CN114716346B - 一种4-硝基苯胺衍生物及其应用 - Google Patents

一种4-硝基苯胺衍生物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种4‑硝基苯胺衍生物及其应用，属于医药技术领域。申请人的试验表明，本发明所述的4‑硝基苯胺衍生物可以抑制慢性阻塞性肺疾病气道原代平滑细胞增殖，减轻肺动脉高压进展同时减轻肺纤维化进展。本发明所述4‑硝基苯胺衍生物的结构如下述式(I)所示：
Figure DDA0003620532040000011

Description

一种4-硝基苯胺衍生物及其应用
本申请是“一种4-硝基苯胺衍生物及其合成方法和应用”的分案申请，原申请的申请日为：2020年12月15日，申请号为：202011479135.2，发明名称为：一种4-硝基苯胺衍生物及其合成方法和应用。
技术领域
本发明涉及一种4-硝基苯胺衍生物及其合成方法和应用，属于医药技术领域。
背景技术
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种慢性炎症性肺疾病，会导致肺部气流阻塞，包括小气道阻塞(慢性阻塞性细支气管炎)和肺气肿。气道重塑(AR)是慢性哮喘和慢性阻塞性肺疾病的重要病理特征。气道重塑的主要因素之一是气道平滑肌(ASM)，它会因哮喘而增厚，变得更收缩，并产生更多的细胞外基质。大鼠气道平滑肌细胞原代培养广泛应用于多种肺部疾病的体外生理学和病理学研究，尽管气道平滑肌细胞在慢性阻塞性肺疾病中具有潜在的重要作用，但气道平滑肌细胞的原代培养至今很少受到重视。目前还没有建立有效和广泛接受的方法。
肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一种以肺小动脉重构，毛细血管变窄、阻塞或破坏，使血液更难流经肺部，引起肺血管阻力渐进性增加，随着压力的增加，心脏的右心室必须更努力地将血液泵入肺部，最终导致右心负荷增加及右心功能不全的疾病。肺动脉高压最主要的病理生理特征是不同程度的肺血管结构重构和肺血管阻力升高。当前的药物及疗法在肺血流动力学、功能能力和达到临床恶化的时间方面取得了适度的改善，但对逆转潜在的疾病过程影响很小。目前该疾病仍然无法治愈，大多数患者在5年内进展为肺移植或死亡。因此，迫切需要开发针对这种破坏性疾病的潜在发病机理的新疗法。
肺纤维化(pulmonaryfibrosis，PF)是一种慢性肺疾病，其特征在于细胞外基质(ECM)的过度积累和肺结构的重塑。这些特征会导致进行性呼吸困难，喘息，最后导致呼吸衰竭。肺纤维化主要包括弥漫性纤维化肺泡炎、弥漫性间质纤维化和特发性肺纤维化，其中特发性肺纤维化被认为是该病最常见和最严重的形式。肺成纤维细胞改变，肺泡上皮细胞丢失和细胞基质ECM过度积聚，是该疾病主要表型形式。
本申请发明人团队前期研发了一种如下述式(A)所示结构的2-芳基-1,3-二氢苯并咪唑衍生物：
Figure BDA0003620532020000021
本申请发明人团队通过试验发现该化合物体外抗肾纤维化活性显著，具体如公布号为CN 105061324A的发明专利所述。本申请发明人团队在后续的研究中意外发现，上述式(A)所示结构的化合物还存在一个同分异构体，具体结构如下述式(I)所示：
Figure BDA0003620532020000022
目前尚未见对上述式(I)所示化合物的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖的4-硝基苯胺衍生物及其合成方法，以及其在制药中的应用。
本发明所述的4-硝基苯胺衍生物为具有下述式(I)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003620532020000023
