CN1146862A - 可可的酶处理 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可可豆肉或可可汁的酶促加工方法，其特征在于可可豆肉或可可汁是由发酵1-15天的可可豆制备的，在pH3-8的水性介质中至少与一种工业蛋白酶混合，将混合物在足够的温度下保温一定时间使得每克干物质至少得到10μmol的疏水氨基酸，并且使获得的水解产物与原先存在于可可豆中的相比至少多1.4倍；一种组合物，含有由发酵1-15天的可可豆制备的可可豆肉或可可汁和一种工业蛋白酶和/或一种工业转化酶；一种由本发明所述的混合物经焙炒而得的可可。

Description

可可的酶处理
本发明涉及一种用来改善可可豆肉或可可汁的风味前体成份的酶促处理方法，利用这种方法可使得各种发酵状态下的可可豆得以利用。
巧克力的品质直接受到可可豆的生长地理条件、基因来源以及可可豆的加工条件的影响，即从可可豆在田地里生长到在工厂中进行加工处理都对巧克力的品质有影响。在生长可可的国家，可可收获后经发酵和自然干燥以使风味前体出现。但是成熟可可豆的收获时机和可可豆的发酵条件并不总是得到充分控制的。另外，Theobroma cacao种的三种主要可可树：Criollo，Forastero和Trinitario所长出的可可豆各自具有不同的成分。最后还有一点是，在将可可豆运至专门从事可可豆加工的国家的运输过程中，干豆可能会被损坏。因此工业生产中必须正视同一批可可豆会出现组份不同的问题(例如，见Smaffer M.，TheManufacturing Confectioner，92-94，June 1994)。
然后，经发酵并干燥处理的可可豆一般都经不同程度的碾磨，脱去外面的豆皮，然后进行焙炒，适当时配以碱化处理，这样做是为了使可可呈现香味和颜色。焙炒步骤还包括在还原糖和蛋白质降解产物，特别是氨基酸和水解产物之间的美拉德反应(Maillard reaction) (Wood and Lass，Cocoa，LongmanScientific & Technical，Longman Group UK，England，1985，ISBN 0-582-46352-1)。
风味前体仅在可可豆的自然发酵中出现，是水解反应的结果。有关未发酵可可豆或可可豆碎块的玻璃容器内保温实验表明，这些水解反应依赖于PH值、温度以及酶的区域化和可可豆中底物的区域化。此外水解反应对多酚的存在也很敏感。因此利用丙酮从可可豆中提取多酚是有益的，将上述可可豆在醋酸中保温而使酶及底物非区域化也是有好处的(Biehl B.et a1.，J.Sci.Food.Agric.，33，1280-1290，1982)。
此外，其他研究表明，可可豆至少含有3种涉及可可风味前体的出现的质子活性物，即在PH 3.5时具有最佳活性的蛋白质内切酶，在PH 5.8时具有最佳活性的羧肽酶和在PH 7时具有最佳活性的氨肽酶。有关除去多酚的纯化了的可可豆球蛋白水解反应的实验采用了工业用蛋白酶和/或纯化可可蛋白质内切酶和羧肽酶，该实验表明，水解球蛋白优选连续地在PH 3.5条件下使用可可蛋白质内切酶，然后在PH5-6下使用可可羧肽酶或工业用羧肽酶，用这种方法使可得到水解产物和氨基酸成分，它们有益于后续在还原糖存在的条件下焙炒混合物过程中产生可可风味(Voigt J.et al.，Food Chemistry，50，177-184，1994)。
此外，US2965490介绍了一种用于对未发酵可可豆(青可可豆)进行玻璃容器内水解的方法，这种方法可以替代可可豆的自然发酵。为达此目的，青可可豆蛋白质被酸水解或酶促水解，上述可可豆中的碳水化合物被酶促水解为单糖，两种水解物在无水条件下、一定温度下反应足够时间，产生一种风味物质。然而应该说明的是，青可可豆中的多酚极大地限制了储存蛋白质的酶促水解作用。
最后，上述方法和研究明显是为了用一种对青可可豆(由多酚造成的问题)或是对可可豆的钝化蛋白质(已除去多酚)进行受控酶促水解反应的方法来替代可可豆的自然发酵。此外，人们尚不清楚在焙炒过程中得以形成良好可可风味所需的可可豆风味前体的质量和数量。
本发明的目的是为了克服经发酵处理的可可豆的风味前体成份的可变性问题并且赋予可可豆肉或可汁最佳风味前体成份。
为达此目的，本发明所涉及的方法中，可可豆肉或可可汁是用发酵1-15天的可可豆制得的，在PH3-8的含水介质中至少与一种蛋白酶混合，将混合物在足够温度条件下保温一定时间以水解蛋白质和肽。
