CN110501200B - 一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法 - Google Patents
一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，该方法主要是利用超声破壁法提取和智能双水相萃取法分离实现龙葵碱和龙葵多糖两种物质的同步提取和分离，包括制备龙葵碱混合标准品溶液和葡萄糖标准品储备液、超声破壁提取和双水相萃取法分离等步骤，该方法可以同时提取龙葵叶中的龙葵碱和龙葵多糖两种有效成分，并实现二者的分离和测定；该方法中的提取分离试剂可以回收利用；该方法通过高效液相对龙葵碱进行测定，通过紫外分光光度计对龙葵多糖进行测定，步骤简单、稳定且具有良好的再现性。
Description
技术领域
本发明涉及龙葵有效成分的提取与分离技术领域，具体的说是一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，该方法能够同步提取、分离龙葵叶中龙葵碱和龙葵多糖，且主要提取分离试剂可被循环利用。
背景技术
龙葵，一年生草本茄科植物，广泛分布于中国各地，在欧洲、亚洲、美洲的温热带地区也均有分布。全株入药，可活血化瘀，清热解毒，还能够治疗头痛、牙痛、痢疾、肺痨、小儿风热、泌尿道感染等多种疾病。龙葵碱和龙葵多糖为龙葵中重要的有效成分。
在19世纪初期，龙葵碱(Solanine)首次被Desfososses发现。它是一种糖苷生物碱，是从龙葵的全草或还没有完全成熟的龙葵果中提纯出的一种生物总碱，其中最主要的是澳洲茄碱与澳洲茄边碱，除此之外，还包含了边缘茄碱、茄微碱和茄达碱等多种生物碱。在马铃薯、番茄及茄子等茄科植物中，都有着龙葵碱的存在。龙葵碱具有抗肿瘤、强心、抗过敏、抗菌等作用。龙葵碱还可以抑制癌细胞的活性，减缓癌细胞扩散、转移速度，还可以使肿瘤细胞的增殖受到抑制，诱导细胞凋亡。
作为一种水溶性多糖，龙葵多糖能够降低血管透性及透明质酸酶的生物活性,可以促进抗体的形成，使血液的凝固性降低，抑制心脏的兴奋等免疫功能。国内学者通过大量的实验证明，龙葵多糖对金葡球菌、伤寒杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、猪霍乱杆菌、志贺菌属有一定的抑制作用。
因此，对龙葵碱和龙葵多糖的研究与生产是非常必要的。目前对这两种物质的提取都是单一的，即不能对龙葵中的龙葵碱和龙葵多糖同时进行提取和分离。本发明旨在构建一种能够同时提取龙葵叶中的龙葵碱和龙葵多糖，并实现二者分离的方法；同时，为了节约成本和减少环境污染，该方法中的主要提取分离试剂可以回收再利用。
发明内容：
本发明的目的是提供一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，该方法可以同时提取龙葵叶中的龙葵碱和龙葵多糖两种有效成分，并实现二者的分离和测定；该方法中的提取分离试剂可以回收利用；该方法通过高效液相对龙葵碱进行测定，通过紫外分光光度计对龙葵多糖进行测定，步骤简单、稳定且具有良好的再现性。
本发明的目的是这样实现的，一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，该方法主要是利用超声破壁法提取和智能双水相萃取法分离实现龙葵碱和龙葵多糖两种物质的同步提取和分离，具体步骤如下：
(1)、制备龙葵碱混合标准品溶液和葡萄糖标准品储备液；a、所述龙葵碱标准品溶液的制备：准确称量澳洲茄碱和澳洲茄边碱的标准品(25mg)，分别放入5mL容量瓶中，用3mL乙醇溶解，并定容至5mL，得到浓度为5mg·mL-1的澳洲茄碱和澳洲茄边碱标准品储备液；然后，将两种单一对照品的储备液各取2ml，放入同一个10mL容量瓶中，定容至10mL，得到了龙葵碱混合标准品溶液；b、葡萄糖标准品溶液的制备：准确称量10mg的葡萄糖，并放置于100mL容量瓶中，向其中加入20mL纯净水溶解，定容至100mL，获得浓度为0.1mg·mL-1的葡萄糖标准品储备液。
(2)、超声破壁提取：首先称取龙葵叶10～100g，将其放入破碎机中充分打碎，将打碎后的龙葵叶放入烧杯中，按比例加入0.05g·mL-1的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液，将上述混合物放入超声破壁仪中，超声破壁30min；然后离心10min，取上清液，向残渣中按比例加入聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚的0.05g·mL-1的溶液，将混合物放入超声破壁仪中，超声破壁20min；然后离心10min，取上清液，合并上清液并过滤，得龙葵叶提取液，记为样品A；
