CN114672508A - 一种纳他霉素高产菌株的构建方法、菌株和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳他霉素高产菌株的构建方法，所述方法是通过在纳他霉素生产菌中过表达负责GDP‑甘露糖合成的酶即磷酸甘露糖异构酶的编码基因的方式实现。本发明方法通过在原始菌株中引入受强启动子驱动的磷酸甘露糖异构酶基因或者同时引入受强启动子驱动的磷酸甘露糖异构酶基因、磷酸甘露糖变位酶编码基因、GDP‑甘露糖焦磷酸化酶编码基因，实现工程菌株的构建。工程菌株在葡萄糖为碳源的发酵培养基中，纳他霉素的产量比原始菌株显著提高。

Description

一种纳他霉素高产菌株的构建方法、菌株和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种纳他霉素高产菌株的构建方法、菌株和应用。
背景技术
纳他霉素(Natamycin)，又称为匹马菌素，是目前市场上唯一的一个GRAS(Generally regarded as safe)状态的抗真菌剂，在食品防腐、医疗、农业能领域广泛使用。当前纳他霉素的应用场景和需求的不断扩大，对高性能菌种和低成本生产提出了更高的需求。
现有纳他霉素生产菌株主要从野生型生产菌株经过传统诱变育种技术获得，传统的诱变技术的连续使用容易遇到瓶颈，不能获得菌株性能的持续提升。现代基因工程育种技术降低了传统诱变技术的盲目性和随机性，与诱变技术相结合能够获得菌株性能的进一步提升。
对纳他霉素基因簇相关基因进行遗传改造是获得纳他霉素高产菌株最直接的方式。在多种链霉菌，如纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)，恰塔努加链霉菌(Streptomyces chatanoogensm)，褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)，利迪链霉菌 (Streptomyces lydicus)中都有发现纳他霉素的产生。纳他霉素生物合成基因簇也已从多个产生菌中克隆鉴定。这些基因簇在基因组成和结构上非常相似。通过在Streptomyces lydicusA02中克隆并过表达基因簇包含的途径特异性调控基因slnM2，工程菌株的纳他霉素产量是出发菌株的3.0倍(J Ind Microbiol Biotechnol.2014Jan；41(1):163-72.)。通过在褐黄孢链霉菌中过表达基因簇内部的信号蛋白编码基因(pimE)，工程菌的纳他霉素产量提高了72％(J Microbiol Biotechnol.2016Feb；26(2):241-7.)。通过前体合成途径的改造以加强前体供给是构建高产菌株的另一种有效基因工程育种方式。纳他霉素属于大环内酯聚酮类化合物，结构上由两部分组成：23元聚酮内酯环和海藻糖胺糖基，结构具体如下所示：
Figure BDA0003559775220000011
聚酮内酯环的合成是以酰基辅酶A为前体，由基因簇编码的I型聚酮合酶催化下连续组装而成。通过代谢工程的方法，过表达乙酰乳酸合成酶调控亚基(ilvH)，加强分支链氨基酸代谢途径，进而提高前体物质乙酰辅酶A的胞内供给，工程菌株纳他霉素产量提高了32％(Appl Microbiol Biotechnol.2020May；104(10):4471-4482.)。纳他霉素的另一个重要结构组分—海藻糖胺对纳他霉素的活性是必需的。合成海藻糖胺的直接前体是GDP-甘露糖。但是，目前野生型菌株中GDP-甘露糖的胞内供给是否是纳他霉素合成的瓶颈因素，目前还没有研究报道。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种纳他霉素高产菌株的构建方法、菌株和应用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种纳他霉素高产菌株的构建方法，所述方法是通过在纳他霉素生产菌中过表达负责 GDP-甘露糖合成的酶即磷酸甘露糖异构酶的编码基因的方式实现。
进一步地，所述负责GDP-甘露糖合成的酶还包括磷酸甘露糖变位酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶，所述方法是通过在纳他霉素生产菌中同时过表达负责GDP-甘露糖合成的酶即磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶的编码基因的方式实现。
进一步地，所述负责GDP-甘露糖合成的酶为纳他霉素生产菌自身来源的酶，或者为非自身来源的酶。
进一步地，所述纳他霉素生产菌为褐黄孢链霉菌，所述负责GDP-甘露糖合成的酶为天蓝色链霉菌来源的酶。
进一步地，具体步骤如下：
(1)构建重组质粒pOEmanABC：构建包含磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶编码基因的重组质粒，即从天蓝色链霉菌中分别扩增获得磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶的编码基因manA、manB、manC；三个基因放置在一个组成型启动子-kasO*p控制组成一个转录单元，并克隆到整合型载体上，构建成重组质粒pOEmanABC；
(2)将重组质粒pOEmanABC转化入纳他霉素生产菌，构建成manA、manB、manC 过表达菌株OEmanABC，工程菌OEmanABC即纳他霉素高产菌株，该菌株发酵生产纳他霉素的产量显著高于原始菌株。
利用如上所述的方法构建的纳他霉素高产菌株。
进一步地，所述纳他霉素高产菌株能够以葡萄糖作为发酵的碳源。
利用如上所述的菌株发酵生产纳他霉素的方法，包括如下步骤：
所述方法以葡萄糖作为发酵的碳源，且在采用发酵罐进行发酵过程中，通过流加的方式补充碳源，使得培养基中葡萄糖的浓度维持在1％以上。
进一步地，具体步骤如下：