上述式(I)所示结构的化合物的化学名称为(E)-2-((2,4-二氯亚苄基)氨基)-4-硝基苯胺，在本申请中也简称为ZG-1，黄色固体产物，分子量为：310.1。
本发明所述式(I)所示结构的化合物与公布号为CN 105061324A的发明中的目标化合物为同分异构体，可采用同样的合成方法合成得到粗品，只是在纯化时采用不同的溶剂体系进行洗脱或重结晶。因此，上述式(I)所示化合物的合成方法为：取4-硝基邻苯二胺和2,4-二氯苯甲醛置于有机溶剂中，于加热条件下反应，所得反应物抽滤，即得目标物粗品；所述的有机溶剂选自无水甲醇、无水乙醇、丙酮、氯仿和二氯甲烷中的一种或两种以上的组合。所述4-硝基邻苯二胺和2,4-二氯苯甲醛的摩尔比为化学计量比，有机溶剂的用量通常是按10mmol的4-硝基邻苯二胺加入50～80ml有机溶剂为基准来计算。反应优选是在40℃至有机溶剂的回流温度下进行，反应是否完全通过TLC跟踪检测，反应完成后，所得反应物冷却后抽滤，收集滤饼即为目标物粗品。
在对上述式(I)所示结构的化合物粗品进行纯化时，可以是将制得的目标物粗品经硅胶柱层析或重结晶以获得纯化后的目标物。具体的，当采用硅胶柱层析的方式进行纯化时，用由体积比为5：1的石油醚和二氯甲烷组成的洗脱剂进行洗脱；而当采用重结晶的方式进行纯化时，用由体积比为3～5：1的石油醚和二氯甲烷组成的溶剂进行重结晶。
进一步的，还可以将上述得到式(I)所示结构的化合物培养成单晶，具体是将目标物粗品或纯化后的目标物置于由体积比为0.5～2：4的二氯甲烷和正己烷组成的溶剂中于室温下挥发培养单晶。在挥发48h左右的时间后，即可在容器底部观察到针状单晶，单晶呈黄褐色。本发明还包括上式(I)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用；更进一步是在制备抑制气道平滑肌细胞增殖的药物中的应用。
本发明进一步包括上述式(I)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肺动脉高压药物中的应用；更进一步是在制备治疗由野百合碱诱导的肺动脉高压药物中的应用。
本发明进一步还包括上述式(I)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肺纤维化药物中的应用；更进一步是在制备治疗由博来霉素诱导的肺纤维化药物中的应用。
与现有技术相比，结构新颖的4-硝基苯胺衍生物及其合成方法和应用。申请人的试验结果表明，上述式(I)所示结构的化合物不仅可以抑制慢性阻塞性肺疾病气道原代平滑细胞增殖；经腹腔注射还能够减轻肺动脉微小血管壁增厚，同时减轻心脏纤维化；此外，经腹腔注射还可减肺纤维化进展，减轻炎症反应。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的最终产物的核磁共振碳谱图。
图2为本发明实施例1制得的最终产物的核磁共振氢谱图。
图3为本发明实施例2制得的单晶在显微镜下的外观图。
图4为本发明实施例2制得的单晶的晶体结构图。
图5为实验例1中模型组平滑肌标志蛋白α-SMA的免疫印迹图，其中CON表示正常对照组，M表示模型组。
图6为实验例1中模型组平滑肌细胞在光学显微镜下的形态图。
图7为实验例1中传代培养所得模型组的平滑肌细胞的免疫荧光鉴定图。
图8为实验例1中模型组细胞给予ZG-1治疗的免疫印迹图，其中(a)为正常组不做处理的平滑肌细胞，(b)为模型组细胞给予ZG-1治疗后的免疫印迹图；其中CON表示对照组，M表示模型组。
图9为实验例2中各组大鼠体重变化图，其中CON表示对照组，M表示模型组，L表示给药组L，H表示给药组H。
图10为实验例2中各组大鼠的右心室肥大指数图，其中C表示对照组，M表示模型组，L表示给低浓度药组，H表示给药高浓度组。
图11实验例2中各组大鼠的相关蛋白免疫印迹图，其中CON表示对照组，M表示模型组，L表示给药低浓度组，H表示给药高浓度组。
