CN114720576A

CN114720576A - 一种贝母属药材中甾体生物碱富集纯化的方法

Info

Publication number: CN114720576A
Application number: CN202110006630.XA
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 司玮; 刘艳芳; 沈爱金; 俞冬萍; 郭志谋
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2021-01-05
Filing date: 2021-01-05
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2041-01-05
Also published as: CN114720576B

Abstract

本发明涉及贝母属药材中甾体生物碱的富集纯化方法，属于中药提取物的纯化技术领域。本发明首次基于一种全氟辛基固定相实现甾体生物碱的富集纯化，可以有效地对贝母属药材中生物碱类活性成分进行精制。本发明可以简便、快速、高效地实现贝母属药材中甾体类生物碱类活性成分的富集，提供高品质、高纯度的甾体生物碱，对于进一步的药效研究和物质基础研究有着重要的应用意义。

Description

一种贝母属药材中甾体生物碱富集纯化的方法

技术领域

本发明涉及贝母属药材中甾体生物碱的富集纯化方法，属于中药提取物的纯化技术领域。

背景技术

甾体类生物碱是一类天然甾体的含氮衍生物，根据结构甾体骨架可以分为孕甾烷生物碱、环孕甾烷生物碱和胆甾烷生物碱三大类。胆甾烷生物碱又可分为胆甾烷类和异胆甾烷类，主要分布在茄科茄属和百合科贝母属及藜芦属植物中。其母核由1,2苯芴和一个含氮杂环骈合而成，这类生物碱是一类重要的活性成分，在抗肿瘤、调节免疫、抗病毒、降压、镇咳等方面具有广泛的药理活性。植物来源中药中含有的甾体类生物碱主要包括环巴胺、贝母素甲、贝母素乙、贝母碱、西贝素、贝母辛、蒲贝酮碱等。研究表明，环巴胺是一种Hedgehog通路抑制剂，在抗肿瘤方面有良好的活性[周剑侠等.异甾体生物碱——环巴胺的研究进展[J].中国天然药物,2006(06):468-472.]。贝母中甾体生物碱，根据结构类型，其中贝母辛与环巴胺母核结构相同，属于介藜芦型类，在抗肿瘤及平喘方面有较好的活性；贝母素甲、贝母素乙、西贝素等属于瑟文型具有降压、抗菌、松弛平滑肌等作用。甾体生物碱类成分作为贝母中止咳平喘、抗肿瘤等药理作用的主要活性成分，含量极低，总生物碱含量平均在0.1％左右，此类成分的有效富集对于后续对单体纯化制备及进一步药效研究提供基础。此外，甾体生物碱作为类脂化合物中一类，极性相对较弱，从结构上看，其母核中基本无共轭体系而无紫外吸收，贝母中另一种主要成分甾体皂苷类同样无紫外吸收，且两类成分疏水保留相似，对微量生物碱成分的分析有干扰，不利于活性成分的质量控制及中药标准化，因此提供高纯度的甾体生物碱类组分有重要意义。

传统生物碱富集及纯化采用酸提碱沉、液液萃取、树脂吸附及硅胶柱层析等方法。但酸提碱沉及硅胶柱层析往往回收率低，需要反复多次操作，溶剂消耗量大；液液萃取在pH调整过程中，对于pH敏感的成分可能造成不可逆的结构改变。树脂吸附法常用离子交换树脂和大孔树脂，刘等采用阳离子交换树脂柱优化川贝母总生物碱的纯化工艺[刘元涛等.辽宁中医杂志,2016,43(03):583-586.]，离子交换树脂可以选择性吸附碱性化合物，但死吸附严重，洗脱过程引入高离子强度洗脱剂，后处理困难，且微量生物碱回收率低。王等采用大孔树脂基于反相模式对贝母中生物碱进行富集[Wang DD et al.Biomed ResInt.2014.]，但贝母中除了甾体生物碱外，还含有与之极性类似的甾体皂苷成分，常规反相模式较难达到纯度较高的富集的效果。此外，甾体生物碱疏水性强，在高水相中较难溶解，对传统反相模式富集甾体生物碱造成一定阻碍。因此需要更合适的分离模式达到更好的富集纯化效果。