将纳他霉素高产菌株的孢子悬液按2％-4％的接种量接种到装有50ml种子培养基的 250ml的三角瓶中，28℃、200rpm培养两天，得种子培养液；然后将种子培养液按5％的接种量转接到发酵罐中，发酵罐中的发酵培养基的总体积占发酵罐总体积的60％，发酵罐温度控制在28℃，600rpm，通气量为2v/v/m，发酵罐溶氧控制在30％以上；当发酵罐中葡萄糖的质量浓度低于1％时，在72h和96h各补加质量浓度为10％的葡萄糖溶液；或者，在反应过程中根据生产情况添加消泡剂控制泡沫，发酵5天，即得；
其中，每1L种子培养基的配方为：葡萄糖:20.0g；蛋白胨:6.0g；酵母浸出物:6.0g；Nacl:10.0g，pH 7.0，去离子水溶解后定容至1.0L，即得；
每1L发酵培养基的配方为：葡萄糖:40.0g，大豆蛋白胨15.0g，酵母浸出物5.0g，牛肉浸粉5.0g，去离子水溶解后定容至1.0L，即得。
利用如上所述的菌株在发酵生产纳他霉素方面中的应用。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明方法通过在原始菌株中引入受强启动子驱动的磷酸甘露糖异构酶基因或者同时引入受强启动子驱动的磷酸甘露糖异构酶基因、磷酸甘露糖变位酶编码基因、GDP- 甘露糖焦磷酸化酶编码基因，实现工程菌株的构建。工程菌株在葡萄糖为碳源的发酵培养基中，纳他霉素的产量比原始菌株显著提高。
2、如图1所示，链霉菌中GDP-甘露糖可以源自甘露糖前体，也可以源自糖酵解中间体果糖-6-磷酸前体。本发明人发现，在葡萄糖为碳源的培养条件下，ManA(磷酸甘露糖异构酶)催化的由果糖-6-磷酸生成甘露糖-6-磷酸的反应步骤是GDP-甘露糖合成的主要限速步骤。在褐黄孢链霉菌中过表达天蓝色链霉菌来源的manA基因(manAsc)，或者过表达自身来源的manA基因(manAsg)都能显著提高纳他霉素的产量，二者产量分别比野生型菌株提高了32.65％和19.34％。并且manAsc过表达对纳他霉素产量的提升效果要优于 manAsg过表达。
3、本发明将天蓝色链霉菌来源的GDP-甘露糖合成的三个关键酶的编码基因：manA(编码磷酸甘露糖异构酶),manB(编码磷酸甘露糖变位酶),manC(GDP-甘露糖焦磷酸化酶)同时过表达，获得的工程菌株纳他霉素产量进一步提升，在摇瓶发酵条件下达1222 mg/L,比野生型提高了82.74％。在2L发酵罐发酵条件下，纳他霉素产量达3874mg/L，比野生型提高了32.8％。
附图说明
图1为链霉菌中GDP-甘露糖合成途径示意图。
图2为本发明中野生型菌株在不同碳源(葡糖糖、甘露糖)条件下摇瓶发酵结果图；
图3为本发明中葡糖糖为碳源摇瓶发酵，野生型(WT)、工程菌OEmanAsc和工程菌OEmanAsg的纳他霉素产量图；
图4为本发明中质粒pOEmanABC的结构示意图；
图5为本发明中葡糖糖为碳源摇瓶发酵，野生型(WT)和工程菌OEmanABC的纳他霉素产量图；
图6为本发明中葡糖糖为碳源发酵罐发酵，野生型(WT)和工程菌OEmanABC的纳他霉素产量图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种纳他霉素高产菌株的构建方法，所述方法是通过在纳他霉素生产菌中过表达负责 GDP-甘露糖合成的酶即磷酸甘露糖异构酶的编码基因的方式实现。
较优地，所述负责GDP-甘露糖合成的酶还包括磷酸甘露糖变位酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶，所述方法是通过在纳他霉素生产菌中同时过表达负责GDP-甘露糖合成的酶即磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶的编码基因的方式实现。
较优地，所述负责GDP-甘露糖合成的酶为纳他霉素生产菌自身来源的酶，或者为非自身来源的酶。
较优地，所述纳他霉素生产菌为褐黄孢链霉菌，所述负责GDP-甘露糖合成的酶为天蓝色链霉菌来源的酶。
较优地，具体步骤如下：
(1)构建重组质粒pOEmanABC：构建包含磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶编码基因的重组质粒，即从天蓝色链霉菌中分别扩增获得磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶的编码基因manA、manB、manC；三个基因放置在一个组成型启动子-kasO*p(kasO*p启动有参考文献(Applied&
Environmental Microbiology,2013,79(14):4484-4492)，是领域内公知的。)控制组成一个转录单元，并克隆到整合型载体上，构建成重组质粒pOEmanABC；
(2)将重组质粒pOEmanABC转化入纳他霉素生产菌，构建成manA、manB、manC 过表达菌株OEmanABC，工程菌OEmanABC即纳他霉素高产菌株，该菌株发酵生产纳他霉素的产量显著高于原始菌株。
利用如上所述的方法构建的纳他霉素高产菌株。
较优地，所述纳他霉素高产菌株能够以葡萄糖作为发酵的碳源。
利用如上所述的菌株发酵生产纳他霉素的方法，包括如下步骤：
所述方法以葡萄糖作为发酵的碳源，且在采用发酵罐进行发酵过程中，通过流加的方式补充碳源，使得培养基中葡萄糖的浓度维持在1％以上。
较优地，具体步骤如下：
将纳他霉素高产菌株的孢子悬液按2％-4％的接种量接种到装有50ml种子培养基的 250ml的三角瓶中，28℃、200rpm培养两天，得种子培养液；然后将种子培养液按5％的接种量转接到发酵罐中，发酵罐中的发酵培养基的总体积占发酵罐总体积的60％，发酵罐温度控制在28℃，600rpm，通气量为2v/v/m，发酵罐溶氧控制在30％以上；当发酵罐中葡萄糖的质量浓度低于1％时，在72h和96h各补加质量浓度为10％的葡萄糖溶液；或者，在反应过程中根据生产情况添加消泡剂控制泡沫，发酵5天，即得；