更适合的方法是，将混合物在足够的温度条件下保温一定时间，使每克干物质至少得到10μmol疏水氨基酸，和/或与可可豆中原先存在的水解产物相比至少多1.4倍。
利用本发明的方法可以增强可可豆中储存蛋白质的水解作用，这种水解作用开始发生在可可豆的自然发酵中，直到得到了足够量的合适的氨基酸和水解产物成份为止。
按本发明的方法对混合物进行下一步焙炒可以得到良好的可可风味，与焙炒传统发酵的可可豆得到的可可风味比更强烈、浓郁。
也可以利用取自不同发酵阶段的可可豆，例如不含足够风味前体的发酵不足的可可豆，不含合适的风味前体成份的发酵过头的可可豆或是如含有劣质风味前体成份的发酵不良的可可豆。同样地，可可豆也可产自不同植物和来源于不同地区。因此，本发明的方法可以使不同来源和取自不同发酵阶段的可可豆混合物产生的风味前体成份得以均匀化。
此外，由于酶对可可豆中多酚的敏感性，用工业酶水解可可豆肉或可可汁令人出乎意料。本方法表明，自然发酵至少1天的可可豆的多酚含量明显低，使得工业用酶在本方法中没有被明显抑制。另外由于青可可豆的多酚含量太高，所以本发明不采用青可可豆。
特别的是，添加转化酶有利于提高混合物中天然葡萄糖和果糖的含量，这样有助于在随后对混合物进行焙炒中可可风味的形成。
最后，本发明中可应用各种工业酶，可以产生消费者所喜爱的各种不同的可可风味。图1：
水与未充分发酵的可可豆的混合物在一种转化酶作用下产生的葡萄糖的量随处理时间及转化酶添加量而变化的关系图。
一个酶促活性单位被定义为每分钟所转化的产物的μmol量。除有特殊说明，百分量以重量表示。
″发酵不足的可可豆″是指可可豆经传统发酵1-4天并干燥，在聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE色谱分析中，其中的蛋白质显示出相当于21kD和31kD/47kD储存蛋白质的两条可见区带(见WO91/00913和WO91/00914)。而且，这种可可豆不含足够的氨基酸和肽，在随后的焙炒中不能形成可可风味。
″发酵良好的可可豆″是指可可豆经传统发酵2-10天并干燥，在聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE色谱分析中，其中的蛋白质显示出相当于21kD储存蛋白质的一个可见区带和相当于被部分或完全降解了的21kD和47kD蛋白质的两条区带。而且，这些可可豆含有足够的氨基酸和肽，在随后的焙炒中形成可可风味。
″发酵过头的可可豆″指经7-15天传统发酵并干燥的可可豆，在聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE色谱分析中，可可豆中的蛋白质没有显示相当于21kD和31kD/47kD储存蛋白质的清晰可辨的两条区带。而且，这些可可豆含有足够的氨基酸和不足量的肽在随后的焙炒中形成可可风味。
最后，为达本发明的目的，可可豆肉是通过用传统方法碾磨发酵的或未发酵的可可豆得到的，可可汁是不同程度地碾磨可可豆或可可豆肉直至细胞中的可可脂被磨出而制得的。
为实施本方法，可可豆肉或可可汁是用经1-15天发酵的可可豆制得的。因此，可以使用取自不同发酵阶段如发酵不足的、发酵良好的、发酵过头的或发酵不良的可可豆，可以混合使用或是以别的方式使用。采自不同基因型的可可树的可可豆，如采自Theobroma cacao Criollo，Forastero和/或Trinitario的，可以被混合使用或以其他方式使用。可将可可豆肉或可可汁粉碎成细粉，不过必须注意，如果可可豆肉或可可汁在高于35-45℃的条件下进行酶促处理，可可汁或可可块将会熔化，这样可使酶到达混合物最内层的物质处。
然后在PH3-8的水介质中将可可豆肉或可可汁与至少一种蛋白酶混合。蛋白酶可以是由蛋白质内切酶、羧肽酶和氨肽酶组成的一组酶中的一种酶单独使用，也可以多种酶混合使用。水性介质的PH值可以通过添加无机酸或有机酸来调节或是通过选用食品加工中常用的缓冲剂，特别是由柠檬酸盐、磷酸盐或醋酸盐制成的缓冲剂来调节。比较理想的是选用PH 3-5，以便激活可可豆内的内生蛋白质内切酶；不过，最终最好选用在此酸度范围内具有活性的工业酶。
混合物可含有10-80％，尤其是20-70％的可可豆肉或可可汁，每克混合物可含1-100单位的蛋白酶，尤其是0.01-5％(重量/重量)的商业性工业转化酶制剂。
