CN114668893A - 一种基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法。该方法包括如下步骤：表面图案化实验平台的制备；最佳反应参数的确定；神经修复材料的高通量制备。选用图案化表面既能促进神经修复，同时，能将表面区域分割成若干区域，阻断细胞跨区迁移，能有效提高高通量实验平台的准确性。本发明能够快速确定制备促神经修复多肽材料表面的最佳反应时间，控制接枝密度，得到梯度接枝密度的表面，进一步得到表面促神经修复多肽接枝量与细胞形貌的规律关系，在实现表面生物学性能最大化的条件下，确定最低的促神经修复多肽接枝密度，有效解决周围神经聚己内酯导管表面缺乏生物活性的问题，制备具有优异性能的促神经修复材料。

Description

一种基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的 方法
技术领域
本发明属于生物材料表面改性技术领域，具体涉及一种基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法。
背景技术
周围神经损伤在医学上是一种常见的疾病，使患者感觉受损，疼痛和冷不耐受，从而影响其运动功能。
自体神经移植是神经间隙修复的金标准，通常从自体取神经接到患处进行修复，也就是“拆东墙补西墙”，但其成功率并不理想。随着组织工程的发展，出现了人工神经导管，如聚己内酯，具有合适的机械强度等，通过了FDA认证，但缺乏生物活性。周围神经损伤修复背后，存在一系列复杂生物学特性，这不仅要求物理上能支持组织生长，还须引发所预期的细胞特异性反应。表面修饰可以赋予材料表面新的性质，如生物相容性和生物活性等。
接枝促神经修复多肽能改善表面生物学活性，促进细胞的分化或增殖。不同的促神经修复多肽具有不同的生物学性能，YIGSR多肽能促进神经细胞的分化，RGD多肽能促进细胞的黏附和增殖。表面接枝促神经修复多肽数量过少，生物学性能表现会很弱甚至没有；表面接枝促神经修复多肽数量过多，若再进一步增加接枝量往往不会继续增强生物学性能甚至会降低其生物学性能，同时，大大增加了生产的成成本，造成浪费。
因此，如何快速确定构建材料表面接枝生物活性多肽的最佳参数，从而指导人工神经导管材料表面的改性具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法，包括如下步骤：
S1、表面图案化实验平台的制备：
S11、取片状的聚己内酯基底材料，通过真空热压处理得到表面呈非平整的、图案化形貌的基底材料；
S12、将经步骤S1处理的基底材料浸入带有氨基和双键的分子溶液中，反应完成后取出，清洗，即得到所述的实验平台；
S2：最佳反应参数的确定：
S21、取步骤S1所得实验平台竖直置于容器中，匀速加入具有促神经修复作用的多肽溶液，并于时间T内恰好浸没基底材料；
S22、将经步骤S21处理的实验平台按竖直方向自上而下等分为n个区域，区域标号为1～n；
S23、在所述的实验平台表面培养神经细胞，观察细胞的形貌，筛选出最佳区域k；
S24、确定材料表面构建的最佳反应时间t，t按如下公式进行计算：t＝k/n*T；
S3：神经修复材料的高通量制备：
取步骤S1所得实验平台浸入与步骤S21相同的多肽溶液中，设置反应时间为t；反应完成后取出，清洗，即获得所述的神经修复材料。
进一步的，上述方法中所述的带有氨基和双键的分子的分子结构式为H2N-R1-C＝CH2，其中，R1表示CnH2n，n为2～20的整数，化学结构式如式1：
Figure BDA0003542492050000021
所述的多肽的分子结构式为HS-R2-Peptide，R2表示C(PA)nP，n为1～5的整数，P表示脯氨酸，A表示丙氨酸；Peptide包括但不限于YIGSR和RGD多肽，其化学结构式分别如
式2和3：
Figure BDA0003542492050000022
Figure BDA0003542492050000031
进一步的，步骤S11中所述的聚己内酯的分子量为Mw＝40000～120000。