其中，每1L种子培养基的配方为：葡萄糖:20.0g；蛋白胨:6.0g；酵母浸出物:6.0g；Nacl:10.0g，pH 7.0，去离子水溶解后定容至1.0L，即得；
每1L发酵培养基的配方为：葡萄糖:40.0g，大豆蛋白胨15.0g，酵母浸出物5.0g，牛肉浸粉5.0g，去离子水溶解后定容至1.0L，即得。
利用如上所述的菌株在发酵生产纳他霉素方面中的应用。
具体地，相关的制备及检测如下：
1、对于纳他霉素聚酮内酯环碳骨架的合成前体：酰基辅酶A(包含乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶三种)。对每一个前体，本发明人都选取了一个对应的合成途径，并进行了大量的试验，通过过表达相应合成酶的方式进行了途径加强改造。但是发现获得的工程菌株与原始菌株相比纳他霉素发酵产量没有显著差异。
Figure BDA0003559775220000041
2、本发明人发现野生型菌株在甘露糖为碳源的培养基中纳他霉素的产量达3158mg/L, 是葡萄糖为碳源的培养基中产量的4.7倍，推测在葡萄糖为碳源的培养基GDP-Mannnose 的供给是纳他霉素合成的主要瓶颈。与葡萄糖相比，甘露糖价格昂贵，不适宜在发酵生产中使用。本发明通过加强葡萄糖碳源条件下的GDP-甘露糖合成途以获得了纳他霉素高产菌株。
实施例1在甘露糖为唯一碳源条件下野生型菌株的摇瓶发酵
葡萄糖是纳他霉素生产的常用碳源。为了探究GDP-甘露糖的供给是否为纳他霉素合成时的限速因素，本发明采用甘露糖为唯一碳源条件下野生型菌株的发酵实验。具体过程如下：
种子培养基：(1L):葡萄糖:20.0g；蛋白胨:6.0g；酵母浸出物:6.0g；Nacl:10.0g，pH 7.0；发酵培养基:(1L):葡萄糖:40.0g，大豆蛋白胨15.0g，酵母浸出物5.0g，牛肉浸粉5.0g,pH 7.5；
发酵培养基(甘露糖)：D-甘露糖:40.0g，大豆蛋白胨15.0g，酵母浸出物5.0g，牛肉浸粉5.0g,pH 7.5；
将野生型菌株(S.gilvosporeus ATCC 13326)划线于MS平板，在28℃培养7-10天。用无菌水洗取新鲜孢子，制备新鲜孢子悬浮液。将孢子悬液按2％-4％的的接种量接种到装有20ml种子培养基的100ml的三角瓶中，28℃、200rpm培养两天，然后将种子培养基按 5％的接种量转接到含有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃、200rpm发酵五天。进行发酵液中那他霉素含量的测定。
样品处理：取1ml发酵液，加入9ml的甲醇，充分震荡后，超声20min，之后8000r/min离心15min。将上清液用甲醇稀释合适倍数后用0.22um有机膜过滤，即得到待测液。
HPLC检测方法：Cosmosil5C18-MS-Ⅱ柱(4.6mmID×150mm)；流动相：甲醇：水＝7：3(体积比)；流速：0.7ml/min；检测波长：303nm；进样量：10ul；柱温30℃。
结果如图2所示，在甘露糖为碳源的发酵培养基纳他霉素产量达3158mg/L，是以葡萄糖为碳源的发酵培养基产量的4.7倍。
根据这一结果，推测葡萄糖为碳源的情况下，GDP-甘露糖的胞内供给不足可能是造成产量低于以甘露糖为碳源发酵条件的主要原因。因此，加强GDP-甘露糖的合成途径，有望提升纳他霉素的产量。
实施例2工程菌株OEmanAsc和OEmanAsg的构建与发酵
葡萄糖为碳源的条件下，果糖-6-磷酸异构酶催化的反应：果糖-6-磷酸生成甘露糖-磷酸可能为GDP-甘露糖合成的限速步骤。为了获得纳他霉素高产菌株，本发明构建了果糖-6- 磷酸异构酶过表达工程菌。两个不同来源的果糖-6-磷酸异构酶编码基因分别被用来进行工程菌株的构建。来源于天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的果糖-6-磷酸异构酶编码基因称为 manAsc，来源于褐黄孢链霉菌(S.gilvosporeus)的果糖-6-磷酸异构酶编码基因称为manAsg。构建好的两个果糖-6-磷酸异构酶编码基因过表达工程菌株分别为：OEmanAsc和 OEmanAsg.工程菌株的构建过程如下：
1)重组质粒pOEmanAsg的构建
首先委托基因合成公司合成DNA片段kasO*p(序列如序列1)，并经该片段克隆入链霉菌整合型质粒pIJ10500(该质粒在申请日前文献中已经公开，具体可以参考文献：BMCGenomics 12,175(2011).https://doi.org/10.1186/1471-2164-12-175)，获得重组质粒pIJ10500::kasO*p(序列2)。以褐黄孢链霉菌(S.gilvosporeus ATCC 13326)基因组为模板， A-L/A-R(表1)为引物对进行PCR扩增，获得磷酸甘露糖异构酶编码基因manAsg。50μLPCR反应体系含有如下组分：5×PS Buffer：10μL；dNTP(2mM)：4μL；A-L(10μM)：2μL； A-R(10μM)：2μL；S.gilvosporeus ATCC 13326基因组(10ng/μL)0.5μL；PrimeSTAR DNA聚合酶(Takaru，R010A):0.5μL，去离子水:31μL。PCR反应条件为：98℃预变性3min； 98℃变性10s，68℃延伸5min,反应30个循环；68℃10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收。
将载体pIJ10500::kasop用HindⅢ单酶切，酶切体系为：载体12μl，Buffer(10×)6μL， HindⅢ2μL，加水定容至60μL，37℃水浴三十分钟后采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANgel Midi Purification Kit，TIANGEN Biotech Co.,Ltd.)，获得线性化载体片段。
