CN114716493A - 一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法 - Google Patents
一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种黑果枸杞纯化产品的制备方法，尤其是涉及一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，该方法为首先从黑果枸杞中提取花色苷粗提液，然后将粗提液用大孔树脂纯化、收集酸性乙醇洗脱液减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液，再将花色苷大孔树脂洗脱液进一步采用凝胶柱纯化，每50mL/管收集，收集第5～7管，第19～24管，分别分段合并洗脱液，将两段的洗脱液分别减压浓缩冻干后得到2个矮牵牛素类花色苷，既矮牵牛素‑3‑O‑芸香糖(香豆酰基)‑5‑O‑二葡萄糖苷和矮牵牛素3‑O‑芸香糖(香豆酰基)‑5‑O‑葡萄糖苷；本发明方法独特、能同时分离黑果枸杞中两个结构相似的产品、为黑果枸杞花色苷的定性、定量及其构效关系研究及标准品开发提供了重要的理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种黑果枸杞纯化产品的制备方法，尤其是涉及一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法。
背景技术
黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)，属茄科(Solanceae)枸杞属(Lycium L.)，是近年来发现的多年生，抗旱、耐盐野生枸杞资源，主要分布于我国西北地区，在欧洲和中亚地区也有少量分布。黑果枸杞富含花色苷类化合物，其花色苷含量占干果重的1.5％-3.2％，远高于蓝莓等其它果蔬。
花色苷是黑果枸杞的主要活性物质之一，具有抗氧化、抗炎症、抑制胰脂肪酶活性、提高免疫、降血脂、抗肿瘤、改善记忆力等多种功效。黑果枸杞富含的芳香酸酰化的矮牵牛素花色苷及其同分异构体，分子量较大，结构同时具有矮牵牛素母核、芳香酸酰化、芸香糖和葡萄糖糖苷化的特征，在天然产物中鲜见，并且相较于非酰化的花色苷，这一类的花色苷具有更高的稳定性和生物可及性。因此黑果枸杞的花色苷具有良好的前景。
矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-p-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷是黑果枸杞的主要花色苷，约占花色苷总量的50％。一般地，采用大孔树脂、凝胶色谱等常规的色谱法只能从黑果枸杞中分离出一定纯度的主要化合物矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-p-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷。而对分离其它结构相似但具有较小含量的化合物具有一定的技术难度。制备液相可对含量较低的花色苷等化合物进一步分离，但制备量极小。目前鲜见采用凝胶色谱法同时制备较大量的两个较高纯度的黑果枸杞矮牵牛素花色苷的方法报道。限制了黑果枸杞花色苷商业化的对照品研发及其进一步研究和应用。
发明内容
本发明的目的主要是克服现有技术的不足，提供一种制作方法独特、能同时分离黑果枸杞中两个结构相似的矮牵牛素类花色苷、为黑果枸杞花色苷的定性、定量及其构效关系研究及标准品开发提供了重要的理论依据的一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法。
本发明通过如下方式实现：
一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，其特征在于：该方法为首先从黑果枸杞中提取花色苷粗提液，然后将粗提液用大孔树脂纯化、收集酸性乙醇洗脱液减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液，再将花色苷大孔树脂洗脱液进一步采用凝胶柱纯化，用酸性乙醇洗脱，每50mL/管收集，收集第5～7管、第19～24管，分别分段合并洗脱液，将两段的洗脱液分别减压浓缩冻干后得到2个矮牵牛素类花色苷，既矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷；
所述花色苷粗提液的制备方法为以黑果枸杞干果为原料，将其除杂后放入粉碎机，加液氮将其冷冻，迅速粉碎至80～100目，采用pH 1～3的60％～75％乙醇溶液提取后减压浓缩得到粗提液；
所述花色苷大孔树脂洗脱液的制备方法为将所述粗提液缓慢注入D101，D4020，DA201，HPD100，NKA-9任意一种大孔树脂层析柱，分别用pH 1～3的水和pH 1～3的60％～75％乙醇溶液洗脱2～4个柱体积，收集酸性乙醇洗脱液，将收集到的花色苷样品40～50℃减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液；
所述凝胶柱纯化条件为：凝胶为Sephadex LH-20，色谱柱规格为：Ф36mm*460mm，洗脱液进样浓度为：1～6.7mg/mL，上样体积：1～10mL，洗脱溶剂：pH 1～3的30％乙醇溶液，压力为：0.1bar；
所述矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷的相对含量均大于80％，批次制备量分别可达0.3～13.2mg和0.7～30.7mg。
本发明具有如下效果：