含氟辛基固定相作为一种改性反相固定相，当流动相体系中不含有缓冲盐时，对碱性化合物具有极强的保留，当体系中引入缓冲盐后，可以实现碱性化合物的洗脱。因此，采用含氟辛基固定相，通过纯有机溶剂模式(即无水或非水模式)上样提高弱极性生物碱样品溶解性，以纯有机溶剂快速洗脱非碱性物质，实现碱性化合物的选择性富集，为提供高纯度、高品质的甾体类生物碱组分具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种全新的纯有机相条件下(即无水或非水模式)富集纯化贝母属药材中甾体生物碱的方法。

具体技术方案为：

利用全氟辛基固定相在纯有机相中对碱性化合物保留强，中性和酸性化合物保留弱；引入缓冲盐后，生物碱快速洗脱的特点。在非水模式下，保证疏水性生物碱成分溶解度的前提下，通过调整缓冲盐的使用，从中药提取物中富集纯化疏水性生物碱，提供一种新的、快速、有效的富集贝母属药材中甾体生物碱的方法，其特征包括如下步骤：

1)贝母总提物制备：用药材质量10-20倍(药材g/mL)体积的溶剂提取，提取溶剂为有机溶剂或体积浓度70％以上的有机溶剂水溶液中的一种，有机溶剂为甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或两种以上任意组合，回流提取或超声提取，提取后固液分离，每次提取时间30-180分钟，固体产物再次加入药材质量10-20倍(药材g/mL)体积的提取溶剂进行提取和固液分离操作0-2次，共提取1-3次，合并提取液，得总提取液，在30-70℃浓缩至总提取液体积1/10-1/200，冻干得总提取物。

2)甾体生物碱类组分制备：采用全氟辛基固定相为填料的固相萃取柱或者色谱柱；采用纯有机相条件(即无水或非水模式)上样，以纯甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种或二种以上任意组合洗脱3-10倍柱体积，除去非生物碱类成分；以终浓度5mM-50mM/L甲酸铵、乙酸铵、碳酸氢铵、高氯酸铵、高氯酸钠中的一种或两种组合的上述有机溶剂，其中不添加或添加有终体积浓度0.1％-0.5％的甲酸、乙酸、碳酸、高氯酸中的一种或两种组合洗脱3-10倍柱体积，得到甾体生物碱类组分。

3)类组分分析：采用高效液相色谱-飞行时间质谱进行分析。

以粒径1.5-5μm十八烷基键合硅胶固定相为色谱柱；柱温为20℃～50℃；流速为0.2mL/min～0.4mL/min；以乙腈溶液为流动相A，以0.05％-0.2％甲酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。

洗脱梯度条件：0～15min，8％A～25％A；15～17min，25％A～45％A；17～25min，45％A～90％A；25～30min，90％A～100％A。

正离子模式下采集，扫描范围从m/z 100到m/z1500，碰撞能为40eV，干燥气温度设为350℃，流速为8L/min，喷雾器压为35psi，毛细管电压为3500V，碎裂电压为175V。

本发明的优点如下：

1.本发明首次基于全氟辛基固定相实现贝母中甾体生物碱的高选择性富集。

2.本发明首次在纯有机相条件下实现贝母中甾体生物碱的高选择性富集，克服了甾体类生物碱在含水溶液中溶解度低的问题，对于其他疏水性生物碱类成分的富集也具有很好的借鉴意义。