采用一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit C112，VazymeBiotech Co., Ltd.)，将回收后的manAsg片段和pIJ10500::kasop线性载体进行连接。连接体系为：4μL 5×CE II Buffer，2μL ClonExpress II，5μLmanA(S.gilvosporeus)片段，5μLpIJ10500::kasop 线性载体，4μL H2O。37℃反应30min后立即冰浴5min。
将连接产物转化E.coli JM09感受态细胞，转化子在含有潮霉素(200μg/mL)的LB培养基上进行筛选。培养转化子并提取质粒，经测序验证构建成功的重组质粒命名为pOEManAsg。
表1所用引物
Figure BDA0003559775220000051
Figure BDA0003559775220000061
2)重组质粒pOEmanAsc的构建
以天蓝色链霉菌(S.coelicolor M145)基因组为模板，SCO3025-L/SCO3025-R(表2) 为引物对进行PCR扩增，获得磷酸甘露糖异构酶编码基因manAsc。50μL PCR反应体系含有如下组分：5×PS Buffer：10μL；dNTP(2mM)：4μL；A-L(10μM)：2μL；A-R(10μM)： 2μL；S.coelicolor基因组(10ng/)0.5μL；PrimeSTAR DNA聚合酶(Takaru，R010A):0.5μL，去离子水:31μL。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，68℃延伸5min,反应 30个循环；68℃10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收。
表达载体pIJ10500::kasop用HindⅢ单酶切，酶切体系为：载体12μl，Buffer(10×)6μL， HindⅢ2μL，加水定容至60μL，37℃水浴三十分钟后采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANgel Midi Purification Kit，TIANGEN Biotech Co.,Ltd.)，获得载体片段。
采用一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit C112，VazymeBiotech Co., Ltd.),将回收后的manA(S.coelicolor)片段和pIJ10500::kasop线性载体连接。连接体系为：4μL 5×CE II Buffer，2μL ClonExpress II，5μL manA(S.coelicolor)片段，5μL pIJ10500::kasop线性载体，4μLH2O。37℃反应30min后立即冰浴5min。
将连接产物转化E.coli JM09感受态细胞，转化子在含有潮霉素(200μg/mL)的LB培养基上进行筛选。培养转化子并提取质粒，经测序验证构建成功的重组质粒命名为pOEManAsc。
表2所用引物
Figure BDA0003559775220000062
3)工程菌株OEmanAsg的构建
将质粒pOEmanAsg通过结合转移的方式转化入S.gilvosporeus ATCC 13326中，获得果糖-6磷酸异构酶过表达工程菌株OEmanAsg。具体步骤如下：
(1)将质粒pOEmanAsg转化入大肠杆菌菌株E.coliET12567/pUZ8002感受态细胞。
(2)将含有pOEmanAsg质粒的大肠杆菌菌株E.coli ET12567/pUZ8002接种于5mL含有50μg/mL潮霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。取0.2mL过夜培养物转接到含有 50μg/mL潮霉素的新鲜LB培养基中，37℃摇床培养至2～3小时，直至大肠杆菌菌体的浓度达到OD600约为0.5～0.6。收集其中培养物1mL，8000转/分离心1分钟。然后用新鲜的 LB培养基清洗菌体三次，最终用十分之一体积的新鲜LB培养基悬浮菌体。
(3)取100μL新鲜的链霉菌孢子，先用2×YT培养基清洗一次，然后悬浮在新鲜的2×YT 培养基中，放入50℃水浴锅中热激10分钟。
(4)将上述步骤中的大肠杆菌菌液和链霉菌孢子液按照供体:受体＝1:1的比例混合均匀，涂布在含有MS培养基的平板上，30℃培养13～20小时后，使用1mL含有20ul潮霉素(母液浓度50mg/ml)和1.35mg萘啶酮酸的无菌水均匀覆盖平板表面。吹干平板表面的水分后，再放入30℃培养箱中恒温倒置培养3～5天，直至含有pOEManAsg的重组菌株生长起来。
(其中，MS培养基：甘露醇20g，黄豆粉20g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，115℃灭菌30分钟，用于链霉菌的培养。2×YT培养基：胰蛋白胨16g，酵母浸出物10g，NaCl 5g，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20分钟，用于接合转移实验。LB培养基：胰蛋白胨10 g酵母浸出物5gNaCl 10g琼脂20g，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20分钟，用于大肠杆菌的培养)。
经验证，pOEManAsg成功整合入褐黄孢链霉菌基因组的转化子命名为OEmanAsg。
4).工程菌株OEmanAsc的构建
将质粒pOEManAsc通过结合转移的方式转化入S.gilvosporeusATCC 13326中，获得果糖-6磷酸异构酶过表达工程菌株OEmanAsc。具体构建过程如菌株OEmanAsc的构建。
5).工程菌株OEmanAsc和OEmanAsg的发酵.
