EDTA，流速为0.45ml/min进行8分钟。ADC样品的聚集体洗脱级分％基于280nm下峰面积吸收率进行定量。计算是基于280nm的高分子量洗脱剂除以高分子量及单体洗脱剂的相同波长下的峰面积吸光度的总和之间的比率乘以100％。在配备有Wyatt miniDAWN光散射及Treos折射率检测器(Wyatt Technologies,Santa Barbara,CA)的Agilent Bio-Inert 1260HPLC上采集资料。
尺寸排阻色谱(SEC)II
SEC数据使用具有以下参数(表15)的仪器及12分钟的运行长度采集：
表15.参数
Figure BDA0003410186110005911
结果
示例性ADC的特征概述于表16、16a及16b中(偶合及LC/MS方法、聚集状态及DAR)。平均DAR值使用上述LC/MS方法(LC/MS I)测定，且百分比聚集使用上述SEC方法(SEC I)测定。
表16.ADC分析性特征及缀合方法
Figure BDA0003410186110005912
Figure BDA0003410186110005921
表16a.ADC分析性特征及缀合方法
Figure BDA0003410186110005922
表16b.ADC分析性特征及缀合方法
Figure BDA0003410186110005923
实施例5：体外评定I
通过荧光偏振(FP)确定的Mcl-1抑制
各化合物的相对结合效力经由荧光偏振(FP)测定。该方法使用荧光素标记的配体(荧光素-βAla-Ahx-A-REIGAQLRRMADDLNAQY-OH(SEQ ID NO:72)；MW 2,765)，其结合于Mcl-1蛋白(UniProt参考序列：Q07820；SEQ ID NO:48)，引起使用读取器以毫偏振(mP)单位测量的各向异性增加。添加作为配体竞争性结合至同一位点的化合物产生系统中更大比例的未结合配体，如由以mP单位的减少指示。
在DMSO中制备各化合物的11点连续稀释液，且将2μl转移至平底、低结合的384孔板中(最终DMSO浓度为5％)。随后添加含有荧光素标记的配体(最终浓度1nM)及Mcl-1蛋白(最终浓度为5nM)的38μl缓冲液(10mM 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸[HEPES]、150mMNaCl、0.05％Tween 20，pH 7.4)。
分析板在室温下孵育约2小时，随后在Biomek Synergy2读取器(Ex.528nm，Em.640nm，截止510nm)上测量FP且计算mP单位。与在“仅5％DMSO”与“100％抑制”对照物之间确立的窗口相比，增加剂量的测试化合物的结合表示为mP的减小百分比。11点剂量反应曲线用XL-Fit软件使用4参数对数模型(S形剂量-反应模型)标绘，且确定给出50％mP减小的抑制浓度(IC50)。结果呈现于下表17中。结果表明所测试化合物抑制Mcl-1蛋白与荧光素标记的肽之间的相互作用。
体外细胞毒性
在NCI-H929多发性骨髓瘤细胞系上进行细胞毒性研究。将细胞分布至微板上且暴露于测试化合物48小时。随后，细胞活力是通过比色分析，微量培养四唑分析(Carmichael等人(1987)Cancer Res.47:936-42)来定量。
结果是以IC50(将细胞活力抑制50％的化合物的浓度)来表示且呈现于下表17中。结果显示所测试化合物在NCI-H929细胞中具有细胞毒性。
表17.NCI-H929细胞中Mcl-1抑制及细胞毒性的IC50
Figure BDA0003410186110005941
实施例6：体外评定II-DLBCL细胞系中CD74-L7-P1及P1有效负载的体外活性(CTG72h)
DLBCL细胞系(Karpas422、SUDHL4、NUDHL1、SUDHL6、SUDHL10、DOHHL2及SUDHL5)在补充有10％热灭活胎牛血清、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)及L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI中培养。将细胞在37℃下在含有5％CO2的湿润气氛中培养。将细胞接种于96微孔板中且使其暴露于ADC或相应有效负载持续72h(连续稀释；各9种浓度，重复三次)。在孵育3天之后，评定ADC或有效负载对细胞活力的影响，该评定在37℃/5％CO2下通过使用CellTiterGlo以75μL试剂/孔定量细胞ATP含量来进行。所有条件进行重复三次测试。在多用途读板仪上定量荧光。使用标准四参数曲线拟合计算IC50。IC50定义为CTG信号减少至对照组所测量的50％时的化合物浓度。各实验至少进行两次，结果为可再现的。如表18及图1A及图1B中所示，有效负载P1及ADC CD74-L7-P1诱导CTG分析中DLBCL细胞的活力的剂量依赖性降低。
表18：ADC及有效负载在各种细胞系中的细胞毒性的IC50
Figure BDA0003410186110005942
Figure BDA0003410186110005951
实施例7：体外评定III-Monomac1 AML细胞系中CD74-Mcl-1ADC及有效负载的体外活性(CTG 72h)
将Monomac1细胞在补充有10％热灭活胎牛血清、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)及L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI中培养。将细胞系在37℃下在含有5％CO2的湿润气氛中培养。将细胞接种于96微孔板中且使其暴露于有效负载或ADC持续72h(连续稀释；各9种浓度，重复三次)。在孵育3天之后，评定有效负载或ADC对细胞活力的影响，该评定在37℃/5％CO2下通过使用CellTiterGlo以75μL试剂/孔定量细胞ATP含量来进行。所有条件进行重复三次测试。在多用途读板仪上定量荧光。使用标准四参数曲线拟合计算IC50。IC50定义为CTG信号减少至对照组所测量的50％时的化合物浓度。各实验至少进行两次，结果为可再现的。如表19及图2中所示，有效负载及抗CD74-Mcl-1 ADC诱导CTG分析中Monomac1细胞的活力的剂量依赖性降低。
表19.ADC及有效负载在Monomac-1细胞中的细胞毒性的IC50
Figure BDA0003410186110005952
Figure BDA0003410186110005961
实施例8：体外评定IV-CD74 ADC在多种癌细胞系中的体外活性
细胞系
CD74 MCL-1抗体药物缀合物CD74-L7-P1、同种型IgG-L7-P1ADC及无MCL-1的有效负载P1针对六种内源癌细胞系进行测试。KMS-21BM(JCRB JCRB1185号，培养于RPMI-1640+10％FBS中)、KMS-20(JCRB JCRB1196号，培养于RPMI-1640+10％FBS中)、MONO-MAC-1(DSMZ第ACC-252号，培养于RPMI-1640+10％FBS+1×非必需氨基酸+1mM丙酮酸钠中)、NOMO-1(DSMZ ACC-542号，培养于RPMI-1640+10％FBS中)、Kasumi-6(ATCC CRL-2775号，培养于RPMI-1640+20％FBS+1.5g/L碳酸氢钠+4.5g/L葡萄糖+10mM HEPES+1mM丙酮酸钠中，其补充有2ng/ml人类重组粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF))及EOL-1(DSMZ第ACC-386号，培养于RPMI-1640+10％FBS中)
细胞增殖及存活的抑制
使用Promega CellTiter
Figure BDA0003410186110005962
增殖分析评定CD74MCL-1抗体药物缀合物(CD74-L7-P1)、同种型IgG-L7-P1 ADC及无MCL-1的有效负载P1抑制细胞增殖及存活的能力。细胞系在组织培养孵育箱中在5％CO2，37℃下对于其生长最佳的培养基中培养。在针对增殖分析接种之前，细胞在分析之前至少2天分割以确保最佳生长密度。在接种当天，收集悬浮细胞。使用细胞计数器(Vi-Cell XR Cell Viability Analyzer,Beckman Coulter)测定细胞活力及细胞密度。将具有高于85％活力的细胞接种在白色透明底384孔TC处理的板(Corning目录号3765)中。细胞以1,000个细胞/孔的密度接种在45μL标准生长培养基中。板在5％CO2，37℃组织培养孵育箱中孵育过夜。次日，无MCL-1的有效负载(P1)、靶向MCL-1ADC及非靶向同种型ADC以10×在标准生长培养基中制备。随后将所制备的药物治疗剂添加至细胞中，使得最终浓度为0.0005-500nM，且最终体积为50μL/孔。各药物浓度以一式三份进行测试。板在5％CO2，37℃组织培养孵育箱中孵育5天，这之后通过添加25μL CellTiter
Figure BDA0003410186110005972
(Promega，目录号G7573)，一种裂解细胞且测量三磷酸腺苷(ATP)总含量的试剂来评定细胞活力。板在室温下孵育10分钟以使发光信号稳定，随后使用荧光读取器(EnVisionMultilabel Plate Reader,PerkinElmer)读数。为了评估药物治疗剂的效果，使用来自含有未处理细胞(100％活力)的孔中的发光计数来使处理过的样品标准化。应用可变斜率模型以使非线性回归曲线拟合GraphPad PRISM版7.02软件中的数据。自所得曲线外推IC50及Amax值。
结果
表达所关注CD74靶标的代表性癌细胞系的剂量反应曲线显示于图3(正方形＝CD74-L7-P1，圆圈IgG-L7-P1，三角形＝无MCL1的有效负载P1)中。抑制50％细胞生长或存活所需的治疗剂浓度(IC50)用表20中所概述进行测试的细胞系的代表性IC50值加以计算。
表20：D74 MCL1 ADC
Figure BDA0003410186110005971
**测试但曲线并未收敛
实施例9.体外评定V-CD74 ADC作为单一试剂及与Bcl-2抑制剂组合的体外活性
细胞系
针对三种内源癌细胞系测试CD74 MCL-1抗体药物缀合物。MONO-MAC-1(DSMZ ACC-252号，培养于RPMI-1640+10％FBS+1×非必需氨基酸+1mM丙酮酸钠中)、NOMO-1(DSMZ ACC-542号，培养于RPMI-1640+10％FBS中)及EOL-1(DSMZ ACC-386号，培养于RPMI-1640+10％FBS中)
细胞增殖及存活的抑制
使用Promega CellTiter-
Figure BDA0003410186110005981
增殖分析评定CD74MCL-1抗体药物缀合物与BCL-2抑制剂组合抑制细胞增殖及存活的能力。细胞系在组织培养孵育箱中在5％CO2，37℃下最佳用于其生长的培养基中培养。在针对增殖分析接种之前，细胞在分析之前至少2天分割以确保最佳生长密度。在接种当天，收集悬浮细胞。使用细胞计数器(Vi-Cell XR CellViability Analyzer,Beckman Coulter)测定细胞活力及细胞密度。将具有高于85％活力的细胞接种在白色透明底384孔TC处理的板(Corning目录号3765)中。细胞以1,000个细胞/孔的密度接种在45μL标准生长培养基中。板在5％CO2，37℃组织培养孵育箱中孵育过夜。次日，无MCL-1的有效负载(P1)、靶向MCL-1 ADC及非靶向同种型ADC以10×在标准生长培养基中制备。随后将所制备的药物治疗剂添加至细胞中，使得最终浓度为0.0005-300nM，且最终体积为50μL/孔。各药物浓度以一式三份进行测试。针对各化合物评估三种条件。化合物以单一试剂及与维奈托克组合及与化合物A1组合进行评估。维奈托克及化合物A1以5nM或50nM最终浓度给药。板在5％CO2，37℃组织培养孵育箱中孵育5天，这之后通过添加25μLCellTiter
Figure BDA0003410186110005982
(Promega，目录号G7573)，一种溶解细胞且测量三磷酸腺苷(ATP)总含量的试剂来评定细胞活力。板在室温下孵育10分钟以使发光信号稳定，随后使用荧光读取器(EnVision Multilabel Plate Reader,PerkinElmer)读数。为了评估药物治疗剂的效果，使用来自含有未处理细胞(100％活力)的孔中的发光计数来使处理过的样品标准化。应用可变斜率模型以使非线性回归曲线拟合GraphPad PRISM版7.02软件中的数据。自所得曲线外推IC50及Amax值。
结果
表达所关注CD74靶标的代表性癌细胞系的剂量反应曲线显示于图4及图5中。抑制50％细胞生长或存活所需的治疗剂浓度(IC50)用表21中所概述进行测试的细胞系的代表性IC50值加以计算。
表21：CD74-MCL-1ADC与维奈托克及化合物A1组合
Figure BDA0003410186110005991
实施例10：体外评定VI-CD74 MCL-1ADC的体外活性
细胞系
针对三种内源癌细胞系测试CD74 MCL-1抗体药物缀合物。MONO-MAC-1(DSMZ ACC-252号，培养于RPMI-1640+10％FBS+1×非必需氨基酸+1mM丙酮酸钠中)、NOMO-1(DSMZ ACC-542号，培养于RPMI-1640+10％FBS中)及EOL-1(DSMZ ACC-386号，培养于RPMI-1640+10％FBS中)。