3.本发明通过简单地添加低浓度、可挥发的缓冲盐，实现生物碱的高效洗脱，有利于样品后处理。

4.本发明的富集方法快速、简单、高效，获得高品种、高纯度的甾体类生物碱活性成分，对于进一步的药效研究和物质基础研究有着重要的应用意义。

附图说明

图1为FC8HL色谱柱甾体生物碱及甾体皂苷标准品提取离子流图；

图2为浙贝母中主要生物碱的富集验证；

图3为浙贝母总提物中异甾体生物碱及非生物碱在不同洗脱馏分中分布；

图4为平贝母中主要生物碱的富集验证；

图5为平贝母总提物中异甾体生物碱及非生物碱在不同洗脱馏分中分布；

图6为炉贝中主要生物碱的富集验证；

图7为炉贝总提物中异甾体生物碱及非生物碱在不同洗脱馏分中分布；

图8为常规C18色谱柱甾体生物碱及甾体皂苷标准品提取离子流图

具体实施方式

下面结合实例，对本发明的技术方案作进一步解释和说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

仪器：Waters Alliance高效液相色谱仪(2695梯度泵，2998二极管阵列检测器，自动进样器，柱恒温系统，Empower色谱工作站)。

试剂：甲醇(色谱纯，Merck，德国)，甲酸铵(色谱纯，Sigma-Aldrich)，甲酸(色谱纯，Sigma-Aldrich)，甲醇(色谱纯，迈瑞尔，中国)，实验用水为Mill-Q纯水系统生成；其余试剂均为分析纯。

对照品：贝母素甲、贝母素乙、贝母辛、梭砂贝母碱、知母皂苷BII、知母皂苷AIII及薯蓣皂苷均购自成都普瑞法科技开发有限公司。

样品：炉贝、浙贝母、平贝母药材购自药材市场。

固定相FC8HL的制备：向250mL烧瓶中加入10.3g水合硅胶(硅胶吸水率3％)，加入100mL二甲苯搅拌均匀，然后滴加5.5g 1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷(摩尔数为11mmol)和4.1g 2-(4-氯磺酰苯基)乙基三氯硅烷(摩尔数为12mmol)混合物，在30℃下反应3小时，过滤，依次用二氯甲烷、甲醇、体积比1：1的甲醇水、甲醇、四氢呋喃洗涤，所得固体于干燥箱中80℃条件下干燥24小时，得到固定相FC8HL，结构如下：

每g硅胶含氟烷基链含量1.1mmol，极性基团1.2mmol；以上述制备的固定相为填料装填成FC8HL色谱柱应用于下述实施例中；

本发明中所述的异甾体生物碱，涉及到从中药或其他天然植物中所提取的产物，如贝母素甲、贝母素乙、贝母辛、西贝素、贝母酮碱等天然来源化合物进行富集纯化。

甾体生物碱通过高效液相色谱进行富集纯化，考虑甾体生物碱极性弱，因此采用非水条件上样，在非水模式下进行，改善样品溶解性同时提高上样量。

实施例1

实施方法

1.对照品制备：分别取异甾体生物碱对照品贝母素甲、贝母素乙、贝母辛及梭砂贝母碱，甾体皂苷对照品知母皂苷BII、知母皂苷AIII及薯蓣皂苷适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含对照品1000μg的储备液；各储备液以甲醇稀释为各成分浓度为10μg/mL的混合标准品溶液，过0.22μm有机膜除杂后分析。

2.分析条件：

仪器：Agilent 1290 UHPLC-QToF6540

色谱柱：FC8HL(Acchrom-Tech，4.6×100mm，填料粒径5μm)

流速：1.5mL/min(分流)

柱温：40℃

进样量：4μL

波长采集范围：190nm-400nm

质谱参数：正离子模式下采集，扫描范围从m/z 100到m/z1500，碰撞能为40eV，干燥气温度设为350℃，流速为8L/min，喷雾器压为35psi，

毛细管电压为3500V，碎裂电压为175V。

流动相：A.甲醇B.10mM乙酸铵/甲醇溶液

梯度：

3.通过提取离子图判断生物碱与非生物碱的保留：提取各生物碱质荷比416.3523，428.3159，430.3316，432.3472；提取各非生物碱质荷比741.4420，869.4893，921.5054(图1)。

4.结果：经标准品验证，非生物碱在前4分钟甲醇条件下快速洗脱，生物碱仍然吸附在色谱柱上；有机溶剂中引入乙酸铵后生物碱迅速洗脱，互相无交叉干扰。

实施例2

实施方法

1.样品制备：将浙贝母药材，用15倍(药材g/mL溶剂)体积浓度90％乙醇回流提取120分钟，固液分离，提取液在50℃浓缩至提取液体积的1/10后，冻干得总提取物。