(3)双水相萃取法分离：取5mL～50mL样品A与柠檬酸钠溶液、聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液和水按比例混合，充分振荡后，静置30min，溶液分成上下两相，分离上、下两相溶液，记为样品A上和样品A下；将样品A上与水按比例混合，记为样品B，充分振荡后，放入80℃恒温水浴加热，静置1h，溶液再次分成上下两相，分离上、下两相溶液，记为样品B上和样品B下；
所述样品B上中富含龙葵碱，所述龙葵碱指的是澳洲茄碱和澳洲茄边碱；
所述样品A下中的富含龙葵多糖；
所述样品B下中为可进行循环利用的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚。
步骤(2)中所述比例加入0.05g·mL-1的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液，比例为：每克龙葵叶加入7mL的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液；步骤(2)中所述向残渣中按比例加入聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚的0.05g·mL-1的溶液，具体比例为：每克龙葵叶加入3mL的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液。
步骤(3)中所述柠檬酸钠溶液的浓度为0.25g·mL-1；所述聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液的浓度为0.30g·mL-1；所述样品A与柠檬酸钠溶液和聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液按比例混合，比例为：2：4.5：3.5；所述将样品A上与水按比例混合，比例为1：1。
利用高效液相质谱测定步骤(1)制得的龙葵碱混合标准品溶液的峰面积，龙葵碱的浓度与峰面积呈现良好的线性关系；检测样品A、样品A下、样品B上和样品B下中的龙葵碱，检测结果：样品B上中富含龙葵碱，样品A下和B下中没有检测出龙葵碱。
使用苯酚-硫酸法，用紫外分光光度计检测样品A、样品A下、样品B上和样品B下中的龙葵多糖，操作步骤具体如下：精确吸取步骤(1)获得的葡萄糖标准品储备液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分别置于七个10mL容量瓶中，之后分别向每个容量瓶中加入1mL浓度为5％的苯酚，摇匀后迅速加入5mL浓度大于95％的浓硫酸，充分摇匀后，置于90℃水浴中显色25min，取出加水定容至10mL；根据紫外分光光度计测定标准溶液的吸光度进行标准曲线的绘制；精确吸取供试品(样品A、样品A下、样品B上或样品B下)1mL，置于10mL容量瓶中，之后向容量瓶中加入1mL浓度为5％的苯酚，充分摇匀后迅速加入5mL浓度大于95％的浓硫酸，再次充分摇匀后，置于90℃水浴中显色25min，取出加水定容，利用紫外分光光度计测定供试品溶液的吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液的吸光度；检测结果：样品A下中的富含龙葵多糖，样品B上和B下中的未检测出龙葵多糖；
回收B下，其主要成分为聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚，对其进行循环利用，即配制聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液共下次实验使用，配制过程中需按比例补充纯的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚，具体比例为：回收聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚B下：纯聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚＝98：2。