进一步的，步骤S11中所述的真空热压的条件为：温度75～85℃、时间0.5～1.5h；优选为温度80℃、时间1h。
进一步的，步骤S11中所述的基底材料的表面可根据需要调整，优选呈条状隆起和凹状沟壑相间排列组合的结构；其中，所述的条状隆起的横断面为长宽均在0.1～100μm范围的矩形，任意两相邻的条状隆起之间的间隔为0.1～100μm；此时，步骤S21中取步骤S1所得实验平台竖直置于容器中的具体操作为：保持条状隆起延伸方向与水平面垂直或平行，将步骤S1所得实验平台，竖直置于容器中。
进一步的，步骤S12中所述的基底材料的可根据需要裁剪后再使用，包括但不限于矩形、圆形、梯形等；当形状为矩形时，长宽均在3～100mm范围内。
进一步的，步骤S12中所述的带有氨基和双键的分子溶液的浓度为0.001～10mol/L。
进一步的，步骤S12中所述的反应的时间为时间0.5～24h。
进一步的，步骤S21中所述的多肽溶液的浓度为1～100mol/L。
进一步的，步骤S21中所述的T的取值在1h～24h范围内；优选在12h～24h范围内。
进一步的，步骤S21中所述的n的取值在2～20范围内；优选为10。
进一步的，步骤S23中所述的培养的具体步骤如下：
1)配制1×104/mL细胞浓度的神经细胞悬液；
2)将表面图案化基底置于75％乙醇中消毒1小时，然后加入神经细胞悬液，于37℃、5％CO2条件下培养1～5天；
进一步的，步骤S23中所述的观察通过荧光显微镜实现。
进一步的，步骤S23中所述的神经修复材料在使用前先卷成导管结构，优选内径0.5～5mm，长度1～50mm。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
图案化的表面本身能促进神经修复，选用图案化表面既能促进神经修复，同时，能将表面区域分割成若干区域，阻断细胞跨区迁移，能有效提高高通量实验平台的准确性。
传统的研究主要注重促神经修复多肽在溶液中的生物学性能，缺乏接枝在表面的神经活性多肽数据以及比较，或仅通过正交实验来得到具有生物学性能的接枝密度，缺乏接枝量与生物学性能的规律研究。本发明能够快速确定制备促神经修复多肽材料表面的参数，包括促神经修复多肽溶液的最佳反应时间，调整接枝条件可控制接枝密度，得到梯度接枝密度的表面，本发明通过比较梯度表面上细胞的形貌，能得到表面促神经修复多肽(YIGSR、RGD)接枝量与细胞形貌的规律关系，在实现表面生物学性能最大化的条件下，确定最低的促神经修复多肽接枝密度，有效解决周围神经聚己内酯导管表面缺乏生物活性的问题，并制备具有优异性能的促神经修复材料。
附图说明
图1为实验平台表面细胞培养情况示意图；其中，A为梯度表面制备示意图，B为实验平台表面细胞培养情况示意图。
图2为实验平台表面结构示意图；其中，1条状隆起，2凹状沟壑。
图3为动物实验SFI测量与计算示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所用的聚己内酯片的重均分子量Mw＝40000～120000。
下述实施例中所用的神经细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12，购于中国科学院细胞库。
下述实施例中所用的动物坐骨神经修复实验具体步骤如下：
(1)选取约220-250g标准体重的大鼠6只，自体组、导管组各3只，以3％的戊巴比妥钠1mL腹腔注射麻醉，麻醉成功后，将大鼠固定在手术台，右股后外侧剃毛备皮，碘酒消毒。后正中凹陷处切口，切开皮肤，手术开口约为1cm，沿肌间隙小心分离暴露右侧坐骨神经；
(2)固定两端神经，中段切除，形成10mm神经缺损。移植12mm神经导管连接神经的远端和近端，两侧神经断端套入导管内约1mm，两端各留1mm缝合，接头用细度为6-0手术缝合线缝合；自体组用切除下来的坐骨神经180°反方向原位缝合，两端各重合缝起约1mm，略带张力；
(3)逐层缝合关闭切口，肌肉缝合用型号为5-0(直径范围0.100-0.149mm)手术缝合线，表皮缝合用型号为2-0(直径范围0.300-0.349mm)手术缝合线；