在葡萄糖为唯一碳源的条件下，对野生型菌株和果糖-6磷酸异构酶过表达工程菌株进行摇瓶发酵。过程如下：用无菌水洗取新鲜孢子，制备新鲜孢子悬浮液。将孢子悬液按2％-4％的的接种量接种到装有20ml种子培养基的100ml的三角瓶中，28℃、200rpm培养两天，然后将种子培养基按5％的接种量转接到含有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中， 28℃、200rpm发酵五天。
采用实施例子1中的样品处理和HPLC检测方法对发酵液中的纳他霉素进行检测。结果如图3所示：与野生型相比，两个工程菌株纳他霉素产量得到显著提升，其中，OEmanAsc产量提高了32.65％。OEmanAsg产量提高了19.34％。表明在加强GDP-甘露糖合成途径，提高纳他霉素产量方面，过表达天蓝色链霉菌来源的果糖-6磷酸异构酶编码基因(manAsc) 要优于过表达褐黄孢链霉菌内源基因(manAsg)。
实施例3工程菌株OEmanABC的构建与发酵
为了进一步提高纳他霉素产量，本发明将GDP-甘露糖合成途径中的三个合成基因(manA,manB,manC)在褐黄孢链霉菌中同时进行了过表达，构建了工程菌株OEmanABC。根据实施例2的研究结果，本构建所采用的三个基因均克隆自天蓝色链霉菌。具体构建过程如下：
1)首先构建manA、manB共过表达重组质粒pOEmanAB:
以天蓝色链霉菌(S.coelicolor M145)基因组为模板，SCO3028-L和SCO3028-R为引物进行PCR扩增，获得磷酸甘露糖变位酶编码基因(manB)。50μLPCR反应体系含有如下组分：5×PS Buffer：10μL；dNTP(2mM)：4μL；A-L(10μM)：2μL；A-R(10μM)：2μL； S.coelicolorM145基因组(10ng/μL)0.5μL；PrimeSTAR DNA聚合酶(Takaru， R010A):0.5μL，去离子水:31μL。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，68℃延伸5min,反应30个循环；68℃10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收。
将重组质粒pOEManAsc用HindⅢ单酶切，酶切体系为：载体12μl，Buffer(10×)6μL， HindⅢ2μL，加水定容至60μL，37℃水浴三十分钟后采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANgel Midi Purification Kit，TIANGEN Biotech Co.,Ltd.)，获得线性化载体片段。
采用一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit C112，VazymeBiotech Co., Ltd.),将回收后的manB片段和pOEManAsc线性载体进行连接。进连接体系为：4μL 5×CE II Buffer，2μL ClonExpress II，5μLmanB片段，5μLpMANAsgOE线性载体，4μLH2O。轻轻吸打混匀后，37℃反应30min后立即冰浴5min。
将连接产物转化E.coli JM09感受态细胞，转化子在含有潮霉素(200μg/mL)的LB培养基上进行筛选。培养转化子并提取质粒，经测序验证构建成功的重组质粒命名为pOEmanAB。
2)在此基础上构建manA、manB、manC共过表达重组质粒pOEmanABC:
以以天蓝色链霉菌(S.coelicolor M145)基因组为模板，SSCO3039-L和SCO3039-R为引物扩增GDP-甘露糖焦磷酸化酶编码基因(manC)。50μLPCR反应体系含有如下组分： 5×PS Buffer：10μL；dNTP(2mM)：4μL；A-L(10μM)：2μL；A-R(10μM)：2μL；S.coelicolor M145基因组(10ng/)0.5μL；PrimeSTAR DNA聚合酶(Takaru，R010A):0.5μL，去离子水:31μL。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，68℃延伸5min,反应30个循环；68℃10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收。
HindⅢ单酶切pOEManAB。酶切体系为：载体12μl，Buffer(10×)6μL，HindⅢ2μL，加水定容至60μL，37℃水浴三十分钟后采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANgel MidiPurification Kit，TIANGEN Biotech Co.,Ltd.)，获得线性化载体片段。
采用一步克隆试剂盒，将回收后的manC片段和pOEManAB线性载体进行连接。连接体系为：4μL 5×CE II Buffer，2μL ClonExpress II，5μL manC片段，5μLpMANABsgOE 线性载体，4μL H2O。轻轻吸打混匀后，37℃反应30min后立即冰浴5min。
将连接产物转化E.coli JM09感受态细胞，转化子在含有潮霉素(200μg/mL)的LB培养基上进行筛选。培养转化子并提取质粒，经测序验证构建成功的重组质粒命名为pOEmanABC.质粒pOEmanABC的结构示意图如图4所示，manA、manB、manC三个基因在强启动子kasO*p驱动下，组成一个转录单元。
表3所用引物
Figure BDA0003559775220000081
3).工程菌株OEmanABC的构建
将质粒pOEmanABC通过结合转移的方式转化入S.gilvosporeus ATCC 13326中，获得manA、manB、manC共过表达工程菌株OEmanABC。结合转移的方式如实施例2中所述。
4).工程菌株OEmanABC的发酵
在葡萄糖为唯一碳源的条件下，对野生型菌株和OEManABC进行摇瓶发酵。菌株发酵、样品处理和HPLC检测过程如实施例1中所述。
结果如图5所示，OEmanABC发酵产量达1222.18mg/L，比野生型提高了82.74％。
实施例4褐黄孢链霉菌工程菌株OEManABC 2L发酵罐发酵
将野生型菌株和褐黄孢链霉菌工程菌株OEManABC分别采用2L发酵罐进行发酵。具体操作过程如下：
将孢子悬液按2％-4％的的接种量接种到装有50ml种子培养基的250ml的三角瓶中， 28℃、200rpm培养两天，然后将种子培养基按5％的接种量转接到2L的发酵罐中，发酵罐中发酵培养基的总体积为1.2L，发酵罐温度控制在28℃，600rpm，通气量为2v/v/m，发酵罐溶氧控制在30％以上。发酵罐葡萄糖浓度低于1％时，在72h和96h各补加120ml 的10％葡萄糖溶液。在必要时，添加消泡剂控制泡沫，发酵五天；
其中，每1L种子培养基的配方为：葡萄糖:20.0g；蛋白胨:6.0g；酵母浸出物:6.0g；Nacl:10.0g，pH 7.0，去离子水溶解后定容至1.0L，即得；
每1L发酵培养基的配方为：葡萄糖:40.0g，大豆蛋白胨15.0g，酵母浸出物5.0g，牛肉浸粉5.0g，去离子水溶解后定容至1.0L，即得。
样品处理和HPLC检测过程如实施例1中所述。
结果如图6所示工程菌株的纳他霉素产量达3874.88mg/L,比野生型提高了32.8％。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种纳他霉素高产菌株的构建方法、菌株和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 106
<212> DNA
<213> kasO*p序列(Unknown)
<400> 1
catatgtcct gttcacattc gaacggtctc tgctttgaca acatgctgtg cggtgttgta 60
aagtcgtggc caggagaata cgacagcgtg caggactggg ggagtt 106
<210> 2
<211> 6958
<212> DNA
<213> 重组质粒pIJ10500::kasO*p序列(Unknown)