为实施本发明，混合物在足够温度下保温一定时间以水解混合物中的蛋白质和肽。
更合适的方法是，混合物在足够温度下保温一定时间使得每克干物质至少得到10μmol的疏水氨基酸和/或与原先存在于加工过的可可豆中的水解产物相比，水解产物至少多1.4倍，甚至多1.7或2倍。这种情况下可以将从用本发明方法处理前和处理后的可可豆中发现的相同的水解产物(肽和氨基酸)的数量进行比较。还可注意到，较之未经本发明方法处理的豆肉中存在的水解产物，有新的水解产物的存在，但它们受到青可可豆经天然发酵而明显具有的那些水解产物的限制。特别的是，将保留时间约为9，17，24和29.5分钟的四种水解产物的数量在C18反相高效液相色谱(HPLC)柱(No.218TP54 Vydac；USA)上进行洗提分析比较，以恒量流速为1ml/min、含有0.1％三氟乙酸和2％乙腈水溶液的洗脱液洗提10分钟，然后用线性梯度的含0.1％三氟乙酸和2％-52.7％的乙腈的洗脱液洗提50分钟。在215和280nm处检测经洗提的水解产物。
同样还可注意到，作为疏水氨基酸，只有主要存在于经本发明方法处理的豆肉中的那些，例如苯丙氨酸，亮氨酸和丙氨酸。
例如，为了得到足够量的疏水氨基酸和水解产物，混合物可以在10-60℃下保温30分钟至20小时。但是，水解时间和温度应根据水解介质、酶的种类、可可豆的发酵程度和可可豆的来源情况选定。
在本发明的第一个实施方案中，可可豆肉可可汁是由发酵1-15天的可可豆制备来的，与PH3-6的水性介质混合，在40-60℃下将混合物保温10分钟至20小时，以提高可可蛋白质内切酶的活性，将介质的PH调到4-8，至少向其中添加一种工业酶，将混合物在10-60℃下保温5分钟至20小时，以得到蛋白质和肽的水解产物，但较合适的是每克干物质至少得到10μmol的疏水氨基酸和/或与原先存在于可可豆中的水解产物相比，水解产物(肽和氨基酸)至少多1.4倍。
在本发明的第二个实施方案中，可可豆肉或可可汁是由发酵1-15天的可可豆制备来的，与PH4-8的水性介质混合，其中至少加一种蛋白酶，将混合物在10-60℃保温5分钟至20小时以得到蛋白质和肽的水解产物，但较合适的是每克干物质至少得到10μmol的疏水氨基酸和/或与原先存在于可可豆中的水解产物相比，水解产物(肽和氨基酸)至少多1.4倍，较为合适的PH值的范围应是能使可可蛋白内切酶和工业蛋白酶都具有活性。
最后在本发明的第三个实施方案中，至少从由转化酶、糖苷酶、纤维素酶、果胶酶和氧化酶组成的一组酶中选出一种酶添加至反应混合物中。上述酶中的一种的较为合适的添加量是工业酶制剂的0.01-5％，或是每克混合物1-100单位。反应混合物应理解为上述被保温一定时间的混合物中的一种(含有工业酶或是其他酶)。
特别的是，工业酶和/或可可蛋白质内切酶处理与一种工业转化酶结合使用。这种处理可有利于产生疏水氨基酸和其他水解产物，在随后的焙炒过程中疏水氨基酸和其他水解产物与葡萄糖和果糖结合产生一种更加浓郁的巧克力风味(带来了多种浓厚的味道)。出人意料的是，可可蛋白质内切酶、工业转化酶和蛋白酶能在单一步骤中使用(本发明的第二个实施方案)，但是要正确选择PH范围，使所存酶(蛋白质内切酶、工业蛋白酶和转化酶)都具有活性。
如果不利用转化酶，也可在焙炒之前向最终混合物中至少添加0.1％的还原糖，比如添加0.1-5％的葡萄糖和/或果糖。
最后，可以用诸如加热(80-120℃加热1-60分钟)或加高流体静压力的方法对酶进行钝化处理，以此来保护经发明的方法处理的混合物。也可以用冷冻干燥法、喷雾干燥法、真空抽吸法或者在对混合物进行微微加热的过程中用蒸发水分的方法使混合物干燥。当混合物干燥至水分含量低于10％，特别是低于5％时为止。还可以如EP0,226,727介绍的那样对混合物进行传统的焙炒和/或碱化处理。
更为理想的是，在实施本发明方法后，将混合物PH调至5-6，然后干燥、焙炒。
本发明还涉及一种含有用发酵1-15天的可可豆制得的可可豆肉或可可汁、一种工业蛋白酶和/或一种工业转化酶的组合物。如果酶仍有活性，每克组合物至少具有一个酶活性单位。即使在这些酶无活性的情况下，如组合物在进行了热变性处理后，借助合适的抗体，仍能将其识别出来，以此表明原来用过这种酶。