细胞增殖及存活的抑制
使用Promega CellTiter-
Figure BDA0003410186110006001
增殖分析评定CD74MCL-1抗体药物缀合物抑制细胞增殖及存活的能力。细胞系在组织培养孵育箱中在5％CO2，37℃下最佳用于其生长的培养基中培养。在针对增殖分析接种之前，细胞在分析之前至少2天分割以确保最佳生长密度。在接种当天，收集悬浮细胞。使用细胞计数器(Vi-Cell XR Cell Viability Analyzer,Beckman Coulter)测定细胞活力及细胞密度。将具有高于85％活力的细胞接种在白色透明底384孔TC处理的板(Corning目录号3765)中。细胞以1,000个细胞/孔的密度接种在45μL标准生长培养基中。板在5％CO2，37℃组织培养孵育箱中孵育过夜。次日，以10×在标准生长培养基中制备靶向MCL-1ADC。随后将所制备的药物治疗剂添加至细胞中，使得最终浓度为0.01-200nM，且最终体积为50μL/孔。各药物浓度以一式三份进行测试。板在5％CO2，37℃组织培养孵育箱中孵育5天，这之后通过添加25μL CellTiter
Figure BDA0003410186110006002
(Promega，目录号G7573)，一种溶解细胞且测量三磷酸腺苷(ATP)总含量的试剂来评定细胞活力。板在室温下孵育10分钟以使发光信号稳定，随后使用荧光读取器(EnVision Multilabel PlateReader,PerkinElmer)读数。为了评估药物治疗剂的效果，使用来自含有未处理细胞(100％活力)的孔中的发光计数来使处理过的样品标准化。应用可变斜率模型以使非线性回归曲线拟合GraphPad PRISM版7.02软件中的数据。IC50及Amax值自所得曲线外推，且示于表22中。
表22：IC50值
Figure BDA0003410186110006003
Figure BDA0003410186110006011
**测试但曲线并未收敛
实施例11.体内评定I-静脉内(IV)施用之后Nomo1急性髓性白血病模型中CD74ADC的体内活性
在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中配制的靶向CD74的ADC的体内治疗效果在静脉内(IV)施用之后在Nomo1急性髓性白血病模型中测定。测试以下化合物：抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1、抗CD74_CysmAb Fc沉默及IgG1-接头-有效负载Fc沉默。
材料及方法
自DSMZ获得的Nomo1细胞在补充有10％FBS的RPMI中培养。0.1ml含有5×106个细胞皮下接种至由Charles River提供的雌性SCID小鼠的右侧腹中。在肿瘤达至适当体积时，使用Easy stat软件将小鼠随机分组，6只动物/组。IgG1-接头-有效负载Fc沉默、抗CD74_CysmAb Fc沉默及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(30mg/kg)在PBS中IV注射一次。维奈托克(在Servier Research Institute-IdRS合成)在PEG/EtOH/Phosal(聚乙二醇/乙醇/phosal，30/10/60)中配制，且在工作日每日经口(PO)施用(50mpk，4ON/3OFF/4ON)。一周三次监测小鼠体重，且使用电子测径器来测量肿瘤尺寸。通过测量最小及最大肿瘤直径使用式：(最小直径)2(最大直径)/2来估算肿瘤体积。在研究中仍存在所有组中的至少一半动物的最后一天(d9)，使用下式计算肿瘤生长抑制：
Figure BDA0003410186110006021
其中Dx处的DTV(Δ肿瘤体积)，计算为Dx下的TV-随机分组时的TV。
在第一次测量到肿瘤体积超过2000mm3时或在动物健康恶化的第一次迹象时处死小鼠。由IdRS道德委员会批准后，所有实验皆按照2018年生效的法国法规进行。根据机构指南维持SCID小鼠。
结果
抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1对Nomo1异种移植物的功效在图3中说明。在肿瘤细胞接种后10天(中值大小：191.6mm3)开始治疗。IgG1-接头-有效负载Fc沉默(非靶向ADCFS)、抗CD74_CysmAb Fc沉默(裸抗体FS)及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(靶向CD74的ADCFS)以30mg/kg IV施用一次。非靶向ADC FS及靶向CD74的ADC FS也结合维奈托克，其以50mg/kg给药PO 4ON/3OFF/4ON。在第9天，30mg/kg下的裸抗体FS、靶向CD74的ADC FS或对应的非靶向ADC FS(TGI分别＝32.7％、-5.6％及-12.2％)不诱导肿瘤生长抑制(TGI％)或诱导极轻微肿瘤生长抑制，如图6及表23中所描绘。然而，与维奈托克组合，靶向CD74的ADC FS诱导的抗肿瘤活性比对应的非靶向ADC FS(TGI分别＝98.6％对比5.5％，p<0.001)大得多。值得注意的，单独的维奈托克对肿瘤生长几乎不具有任何影响(TGI＝26.2％)。未观察到归因于治疗的临床上相关的体重损失或其它临床征象(图7)。
表23：Nomo1肿瘤生长抑制
Figure BDA0003410186110006031
***p<＝0.001，与对照组相比。
实施例12.体内评定II-静脉内(IV)施用之后CD74 ADC在Karpas422弥漫性大B细胞淋巴瘤模型中的体内活性
在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中配制的靶向CD74的ADC的体内治疗效果在静脉内(IV)施用之后在Karpas422弥漫性大B细胞淋巴瘤模型中测定。测试以下化合物：靶向CD74的ADC为抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1、IgG1-接头-有效负载Fc沉默及抗CD74_CysmAb Fc沉默。
材料及方法
自ATCC获得的Karpas422细胞在补充有20％FBS的RPMI中培养。将细胞重悬浮于100％基质胶(BD Biosciences)中，且0.1ml含有11×106个细胞皮下接种至由CharlesRiver提供的雌性NSG小鼠的右侧腹中。在肿瘤达至适当体积时，使用Easy stat软件将小鼠随机分组，6只动物/组。IgG1-接头-有效负载Fc沉默、抗CD74_CysmAb Fc沉默及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(30mg/kg)在PBS中IV注射一次。维奈托克(在Servier ResearchInstitute-IdRS合成)在PEG/EtOH/Phosal(聚乙二醇/乙醇/phosal，30/10/60)中配制，且在工作日每日经口(PO)施用(50mpk，4ON/3OFF/4ON)。一周三次监测小鼠体重，且使用电子测径器来测量肿瘤尺寸。通过测量最小及最大肿瘤直径使用式：(最小直径)2(最大直径)/2来估算肿瘤体积。在研究中仍存在至少一半对照动物的最后一天(d23)，使用下式计算肿瘤生长抑制：
Figure BDA0003410186110006041
其中Dx下的DTV(Δ肿瘤体积)，经计算为Dx下的TV-随机分组下的TV。如下评估反应：如果至少三次测量的肿瘤尺寸≤25mm3，则CR(完全反应)，如果至少三次测量的肿瘤尺寸介于25mm3与168.3mm3(初始尺寸的一半)之间，则PR(部分反应)。在第一次测量到肿瘤体积超过2000mm3时或在动物健康恶化的第一次迹象时处死小鼠。由IdRS道德委员会批准后，所有实验皆按照2018年生效的法国法规进行。根据机构指南维持SCID小鼠。
结果
抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1对Karpas422异种移植物的功效在图8中说明。在肿瘤细胞接种(中值大小：336.6mm3)后17天开始治疗。IgG1-接头-有效负载Fc沉默(非靶向ADC FS)、抗CD74_CysmAb Fc沉默(裸抗体FS)及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(靶向CD74的ADC FS)以30mg/kg IV施用一次。非靶向ADC FS及靶向CD74的ADC FS也结合维奈托克，其以50mg/kg给药PO 4ON/3OFF/4ON。
在第23天，30mg/kg下的裸抗体FS、靶向CD74的ADC FS或对应的非靶向ADC FS(TGI分别＝-1％、-61.8％及-76.2％)不诱导肿瘤生长抑制(TGI％)，如图8及表24中所描绘。然而，与维奈托克组合，靶向CD74的ADC FS诱导的抗肿瘤活性对应的非靶向ADC FS(TGI分别＝154.9％对比-9％，p<0.001)大得多，且完全消退(CR)仅在此治疗组(表24)中实现。值得注意的，单独的维奈托克对肿瘤生长几乎不具有任何影响(TGI＝31.1％)。未观察到归因于治疗的临床征象，除了在用维奈托克给药的组中的中度体重损失(仍在临床上不相关)之外(图9)。
表24：Karpas422肿瘤生长抑制
Figure BDA0003410186110006051
***p<＝0.001，与对照组相比
实施例13.体内评定III-静脉内(IV)施用之后Monomac1急性髓性白血病模型中CD74 ADC的体内活性
在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中配制的靶向CD74的ADC的体内治疗效果在静脉内(IV)施用之后在Monomac1急性髓性白血病模型中测定。测试以下化合物：靶向CD74的ADC为抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1、IgG1-接头-有效负载Fc沉默及抗CD74_CysmAb Fc沉默。
材料及方法
自DSMZ获得的Monomac1细胞在补充有10％FBS的RPMI中培养。0.1ml含有5×106个细胞皮下接种至由Charles River提供的雌性SCID小鼠的右侧腹中。在肿瘤达至适当体积时，使用Easy stat软件将小鼠随机分组，6只动物/组。IgG1-接头-有效负载Fc沉默、抗CD74_CysmAb Fc沉默及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(30mg/kg)在PBS中IV注射一次。维奈托克(在Servier Research Institute-IdRS合成)在PEG/EtOH/Phosal(聚乙二醇/乙醇/phosal，30/10/60)中配制，且在工作日每日经口(PO)施用(50mpk，2ON/2OFF/5ON/2OFF/4ON)。一周三次监测小鼠体重，且使用电子测径器来测量肿瘤尺寸。通过测量最小及最大肿瘤直径使用式：(最小直径)2(最大直径)/2来估算肿瘤体积。在研究中仍存在至少一半对照动物的最后一天(d16)，使用下式计算肿瘤生长抑制：
Figure BDA0003410186110006061
其中Dx下的DTV(Δ肿瘤体积)，经计算为Dx下的TV-随机分组下的TV。
如下评估反应：如果至少三次测量的肿瘤尺寸≤25mm3，则CR(完全反应)，如果至少三次测量的肿瘤尺寸包含介于25mm3与60.1mm3(初始尺寸的一半)之间，则PR(部分反应)。在第一次测量到肿瘤体积超过2000mm3时或在动物健康恶化的第一次迹象时处死小鼠。由IdRS道德委员会批准后，所有实验皆按照2018年生效的法国法规进行。根据机构指南维持SCID小鼠。
结果
抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1对Monomac1异种移植物的功效在图10中说明。在肿瘤细胞接种(中值大小：120.2mm3)后7天开始处理。IgG1-接头-有效负载Fc沉默(非靶向ADCFS)、抗CD74_CysmAb Fc沉默(裸抗体FS)及抗CD74_CysmAb Fc沉默_L5-P1(靶向CD74的ADCFS)以30mg/kg IV施用一次。非靶向ADC FS及靶向CD74的ADC FS也结合维奈托克，其以50mg/kg给药PO 2ON/2OFF/5ON/2OFF/4ON。在第16天，30mg/kg下的靶向CD74的ADC FS诱导的肿瘤生长抑制(％TGI)比裸抗体FS(TGI分别＝33.8％对比-23％，p<0.05)及对应的非靶向ADC FS(TGI＝-14.6％)大得多，如图10及表25中所描绘。当结合维奈托克时，非靶向ADCFS显示一些抗肿瘤活性(TGI＝34.4％，p<0.05)，但完全及持久的肿瘤消退仅在与靶向CD74的ADC FS(TGI＝108.5％，p<0.001)组合时观测到。未观测到临床上相关的体重损失或因治疗所致的其他临床征象(图11)。
表25：Monomac1肿瘤生长抑制
Figure BDA0003410186110006071
*p<＝0.05，**p<＝0.01，***p<＝0.001，与对照组相比