2.供试品溶液制备：取浙贝母总提取物适量，加适量甲醇，超声溶解制成每1mL含200mg总提取物的溶液。

3.固相萃取过程：取20g FC8HL固相萃取(SPE)柱，分别以3倍柱体积甲醇活化、平衡，总提物以1％上样量上样(g/g)；以5倍柱体积甲醇淋洗SPE柱，洗脱非生物碱成分(F1)；以5倍柱体积含体积浓度0.1％甲酸的20mM甲酸铵/甲醇溶液淋洗SPE柱，洗脱得生物碱成分(F2)。

4.样品处理：收集不同洗脱部分，通过质谱分析验证生物碱富集情况。

5.数据分析：

1)通过特征异甾体生物碱离子提取，验证浙贝母中生物碱在色谱柱上保留(图2)。

2)根据氮规则，统计生物碱和非生物碱在两部分中的分布(图3)。

6.结果：经验证，浙贝母样品上样量1％时，非生物碱部分(F1)中基本不含生物碱，提取后积分面积之和占生物碱部分(F2)的0.23％，可以忽略不记，并且回收率较高，可以有效地对生物碱进行富集。

表1浙贝母异甾体生物碱穿透情况及富集回收率

实施例3

实施方法

1.样品制备：将平贝母药材，用15倍(药材g/mL溶剂)体积浓度90％乙醇回流提取120分钟，固液分离，提取液在50℃浓缩至提取液体积的1/10后，冻干得总提取物。

2.供试品溶液制备：取平贝母总提取物适量，加适量甲醇，超声溶解制成每1mL含125mg总提取物的溶液。

3.液相分析条件：

仪器：Alliance e2695-2489

色谱柱：FC8HL(Acchrom-Tech，4.6×100mm，5μm)

流速：1.5mL/min

柱温：40℃

进样量：125μL

波长采集范围：190nm-400nm

提取波长：210nm，280nm

流动相：A.甲醇B.20mM甲酸铵/甲醇(含体积浓度0.1％甲酸)

梯度：

4.样品处理：收集不同流动相洗脱部分，通过质谱分析验证生物碱富集情况。

5.数据分析：

1)通过特征异甾体生物碱离子提取，验证平贝母中生物碱在色谱柱上保留(图4)。

2)根据氮规则，统计生物碱和非生物碱在两部分中的分布(图5)。

3)通过对总提物及富集生物碱馏分中提取主要生物碱面积进行回收率计算(表1)。

6.结果：经验证，平贝母样品上样量2.5％时，可以有效地对生物碱进行富集，非生物碱部分(F1)中不含生物碱成分，并且回收率较高。

表2平贝母异甾体生物碱穿透情况及富集回收率

实施例4

实施方法

1.样品制备：将炉贝药材，用15倍(药材g/mL溶剂)体积浓度90％乙醇回流提取120分钟，固液分离，提取液在50℃浓缩至提取液体积的1/10后，冻干得总提取物。

2.供试品溶液制备：取炉贝总提取物适量，加适量甲醇，超声溶解制成每1mL含200mg总提取物的溶液。

3.分析条件：同实施例3。

5.数据分析：

1)通过特征异甾体生物碱离子提取，验证炉贝中生物碱在色谱柱上保留(图6)。

2)根据氮规则，统计生物碱和非生物碱在两部分中的分布(图7)。

3)通过对总提物及富集生物碱馏分中提取主要生物碱面积进行回收率计算(表2)。

6.结果：经验证，炉贝样品在高载样量下(上样量5％)，可以有效地对生物碱进行富集，非生物碱部分(F1)中基本不含生物碱，提取后积分面积之和占生物碱部分(F2)的0.91％，可以忽略不记，并且回收率较高。

表3炉贝异甾体生物碱穿透情况及富集回收率

对比例1

与实施例1的区别在于，以常规C18色谱柱对标准品进行验证，在相同洗脱溶剂条件下，通过质谱分析，提取各物质质荷比(图8)，生物碱与非生物碱在纯有机相溶剂中同时洗脱，生物碱在纯有机相中无法保留，不可进行选择性富集。