因此，这些组合物可含有由各种发酵阶段的可可豆的混合物制得的和/或来自各种基因型可可树的可可豆的混合物制得的可可豆肉或可可汁。这些组合物可以是前面所介绍的在本发明方法的范围内的组合物中的一种。因此，本发明也涉及干燥了的组合物，包括添加有葡萄糖和/或果糖的，特别是含有经焙炒上述组合物得到的可可(粉、豆肉、汁等等)。这些组合物尤其与现有技术中的不同，因为它们是由含有各种发酵阶段的可可豆和/或采自各种基因型可可树的可可豆，和活性或无活性的工业蛋白酶和/或转化酶的混合物获得的。
下面将用实施例进一步详述本发明。在介绍实施例之前是各种测试说明及图的详细说明。不言而喻，这些实施例是以介绍发明的主题的方式给出的，并不构成任何方式的限制。氨基酸分析
将根据本发明钝化了的混合物置于超声槽内10分钟，在转速9600rpm下均质两次，每次1分钟，以10,000克的力将混合物离心10分钟，得到上层液，将其过滤，然后用ACCQTagkit(Waters，USA)分析其氨基酸含量。
为分析氨基酸，将20μl的样品和标准物与140μl的硼酸盐缓冲剂混合，并添加40μl含有6-氨基喹啉基-N-羟基丁二酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)的试剂，将混合物涡流旋转，室温静置1分钟，在55℃加热7分钟，将其注入C18反相高效液相色谱(HPLC)柱中(Novapak C18，4μm；USA)，在36.5℃得到的氨基酸以1ml/min的流速洗脱，洗脱梯度是：100％溶剂A 10分钟，98％溶剂A 10.5分钟，93％溶剂A 26分钟，90％溶剂A 30分钟，67％溶剂A 43分钟，30％溶剂A 53分钟，100％水54分钟，100％的乙腈/水溶剂(65％/35％)60分钟(溶剂A＝Waters提供的磷酸盐缓冲液)。
获得的经洗脱的氨基酸用Applied Biosystem公司的980型检测器395nm处进行检测。对混合物中的氨基酸以每克干混合物中氨基酸的μmol量进行定量，并同在相同条件下获得的和经洗脱的标准样相比。水解产物分析
向根据本发明的方法进行钝化的混和物中添加甲醇至甲醇浓度达70％，添加1.5ml 70％甲醇和100mg聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，室温下将混合物缓缓搅动1小时，以20,000g力离心两次，每次10分钟，得到上层液，真空抽吸除去甲醇，在丸粒中加0.35ml水，在20,000g力下使溶液离心5分钟，将溶液过滤然后其水解产物的含量可用在C18反相高效液相色谱(HPLC)柱上洗提分析，用含0.1％三氟乙酸和2％的乙腈的水溶液以1ml/min的流速洗脱10分钟，然后用线性梯度的含有0.1％三氟乙酸和2-52.7％乙腈洗脱液洗提50分钟。洗提出的水解产物在215和280nm处进行检测。
在本发明的方法范围中，用本发明方法处理过的混合物中水解产物(肽和氨基酸)的量比未处理过的混合物中的水解产物的量增多了，其增加程度是通过比较保留时间为9，17，24，29.5分钟的四种水解产物的洗脱峰的面积来确定的。这些面积通常可以在对采自Theobroma cacao Trinitario，Criollo和Forastero等可可树的可可豆进行传统发酵的过程中见到。但是，不能排除的是，对采自一些特殊基因型的可可树的可可豆进行传统发酵时也会出现其他的水解产物。糖分析
对根据本发明进行钝化的混合物在60℃搅拌保温30分钟，在室温下静置15-30分钟，以20,000g力离心两次，每次5分钟，上层液用C18 Waters Sep-Pak萃取柱柱体进行过滤，再用SartoriusMinisart过滤器(SRP15，No.1755K)过滤滤液，借助Boehringer-Mannheim No.124028装置(德国)，用″God-Perid″分光光度法或是用HPLC法确定混合物中葡萄糖的含量。感官分析
根据本发明方法制得的水解可可汁或可可豆肉经加热钝化，PH调至5-6，真空微热(＜60℃)蒸发水分或水分含量低于10％，然后在130℃烘箱中焙炒15分钟，经焙烤产生的风味由风味评尝专家进行评价。
将所有的风味与那些在相同条件只经简单干燥和焙炒的可可豆碎粒或可可汁产生的风味相比较，这些可可豆碎粒和可可汁是用来充分发酵的Sanchez和Sulawesi可可豆及充分发酵过的Ghana可可豆制得的(本领域技术人员所知的可可豆)。