1)制备方法独特：本发明提供的方法为首先从黑果枸杞中提取花色苷粗提液，然后将粗提液洗脱、收集酸性乙醇洗脱液减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液，再将花色苷大孔树脂洗脱液进一步采用凝胶柱纯化，用酸性乙醇洗脱，每50mL/管收集，收集5～7管，和19～24管，分别分段合并洗脱液，将两段的洗脱液分别减压浓缩冻干后得到组分Ⅰ和Ⅱ，既得矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷两个花色苷。
2)方法便捷，重复性好，处理量大，对黑果枸杞资源的研究和应用开发具有重要意义：本发明提供的方法中花色苷粗提液的制备方法为以黑果枸杞为原料，将其除杂后放入粉碎机，加液氮将其冷冻，迅速粉碎至80～100目，采用pH 1～3的60％～75％乙醇溶液提取后减压浓缩得到粗提液；花色苷大孔树脂洗脱液的制备方法为将所述浓缩粗提液缓慢注入D101，D4020，DA201，HPD100，NKA-9任意一种大孔树脂层析柱，分别用pH 1～3的水和pH 1～3的60％～75％乙醇溶液洗脱2～4个柱体积，收集酸性乙醇洗脱液，将收集到的花色苷样品40～50℃减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液，所述凝胶柱纯化条件为：Sephadex LH-20，色谱柱规格为：Ф36mm*460mm，洗脱液进样浓度为：1～6.7mg/mL，上样体积：1～10mL，洗脱溶剂：pH 1～3的30％乙醇溶液，压力为：0.1bar，该方法将凝胶树脂和中压制备色谱联合，同时分离制备出矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷，该方法便捷，重复性好，处理量大，对黑果枸杞资源的研究和应用开发具有重要意义。
3)纯度高：本发明提供的方法首次用凝胶色谱从黑果枸杞中同时分离制备出矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷，其纯度均可达80％以上。
具体实施方式
实施例一：一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，该方法为包括如下步骤：
(1)花色苷提取：以黑果枸杞为原料，将其除杂后放入粉碎机，加液氮将其冷冻，迅速粉碎至80目，采用pH＝2的60％乙醇溶液提取后减压浓缩得到粗提液。
(2)将上述浓缩粗提液缓慢注入D101大孔树脂层析柱，分别用pH＝2的水和pH＝2的60％乙醇溶液洗脱2～4个柱体积，收集酸性乙醇洗脱液，于40～50℃减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液。
(3)将上述花色苷大孔树脂洗脱液进一步采用凝胶柱纯化，纯化条件为：凝胶为Sephadex LH-20，色谱柱规格为：Ф36mm*460mm，洗脱液进样浓度为：6.7mg/mL，上样体积：10mL，洗脱溶剂：pH＝2的30％乙醇溶液，压力为：0.1bar，每50mL/管收集，收集第5～7管，和第19～24管，分别分段合并洗脱液，将两段的洗脱液分别减压浓缩冻干后即得矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷2个花色苷，相对含量分别为：84.16％和81.48％。批次制备量分别可达13.2mg和30.7mg。
实施例二：一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，该方法为包括如下步骤：
(1)花色苷提取：以黑果枸杞为原料，将其除杂后放入粉碎机，加液氮将其冷冻，迅速粉碎至90目，采用pH＝1.8的65％乙醇溶液提取后减压浓缩得到粗提液。
(2)将上述浓缩粗提液缓慢注入D4020大孔树脂层析柱，分别用pH＝1.8的水和pH＝1.8的65％乙醇溶液洗脱2～4个柱体积，收集酸性乙醇洗脱液，于40～50℃减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液。
(3)将上述花色苷大孔树脂洗脱液进一步采用凝胶柱纯化，纯化条件为：凝胶为Sephadex LH-20，色谱柱规格为：Ф36mm*460mm，洗脱液进样浓度为：4.3mg/mL，上样体积：10mL，洗脱溶剂：pH＝1.8的30％乙醇溶液，压力为：0.1bar，每50mL/管收集，收集第5～7管，和第19～24管，分别分段合并洗脱液，将两段的洗脱液分别减压浓缩冻干后即得矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷2个花色苷，相对含量分别为：85.01％和81.62％。批次制备量分别可达7.6mg和18.8mg。
实施例三：一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，该方法为包括如下步骤：
(1)花色苷提取：以黑果枸杞为原料，将其除杂后放入粉碎机，加液氮将其冷冻，迅速粉碎至100目，采用pH＝2.5的75％乙醇溶液提取后减压浓缩得到粗提液。
(2)将上述浓缩粗提液缓慢注入DA201大孔树脂层析柱，分别用pH＝2.5的水和pH＝2.5的75％乙醇溶液洗脱2～4个柱体积，收集酸性乙醇洗脱液，于40～50℃减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液。
(3)将上述花色苷大孔树脂洗脱液进一步采用凝胶柱纯化，纯化条件为：凝胶为Sephadex LH-20，色谱柱规格为：Ф36mm*460mm，洗脱液进样浓度为：6.7mg/mL，上样体积：5mL，洗脱溶剂：pH＝2.5的30％乙醇溶液，压力为：0.1bar，每50mL/管收集，收集第5～7管，和第19～24管，分别分段合并洗脱液，将两段的洗脱液分别减压浓缩冻干后即得矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷2个花色苷，相对含量分别为：82.39％和80.73％。批次制备量分别可达6.8mg和15.6mg。