实施例14：CD74-L5-P1 Fc沉默针对小鼠中的EOL1人类急性骨髓(嗜酸性粒细胞)白血病异种移植模型的体内功效
在体外研究已显示通过组合CD74-L5-P1 Fc沉默与维奈托克，EOL1细胞系中细胞生长的靶标依赖性及有效抑制，此组合治疗的抗肿瘤活性在此AML模型中进行体内评估。
方法
经EOL1荧光素酶转染的细胞在37℃下在空气中5％CO2的气氛下在补充有10％FCS(BioConcept Ltd.Amimed，编号2-01F30-I)、2mM L-谷氨酰胺(BioConcept Ltd.Amimed，编号5-10K00-H)及1mM丙酮酸钠(BioConcept Ltd.Amimed，编号5-60F00-H)、10mM HEPES(Gibco编号11560496)的RPMI1640(BioConcept Ltd.Amimed)中培养。为确立EOL1，异种移植细胞收集且重悬浮于HBSS(Gibco，编号14175)中，随后将100μL含有5×106个细胞皮下注射于雌性SCID beige小鼠(Charles River,Germany)的侧腹中。细胞接种后定期监测肿瘤生长，且将动物随机分为治疗组(n＝6)，平均肿瘤体积约130mm3。对照组及多个治疗组如图12中所指示给药。在治疗开始时以图12中所指示的剂量单独或与以50mg/kg每日(qd)经口(po)施用的维奈托克组合静脉内(iv)施用CD74-L5-P1 Fc沉默、同种型IgG1 ADC Fc沉默及CD74 Fc沉默抗体一次。针对单个小鼠体重调节剂量。iv剂量体积为10ml/kg，且将各ADC溶解于0.9％(w/v)NaCl水溶液中。使用Kruskal-Wallis秩和检验(Indigo软件)统计学分析治疗后第10天的肿瘤体积资料。适当时，结果呈现为平均值±SEM。作为功效的测量，T/C％值在第10天根据下式计算：
(Δ肿瘤体积治疗/Δ肿瘤体积对照)×100
肿瘤消退根据下式计算：
-(Δ肿瘤体积治疗/肿瘤体积治疗开始时)×100
其中Δ肿瘤体积表示评估日的平均肿瘤体积减去实验开始时的平均肿瘤体积。
结果：功效及耐受性
CD74-L5-P1 Fc沉默与维奈托克组合以及多个对照组的抗肿瘤效果概述在图12及表26中。观测到单独的维奈托克(50mg/kg po qd)及CD74 Fc沉默抗体加上维奈托克的组合出现的有限功效。观测到同种型IgG1 ADC(30mg/kg)加上维奈托克(50mg/kg)的组合以及单独的CD74-L5-P1 Fc沉默(30mg/kg)出现的轻微肿瘤生长延迟(TGD)，但两者均统计学上不同于媒剂对照组。相比之下，观测到以10或30mg/kg iv给药一次的CD74-L5-P1 Fc沉默与维奈托克50mg/kg po qdx21(p<0.05来自媒剂组及同种型IgG1 ADC加上维奈托克组)组合出现完全消退(CR)。所有治疗基于体重变化具有良好耐受性(图13)。
表26：CD74-L5-P1 Fc沉默与维奈托克组合的抗肿瘤效果
Figure BDA0003410186110006081
Figure BDA0003410186110006091
计算第10天的Δ肿瘤体积及T/C％值且呈现为平均值。*是指与媒剂对照相比的统计学差异(p<0.05)，且$是指在第10天与同种型IgG1 ADC+维奈托克相比的统计学差异(<0.05)(Kruskal-Wallis秩和检验；Indigo软件)。
实施例15.具有不同接头有效负载的CD74-ADC Fc沉默针对小鼠中的EOL1人类急性骨髓(嗜酸性粒细胞)白血病异种移植模型的体内功效
为使接头有效负载优化，在体内EOL1模型中评估6个具有不同接头有效负载(L5-P1、L30-P1、L31-P1、L32-P1、L33-P1及L34-P1)的CD74-ADC的功效。
方法
经EOL1荧光素酶转染的细胞在37℃下在空气中5％CO2的气氛下在补充有10％FCS(BioConcept Ltd.Amimed，编号2-01F30-I)、2mM L-谷氨酰胺(BioConcept Ltd.Amimed，编号5-10K00-H)及1mM丙酮酸钠(BioConcept Ltd.Amimed，编号5-60F00-H)、10mM HEPES(Gibco编号11560496)的RPMI1640(BioConcept Ltd.Amimed)中培养。为确立EOL1，将异种移植细胞收集且重悬浮于HBSS(Gibco，编号14175)中，随后将100μL含有5×106个细胞皮下注射于雌性SCID米色小鼠(Charles River,Germany)的侧腹中。细胞接种后定期监测肿瘤生长，且将动物随机分为治疗组(n＝6)，平均肿瘤体积约130mm3。对照及多个CD74-ADC fc沉默(L5-P1、L30-P1、L31-P1、L32-P1、L33-P1及L34-P1)如图14中所指示进行给药。在治疗开始时以2.5mg/kg或以3.3mg/kg与以50mg/kg每日(qd)经口(po)施用的维奈托克组合静脉内(iv)施用ADC一次。针对单个小鼠体重调节剂量。iv剂量体积为10ml/kg，且将各ADC溶解于0.9％(w/v)NaCl水溶液中。使用单向ANOVA事后分析Tukey's多重比较检验(Indigo软件)统计学分析治疗后第10天的肿瘤体积资料。结果呈现为平均值±SEM。作为功效的测量，T/C％值在第10天根据下式计算：
(Δ肿瘤体积治疗/Δ肿瘤体积对照)×100
肿瘤消退根据下式计算：
-(Δ肿瘤体积治疗/肿瘤体积治疗开始时)×100
其中Δ肿瘤体积表示评估日的平均肿瘤体积减去实验开始时的平均肿瘤体积。
结果：功效及耐受性
与媒剂对照组相比，在第10天，施用2.5mg/kg的低剂量与维奈托克组合之后，除CD74-L5-P1 Fc沉默外所有ADC显著(p<0.05)减少EOL1肿瘤的生长(图14及表27)。CD74-L34-P1 Fc沉默呈现2.5与3.3mg/kg之间的剂量相关反应。所有治疗时间表基于体重变化具有良好耐受性(图15)。
表27：CD74-ADC与维奈托克组合的抗肿瘤效果
Figure BDA0003410186110006101
计算第10天的Δ肿瘤体积及T/C％值且呈现为平均值。*是指与媒剂对照相比的统计学差异(p<0.05)，且$是指在第10天与同型CD74-L5-P1+维奈托克相比的统计学差异(<0.05)(单向ANOVA事后分析塔基多重比较检验；Indigo软件)。
实施例16-人源化LL1变体的表达
含有不同人源化LL1重链及人源化LL1轻链的表达载体使用expifectamine共转染至Expi293细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中且培养7天。通过离心、过滤收集培养上清液，且通过蛋白A亲和色谱法纯化抗体。通过分析型尺寸排阻色谱测试亲和色谱法之后的抗体纯度。
第一轮转染(表28)重点在于评估不同人源化重链及轻链以及PTM移除突变(参见实施例17)。
表28：人源化LL1变体的表达，第一轮
Figure BDA0003410186110006111
Figure BDA0003410186110006121
总体表达及纯度在大多数人源化变体与初始人源化版本(hLL1)之间是相当的。与另一种人源化变体相比，大多数PTM移除变体中看到总产率降低。
将NQ突变集合并入hzLL1-Vk1b及hzLL1-Vk1a轻链中，且使用瞬时转染至Expi293细胞中表达第二轮变体(表29)：
表29：人源化LL1变体的表达，第二轮
重链 轻链 最终产率(mg) 纯度(单体％)
hLL1 hzLL1-Vk1a(NQ) 2.8 96.0
hLL1 hzLL1-Vk1b(NQ) 0.5 98.0
hzLL1-VH1a Y95F hzLL1-Vk1a(NQ) 2.75 98.0
hzLL1-VH1a Y95F hzLL1-Vk1b(NQ) 0.8 99.0
hzLL1-VH1a V5Q Y95F hzLL1-Vk1a(NQ) 1.8 98.0
hzLL1-VH1a V5Q Y95F hzLL1-Vk1b(NQ) 0.8 99.0
此类变体的总体表达似乎与轻链的选择相关-具有hzLL1-Vk1a(NQ)轻链的变体以比具有hzLL1-Vk1b(NQ)轻链的变体较高的含量表达。
人源化变异抗体使用FACS及SPR测试其与人类CD74蛋白的结合。选择具有与米拉珠单抗类似的结合特征的变异抗体。
实施例17：LL1 VH及VL序列的人源化及PTM移除
鼠类抗CD74抗体LL1的可变域在嵌合抗体序列(cLL1)的情形下描述于US7931903中：
LL1 VH
QVQLQQSGPELKKPGETVKVTCKTSGYTFTNYGVNWIKQTPGEGLQWMGWINPNTGEPTFDDDFKGRFAFSLESSASTAFLQISNLKNEDMGTYFCSRSRGKNEAWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:49)
LL1 VL
DIQLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSSHVPPTFGAGTKLEIK(SEQ ID NO:50)
这些分别与人源化VH域(hLL1 VH)及VL域(hLL1 VL)的序列同时公开：
hLL1 VH
QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGVNWIKQAPGQGLQWMGWINPNTGEPTFDDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCSRSRGKNEAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)
hLL1 VL
DIQLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSSHVPPTFGAGTRLEIK(SEQ ID NO:23)
此类序列的人源化描述于US7931903的实施例5中。此人源化方法描述使用人源化抗体的非种系抗体序列(RT-TS3、HF-21/28)作为模板使两个可变域人源化，其将多个鼠类框架残基引入最终抗体序列中。此外，常见蛋白质翻译后修饰(去酰胺化)的问题位点(Asn-Gly或NG)在人源化轻链的CDR L1区中保持完整。此类特性对于抗体治疗剂为非所需的，因为其可在储存时增加免疫原性或降低抗体的结合亲和力。
进行两个独立尝试以解决这些复杂化问题。首先，使用人类种系框架作为模板使LL1的重链与轻链两者再人源化。其次，在LL1轻链的CDR L1区中有意将数个突变引入Asn-Gly序列中以破坏翻译后修饰位点。将具有合理表达及结合于CD74的人源化构建体与PTM移除突变组合以产生最终先导候选者。
LL1的人源化
首先，比较鼠类LL1 VH及VL序列与小鼠种系框架。对于VH，最接近的V基因匹配(79/98残基)似乎为鼠类IGHV9-1*02(IMGT命名法)，其中来自种系的突变在CDR与框架区之间分散。对于VL，最接近的V基因匹配(93/100残基)似乎为鼠类IGKV1-100*01，其中突变在CDR区与N端之间划分。
鼠类LL1 VH区与人类种系的比对公开与三个人类种系：IGHV7-4-1*02(最接近匹配)、IGHV1-3*02及IGHV5-51*02的合理匹配。在先前重链人源化(hLL1 VH)中维持的框架区中的若干鼠类残基也标记为可能对结合重要的。此类三个人类种系及鼠类残基用于制备6个变异重链：
1.人源化成IGHV7-4-1*02(hzLL1-VH1a)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGVNWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGEPTFDDDFKGRFVFSLDSSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCSRSRGKNEAWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:51)
2.保留V37I突变的情况下人源化为IGHV7-4-1*02(hzLL1-VH1b)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGVNWIRQAPGQGLEWMGWINPNTGEPTFDDDFKGRFVFSLDSSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCSRSRGKNEAWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:52)
3.保留Y95F突变的情况下人源化为IGHV7-4-1*02(hzLL1-VH1a Y95F)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGVNWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGEPTFDDDFKGRFVFSLDSSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCSRSRGKNEAWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:53)
4.保留V5Q Y95F突变的情况下人源化为IGHV7-4-1*02(hzLL1-VH1a V5Q Y95F)
QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGVNWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGEPTFDDDFKGRFVFSLDSSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCSRSRGKNEAWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:54)
5.人源化为IGHV1-3*02(hzLL1-VH2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGVNWVRQAPGQRLEWMGWINPNTGEPTFDDDFKGRVTITLDSSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCSRSRGKNEAWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:55)
6.人源化为IGHV5-51*01(hzLL1-VH3)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYGVNWVRQMPGKGLEWMGWINPNTGEPTFDDDFKGQVTISLDSSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCSRSRGKNEAWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:56)
对于轻链，鼠类LL1轻链与人类种系的比对公开与两个人类种系IGKV2-40*01及IGKV2-30*02的合理匹配。此类序列用于制备两个变异人源化轻链：
1.人源化为IGKV2-40*01(hzLL1-Vk1a)
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSSHVPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:27)
2.人源化为IGKV2-30*02(hzLL1-Vk1b)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSSHVPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:31)
人源化重链及轻链经合成，且用于重组蛋白表达(参见实施例16)。
来自LL1轻链的PTM移除
为自轻链的CDR L1区移除去酰胺位点(Asn-Gly、NG)，在hLL1VL序列中构筑含有以下5个替代残基(QG、SG、TG、NQ、NV)的序列。此用于制备以下5种变体轻链：
hLL1 VL(QG)
DIQLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRQGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSSHVPPTFGAGTRLEIK(SEQ ID NO:57)
hLL1 VL(SG)
DIQLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRSGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSSHVPPTFGAGTRLEIK(SEQ ID NO:58)
hLL1 VL(TG)
DIQLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRTGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSSHVPPTFGAGTRLEIK(SEQ ID NO:59)
hLL1 VL(NQ)
DIQLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRNQNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YFCSQSSHVPPTFGAGTRLEIK(SEQ ID NO:36)
hLL1 VL(NV)
DIQLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRNVNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSSHVPPTFGAGTRLEIK(SEQ ID NO:60)
突变型人源化轻链经合成且用于重组蛋白表达。
实施例18.Biacore KD测定
使用Biacore针对亲和力测定评定与人类及食蟹猴CD74针对WT IgG及人源化变体抗体的结合。使用如下所述的Biacore 8K仪器(Cytiva，先前GE HealthcareLifesciences)经由SPR进行动力学速率常数。采用抗IgG Fc捕捉方法以测定抗体动力学。使用市售抗IgG Fc捕捉试剂盒(Cytiva，先前GE Healthcare Lifesciences)。使用来自GE的所提供的胺偶合方案将所提供的IgG固定于芯片表面上。此固定的抗体捕获WT及人源化变体，且可溶性人类及食蟹猴CD74随分析物流动。CD74浓度在100nM下开始且以1份连续稀释至七种浓度的1份操作缓冲液。在各浓度结束时使用试剂盒中的指定条件进行再生。
完成双重参考减除以产生最终数据。使原始数据拟合于1:1结合模型，其中参数折射率设定为局部。由于抗原的性质，下表列举WT及人源化IgG变体的表观动力学结果。
表30.动力学结果
Figure BDA0003410186110006171

Claims (69)

1.一种式(1)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)p (1)
其中：
Ab为抗CD74抗体或其抗原结合片段；
p为1至16的整数；且
-(L-D)具有式(C)：
Figure FDA0003410186100000011
其中：
R1为附接基团；
L1为桥接间隔子；
Lp为包含1至6个氨基酸的肽基团；
D为Mcl-1抑制剂；
G1-L2-A为自降解间隔子；
L2为键、亚甲基、亚新戊基或C2-C3亚烯基；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000012
Figure FDA0003410186100000013
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为间隔子部分；且
R2为亲水性部分。
2.如权利要求1所述的抗体-药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中-(L-D)具有式(D)：
Figure FDA0003410186100000021
其中：
R1为附接基团；
L1为桥接间隔子；
Lp为包含1至6个氨基酸的肽基团；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000022
Figure FDA0003410186100000023
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；
L3为间隔子部分；且
R2为亲水性部分。
3.如权利要求1或2所述的抗体-药物缀合物，其中L1包含：
Figure FDA0003410186100000024
或*-CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)-**，
其中各n为1至12的整数，其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中L1为
Figure FDA0003410186100000025
且n为1至12的整数，或n为1，或n为12，其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点。
5.如权利要求1至3中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中L1为
Figure FDA0003410186100000031
且n为1至12的整数，其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点。
6.如权利要求1至3中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中L1包含
Figure FDA0003410186100000032
其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点。
7.如权利要求1或2所述的抗体-药物缀合物，其中L1为包含以下的桥接间隔子：
*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(R3)2(CH2)mC(＝O)NR3(CH2)mNR3C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(R3)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*指示直接或间接附接至Lp的点，且L1的**指示直接或间接附接至R1的点；
X1为
Figure FDA0003410186100000033
且
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9及10；且
各t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30；
且各R3独立地选自H及C1-C6烷基。
8.如权利要求1至7中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中R2为包括以下的亲水性部分：聚乙二醇、聚亚烷基二醇、多元醇、聚肌氨酸、糖、寡糖、多肽或用1至3个
Figure FDA0003410186100000041
基团取代的C2-C6烷基。
9.如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中R2为
Figure FDA0003410186100000042
Figure FDA0003410186100000043
Figure FDA0003410186100000044
其中n为介于1与6之间的整数、
Figure FDA0003410186100000045
Figure FDA0003410186100000046
或
Figure FDA0003410186100000051
10.如权利要求1或8所述的抗体-药物缀合物，其中该亲水性部分包含：
(i)例如具有以下部分的聚肌氨酸：
Figure FDA0003410186100000052
其中n为介于3与25之间的整数；且R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；或
(ii)具有下式的聚乙二醇：
Figure FDA0003410186100000053
其中R为H、-CH3、CH2CH2NHC(＝O)ORa、-CH2CH2NHC(＝O)Ra或-CH2CH2C(＝O)ORa，R'为OH、-OCH3、-CH2CH2NHC(＝O)ORa、-CH2CH2NHC(＝O)Ra或-OCH2CH2C(＝O)ORa，其中Ra为H或任选地用OH或C1-4烷氧基取代的C1-4烷基，且m及n中的每一者独立地为介于2与25之间的整数。
11.如权利要求1至9中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中该亲水性部分包含
Figure FDA0003410186100000054
12.如权利要求1至11中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中：
(i)L3为具有结构
Figure FDA0003410186100000055
的间隔子部分，
其中：
W为-CH2-、-CH2O-、-CH2N(Rb)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-、-C(＝O)N(X-R2)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)-、-CH2NRbC(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)NRb-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基；且
X为键、三唑基或-CH2-三唑基-；或
(ii)L3为具有结构
Figure FDA0003410186100000061
的间隔子部分，
其中：