每个样品作以下感官评价：″可可风味″(得自Ghana豆)，″酸味″(大多数酸的稀水溶液产生的基本味觉)，″苦味″(由奎宁之类的各种各样物质的稀溶液产生的，在舌面及上颚后部感觉到的基底味觉)，″涩味″(比名词含义现已扩大到多酚所具有的全部作用，它可引起多种物理感觉，即从抑制油滑感到医疗意义上的收敛性，包括组织的收敛感和/或收缩感)；″果味″(属于花香的味感，使人想起苹果、香蕉、梨等达到成熟阶段的水果)；″花味″(相应于使人联想到玟瑰、茉莉花、眉豆、丁香等花的那种嗅觉感)；″烟味″(薰火腿的味道与气味；一般是用木炭烘烧方法将发酵后的可可豆进行干燥时感到的味道)；″霉味″和″生味″(未充分烘炒的、风味未充分形成的可可特有的味道；与涩味及酸味有关；这种味道令人想起落花生)。对比例1
采自Theobroma cacao Trinitario ICS-95的青可可豆肉经传统方法制备而得，在合适的时候，上述可可豆肉100mg，与多酚形成复合物的100mg PVPP和1ml PH 4的200mM柠檬酸缓冲液混合。将混合物在50℃保温2小时，用1ml PH 7的200mM柠檬酸盐缓冲液调节PH值，在适当时候添加40μl苯氧基肽酶A(0.06单位/μl，Sigma)，然后在25℃保温1小时，然后在95℃对混合物加热5分钟，停止反应。
用上述方法确定处理过的可可豆肉中的自由氨基酸含量和最初的可可豆肉及处理过的可可豆肉中的四种水解产物的洗脱峰面积，以此来分析可可蛋白质的水解程度(与自然发酵可可豆有关的产物、氨基酸和肽)。
表1所示结果表明：与原来存在于青可可豆中的风味前体相比，在PH 4和PH 7条件下可可豆肉的自溶并不能造成风味前体的显著增加。另一方面，含有PVPP的可可豆肉在PH 4条件下的自溶，随后在PH 7进行蛋白质酶促水解，则可使风味前体显著增加。因此青可可豆中的多酚确实有明显的抑制作用。表1
酶促处理 添加PVPP 氨基酸(μmol/g干重) 水解产物面积(单位任意)
总量 疏水性的 峰1 峰2 峰3 峰4
    无     -   15.9     2.5     604  551   716  -
    有     -   26.8     8.3     695  1224   696  -
    有     +   34.9     12.1     1559  2847   2854  1804
(水解产物1-4的保留时间分别为9，17，24和29.5分钟)对比例2
可可豆肉是由采自Theobroma cacao trinitario ICS-95的可可豆经1，2，3，4，5和7天的传统发酵然后干燥制备的。用上述方法确定发酵了的可可豆肉中四种水解产物(水解产物与自然发酵的可可豆有关)的洗脱峰面积，以此来分析可可豆肉蛋白质的水解程度。分析结果如表2所示。
通过以聚丙烯酰胺凝胶为载体的SDS-PAGE色谱分析法进行的可可豆肉蛋白质分析表明，如果发酵至少3天的可可豆，31kD和47kD区带的蛋白质则高度降解。另一方面，如果是发酵1-7天的可可豆，21kD区带的蛋白质则不降解。
在烤炉中将各种可可豆肉在130℃下焙炒15分钟。对可可豆肉产生的风味进行的感官分析表明，发酵3天的可可豆足以产生能被接受的可可风味。实施例1
采自Theobroma cacao trinitario ICS-95的可可豆经1，2，3，4，5和7天的传统发酵后干燥，经传统方法制成可可豆肉。1mlPH 4的200mM柠檬酸盐缓冲剂与每一种可可豆肉100mg混合，将混合物在50℃保温2小时，用1ml PH 7的200mM柠檬酸盐缓冲剂调整PH值，加入40μl羧肽酶A(0.06单位/μl，Sigma)，25℃降温1小时，然后通过95℃加热5分钟停止反应。按照前述方法，通过确定自由氨基酸含量和可可豆肉的四种主要水解产物(与自然发酵可可豆有关的水解产物)的洗脱峰面积来分析可可蛋白质的水解程度。
表2所示结果表明：由发酵不足或发酵良好的可可豆制得的可可豆肉中的水解产物含量至少增加1.4倍。此外，所有经处理了的可可豆肉中疏水氨基酸的含量和发酵3-7天的可可豆肉中疏水氨基酸的含量都高于每克干物质10μmol。
表2
发酵天数 酶促处理 水解产物面积(单位任意) 水解产物的增加
峰1 峰2 峰3 峰4
  11   无有   5651181   10712626   8331191     -- ×2.06
  22   无有   10721880   23934044   11901968     -- ×1.70