图12为实验例2中PAH模型各组大鼠肺动脉增厚和肺纤维化染色图，其中(a)为各组大鼠肺HE染色图，(b)为各组大鼠肺MASSON染色图；其中C表示对照组，M表示模型组，L表示给药低浓度组，H表示给药高浓度组。
图13为实验例2中PAH模型各组大鼠的心脏肥大和心脏纤维化染色图，其中(a)为各组大鼠心脏HE染色图，(b)为各组大鼠心脏MASSON染色图；其中CON表示对照组，M表示模型组，L表示给药低浓度组，H表示给药高浓度组。
图14为实验例3中各组小鼠肺部解剖直观图，其中CON表示对照组，M表示模型组，L表示给药低浓度组，H表示给药高浓度组。
图15为实验例3中各组小鼠体重曲线图，其中C表示对照组，M表示模型组，L表示给药低浓度组，H表示给药高浓度组。
图16为实验例3中各组肺指数柱状图，其中CON表示对照组，M表示模型组，L表示给药低浓度组，H表示给药高浓度组。
图17为实验例3中ZG-1在抑制大鼠肺TGF-β1/Smads激活的免疫印迹表达图和抑制肺部各蛋白的免疫印迹表达图，其中(a)为免疫印迹方法显示ZG-1抑制肺部转录激活因子(Smad2/3)、磷酸化转录激活因子(p-Smad3)、应激活化蛋白激酶(JNK)和磷酸化应激活化蛋白激酶(P-JNK)的表达图，(b)为免疫印迹方法显示ZG-1抑制肺部胶原蛋白(COL-1)、纤维黏连蛋白(FN)、肌腱蛋白(TNC)和平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达图；其中CON表示对照组，M表示模型组，L表示给药低浓度组，H表示给药高浓度组。
图18为实验例3中PF模型各组大鼠肺的染色图，其中(a)为各组大鼠肺HE染色图，(b)为各组大鼠肺MASSON染色图；其中CON表示对照组，M表示模型组，L表示给药低浓度组，H表示给药高浓度组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
以下各实施例或实验例中，出现的ZG-1或小分子化合物ZG-1均为本申请中所述的式(I)所示结构的化合物。
实施例1
Figure BDA0003620532020000051
具体的合成方法为：取1.53g(10mmol)4-硝基邻苯二胺、1.75g(10mmol)2,4-二氯苯甲醛和50ml无水甲醇置于150ml圆底烧瓶，加热回流4h，静置冷却后抽滤，收集滤饼即为粗产物。滤饼上硅胶柱层板，以体积比石油醚：二氯甲烷＝5:1(体积比)组成的溶剂作为洗脱剂洗脱，得到2.52g黄色固体粉末，产率为76.8％。
对本实施例所得黄色固体产物进行核磁表征，其核磁共振氢谱和碳谱分别如图1和2所示。
因此，可确定上述黄色固体产物为(E)-2-((2,4-二氯亚苄基)氨基)-4-硝基苯胺(ZG-1)，其化学结构式如下式(I)所示：
Figure BDA0003620532020000052
实施例2
取实施例1所得黄色固体粉末20mg置于50ml烧杯中，加入1ml二氯甲烷和4ml正己烷，即二氯甲烷：正己烷＝1:4(体积比)，室温挥发48h，烧杯底部可观察到有黄褐色结晶析出，收集晶体，干燥，得到11mg针状黄褐色晶体，其在显微镜下的外观图如图3所示。
选取尺寸适中的黄褐色晶体置于布鲁克公司APEX单晶衍射仪上，采用石墨单色化的Mo-Kα
Figure BDA0003620532020000053
射线进行单晶测试。在295K条件下，以/>
Figure BDA0003620532020000054
-ω扫描方式在1.12°≤θ≤26.57°范围内收集到衍射点。本实施例所得产物的初始晶体结构均采用SHELXS-97和Olex-2直接法解出，几何加氢，非氢原子坐标及各向异性热参数采用SHELXL-97均经全矩阵最小二乘法精修。所得晶体学数据如下述表1所示，键长数据如下述表2所示，键角数据如下述表3所示，所得晶体的晶体结构如图4所示，确定所得的黄褐色晶体为目标产物ZG-1。
表1
Figure BDA0003620532020000061