W为-CH2-、-CH2O-、-CH2N(Rb)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(Rb)2NH-、-NHC(＝O)C(Rb)2NHC(＝O)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)O-、-C(＝O)N(X-R2)-、-CH2N(X-R2)C(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)-、-CH2NRbC(＝O)NH-、-CH2NRbC(＝O)NRb-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中各Rb独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基；且
X为-CH2-三唑基-C1-4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-C4-6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-或-CH2-三唑基-C1-4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-，其中各n独立地为1、2或3。
13.如权利要求1至12中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中该附接基团由包含至少一个反应性基团的反应形成。
14.如权利要求1至13中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中该附接基团通过使以下反应而形成：
第一反应性基团，其附接至接头，及
第二反应性基团，其附接至该抗体或为该抗体的氨基酸残基。
15.如权利要求13或14所述的抗体-药物缀合物，其中该反应性基团中的至少一个包含：
硫醇，
马来酰亚胺，
卤乙酰胺，
叠氮基，
炔，
环辛烯，
三芳基膦，
氧杂降冰片二烯，
环辛炔，
二芳基四嗪，
单芳基四嗪，
降冰片烯，
醛，
羟胺，
肼，
NH2-NH-C(＝O)-，
酮，
乙烯基砜，
氮丙啶，
氨基酸残基，
Figure FDA0003410186100000071
-ONH2、-NH2、
Figure FDA0003410186100000072
Figure FDA0003410186100000073
-N3、
Figure FDA0003410186100000074
-SH、-SR3、-SSR4、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、
Figure FDA0003410186100000075
-C(O)NHNH2、
Figure FDA0003410186100000076
Figure FDA0003410186100000081
其中：
各R3独立地选自H及C1-C6烷基；
各R4为2-吡啶基或4-吡啶基；
各R5独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；
各R6独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；
各R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、-C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基及-C(＝O)OH取代的C1-4烷基。
16.如权利要求14或15所述的抗体-药物缀合物，其中该第一反应性基团及该第二反应性基团包含：
硫醇及马来酰亚胺，
硫醇及卤乙酰胺，
硫醇及乙烯基砜，
硫醇及氮丙啶，
叠氮基及炔，
叠氮基及环辛炔，
叠氮基及环辛烯，
叠氮基及三芳基膦，
叠氮基及氧杂降冰片二烯，
二芳基四嗪及环辛烯，
单芳基四嗪及降冰片烯，
醛及羟胺，
醛及肼，
醛及NH2-NH-C(＝O)-，
酮及羟胺，
酮及肼，
酮及NH2-NH-C(＝O)-，
羟胺及
Figure FDA0003410186100000091
胺及
Figure FDA0003410186100000092
Figure FDA0003410186100000093
或者
CoA或CoA类似物及丝氨酸残基。
17.如权利要求1至16中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中该附接基团包含选自以下的基团：
Figure FDA0003410186100000101
Figure FDA0003410186100000111
Figure FDA0003410186100000121
酰胺；
Figure FDA0003410186100000122
Figure FDA0003410186100000131
Figure FDA0003410186100000132
和
二硫化物，
其中：
R32为H、C1-4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；
R35为H、C1-6烷基、苯基或用1至3个-OH基团取代的C1-4烷基；
各R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、-C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基及-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R37独立地选自H、苯基及吡啶；
q为0、1、2或3；
R8为H或甲基；且
R9为H、-CH3或苯基。
18.如权利要求1至17中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中该肽基团包含1至4个氨基酸残基、1至3个氨基酸残基或1至2个氨基酸残基。
19.如权利要求1至17中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中该氨基酸残基选自L-甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-半胱氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-甲硫氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)及L-酪氨酸(Tyr)。
20.如权利要求1至17中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中该肽基团包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Leu-Cit、磺基-Ala-Val和/或磺基-Ala-Val-Ala。
21.如权利要求1至17中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中Lp选自：
Figure FDA0003410186100000141
22.如权利要求1至21中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中-(L-D)包含下式的化合物或由下式的化合物形成：
(1)
Figure FDA0003410186100000142
其中：
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000143
Figure FDA0003410186100000144
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(2)
Figure FDA0003410186100000145
其中：
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000151
Figure FDA0003410186100000152
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(3)
Figure FDA0003410186100000153
其中：
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000154
Figure FDA0003410186100000155
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(4)
Figure FDA0003410186100000156
其中：
各R独立地选自H、-CH3及-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000161
Figure FDA0003410186100000162
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(5)
Figure FDA0003410186100000163
其中：
各R独立地选自H、-CH3及-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000164
Figure FDA0003410186100000165
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(6)
Figure FDA0003410186100000171
其中：
Xa为-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-，且各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000172
Figure FDA0003410186100000173
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(7)
Figure FDA0003410186100000174
其中：
R为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000175
Figure FDA0003410186100000176
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(8)
Figure FDA0003410186100000181
其中：
Xb为-CH2-、-OCH2-、-NHCH2-或-NRCH2-，且各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000182
Figure FDA0003410186100000183
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(9)
Figure FDA0003410186100000184
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000185
Figure FDA0003410186100000186
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(10)
Figure FDA0003410186100000187
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000191
Figure FDA0003410186100000192
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(11)
Figure FDA0003410186100000193
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000194
Figure FDA0003410186100000195
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(12)
Figure FDA0003410186100000196
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000197
Figure FDA0003410186100000198
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(13)
Figure FDA0003410186100000201
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000202
Figure FDA0003410186100000203
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(14)
Figure FDA0003410186100000204
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000205
Figure FDA0003410186100000206