实施例四：一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，该方法为包括如下步骤：
(1)花色苷提取：以黑果枸杞为原料，将其除杂后放入粉碎机，加液氮将其冷冻，迅速粉碎至91目，采用pH＝1.6的63％乙醇溶液提取后减压浓缩得到粗提液。
(2)将上述浓缩粗提液缓慢注入HPD100大孔树脂层析柱，分别用pH＝1.6的水和pH＝1.6的63％乙醇溶液洗脱2～4个柱体积，收集酸性乙醇洗脱液，于40～50℃减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液。
(3)将上述花色苷大孔树脂洗脱液进一步采用凝胶柱纯化，纯化条件为：凝胶为Sephadex LH-20，色谱柱规格为：Ф36mm*460mm，洗脱液进样浓度为：4.3mg/mL，上样体积：5mL，洗脱溶剂：pH＝1.6的30％乙醇溶液，压力为：0.1bar，每50mL/管收集，收集第5～7管，和第19～24管，分别分段合并洗脱液，将两段的洗脱液分别减压浓缩冻干后即得矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷2个花色苷，相对含量分别为：83.68％和82.31％。批次制备量分别可达4.1mg和9.3mg。
实施例五：一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，该方法为包括如下步骤：
(1)花色苷提取：以黑果枸杞为原料，将其除杂后放入粉碎机，加液氮将其冷冻，迅速粉碎至95目，采用pH＝1.3的69％乙醇溶液提取后减压浓缩得到粗提液。
(2)将上述浓缩粗提液缓慢注入NKA-9大孔树脂层析柱，分别用pH＝1.3的水和pH＝1.3的69％乙醇溶液洗脱2～4个柱体积，收集酸性乙醇洗脱液，于40～50℃减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液。
(3)将上述花色苷大孔树脂洗脱液进一步采用凝胶柱纯化，纯化条件为：凝胶为Sephadex LH-20，色谱柱规格为：Ф36mm*460mm，洗脱液进样浓度为：6.7mg/mL，上样体积：7.5mL，洗脱溶剂：pH＝1.3的30％乙醇溶液，压力为：0.1bar，每50mL/管收集，收集第5～7管，和第19～24管，分别分段合并洗脱液，将两段的洗脱液分别减压浓缩冻干后即得矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷2个花色苷，相对含量分别为：84.72％和81.59％。批次制备量分别可达9.6mg和20.1mg。
上述黑果枸杞为干果。
Claims (5)
1.一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，其特征在于：该方法为首先从黑果枸杞中提取花色苷粗提液，然后将粗提液用大孔树脂纯化、收集酸性乙醇洗脱液减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液，再将花色苷大孔树脂洗脱液进一步采用凝胶柱纯化，用酸性乙醇洗脱，每50mL/管收集，收集第5～7管、第19～24管，分别分段合并洗脱液，将两段的洗脱液分别减压浓缩冻干后得到2个矮牵牛素类花色苷，既矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷。
2.如权利要求1所述的一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，其特征在于：所述花色苷粗提液的制备方法为以黑果枸杞干果为原料，将其除杂后放入粉碎机，加液氮将其冷冻，迅速粉碎至80～100目，采用pH 1～3的60％～75％乙醇溶液提取后减压浓缩得到粗提液。
3.如权利要求1所述的一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，其特征在于：所述花色苷大孔树脂洗脱液的制备方法为将所述粗提液缓慢注入D101，D4020，DA201，HPD100，NKA-9任意一种大孔树脂层析柱，分别用pH 1～3的水和pH 1～3的60％～75％乙醇溶液洗脱2～4个柱体积，收集酸性乙醇洗脱液，将收集到的花色苷样品40～50℃减压浓缩即得到花色苷大孔树脂洗脱液。
4.如权利要求1所述的一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，其特征在于：所述凝胶柱纯化条件为：凝胶为Sephadex LH-20，色谱柱规格为：Ф36mm*460mm，洗脱液进样浓度为：1～6.7mg/mL，上样体积：1～10mL，洗脱溶剂：pH 1～3的30％乙醇溶液，压力为：0.1bar。
5.如权利要求1所述的一种同时分离制备黑果枸杞中2个矮牵牛素类花色苷的方法，其特征在于：所述矮牵牛素-3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-二葡萄糖苷和矮牵牛素3-O-芸香糖(香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷的相对含量均大于80％，批次制备量分别可达0.3～13.2mg和0.7～30.7mg。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115417901A (zh) * | 2022-09-30 | 2022-12-02 | 无锡市食品安全检验检测中心 | 酰化矮牵牛素-3-o-芸香糖苷(反-对香豆酰)-5-o-葡萄糖苷制备方法 |
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2022
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