表2
Figure BDA0003620532020000062
表3
Figure BDA0003620532020000071
实施例3
重复实施例1，不同的是，用二氯甲烷替代无水甲醇。结果得到2.25g黄色固体粉末，产率为68.5％。
取本实施例所得黄色固体粉末20mg置于50ml烧杯中，加入2ml二氯甲烷和4ml正己烷，即二氯甲烷：正己烷＝2:4(体积比)，室温挥发48h，烧杯底部可观察到有黄褐色结晶析出，收集晶体，干燥，得到10mg针状黄褐色晶体。
对本实施例所得黄褐色晶体进行单晶衍射分析，确定所得晶体为目标产物ZG-1。
实施例4
重复实施例1，不同的是，用丙酮和氯仿的组合(体积比为1：1)替代无水甲醇。结果得到2.10g黄色固体粉末，产率为64.0％。
取本实施例所得黄色固体粉末20mg置于50ml烧杯中，加入0.5ml二氯甲烷和4ml正己烷，即二氯甲烷：正己烷＝0.5:4(体积比)，室温挥发48h，烧杯底部可观察到有黄褐色结晶析出，收集晶体，干燥，得到12mg针状黄褐色晶体。
对本实施例所得黄褐色晶体进行单晶衍射分析，确定所得晶体为目标产物ZG-1。
实验例1：ZG-1逆转慢性阻塞性肺疾病气道原代平滑肌细胞增殖试验
1.实验小鼠分组
购买来自湖南斯莱克公司的雄性C57BL/6小鼠12只，体重20g左右，随机分成四组：对照组Control(溶剂对照)、模型组M(LPS(脂多糖)+cs(香烟)。分笼后的小鼠全部适应性饲养一周。
2.慢性阻塞性肺疾病模型的建立
将实验鼠分为对照组(CON)和模型组(M)，模型组(M)于第1天和第14天一次性腹腔注射给予LPS 10mg/kg建立COPD模型。与此同时，给对照组腹腔一次性注射溶剂生理盐水作为对照，以消除溶剂影响。在注射LPS后的第2天开始烟熏，连续抽烟两周后将其解剖取材。
3.气道平滑肌细胞的培养
颈椎脱臼处死小鼠，将整个小鼠鼠浸泡于75v/v％乙醇中消毒1min。在超净工作台中固定小鼠，沿小鼠颈中线割开，暴露出气管，用手术剪取气管组织，用生理盐水冲洗气管组织，用剪子将气管组织剪成1cm左右的小块，放入培养箱，将培养瓶竖立放置，干贴4h，小心加入含有20％(体积百分比即500ML培养液中含有100ML胎牛血清)胎牛血清的DMEM培养液，避免将组织冲起，培养3天，可以观察到有细胞从组织块周围爬出，更换培养液，之后连续培养7-10天后，待细胞融合至90％(密度比)以上，用0.25％(质量百分比)的胰蛋白酶消化细胞，通常情况下，成纤维细胞和平滑肌细胞易于脱壁，消化时间1-2min，内皮细胞需要消化10-15min，利用这个区别将成纤维细胞和平滑肌细胞先分出来，之后再利用差速贴壁法，由于成纤维细胞和内皮细胞贴壁时间相比平滑肌时间快，因此先将细胞悬液静置培养1.5小时后，将没有贴壁的细胞分出来，重复传代几次，即可获得纯化的平滑肌细胞，传代培养对照组和模型组的平滑肌细胞，并通过免疫荧光鉴定细胞，再通过给予模型组ZG-1药物治疗模型组的平滑肌细胞，免疫印迹鉴定细胞中α-SMA蛋白水平的变化。
4.实验结果
通过免疫印迹来判断COPD模型组平滑肌标志蛋白α-SMA是否有变化。如图5所示，通过COPD大鼠肺组织提总蛋白，可以看出模型组肺组织α-SMA蛋白明显上调。
通过形态学观察平滑肌细胞。如图6所示，通过形态学观察平滑肌细胞，平滑肌细胞呈峰谷状生长。
通过免疫荧光鉴定所得到的细胞是否为平滑肌细胞。结果如图7所示，通过免疫荧光鉴定所得到的细胞为平滑肌细胞。
模型组细胞给予ZG-1治疗后的免疫印迹实验结果如图8所示，由图可知，通过模型组细胞给予ZG-1治疗，ZG-1减少模型组平滑肌细胞中α-SMA蛋白水平的表达。
上述试验结果表明，ZG-1可以抑制慢性阻塞性肺疾病气道原代平滑细胞增殖。
实验例2：ZG-1对肺动脉高压大鼠病情发展的抑制作用
1.实验大鼠分组