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；
(15)
Figure FDA0003410186100000211
其中：
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000212
Figure FDA0003410186100000213
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂；或
(16)
Figure FDA0003410186100000214
其中：
各R独立地为H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
A为键、-OC(＝O)-*、
Figure FDA0003410186100000215
Figure FDA0003410186100000216
-OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中各Ra独立地选自H、C1-C6烷基及C3-C8环烷基，且A的*指示附接至D的点；且
D为Mcl-1抑制剂。
23.如权利要求1至22中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中A为键。
24.如权利要求1至23中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中R为-CH3。
25.如权利要求1至24中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D包含式(I)的化合物：
Figure FDA0003410186100000221
其中：
环D0为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，
环E0为呋喃基、噻吩基或吡咯基环，
X01、X03、X04及X05彼此独立地为碳原子或氮原子，
X02为C-R026基团或氮原子，
Figure FDA0003410186100000222
意指环为芳族的，
Y0为氮原子或C-R03基团，
Z0为氮原子或C-R04基团，
R01为卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、羟基(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-Cy08、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-R012、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
R02、R03、R04及R05彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、羟基(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-R031、-O-(C1-C6)烷基-R012、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或(R01，R02)、(R02，R03)、(R03，R04)或(R04，R05)对与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中所得环任选地用1或2个选自以下的基团取代：卤素、直链或支链(C1-C6)烷基、(C0-C6)烷基-NR011R011'、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01或氧代，
R06及R07彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-R012、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或(R06，R07)对，当与两个相邻碳原子稠合时，与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中所得环任选地用直链或支链(C1-C6)烷基、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01或氧代取代，
W0为-CH2-基团、-NH-基团或氧原子，
R08为氢原子、直链或支链(C1-C8)烷基、-CHR0aR0b基团、芳基、杂芳基、芳基(C1-C6)烷基或杂芳基(C1-C6)烷基，
R09为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、-Cy02、-(C1-C6)烷基-Cy02、-(C2-C6)烯基-Cy02、-(C2-C6)炔基-Cy02、-Cy02-Cy03、-(C2-C6)炔基-O-Cy02、-Cy02-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy03、卤素原子、氰基、-C(O)-R014或-C(O)-NR014R014'，
R010为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、芳基(C1-C6)烷基、(C1-C6)环烷基烷基、直链或支链(C1-C6)卤烷基或-(C1-C6)烷基-O-Cy04，
或(R09，R010)对，当与两个相邻碳原子稠合时，与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，
R011及R011'彼此独立地为氢原子、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基或-(C0-C6)烷基-Cy01，
或(R011，R011')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除该氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中该N原子可用1或2个选自直链或支链(C1-C6)烷基的基团取代，且其中该直链或支链(C1-C6)烷基的一个或多个碳原子任选地氘化，
R012为-Cy05、-Cy05-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-NR011-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-Cy06-O-(C0-C6)烷基-Cy07、-Cy05-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy09、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy09、-NH-C(O)-NH-R011、-Cy05-(C0-C6)烷基-NR011-(C0-C6)烷基-Cy09、-C(O)-NR011R011'、-NR011R011'、-OR011、-NR011-C(O)-R011'、-O-(C1-C6)烷基-OR011、-SO2-R011、-C(O)-OR011，
R013、R013'、R014及R014'彼此独立地为氢原子或任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基，
R0a为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
R0b为-O-C(O)-O-R0c基团、-O-C(O)-NR0cR0c'基团或-O-P(O)(OR0c)2基团，
R0c及R0c'彼此独立地为氢原子、直链或支链(C1-C8)烷基、环烷基、(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧羰基(C1-C6)烷基，
或(R0c，R0c')对与其所附接的氮原子一起形成由5至7个环成员构成的非芳环，其除该氮原子之外可含有1至3个选自氧及氮的杂原子，其中该氮任选地用直链或支链(C1-C6)烷基取代，
Cy01、Cy02、Cy03、Cy04、Cy05、Cy06、Cy07、Cy08及Cy010彼此独立地为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一者任选地被取代，
Cy09为
Figure FDA0003410186100000251
或Cy09为杂芳基，其用选自以下的基团取代：-O-P(O)(OR020)2；-O-P(O)(O-M+)2；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；及-U0-(CH2)q0-NR021R021'，
R015为氢原子；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020基团；直链或支链(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基；-U0-(CH2)q0-NR021R021'基团；或-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基，
R016为氢原子；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；(CH2)r0-U0-V0-O-P(O)(OR020)2基团；-O-P(O)(O-M+)2基团；-O-S(O)2OR020基团；-S(O)2OR020基团；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020基团；-(CH2)p0-O-C(O)-NR022R023基团；或-U0-(CH2)q0-NR021R021'基团，
R017为氢原子；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020基团；-CH2-P(O)(OR020)2基团、-O-P(O)(OR020)2基团；-O-P(O)(O-M+)2基团；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；-U0-(CH2)q0-NR021R021'基团；或醛糖酸，
M+为药学上可接受的单价阳离子，
U0为键或氧原子，
V0为-(CH2)s0-基团或-C(O)-基团，
R018为氢原子或(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，
R019为氢原子或羟基(C1-C6)烷基，
R020为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
R021及R021'彼此独立地为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或羟基(C1-C6)烷基，
或(R021，R021')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除该氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中所得环任选地用氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基取代，
R022为(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基、-(CH2)p0-NR024R024'基团或-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R20基团，
R023为氢原子或(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，
或(R022，R023)对与其所附接的氮原子一起形成含有5至18个环成员的芳环或非芳环，其除该氮原子之外任选地含有1至5个选自O、S及N的杂原子，其中所得环任选地用氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或杂环烷基取代，
R024及R024'彼此独立地为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
或(R024，R024')对与其所附接的氮原子一起形成由5至7个环成员构成的芳环或非芳环，其除该氮原子之外可含有1至3个选自O、S及N的杂原子，且其中所得环任选地用氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基取代，
R025为氢原子、羟基或羟基(C1-C6)烷基，
R026为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基或氰基，
R027为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
R028为-O-P(O)(O-)(O-)基团、-O-P(O)(O-)(OR030)基团、-O-P(O)(OR030)(OR030')基团、-(CH2)p0-O-SO2-O-基团、-(CH2)p0-SO2-O-基团、-(CH2)p0-O-SO2-OR030基团、-Cy010、-(CH2)p0-SO2-OR030基团、-O-C(O)-R029基团、-O-C(O)-OR029基团或-O-C(O)-NR029R029'基团；