Claims

1.一种利用全氟辛基固定相对贝母属药材甾体生物碱富集纯化的方法，其特征在于，在纯有机相条件下(即无水或非水模式)贝母属药材中甾体类生物碱与全氟辛基固定相固定相进行有效地吸附及洗脱，进行甾体类生物碱成分的富集。

2.根据权利要求1所述富集纯化的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)贝母属药材总提取物制备：将贝母药材打粉后，用药材质量10-20倍(药材g/mL)体积的溶剂提取，提取溶剂为有机溶剂或体积浓度70％以上的有机溶剂水溶液中的一种，有机溶剂为甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或两种以上任意组合，回流提取或超声提取，提取后固液分离，每次提取时间30-180分钟，固体产物再次加入药材质量10-20倍(药材g/mL)体积的提取溶剂进行提取和固液分离操作0-2次，共提取1-3次，合并提取液，得总提取液，在30-70℃浓缩至总提取液体积1/10-1/200，冻干得总提取物；

2)甾体生物碱类组分制备：采用全氟辛基固定相为填料的固相萃取柱或者色谱柱；采用纯有机相条件(非水模式)上样，以纯有机试剂洗脱3-10倍柱体积，除去非生物碱类成分；以含缓冲盐的有机试剂洗脱3-10倍柱体积，洗脱甾体生物碱类成分。

3.根据权利要求1或2所述富集纯化的方法，其特征在于，全氟辛基固定相FC8HL为以硅胶为基质，基质表面键合相中含有全氟辛基链及极性基团。

4.根据权利要求3所述富集纯化的方法，其特征在于，全氟辛基固定相上的全氟辛基链是以1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷偶联剂脱除氯后的硅与硅胶表面键合获得，其如下结构：

其中，X为氯，m＝5；每克硅胶上含有0.1-2.5mmol 1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷基团；

全氟辛基固定相上的极性基团是以带磺酸基的硅烷偶联剂脱除氯后的硅与硅胶表面键合获得，其如下结构：

其中，X为氯，R₁是带有苯基的烷基链，除苯基之外的烷基链为C₂H₄，R₂是磺酰氯；每克硅胶上含有0.1-2.0mmol 2-(4-氯磺酰苯基)乙基三氯硅烷。

5.根据权利要求1或2所述富集纯化的方法，其特征在于，贝母属药材总提取物，以纯甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种或两种以上任意组合溶解后上样，以0.1％-5％的上样量(贝母属药材总提取物质量与固定相的质量比)，直接上样。

6.根据权利要求1或2所述富集纯化的方法，其特征在于，采用纯甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种或二种以上作为洗脱溶剂，除去总提物中的非生物碱。

7.根据权利要求1或2所述富集纯化的方法，其特征在于，采用含缓冲盐的甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种或两种以上任意组合作为生物碱洗脱溶剂；

所述生物碱洗脱溶剂中加入的缓冲盐为终浓度5mM-50mM/L甲酸铵、乙酸铵、碳酸氢铵、高氯酸铵、高氯酸钠中的一种或两种组合；

生物碱洗脱溶剂中不添加或添加有终体积浓度0.1％-0.5％的与缓冲盐阴离子对应的酸，为甲酸、乙酸、碳酸、高氯酸中的一种或两种组合。

8.根据权利要求1或2所述富集纯化的方法，其特征在于，甾体生物碱类成分采用高效液相色谱-飞行时间质谱进行分析：

以粒径1.5-5μm十八烷基键合硅胶固定相为色谱柱；柱温为20℃50℃，流速为0.2mL/min～0.4mL/min；以乙腈溶液为流动相A，以体积浓度0.05％-0.2％甲酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱(V/V)，线性梯度设置为0～15min，8％A～25％A；15～17min，25％A～45％A；17～25min，45％A～90％A；25～30min，90％A～100％A；

9.根据权利要求1或2所述富集纯化的方法，其特征在于，所述甾体生物碱具有以下1～5结构式中之一主体结构：

10.根据权利要求1或2所述富集纯化的方法，其特征在于，贝母药材打粉后，取粒径小于60μm颗粒；回流提取温度50-90℃。