购买来自湖南斯莱克公司的雄性SD大鼠24只，体重200左右，随机分成四组：对照组Control(溶剂对照)、模型组M(MCT(野百合碱))、给药组L(MCT+0.5mg/kg ZG-1)、给药组H(MCT+1mg/kg ZG-1)各6只。分笼后的大鼠全部适应性饲养一周。
2.大鼠肺动脉高压模型的建立
将实验鼠分为对照组(CON)、模型组(M)、给药低浓度组(L)、给药高浓度组(H)。取野百合碱将其溶于由无水乙醇和生理盐水按1：4的体积比组成的溶剂中，于第1天一次性腹腔注射给模型组、给药组L、给药组H MCT(60mg/kg)建立PAH模型。与此同时，给对照组腹腔一次性注射溶剂(乙醇和生理盐水按1：4的体积比组成的混合液)作为对照，以消除溶剂影响。在注射MCT后的第二周开始ZG-1治疗，连续给药治疗两周后将其解剖取材。
3.组织的处理和固定
将大鼠胸腔剖开后用止血钳分别钳住两侧皮肉使心脏及肺叶充分暴露在视线下，左手持镊子，右手持剪刀，小心将心肺组织剥离出来，心肺灌注生理盐水避免血液凝固堵塞，而后小心将右心室剥离开来，将左心室和室间隔区分开来，用滤纸吸干后分别称重记录。根据右心室(RV)与左心室+室间隔(LV+S)的比值得出RVHI(右心室肥大指数)，并以RV/(LV+S)表示右心室的肥厚程度。而后将取出来的部分心肺组织放入福尔马林液中固定，部分装管放入-80℃超低温冰箱冻存。
4.实验结果
(I).ZG-1减少PAH大鼠肺部相关蛋白的表达
各组大鼠体重变化如图9所示，与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中(TGF-β1)的表达。
与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中(Smad2/3)的表达。
与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中(MMP-9)的表达。
(II).ZG-1减少PAH大鼠肺部微小动脉的重构
实验结果如图10所示，与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中炎症细胞的减少，同时减轻肺部血管重构。
(III).ZG-1减少PAH大鼠肺部纤维化
实验结果如图11所示，与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺部组织中纤维增生。
(IV).ZG-1抑制PAH大鼠心脏肥大，及减少炎症细胞浸润
实验结果如图12所示，与模型组比较，ZG-1用药组能抑制右心室肥大，并减轻炎症。
(V).ZG-1抑制PAH大鼠心脏纤维化
实验结果如图13所示，与模型组比较，ZG-1用药组能抑制心脏组织中纤维化。
上述试验结果表明，腹腔注射ZG-1能够减轻肺动脉微小血管壁增厚，同时减轻心脏纤维化，TGF-β1、Smads2/3、MMP-9等蛋白表达水平均较模型组显著降低。因此，ZG-1能减轻肺动脉高压进展。
实验例3：ZG-1对肺纤维化小鼠病情发展的抑制作用
1.实验小鼠分组
购买来自湖南斯莱克公司的雄性C57BL/6小鼠24只，体重20g左右，随机分成四组：对照组Control(溶剂对照)、模型组M(BLM(博来霉素))、给药组L(BLM+0.5mg/kg ZG-1)、给药组H(BLM+1mg/kg ZG-1)各6只。分笼后的小鼠全部适应性饲养一周。
2.小鼠肺纤维化模型的建立
将实验鼠分为对照组(CON)、模型组(M)、给药低浓度组(L)、给药高浓度组(H)。取BLM将其溶于生理盐水溶剂中，10％水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射将小鼠鼠麻醉后，仰卧固定于鼠板上，剪颈毛并消毒皮肤，无菌操作作长约1cm的颈中切口，逐层分离暴露气管，弯眼科钳经气管下方穿过，轻抬气管，直视下用1ml注射器针头穿刺两软骨环间，抬高鼠板头端，使与桌面成30～35°角。保持针头与气道方向一致，并尽可能在气道中央，分别给予模型组(M)，给药低浓度组(L)、给药高浓度组(H)小鼠BLM各2.5mg/kg，对照组给予同等体积生理盐水，以消除溶剂影响。在注射BLM后的第二周开始ZG-1治疗，且以注射相应的ZG-1的溶剂给对照模型组排除溶剂治疗的可能性。连续给药治疗一周后，将其解剖取材。