<400> 2
caccgcctgg ttctgcgacg gcgaggcgcc gtcccaggcc ccgccgatcc ccgtcccccg 60
cgtcgtcgag cgcggtgccg acgacaccgc cgcgtggctc gtcacggagg ccgtccccgg 120
cgtcgcggcg gccgaggagt ggcccgagca ccagcggttc gccgtggtcg aggcgatggc 180
ggagctggcc cgcgccctcc acgagctgcc cgtggaggac tgccccttcg accggcgcct 240
cgacgcggcg gtcgccgagg cccggcggaa cgtcgccgag ggcctgtgga cctcgacgac 300
cgatctgatg tgctcagtat caccgccagt ggtatttatg tcaacaccgc cagagataat 360
ttatcaccgc agatggttac ctcgcctctg acccctgacc ccgtcagcct gaggttgaaa 420
aacgctcact ggtaccgaag atgaacacga tcaggcatgg attgccgccg ctgcggagcg 480
cttcgccctt cagcacgacc tagcgggggt ggccgatgag cggcgcgaac aacaggcgca 540
cctagacaac gtgcggcgct ccatcaagga ccttcaggcg gaccgtaagg ccggtctgta 600
cgtcgggcgt gaagagctgg aaacgtggcg ctcaacggtg ctgcaatacc ggtcctacga 660
agcggagtgc acgacccgac tcgctgagct tgacgagaag atgaacggca gcacccgcgt 720
tccgtctgag tggttcagcg gcgaagaccc gacggccgaa gggggcatct gggcaagctg 780
ggacgtgtac gagcgtcggg agttcctgag cttcttcctt gactccgtca tggtcgaccg 840
ggggcgccac cctgagacga agaaatacat ccccctgaag gaccgtgtga cgctcaagtg 900
ggcggagctg ctgaaggagg aagacgaagc gagcgaagcc actgagcggg agcttgcggc 960
gctgtagcgc acagcgggag gggtcgagcc ggcggacggt tcggcccctt ttttggcctt 1020
gaaatcgtta gttaggctaa ctagtagttc cttcgtcacc atagcgggca gggagcggat 1080
ccgcggccgc gcgcgatcat atgtcctgtt cacattcgaa cggtctctgc tttgacaaca 1140
tgctgtgcgg tgttgtaaag tcgtggccag gagaatacga cagcgtgcag gactggggga 1200
gttaaagctt ggatcctagg ttctcggctt ttcgccattc gtattgcacg acattgcact 1260
ccaccgctga tgacatcagt cgatcatagc acgatcaacg gcactgttgc aaatagtcgg 1320
tggtgataaa cttatcatcc ccttttgctg atggagctgc acatgaacca aaaggatcta 1380
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 1440
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 1500
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 1560
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 1620
tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1680
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1740
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 1800
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 1860
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 1920
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 1980
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 2040
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 2100
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 2160
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 2220
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 2280
gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 2340
tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 2400
tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 2460
cagctatgac atgattacga attcgatcta cttgtcgtca tcgtccttgt agtcgatgtc 2520
gtggtccttg tagtcgccgt cgtggtcctt gtagtcctcg agaggcctca tatgatcgcg 2580
cgcggccgcg gatccgctcc ctgcccgcta tggtgacgaa ggaactacta gttagcctaa 2640
ctaacgattt caaggccaaa aaaggggccg aaccgtccgc cggctcgacc cctcccgctg 2700
tgcgctacag cgccgcaagc tcccgctcag tggcttcgct cgcttcgtct tcctccttca 2760
gcagctccgc ccacttgagc gtcacacggt ccttcagggg gatgtatttc ttcgtctcag 2820
ggtggcgccc ccggtcgacc atgacggagt caaggaagaa gctcaggaac tcccgacgct 2880
cgtacacgtc ccagcttgcc cagatgcccc cttcggccgt cgggtcttcg ccgctgaacc 2940
actcagacgg aacgcgggtg ctgccgttca tcttctcgtc aagctcagcg agtcgggtcg 3000
tgcactccgc ttcgtaggac cggtattgca gcaccgttga gcgccacgtt tccagctctt 3060
cacgcccgac gtacagaccg gccttacggt ccgcctgaag gtccttgatg gagcgccgca 3120
cgttgtctag gtgcgcctgt tgttcgcgcc gctcatcggc cacccccgct aggtcgtgct 3180