R029及R029'彼此独立地为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或直链或支链氨基(C1-C6)烷基，
R030及R030'彼此独立地为氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基(C1-C6)烷基，
R031为
Figure FDA0003410186100000271
Figure FDA0003410186100000272
其中铵任选地以两性离子形式存在或具有单价阴离子抗衡离子，
n0为等于0或1的整数，
p0为等于0、1、2或3的整数，
q0为等于1、2、3或4的整数，
r0及s0独立地为等于0或1的整数；
其中如果存在，则R03、R09或R012基团中的至多一个共价附接至该接头，且
其中原子的化合价凭借一个或多个与其键合的取代基而不被超过，
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
26.如权利要求25所述的抗体-药物缀合物，其中Cy01、Cy02、Cy03、Cy04、Cy05、Cy06、Cy07、Cy08及Cy010彼此独立地为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一者任选地用一个或多个选自以下的基团取代：卤基；-(C1-C6)烷氧基；-(C1-C6)卤烷基；-(C1-C6)卤烷氧基；-(CH2)p0-O-SO2-OR030；-(CH2)p0-SO2-OR030；-O-P(O)(OR020)2；-O-P(O)(O-M+)2；-CH2-P(O)(OR020)2；-(CH2)p0-O-(CHR018-CHR019-O)q0-R020；羟基；羟基(C1-C6)烷基；-(CH2)r0-U0-(CH2)s0-杂环烷基；或-U0-(CH2)q0-NR021R021'。
27.如权利要求1至26中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D包含式(II)化合物：
Figure FDA0003410186100000281
其中：
Z0为氮原子或C-R04基团，
R01为卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、-Cy08、-NR011R011'，
R02、R03及R04彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'、-O-(C1-C6)烷基-R031、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或该(R02，R03)或(R03，R04)对与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中该环任选地用选自以下的基团取代：直链或支链(C1-C6)烷基、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01及氧代，
R06及R07彼此独立地为氢原子、卤素原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)卤烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-(C0-C6)烷基-NR011R011'、-O-Cy01、-(C0-C6)烷基-Cy01、-(C2-C6)烯基-Cy01、-(C2-C6)炔基-Cy01、-O-(C1-C6)烷基-R012、-C(O)-OR011、-O-C(O)-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011-C(O)-R011'、-NR011-C(O)-OR011'、-(C1-C6)烷基-NR011-C(O)-R011'、-SO2-NR011R011'或-SO2-(C1-C6)烷基，
或该(R06，R07)对，当与两个相邻碳原子稠合时，与其所附接的碳原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，且其中该所得环任选地用选自以下的基团取代：直链或支链(C1-C6)烷基、-NR013R013'、-(C0-C6)烷基-Cy01及氧代，
R08为氢原子、直链或支链(C1-C8)烷基、芳基、杂芳基、芳基-(C1-C6)烷基或杂芳基(C1-C6)烷基，
R09为直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、-Cy02、-(C1-C6)烷基-Cy02、-(C2-C6)烯基-Cy02、-(C2-C6)炔基-Cy02、-Cy02-Cy03、-(C2-C6)炔基-O-Cy02、-Cy02-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy03、卤素原子、氰基、-C(O)-R014、-C(O)-NR014R014'，
R011及R011'彼此独立地为氢原子、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基或-(C0-C6)烷基-Cy01，
或该(R011，R011')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中N原子任选地用直链或支链(C1-C6)烷基取代，且其中该直链或支链(C1-C6)烷基的一个或多个碳原子任选地氘化，
R012为-Cy05、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-O-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-(C0-C6)烷基-NR011-(C0-C6)烷基-Cy06、-Cy05-Cy06-O-(C0-C6)烷基-Cy07、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy09、-NH-C(O)-NH-R011、-C(O)-NR011R011'、-NR011R011'、-OR011、-NR011-C(O)-R011'、-O-(C1-C6)烷基-OR011、-SO2-R011或-C(O)-OR011，
R013、R013'、R014及R014'彼此独立地为氢原子或任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基，
Cy01、Cy02、Cy03、Cy05、Cy06、Cy07及Cy08彼此独立地为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一者任选地被取代，
Cy09为
Figure FDA0003410186100000301
其中R015、R016及R017如关于式(I)所定义，
R031为
Figure FDA0003410186100000302
其中R027及R028如关于式(I)所定义，
其中如果存在，则R03、R09或R012基团中的至多一个共价附接至该接头，
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
28.如权利要求1至27中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D包含式(III)化合物：
Figure FDA0003410186100000311
其中：
R01为直链或支链(C1-C6)烷基，
R03为-O-(C1-C6)烷基-NR011R011'或
Figure FDA0003410186100000312
其中R011及R011'彼此独立地为氢原子、任选地取代的直链或支链(C1-C6)烷基或-(C0-C6)烷基-Cy01；
或该(R011，R011')对与其所附接的氮原子一起形成含有5至7个环成员的芳环或非芳环，其除该氮原子之外任选地含有1至3个选自O、S及N的杂原子，其中该N原子可用1或2个选自氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基的基团取代，
且其中R027为氢原子，且R028为-(CH2)p0-O-SO2-O-基团或-(CH2)p0-SO2-OR030基团；
R09为直链或支链(C2-C6)炔基或-Cy02，
R012为-Cy05、-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy06或-Cy05-(C0-C6)烷基-Cy09，
Cy01、Cy02、Cy05及Cy06彼此独立地为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一者任选地被取代，
Cy09为
Figure FDA0003410186100000321
R015、R016及R017如关于式(I)所定义，
其中如果存在，则R03、R09或R012基团中的至多一个共价附接至该接头，
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
29.如权利要求28所述的抗体-药物缀合物，其中R01为甲基或乙基。
30.如权利要求28所述的抗体-药物缀合物，其中R03为-O-CH2-CH2-NR011R011'，其中R011及R011'与携带其的氮原子一起形成哌嗪基，其可用作为氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基的基团取代。
31.如权利要求28所述的抗体-药物缀合物，其中R03包含下式：
Figure FDA0003410186100000322
其中R027为氢原子，且R028为-(CH2)p0-SO2-OR030基团。
32.如权利要求28所述的抗体-药物缀合物，其中R03包含下式：
Figure FDA0003410186100000331
其中-*为与该接头的键。
33.如权利要求28所述的抗体-药物缀合物，其中R09为Cy02。
34.如权利要求33所述的抗体-药物缀合物，其中Cy02为任选地取代的芳基。
35.如权利要求28所述的抗体-药物缀合物，其中Cy05包含选自吡唑基及嘧啶基的杂芳基。
36.如权利要求28所述的抗体-药物缀合物，其中Cy05为嘧啶基。
37.如权利要求1至36中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述L通过L与式(I)、(II)或(III)的R03的共价键附接至D；或所述L通过L与式(I)、(II)或(III)的R09的共价键附接至D。
38.如权利要求1至37中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中：
(1)D包含：
Figure FDA0003410186100000332
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(2)D包含：
Figure FDA0003410186100000341
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(3)D包含：
Figure FDA0003410186100000342
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(4)D包含：
Figure FDA0003410186100000343
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(5)D包含：
Figure FDA0003410186100000351
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(6)D包含：
Figure FDA0003410186100000352
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(7)D包含：
Figure FDA0003410186100000353
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(8)D包含：
Figure FDA0003410186100000361
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(9)D包含：
Figure FDA0003410186100000362
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(10)D包含：
Figure FDA0003410186100000363
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(11)D包含：
Figure FDA0003410186100000371
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(12)D包含：