3.组织的处理和固定
将胸腔剖开后用止血钳分别钳住两侧皮肉使心脏及肺叶充分暴露在视线下，左手持镊子，右手持剪刀，小心将心肺组织剥离出来，心肺灌注生理盐水避免血液凝固堵塞，而后小心将肺部剥离开来，用生理盐水清洗干净，用滤纸吸干后分别称重记录。根据肺重量比小鼠重量的比值得出肺指数，用以评估肺功能。而后将取出来的部分心肺组织放入福尔马林液中固定，部分装管放入-80超低温冰箱冻存。
4.实验结果
图14为各组小鼠肺部解剖直观图。由图10可知，PF模型导致肺部有明显的纤维化病变，肺部弹性减小，相比于模型组，给药组肺组织相比较模型组呈剂量依赖性好转。
图15为各组小鼠体重曲线图。由图11可知，PF模型小鼠体重呈下降趋势，而给药组低浓度和高浓度组小鼠体重相对于模型组，整体呈上升趋势。
图16为各组肺指数柱状图。由图12可知，模型组的肺湿重相对于对照组明显上升，给药后肺湿重开始降低，经统计学分析具有显著性差异。
由图17可知：
与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中的Smad2/3表达。
与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中P-Smad2/3的表达。
与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中JNK的表达。
与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中P-JNK的表达。
与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中α-SMA的表达。
与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中的TNC表达。
与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中COL-1的表达。
与模型组比较，ZG-1用药组能抑制肺组织中的FN表达。
由图18(a)可知，ZG-1可抑制大鼠PF模型炎症细胞，同时改善肺泡功能。由图18(b)可知，ZG-1可抑制大鼠PF模型肺纤维化的发展。
上述试验结果表明，腹腔注射ZG-1能够减肺纤维化进展，减轻炎症反应，Smads2/3较模型组显著降低，且纤维化相关蛋白平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(COL-I)和纤连蛋白(FN)均较模型组降低。因此，ZG-1能减轻肺纤维化进展。

Claims (4)

1.具有下述式(I)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用；
Figure QLYQS_1
(I)。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，是在制备抑制气道平滑肌细胞增殖的药物中的应用。
3.具有下述式(I)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肺动脉高压药物中的应用；
Figure QLYQS_2
(I)。
4.具有下述式(I)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肺纤维化药物中的应用；
Figure QLYQS_3
(I)。
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