  33   无有   16002083   36435074   15952618     170890 ×1.52
  44   无有   15833107   34446051   17942836     202596 ×1.79
  55   无有   16632230   33834719   12492486     270- ×1.43
  77   无有   20612862   39715555   12022563     267- ×1.46
(四种水解产物的保留时间分别为9，17，24，29.5分钟)实施例2
采自Theobroma cacao trinitario ICS-95的可可豆经1，2，3，4，5和7天的传统发酵并干燥，经用传统方法制成可可豆肉。100μlPH 4的200mM柠檬酸盐缓冲剂与每一种可可豆肉100mg混合，将混合物在50℃保温2小时，用100μl PH 7的200mM柠檬酸盐缓冲剂调节PH值，添加40μl羧肽酶A(0.06单位/μl，Sigma)，25℃保温1小时；然后通过95℃加热5分钟停止反应。按照前述方法通过确定自由氨基酸含量和可可豆肉的四种主要水解产物(与自然发酵可可豆有关的水解产物)的洗脱峰面积来分析可可蛋白质的水解程度。实施例3
可可汁是由采自Theobroma cacao种的各种基因型的发酵不足的可可豆制备而得的。在聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE色谱分析中，这些可可豆的蛋白质显示出相当于2lkD和31kD/47kD储存蛋白质的三条可见区带。
通过前述方法确定一部份可可汁的水解产物含量。1ml PH 4的200mM柠檬酸盐缓冲剂与100mg可可汁混合，混合物50℃保温2小时，以1ml PH 7的200mM柠檬酸缓冲剂调节PH值，加入40μl羧肽酶A(0.06单位/μl，Sigma)，25℃保温1小时，然后95℃加热5分钟以停止反应。最后，通过确定可可汁中水解产物含量的方法(如前所述)来分析蛋白质的水解程度。
表3所示结果表明，用本发明的处理方法可显著提高发酵不足可可豆混合物得到的可可汁中的风味前体的含量。
表3
酶处理 氨基酸量(μmol/g干物质) 水解产物面积(单位任意)
总量 疏水氨基酸量   峰1   峰2   峰3   峰4
无 27.2     7.7   -   1451   613   -
有 35.9     14.7   771   2359   1115   724
(四种水解产物的保留时间分别为9，17，24，29.5分钟)实施例4
用实施例3的方法对采自Theobroma cacao的不同基因型可可树的500g发酵不足的可可豆进行酶处理。然后将失活了的混合物的PH值调至5-6，加入0.3％的葡萄糖和0.6％的果糖，以微热(60℃)真空蒸发水分干燥混合物，直至其中水分含量低于5％，在一烤炉中130℃焙炒15分钟，用前述的感官测试方法分析焙炒后的混合物产生的风味。结果表明，按本发明的方法处理并焙炒，用发酵不足的可可豆制得的可可豆肉具有发酵良好并经焙炒的可可豆所特有的那种浓郁的风味。实施例5
可可汁是由采自Theobroma cacao种的各种基因型的发酵过头可可豆经传统方法制得的。在聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE色谱分析中，这些可可豆中的蛋白质未显示出任何相当于21kD和31kD/47kD储存蛋白质的可见区带。
通过前述方法确定(一份)可可汁中的水解产物含量。然后，将100mg可可汁中混入1ml PH 4的200mM柠檬酸盐缓冲剂，混合物50℃保温2小时，用1ml PH 7的200mH柠檬酸缓冲剂调节PH值，加入40μl羧肽酶A(0.06单位/μl，Sigma)，25℃保温1小时，然后95℃加热5分钟停止反应。最后，通过确定可可汁中水解产物含量(方法如前所述)来分析蛋白质的水解程度。
表4所示结果表明：按本发明的方法处理，可使发酵过头的可可豆混合物制得的可可汁中的风味前体含量显著增加。
表4
酶处理 氨基酸量(μmol/g干物质 ) 水解产物面积(单位任意)
总量 疏水氨基酸量  峰1  峰2  峰3 峰4
无 49.5  19.2  960  2192  727 -
有 59.6  25.8  2102  4508  3026 -