所述高效液相质谱检测条件具体为：色谱柱：TC-C18(3.0mm×75mm)；流动相：0.2％甲酸-乙腈＝75％-25％；进样量：1uL；流速：0.2mL·min-1；柱温：30℃；气帘气(curtain gas)：35psi；离子化电压(ion-spray voltage)：+5.5kV；温度：550℃；喷雾气(nebulizing)：50psi；辅助加热气(heating gas)：50psi；去簇电压(declusteringpotential)：50V；入口电压(entrance potential)：10V；碰撞能(collision energy)：90eV；碰撞室出口电压(collision cell exit potential)：13V；澳洲茄碱检测离子对：(Q1885.1->Q3 720.5)、(Q1 885.1->Q3 396.5)、(Q1 885.1->Q3 157.3)，澳洲茄边碱检测离子对：(Q1 869.1->Q3 704.6)、(Q1 869.1->Q3 396.5)、(Q1 869.1->Q3 157.3)；在此条件下，物质分离良好，澳洲茄碱和澳洲茄边碱的浓度与峰面积呈现良好的线性关系。
本发明具有以下优点和积极效果：
1、本发明通过将智能双水相分离与超声细胞破壁提取耦合应用，实现了龙葵中的龙葵碱、龙葵多糖两种主要有效成分的同步提取和分离。
2、本发明中使用的主要提取分离试剂为温敏性聚合物，通过调控温度可以实现其与目标物之间的分离，达到回收利用的目标。
3、本发明方法简便、成本低廉、重现性好、稳定性好，为龙葵有效成分的提取分离提供了新的技术手段。
附图说明
图1为本方法的工艺路线流程图。
具体实施方式
以下的实施例将对本实验做进一步的阐述，能够方便相关领域的技术人员对本发明有更进一步的了解，但并不以此限制本发明。
仪器与药品：
FA104N万分之一分析天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂制造)；HN99-IID超声波细胞破壁仪(上海汉诺仪器有限公司)；美国安捷伦1100高效液相色谱仪；日本岛津紫外分光光度计UV2500。
由郑州阿尔法化工有限公司提供的纯度高于99.9％的澳洲茄碱和澳洲茄边碱；和购于国药集团化学试剂有限公司无水乙醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、EOPO(分析纯)和柠檬酸钠(分析纯)。
实施例1
一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，该方法的具体步骤如下：
(1)、龙葵碱标准品溶液的制备：准确称量澳洲茄碱和澳洲茄边碱的标准品(25mg)，分别放入5mL容量瓶中，用3mL乙醇溶解，并定容至5mL，得到浓度为5mg·mL-1的澳洲茄碱和澳洲茄边碱标准品储备液。然后，将两种单一对照品的存储溶液各取2ml，放入同一个10mL容量瓶中，定容至10mL，得到龙葵碱混合标准品溶液。
(2)、葡萄糖标准品溶液的制备：准确称量10mg的葡萄糖，并放置于100mL容量瓶中，向其中加入20mL纯净水溶解，定容至100mL，获得浓度为0.1mg·mL-1的葡萄糖标准品储备液。
(3)、超声破壁提取：首先称取龙葵叶10g，将其放入破碎机中充分打碎，将打碎后的龙葵放入烧杯中，加入0.05g·mL-1的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液70mL，将上述混合物放入超声破壁仪中，超声破壁30min；然后离心10min，取上清液，向残渣中加入聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚的0.05g·mL-1的溶液30mL，将混合物放入超声破壁仪中，超声破壁20min；然后离心10min，取上清液，合并上清液并过滤，定容至100mL，得龙葵叶提取液，记为样品A。
(4)、取6mL样品A与浓度为0.25g·mL-1的柠檬酸钠溶液13.5mL、浓度为0.30g·mL-1的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液10.5mL混合，充分振荡后，静置30min，溶液分成上下两相，上相体积为6.8mL，下相体积为23.2mL，分离上、下两相溶液，记为样品A上和样品A下；将样品A上与6.8mL水混合，记为样品B，充分振荡后，放入80℃恒温水浴加热，静置1h，溶液再次分成上下两相，上相体积10.2mL，下相体积3.4mL，分离上、下两相溶液，记为样品B上和样品B下。