gaagggcgaa gcgctccgca gcggcggcaa tccatgcctg atcgtgttca tcttccatgt 3240
cggctgtgcg gagccgtgcc cacaccttcg aagcaacgaa ttcgtccagt tcgctgcgct 3300
tgaccgacaa gccgccgtgc cccttcgggt tggcgcacat gtaattgcct tcggcaaggt 3360
cgccgttgcg cttacggcca ccctgggact gacccattga gccgccgcag attcggcacc 3420
ccaggaaacg ccacccgctc agaagcgtcg gttcgacttc ggccccaggc ttccggtcgc 3480
tgagattctt cccggaacgc ttctcttgaa gctcaagcca cttcgagccg ctgagaatgc 3540
ccgtgtgggg cgttagcggc ttgccgccgg ggtcgcgccg tatgacgttg atgtgcgcct 3600
taccgtgctt cacacgctcg aatgcgaaac cgccgattgc gggatggttg agaatccatc 3660
ggaccgtttg agcgcgccac atgatcggct tttcagcgcc gttcaggcga cgtgccttga 3720
tggacgcaag acgcttttcc gtggcgcgtc tctcagccat tccgggcgac gggatctttt 3780
ccttctcgaa ggtcgttgca atggcgttgt cggacacgcc ttcgaacgac attttcgcca 3840
tgcgctcaac tagctcgacg tgatccgggt tgtcttcgtc cggctcaaga acggagatca 3900
cgagattatc gaccttcttg cgcacggcgc gcattccgaa cggggcggaa gacgagtgaa 3960
cgccacccag cgcggcaatc tcgtctttcg cacccttcag gcgctccgcc ttcaggtcac 4020
tgtcctgttt cgcaagggca gcgatcagcg cgaaaatggc gacgccgata ggggtagacg 4080
tgtcaaggaa cggctcaaga accgacatga agcgcacgcc gtgcttcttc aattcgttgt 4140
cgatttcgag cgcgtcatgg gcgcccttgc gagtgagccg ggaaagctca ttcacaacga 4200
caacgtcacc ttcgccggcg cggacttcgc ccatcatgcg ctcgaagtcg gcacgggtca 4260
cgttcgggtc ccagccggag cgcccgacgt ccacgaactc acctgccacg acccagcgcg 4320
cacccccctg ggcgttgcga gacgcgacca acgcacgacc ggccgctagc tgtgcttcgg 4380
tcgacacgtc tgagccgtcg gaccggccct tagactgacg cgcgtacagg aagacgcgaa 4440
cagtgtctag aaggtgctca gggacgtcgg gagcgatgaa gggcgacatg cctagatctt 4500
ggctcatggg cgctgacctg cgctttcttt tgggaacatt ggtggtgctg agtagtttcc 4560
catggatcac tgtccagaga caacaaccca gcacccgaaa cgtctgaagc cccgtccggc 4620
gccagcatgc ctgcaggtcg acggatcttt tccgctgcat aaccctgctt cggggtcatt 4680
atagcgattt tttcggtata tccatccttt ttcgcacgat atacaggatt ttgccaaagg 4740
gttcgtgtag actttccttg gtgtatccaa cggcgtcagc cgggcaggat aggtgaagta 4800
ggcccacccg cgagcgggtg ttccttcttc actgtccctt attcgcacct ggcggtgctc 4860
aacgggaatc ctgctctgcg aggctggccg gctaccgccg gcgtaacaga tgagggcaag 4920
cggatggctg atgaaaccaa gccaaccagg aagggcagcc cacctatcaa ggtgtactgc 4980
cttccagacg aacgaagagc gattgaggaa aaggcggcgg cggccggcat gagcctgtcg 5040
gcctacctgc tggccgtcgg ccagggctac aaaatcacgg gcgtcgtgga ctatgagcac 5100
gtccgcgagc tggcccgcat caatggcgac ctgggccgcc tgggcggcct gctgaaactc 5160
tggctcaccg acgacccgcg cacggcgcgg ttcggtgatg ccacgatcct cgccctgctg 5220
gcgaagatcg aagagaagca ggacgagctt ggcaaggtca tgatgggcgt ggtccgcccg 5280
agggcagagc catgactttt ttagccgcta aaacggccgg ggggtgcgcg tgattgccaa 5340
gcacgtcccc atgcgctcca tcaagaagag cgacttcgcg gagctggtga agtacatcac 5400
cgacgagcaa ggcaagaccg atccccgggg acctgcaggt cgactctagc tagctggcca 5460
gggcccgata cgtcgcggtg agttcaggct ttttcatatc tcattgcccc cggacgagcg 5520
tctgctccgc cattcgccgt ccgccgtgcc aatcggatca gccgtccaaa tgcgggattt 5580
tcgttagtcg gaggccaaac ggcattgagc gtcagcatat catcagcgag ctgaagaaag 5640
acaatccccg atccgctcca cgtgttgccc cagcaatcag cgcgaccttg cccctccaac 5700
gtcatctcgt tctccgctca tgagaactga gaagccccgt caggcaccgc ccgacggggc 5760
tcttcacccg gggcgtcagg cgccgggggc ggtgtccggc ggcccccaga ggaactgcgc 5820
cagttcctcc ggatcggtga agccggagag atccagcggg gtctcctcga acacctcgaa 5880
gtcgtgcagg aaggtgaagg cgagcagttc gcgggcgaag tcctcggtcc gcttccactg 5940
cgccccgtcg agcagcgcgg ccaggatctc gcggtcgccc cggaaggcgt tgagatgcag 6000
ttgcaccagg ctgtagcggg agtctcccgc atagacgtcg gtgaagtcga cgatcccggt 6060
gacctcggtc gcggccaggt ccacgaagat gttggtcccg tgcaggtcgc cgtggacgaa 6120
ccggggttcg cggccggcca gcagcgtgtc cacgtccggc agccagtcct ccaggcggtc 6180