(四种水解产物的保留时间分别为9，17，24，29.5分钟)实施例6
采自Theobroma cacao的不同基因型可可树的发酵过头的可可豆500g，以实施例5的方法进行酶处理。然后将失活了的混合物的PH值调至5-6，加入0.3％的葡萄糖和0.6％的果糖，以微热(60℃)真空蒸发水分干燥混合物，直至其中水分含量低于5％，在一烤炉中130℃焙炒15分钟，用前述的感官测试方法分析焙炒后的混合物产生的风味。结果表明：按本发明的方法处理并焙炒，用发酵过头的可可豆制得的可可豆肉具有发酵良好并经焙炒得到的可可豆所特有的那种浓郁的风味。实施例7
由传统发酵1天的可可豆制备的几种可可豆肉，将每种可可豆肉140g与含有各种活性单位的Maxinvert L10000转化酶的水溶液混合，将混合物保温30或120分钟，在95℃下加热1分钟停止反应，按前述方法确定每一混合物中葡萄糖的含量。图1所示结果表明：用单位1ml的转化酶足以将80％以上的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。实施例8
由发酵不足的Sanchez可可豆(175g)制得的可可汁，在用醋酸液调节PH至4.5的350ml水中50℃保温2小时(蛋白质内切酶作用)，然后用碳酸钾溶液调节PH至7，将混合物与MaxinvertL10000转化酶(20单位/g)及羧肽酶A(0.06单位/ml)一起在50℃下保温15分钟，或者使混合物与20单位/g的Maxinvert L10000转化酶及1％Corolase PP蛋白酶(Roehm，DE)一起在50℃下保温15分钟，或者使混合物与20单位/g的Maxinvert L10000转化酶及1％Promod 192P蛋白酶(Biocatalyst，UK)或1％Promod 279P蛋白酶(Biocatalyst)一起在50℃下保温60分钟。在95℃下加热混合物5分钟停止反应。最后，通过确定可可汁中水解产物含量(方法如前所述)来分析蛋白质的水解程度。
反应结束后，调节混合物PH值至5.2，干燥混合物，焙炒，按照前述方法进行感官分析。
表5所示结果表明：利用蛋白酶和转化酶制剂形成了风味前体。
表5
酶 氨基酸量(μmol/g干物质) ％疏水氨基酸(苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸) 水解产物面积(单位任意) 生成的葡萄糖(mg/g)
总量 疏水氨基酸量 峰1 峰2 峰3
 无  36.6     10.6     29.0     412   651     377     0.0
 Promod 192P  49.8     15.4     30.9     607   1012     494     5.2
 Promod 279P  53.4     16.3     30.5     575   958     470     5.6
 Corolase PP  44.3     15.6     35.2     1053   1423     1088     1.7
羧肽酶  37.6     12.9     34.3     759   1194     646     2.3
(三种水解产物的保温时间分别为9，17，24分钟)实施例9
在相同条件下，如果用蛋白酶对发酵不足的IndonesianSulawesi可可豆进行酶处理和在酶处理中用添加0.6％的果糖和0.3％的葡萄糖来替代转化酶，将得到与实施例8相似的结果。实施例10
用与实施例8相似的方法，让用发酵不足的Sanchez可可豆制得的可可汁与20单位/g转化酶和各种浓度的Promod 192蛋白酶一起保温，使蛋白质内切酶和Promod 192蛋白酶在PH 4.5下同时或顺次发生作用。将混合物在95℃下加热5分钟(除了测试5)停止反应。通过确定可可汁中的水解产物含量(方法如前所述)来分析蛋白质的水解程度。将混合物PH值调至5.2，干燥混合物，焙炒，按上述方法进行感官分析。
反应条件如表6所示。表7结果表明：(1)可以降低酶浓度，(2)所有反应可一步进行，(3)将混合物在干燥之前可避免钝化，(4)保温时可减少水量。
表6
测试 酶Promod192P 蛋白质内切酶PH 4.5  Promod192PPH 4.5 转化酶PH 4.5 可可汁(g) 添加水(ml) 干燥前加热  终点PH