(5)、高效液相质谱测定龙葵碱：利用高效液相测定样品A、样品A下、样品B上和样品B下中的龙葵碱。高效液相质谱检测条件：色谱柱：TC-C18(3.0mm×75mm)；流动相：0.2％甲酸-乙腈＝75％-25％；进样量：1uL；流速：0.2mL·min-1；柱温：30℃。气帘气(curtain gas)：35psi；离子化电压(ion-spray voltage)：+5.5kV；温度：550℃；喷雾气(nebulizing)：50psi；辅助加热气(heating gas)：50psi。去簇电压(declustering potential)：50V；入口电压(entrance potential)：10V；碰撞能(collision energy)：90eV；碰撞室出口电压(collision cell exit potential)：13V。澳洲茄碱检测离子对：(Q1 885.1->Q3 720.5)、(Q1 885.1->Q3396.5)、(Q1 885.1->Q3 157.3)，澳洲茄边碱检测离子对：(Q1 869.1->Q3704.6)、(Q1 869.1->Q3 396.5)、(Q1 869.1->Q3 157.3)。在此条件下，物质分离良好，澳洲茄碱和澳洲茄边碱的浓度与峰面积呈现良好的线性关系。检测结果：样品A中的龙葵碱含量为128.3ug·mL-1，澳洲茄边碱的含量为131.4ug·mL-1；样品B上中澳洲茄碱的含量为75.7ug·mL-1，澳洲茄边碱的含量为76.1ug·mL-1；样品A下、和样品B下中未检出澳洲茄碱和澳洲茄边碱。
(6)、紫外分光光度计测定龙葵多糖：使用苯酚-硫酸法，用紫外分光光度计检测样品A、样品A下、样品B上和样品B下中的龙葵多糖，操作步骤具体如下：精确吸取步骤2获得的葡萄糖标准品储备液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分别置于10mL容量瓶中，之后将浓度为5％的苯酚分别向每个容量瓶中加入1mL，摇匀后迅速加入5mL浓度大于95％的浓硫酸，充分摇匀后，置于90℃水浴中显色25min，取出加水定容至10mL；标准曲线的绘制是根据紫外分光光度计测定标准溶液的吸光度进行的；精确吸取供试品1mL，置于10mL容量瓶中，之后将浓度为5％的苯酚向容量瓶中加入1mL，充分摇匀后迅速加入5mL浓度大于95％的浓硫酸，再次充分摇匀后，置于90℃水浴中显色25min，取出加水定容，利用紫外分光光度计测定供试品溶液的吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液的吸光度；检测结果：样品A中的龙葵多糖含量为8.38mg·mL-1；样品A下中的龙葵多糖含量为2.09mg·mL-1；样品B上和样品B下中未检测出龙葵多糖。
(7)、回收10次实验中的样品B下，质量为28g，将其与0.57g的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚混合，再加水50mL，充分混合后定容至100mL，配制成聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液，其浓度约为0.30g·mL-1。将该溶液用于双水相体系(步骤4)，一次分离的上相体积和下相体积分别为6.8mL和23.2mL，二次分离上相体积和下相体积分别为10.1mL和3.5mL。按步骤5测得结果如下：样品A中的龙葵碱含量为124.1ug·mL-1，澳洲茄边碱的含量为136.8ug·mL-1；样品B上中澳洲茄碱的含量为71.3ug·mL-1，澳洲茄边碱的含量为79.9ug·mL-1；样品A下、和样品B下中未检出澳洲茄碱和澳洲茄边碱。按步骤6测得结果如下：样品A中的龙葵多糖含量为8.02mg·mL-1；样品A下中的龙葵多糖含量为1.92mg·mL-1；样品B上和样品B下中未检测出龙葵多糖。上述结果说明，实验中的样品B下可以回收再利用，且对实验没有影响。
实施例2
一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，该方法的具体步骤如下：
(1)、龙葵碱标准品溶液的制备：准确称量澳洲茄碱和澳洲茄边碱的标准品(25mg)，分别放入5mL容量瓶中，用3mL乙醇溶解，并定容至5mL，得到浓度为5mg·mL-1的澳洲茄碱和澳洲茄边碱标准品储备液。然后，将两种单一对照品的存储溶液各取2ml，放入同一个10mL容量瓶中，定容至10mL，得到龙葵碱混合标准品溶液。
(2)、葡萄糖标准品溶液的制备：准确称量10mg的葡萄糖，并放置于100mL容量瓶中，向其中加入20mL纯净水溶解，定容至100mL，获得浓度为0.1mg·mL-1的葡萄糖标准品储备液。