cagcagccgg ggcgagaggt agccccaccc gcggtggtcc tcgacggtcg ccgcgcggcg 6240
ttcccgcagc agttccggga agacctcgga atggggggtg agcacggtgt tcccggtcag 6300
cggcaccctg tgcagccggc cgagcacccg gccgagttcg cgggccaggg cgagcagcgc 6360
gttccggtcg gtcgtgccgt ccatcgcgga ccgccaggtg gtgccggtca tccggctcat 6420
caccaggtag ggccacggcc aggctccggt gccgggccgc agctcgccgc ggccgaggag 6480
gcggggcacc ggcaccgggg cgtccgccag gaccgcgtac gcctccgact ccgacgcgag 6540
gctctccgga ccgcaccagt gctcgccgaa cagcttgatc accgggtcgg gctcgccgac 6600
cagtacgggg ttggtgctct cgccgggcac ccgcagcacc ggcggcaccg gcagcccgag 6660
ctcctccagg gctcggcggg ccagcggctc ccagaattcc tggtcgttcc gcaggctcgc 6720
gtaggaatca tccgaatcaa tacggtcgag aagtaacagg gattcttgtg tcacagcgga 6780
cctctattca cagggtacgg gccggcttaa ttccgcacgg ccggtcgcga cacggcctgt 6840
ccgcaccgcg gtcaggcgtt gacgatgacg ggctggtcgg ccacgtcggg gacgttctcg 6900
gtggtgctgc ggtcgggatc gccaatctct acgggccgac cgaggcgacg gtgtacgc 6958
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> A-L(Unknown)
<400> 3
tgcaggactg ggggagttaa atggaccgcc tcgccaatac 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> A-R(Unknown)
<400> 4
gccgagaacc taggatccaa gctcgtgcgg cggtcattgt t 41
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> SCO3028-L(Unknown)
<400> 5
gccaccgtgc gcgtctgaaa gctagaaagg ttggccgtgg ctg 43
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> SCO3028-R(Unknown)
<400> 6
gccgagaacc taggatccaa gctttcacgc ccggatgatc gcca 44
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> SCO3025-L(Unknown)
<400> 7
tgcaggactg ggggagttaa gctatggacc gcctcgacaa cac 43
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> SCO3025-R(Unknown)
<400> 8
agccgagaac ctaggatcca agctttcaga cgcgcacggt ggccc 45
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> SCO3039-L(Unknown)
<400> 9
gcgatcatcc gggcgtgaaa gctaggaagc agagacgaca ggtga 45
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> SCO3039-R(Unknown)
<400> 10
gccgagaacc taggatccaa gcttgcagcg gcggcggggg atca 44

Claims (10)

1.一种纳他霉素高产菌株的构建方法，其特征在于：所述方法是通过在纳他霉素生产菌中过表达负责GDP-甘露糖合成的酶即磷酸甘露糖异构酶的编码基因的方式实现。
2.根据权利要求1所述的纳他霉素高产菌株的构建方法，其特征在于：所述负责GDP-甘露糖合成的酶还包括磷酸甘露糖变位酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶，所述方法是通过在纳他霉素生产菌中同时过表达负责GDP-甘露糖合成的酶即磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶的编码基因的方式实现。
3.根据权利要求1所述的纳他霉素高产菌株的构建方法，其特征在于：所述负责GDP-甘露糖合成的酶为纳他霉素生产菌自身来源的酶，或者为非自身来源的酶。
4.根据权利要求1所述的纳他霉素高产菌株的构建方法，其特征在于：所述纳他霉素生产菌为褐黄孢链霉菌，所述负责GDP-甘露糖合成的酶为天蓝色链霉菌来源的酶。
5.根据权利要求1至4任一项所述的纳他霉素高产菌株的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)构建重组质粒pOEmanABC：构建包含磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶编码基因的重组质粒，即从天蓝色链霉菌中分别扩增获得磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶的编码基因manA、manB、manC；三个基因放置在一个组成型启动子-kasO*p控制组成一个转录单元，并克隆到整合型载体上，构建成重组质粒pOEmanABC；
(2)将重组质粒pOEmanABC转化入纳他霉素生产菌，构建成manA、manB、manC过表达菌株OEmanABC，工程菌OEmanABC即纳他霉素高产菌株，该菌株发酵生产纳他霉素的产量显著高于原始菌株。
6.利用如权利要求1至5任一项所述的方法构建的纳他霉素高产菌株。
7.根据权利要求6所述的纳他霉素高产菌株，其特征在于：所述纳他霉素高产菌株能够以葡萄糖作为发酵的碳源。
8.利用如权利要求6或7所述的菌株发酵生产纳他霉素的方法，其特征在于：包括如下步骤：
所述方法以葡萄糖作为发酵的碳源，且在采用发酵罐进行发酵过程中，通过流加的方式补充碳源，使得培养基中葡萄糖的浓度维持在1％以上。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：具体步骤如下：
将纳他霉素高产菌株的孢子悬液按2％-4％的接种量接种到装有50ml种子培养基的250ml的三角瓶中，28℃、200rpm培养两天，得种子培养液；然后将种子培养液按5％的接种量转接到发酵罐中，发酵罐中的发酵培养基的总体积占发酵罐总体积的60％，发酵罐温度控制在28℃，600rpm，通气量为2v/v/m，发酵罐溶氧控制在30％以上；当发酵罐中葡萄糖的质量浓度低于1％时，在72h和96h各补加质量浓度为10％的葡萄糖溶液；或者，在反应过程中根据生产情况添加消泡剂控制泡沫，发酵5天，即得；
其中，每1L种子培养基的配方为：葡萄糖:20.0g；蛋白胨:6.0g；酵母浸出物:6.0g；Nacl:10.0g，pH 7.0，去离子水溶解后定容至1.0L，即得；
每1L发酵培养基的配方为：葡萄糖:40.0g，大豆蛋白胨15.0g，酵母浸出物5.0g，牛肉浸粉5.0g，去离子水溶解后定容至1.0L，即得。
10.利用如权利要求6或7所述的菌株在发酵生产纳他霉素方面中的应用。
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