Figure FDA0003410186100000372
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；或
(13)D包含：
Figure FDA0003410186100000373
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(14)D包含：
Figure FDA0003410186100000381
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(15)D包含：
Figure FDA0003410186100000382
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；
(16)D包含：
Figure FDA0003410186100000383
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐；或
(17)D包含：
Figure FDA0003410186100000391
或前述任一的对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐。
39.如权利要求1至38中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中-(L-D)由选自表A的化合物或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘化衍生物和/或药学上可接受的盐形成。
40.一种抗CD74抗体或抗原结合片段，其包含如下三个重链CDR及三个轻链CDR：
(i)由SEQ ID NO:1组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(ii)由SEQ ID NO:4组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(iii)由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:19组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:21组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(iv)由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:22组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(v)由SEQ ID NO:1组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:35组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(vi)由SEQ ID NO:4组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:35组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(vi)由SEQ ID NO:4组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:35组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(vii)由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:22组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:21组成的轻链CDR3(LCDR3)；或
(viii)由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)。
41.如权利要求40所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗CD74抗体或其抗原结合片段包含：
(i)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区；
(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区；
(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区；
(iv)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变区；
(v)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区；或
(vi)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变区。
42.如权利要求40或41所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗CD74抗体包含：
(a)SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:29的轻链氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:29的轻链氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:29的轻链氨基酸序列；
(g)SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:33的轻链氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:33的轻链氨基酸序列；
(i)SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:33的轻链氨基酸序列；
(j)SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:38的轻链氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:38的轻链氨基酸序列；
(l)SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:38的轻链氨基酸序列；
(m)SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:42的轻链氨基酸序列；
(n)SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:42的轻链氨基酸序列；
(o)SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:42的轻链氨基酸序列；
(p)SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:46的轻链氨基酸序列；
(q)SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:46的轻链氨基酸序列；或
(r)SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:46的轻链氨基酸序列。
43.一种核酸，其编码如权利要求40至42中任一项所述的抗体。
44.一种载体，其包含如权利要求43所述的核酸。
45.一种细胞系，其包含如权利要求44所述的载体或如权利要求43所述的核酸。
46.一种制备如权利要求40至42中任一项所述的抗体的方法，其包含在适合条件下生长如权利要求45所述的细胞系以表达该抗体，随后纯化及分离该抗体。
47.如权利要求1至39中任一项所述的抗体药物缀合物，其中该抗CD74抗体包含如权利要求40至42中任一项所述的抗体。
48.一种组合物，其包含如权利要求1至39及47中任一项所述的抗体-药物缀合物的多个复本，其中该组合物中的该抗体-药物缀合物的平均p为约2至约16，例如约2至约8，例如约2至约4。
49.一种药物组合物，其包含如权利要求1至39及47中任一项所述的抗体-药物缀合物或如权利要求48所述的组合物及药学上可接受的载体。
50.一种治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的如权利要求1至39及47中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求48所述的组合物或如权利要求49所述的药物组合物。
51.如权利要求50所述的方法，其中该癌症表达CD74。
52.如权利要求50或51所述的方法，其中该癌症为肿瘤或血液癌症，优选地，该癌症为乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
53.一种减少或抑制受试者中肿瘤生长的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的如权利要求1至39及47中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求48所述的组合物或如权利要求49所述的药物组合物。
54.如权利要求53所述的方法，其中该肿瘤表达CD74。
55.如权利要求53或54所述的方法，其中该肿瘤为乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
56.如权利要求53至55中任一项所述的方法，其中该抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用将该肿瘤生长减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
57.一种减少受试者的癌细胞群体或减慢受试者的癌细胞群体的扩增的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的如权利要求1至39及47中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求48所述的组合物或如权利要求49所述的药物组合物。
58.如权利要求57所述的方法，其中该癌细胞群体表达CD74。
59.如权利要求57或58所述的方法，其中该癌细胞群体来自肿瘤或血液癌症，优选地，该癌细胞群体来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
60.如权利要求57至59中任一项所述的方法，其中该抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用将该癌细胞群体的扩增减少或减慢至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
61.一种确定患有或疑似患有癌症的受试者是否对用如权利要求1至39及47中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求48所述的组合物或如权利要求49所述的药物组合物的治疗有反应的方法，其包括提供来自该受试者的生物样品；使该样品与该抗体-药物缀合物接触；及检测该样品中该抗体-药物缀合物与癌细胞的结合。
62.如权利要求61所述的方法，其中该样品中的该癌细胞表达CD74。
63.如权利要求61或权利要求62所述的方法，其中该癌症表达CD74。
64.如权利要求61至63中任一项所述的方法，其中该癌症为肿瘤或血液癌症，优选地，该癌症为乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
65.如权利要求61至64中任一项所述的方法，其中该样品为组织活检样品、血液样品或骨髓样品。
66.一种制备如权利要求1至39及47中任一项所述的抗体-药物缀合物的方法，其包括在允许缀合的条件下使抗体或抗原结合片段与接合至MCL1抑制剂的可裂解接头反应。
67.如权利要求50至60中任一项所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用至少一种另外的治疗剂，优选地，该一种另外的治疗剂为Bcl-2抑制剂，更优选地，该一种另外的治疗剂为维奈托克、化合物A1或化合物A2。
68.一种式(1)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)p (1)
其中：
Ab为抗CD74抗体或其抗原结合片段，任选地其中该Ab为Fc沉默抗体；
p为1至16的整数；
L为接头；且
D为MCL1抑制剂化合物。
69.一种治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求68所述的抗体-药物缀合物与Bcl-2抑制剂的组合，其中该疾病或病症由CD74介导。
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