(3)、超声破壁提取：首先称取龙葵叶50g，将其放入破碎机中充分打碎，将打碎后的龙葵放入烧杯中，加入0.05g·mL-1的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液350mL，将上述混合物放入超声破壁仪中，超声破壁30min；然后离心10min，取上清液，向残渣中加入聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚的0.05g·mL-1的溶液150mL，将混合物放入超声破壁仪中，超声破壁20min；然后离心10min，取上清液，合并上清液并过滤，定容至500mL，得龙葵叶提取液，记为样品A。
(4)、取12mL样品A与浓度为0.25g·mL-1的柠檬酸钠溶液27mL、浓度为0.30g·mL-1的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液21mL混合，充分振荡后，静置30min，溶液分成上下两相，上相体积为13.5mL，下相体积为46.5mL，分离上、下两相溶液，记为样品A上和样品A下；将样品A上与13.5mL水混合，记为样品B，充分振荡后，放入80℃恒温水浴加热，静置1h，溶液再次分成上下两相，上相体积20.4mL，下相体积6.6mL，分离上、下两相溶液，记为样品B上和样品B下。
(5)、高效液相质谱测定龙葵碱：利用高效液相测定样品A、样品A下、样品B上和样品B下中的龙葵碱。高效液相质谱检测条件：色谱柱：TC-C18(3.0mm×75mm)；流动相：0.2％甲酸-乙腈＝75％-25％；进样量：1uL；流速：0.2mL·min-1；柱温：30℃。气帘气(curtain gas)：35psi；离子化电压(ion-spray voltage)：+5.5kV；温度：550℃；喷雾气(nebulizing)：50psi；辅助加热气(heating gas)：50psi。去簇电压(declustering potential)：50V；入口电压(entrance potential)：10V；碰撞能(collision energy)：90eV；碰撞室出口电压(collision cell exit potential)：13V。澳洲茄碱检测离子对：(Q1 885.1->Q3 720.5)、(Q1 885.1->Q3 396.5)、(Q1 885.1->Q3 157.3)，澳洲茄边碱检测离子对：(Q1 869.1->Q3704.6)、(Q1 869.1->Q3 396.5)、(Q1 869.1->Q3 157.3)。在此条件下，物质分离良好，澳洲茄碱和澳洲茄边碱的浓度与峰面积呈现良好的线性关系。检测结果：样品A中的龙葵碱含量为135.2ug·mL-1，澳洲茄边碱的含量为138.2ug·mL-1；样品B上中澳洲茄碱的含量为76.3ug·mL-1，澳洲茄边碱的含量为76.6ug·mL-1；样品A下、和样品B下中未检出澳洲茄碱和澳洲茄边碱。
(6)、紫外分光光度计测定龙葵多糖：使用苯酚-硫酸法，用紫外分光光度计检测样品A、样品A下、样品B上和样品B下中的龙葵多糖，操作步骤具体如下：精确吸取步骤2获得的葡萄糖标准品储备液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分别置于10mL容量瓶中，之后将浓度为5％的苯酚分别向每个容量瓶中加入1mL，摇匀后迅速加入5mL浓度大于95％的浓硫酸，充分摇匀后，置于90℃水浴中显色25min，取出加水定容至10mL；标准曲线的绘制是根据紫外分光光度计测定标准溶液的吸光度进行的；精确吸取供试品1mL，置于10mL容量瓶中，之后将浓度为5％的苯酚向容量瓶中加入1mL，充分摇匀后迅速加入5mL浓度大于95％的浓硫酸，再次充分摇匀后，置于90℃水浴中显色25min，取出加水定容，利用紫外分光光度计测定供试品溶液的吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液的吸光度；检测结果：样品A中的龙葵多糖含量为8.06mg·mL-1；样品A下中的龙葵多糖含量为1.95mg·mL-1；样品B上和样品B下中未检测出龙葵多糖。