  1 控制：无处理
  2   1.0％   2h  1h   20U/g   175   350   有     5.2
  3   1.0％   3h，在相同时间   20U/g   175   350   有     5.2
  4   0.2％   3h，在相同时间   20U/g   175   350   有     5.2
  5   1.0％   2h   1h   20U/g   175   350   无     5.2
  6   1.0％   2h   1h   20U/g   175   175   有     5.2
表7
测试 氨基酸量(μmol/g干物质) ％疏水氨基酸(苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸) 水解产物面积(单位任意) 生成的葡萄糖(mg/g)
总量 疏水氨基酸量 峰1 峰2 峰3
  1   36.0     10.6     28.9     412   651     377     0.0
  2   60.9     18.5     30.4     736   1277     560     4.6
  3   69.3     20.7     29.8     1025   1692     751     4.3
  4   46.2     14.0     30.4     547   942     427     5.0
  5   104.6     31.6     30.2     1322   2241     1167     5.4
  6   65.3     20.6     31.5     798   1444     606     3.8
(三种水解产物的保温时间分别为9，17，24分钟)
反应结束后，将混合物PH值调至5.2，然后干燥，焙炒，按照前述方法进行感官评价。结果表明发酵不足的可可豆所特有的那种不良风味消失了。此外，处理后的混合物中生成的可可风味与希望得到的风味近似。以从测试5中获得的样品(水量降低的)为特别优选。

Claims (10)

1.一种可可豆肉或可可汁的加工方法，其中：可可豆肉或可可汁是由发酵1至15天的可可豆制备的，在PH3-8的水性介质中至少它与一种工业蛋白酶混合，将该混合物在足够的温度下保温一定时间以水解蛋白质和肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中：将混合物在足够的温度下保温一定时间使得每克干物质至少得到10μmol的疏水氨基酸，并且获得的水解产物与原先存在于可可豆中的相比至少多1.4倍。
3.如权利要求1所述的方法，其中：可可豆肉或可可汁是发酵1-15天的可可豆制备的，将其与PH3-6的水性介质混合，该混合物在40-60℃范围内保温10分钟至20小时，将混合物PH值调至4-8，向其中至少添加一种工业蛋白酶，然后在10-60℃内保温5分钟至20小时。
4.如权利要求1所述的方法，其中：可可豆肉或可可汁是由发酵1至15天的可可豆制备的，与PH4-8的水性介质混合，至少向其中添加一种工业蛋白酶，在10-60℃下保温5分钟至20小时。
5.如权利要求1所述的方法，其中：可可豆肉或可可汁是由取自不同发酵阶段和/或采自不同基因型的可可树的可可豆的混合物制备的。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中：混合物中含有10-80％的可可豆肉或可可汁，并且每克混合物中含1-100单位的工业蛋白酶。
7.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中：还有，将从含有转化酶、葡萄糖酶、纤维素酶、果胶酶和氧化酶的一组酶中选出的至少一种工业酶添入混合物。
8.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中：还有，至少将0.1％wt的还原糖添入混合物中。
9.一种组合物，含有用经1-15天发酵的可可豆制备的可可豆肉或可可汁和一种工业蛋白酶和/或工业转化酶。
10.一种可可，是对如权利要求9所述的组合物进行焙炒得到的。
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