(7)、回收10次实验中的样品B下，质量为60g，将其与1.22g的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚混合，再加水150mL，充分混合后定容至200mL，配制成聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液，其浓度约为0.30g·mL-1。将该溶液用于双水相体系(步骤4)，一次分离的上相体积和下相体积分别为13.4mL和46.6mL，二次分离上相体积和下相体积分别为20.3mL和6.7mL。按步骤5测得结果如下：样品A中的龙葵碱含量为133.1ug·mL-1，澳洲茄边碱的含量为134.4ug·mL-1；样品B上中澳洲茄碱的含量为72.8ug·mL-1，澳洲茄边碱的含量为77.6ug·mL-1；样品A下、和样品B下中未检出澳洲茄碱和澳洲茄边碱。按步骤6测得结果如下：样品A中的龙葵多糖含量为8.31mg·mL-1；样品A下中的龙葵多糖含量为2.11mg·mL-1；样品B上和样品B下中未检测出龙葵多糖。上述结果说明，实验中的样品B下可以回收再利用，且对实验没有影响。
Claims (9)
1.一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，其特征在于：该方法的具体步骤如下：
（1）、制备龙葵碱混合标准品溶液和葡萄糖标准品储备液；
（2）、超声破壁提取：首先称取龙葵叶10~100 g，将其放入破碎机中充分打碎，将打碎后的龙葵叶放入烧杯中，按比例加入0.05 g·mL-1的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液，将上述混合物放入超声破壁仪中，超声破壁30 min；然后离心10 min，取上清液，向残渣中按比例加入聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚的0.05 g·mL-1的溶液，将混合物放入超声破壁仪中，超声破壁20 min；然后离心10 min，取上清液，合并上清液并过滤，得龙葵叶提取液，记为样品A；
（3）双水相萃取法分离：取5 mL～50 mL样品A与柠檬酸钠溶液、聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液和水按比例混合，充分振荡后，静置30 min，溶液分成上下两相，分离上、下两相溶液，记为样品A上和样品A下；将样品A上与水按比例混合，记为样品B，充分振荡后，放入80℃恒温水浴加热，静置1 h，溶液再次分成上下两相，分离上、下两相溶液，记为样品B上和样品B下；
所述样品B上中富含龙葵碱；
所述样品A下 中的富含龙葵多糖；
所述样品B下中为可进行循环利用的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚。
2.根据权利要求1所述的一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，其特征在于：
a、制备龙葵碱标准品溶液：准确称量澳洲茄碱和澳洲茄边碱的标准品25 mg，分别放入5 mL容量瓶中，用3 mL乙醇溶解，并定容至5 mL，得到浓度为5 mg·mL-1的澳洲茄碱和澳洲茄边碱标准品储备液；然后，将两种单一对照品的存储溶液各取2 ml，放入同一个10 mL容量瓶中，定容至10 mL，得到了龙葵碱混合标准品溶液；
b、制备葡萄糖标准品溶液：准确称量10 mg的葡萄糖，并放置于100 mL容量瓶中，向其中加入20 mL纯净水溶解，定容至100 mL，获得浓度为0.1 mg·mL-1的葡萄糖标准品储备液。
3.根据权利要求1所述的一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，其特征在于：步骤（2）中所述比例加入0.05 g·mL-1的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液，比例为：每克龙葵叶加入7 mL的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液；步骤（2）中所述向残渣中按比例加入聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚的0.05 g·mL-1的溶液，具体比例为：每克龙葵叶加入3 mL的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液。
4.根据权利要求1所述的一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，其特征在于：步骤（3）中所述柠檬酸钠溶液的浓度为0.25 g·mL-1；所述聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液的浓度为0.30 g·mL-1；所述样品A与柠檬酸钠溶液和聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚溶液按比例混合，比例为：2：4.5：3.5；所述将样品A上与水按比例混合，比例为1：1。
5.根据权利要求1所述的一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，其特征在于：利用高效液相质谱测定步骤（1）制得的龙葵碱混合标准品溶液的峰面积，龙葵碱的浓度与峰面积呈现良好的线性关系；检测样品A、样品A下、样品B上和样品B下中的龙葵碱，检测结果：样品B上中富含龙葵碱，样品A下和B下中没有检测出龙葵碱。
6.根据权利要求1所述的一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，其特征在于：使用苯酚-硫酸法，用紫外分光光度计检测样品A、样品A下、样品B上和样品B下中的龙葵多糖，操作步骤具体如下：精确吸取步骤（1）获得的葡萄糖标准品储备液0 mL、0.2 mL、0.4mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分别置于10 mL容量瓶中，之后将浓度为5%的苯酚分别向每个容量瓶中加入1 mL，摇匀后迅速加入5 mL浓度大于95 %的浓硫酸，充分摇匀后，置于90℃水浴中显色25 min，取出加水定容至10 mL；根据紫外分光光度计测定标准溶液的吸光度进行标准曲线的绘制；精确吸取供试品1 mL，置于10 mL容量瓶中，之后将浓度为5 %的苯酚向容量瓶中加入1 mL，充分摇匀后迅速加入5 mL浓度大于95 %的浓硫酸，再次充分摇匀后，置于90 ℃水浴中显色25 min，取出加水定容，利用紫外分光光度计测定供试品溶液的吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液的吸光度；检测结果：样品A下 中的富含龙葵多糖，样品B上和B下中的未检测出龙葵多糖；回收主要成分为聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚的B下进行循环利用。
7.根据权利要求1所述的一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，其特征在于：步骤（3）中所述龙葵碱指的是澳洲茄碱和澳洲茄边碱。
8.根据权利要求5所述的一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，其特征在于：所述高效液相质谱检测条件具体为：色谱柱：TC-C18（3.0 mm × 75 mm）；流动相：0.2%甲酸-乙腈=75%-25%；进样量：1 uL；流速：0.2 mL·min-1；柱温：30℃；气帘气（curtaingas）：35 psi；离子化电压（ion-spray voltage）：+5.5 kV； 温度：550 °C；喷雾气（nebulizing）：50 psi；辅助加热气（heating gas）：50 psi；去簇电压（declusteringpotential）：50 V；入口电压（entrance potential）：10 V；碰撞能（collision energy）：90eV；碰撞室出口电压（collision cell exit potential）：13 V；澳洲茄碱检测离子对：（Q1885.1 ->Q3 720.5）、（Q1 885.1 ->Q3 396.5）、（Q1 885.1 ->Q3 157.3），澳洲茄边碱检测离子对：（Q1 869.1 ->Q3 704.6）、（Q1 869.1 ->Q3 396.5）、（Q1 869.1 ->Q3 157.3）；在此条件下，物质分离良好，澳洲茄碱和澳洲茄边碱的浓度与峰面积呈现良好的线性关系。
9.根据权利要求6所述的一种可循环使用的龙葵有效成份提取和分离方法，其特征在于：回收主要成分为聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚的B下进行循环利用，按比例补充纯的聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚，具体比例为：回收聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚B下：纯聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚=98：2。
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