(4)所有大鼠均在标准实验室条件下饲养，12周后测量大鼠的足迹，计算SFI(坐骨神经的功能指数)，具体计算方法为SFI＝-38.3(PLExp–PLCtrl)/(PLCtrl)+109.5(TSExp–
TSCtrl)/(TSCtrl)+13.3(ITSExp–ITSCtrl)/(ITSCtrl)-8.8，见图3。
本发明中表面接枝量的计算方法：
(1)将1μL浓度为0.415-41.5μM的YIGSR-FITC或RGD-FITC的去离子水溶液直接加入到PCL表面(5mm×5mm)，计算出表面荧光分子的表面密度，0.1-10个/nm2；
(2)通过荧光显微镜测量制备的表面的荧光强度MFI，从而得到MFI与表面荧光分子密度的标准曲线，即MFI-Density标准函数，；
(3)参照标准函数，通过荧光显微镜测量表面的荧光强度，可以计算出表面接枝量，0.1-10个/nm2。
实施例1
(1)将聚己内酯片放入表面平整的PDMS模具中，固定，放入真空干燥箱中，抽真空，升温至80℃，保温1h；
(2)恢复常压，取出样品，空冷至室温，取下，得到聚己内酯基底；
(3)沿条带方向将聚己内酯基底裁剪成3*3mm；
(4)将步骤(3)基底材料，浸入带有氨基和双键的分子H2N-C2H4-C＝CH2溶液中，处理表面，溶液浓度0.001M，反应时间0.5h，清洗；
(5)竖直置于孔板中，其中表面条带沟壑结构方向与水平面垂直；
(6)加入浓度为1μM的促神经修复多肽的HS-CPAPAP-YIGSR溶液，并使其在1h范围内恰好浸没基底材料；
(7)将步骤(6)中所得到的样品进行清洗，得到一种高通量实验平台；
(8)在材料表面培养神经细胞，利用荧光染色的方法观察表面细胞的形貌，具体步骤如下：
首先，将神经细胞混于完全培养基中，配置1×104/mL细胞浓度的细胞悬液；
其次，利用75％乙醇将所构建的高通量平台消毒1小时，然后置于24孔板中，加入1mL细胞悬液，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养1、3和5天；
再次，将样品取出，利用PBS清洗3次，利用戊二醛固定液在常温下固定2h；
最后，利用PBS清洗3次，加入F-actin和DAPI染料，荧光显微镜观察。
(9)将样品按多肽浓度梯度变化的方向等分为2个区域，根据表面细胞的长宽比衡量细胞分化程度，统计和比较表面不同位置促进细胞分化的生物学性能，筛选出促细胞分化的最佳位置为位置2；
(10)根据步骤(9)得到的最佳位置，得到该位置的溶液浓度为1μM和反应时间为1h；
(11)将氨解表面浸入HS-CPAPAP-YIGSR溶液中，溶液浓度和时间和步骤(10)一致；
(12)将步骤(11)中所得样品进行清洗，得到神经修复片材；
(13)将步骤(12)中样品卷成导管，得到神经修复材料；
(14)将神经修复材料用于动物坐骨神经修复，12周后实验组SFI为-62.1，比聚己内酯导管组-70.7高，具有一定的促进修复作用，比自体移植-32.4低，比自体移植效果差。
实施例2
(1)将聚己内酯片放入表面条形结构尺寸0.1×0.1×0.1μmPDMS模具中，固定，放入真空干燥箱中，抽真空，升温至80℃，保温1h；
(2)恢复常压，取出样品，空冷至室温，取下，得到聚己内酯基底，其表面呈条状隆起和凹状沟壑相间排列组合的结构，条状隆起横断面长0.1μm、宽0.1μm，任意两相邻的条状隆起之间的间隔为0.1μm，并标记条带方向；
(3)沿条带方向将聚己内酯基底裁剪成10×10mm；
(4)将步骤(3)基底材料，浸入带有氨基和双键的分子溶液中，处理表面，溶液浓度0.001M，反应时间0.5h，清洗；
(5)竖直置于孔板中，其中表面条带沟壑结构方向与水平面垂直；
(6)加入浓度为1μM的促神经修复多肽的HS-CPAPAP-RGD溶液，使其在1h范围内恰好浸没基底材料；
(7)将步骤(6)中所得到的样品进行清洗，得到一种高通量实验平台；
(8)在材料表面培养神经细胞，利用荧光染色的方法观察表面细胞的形貌，具体步骤如下：
首先，将神经细胞混于完全培养基中，配置1×104/mL细胞浓度的细胞悬液；
其次，利用75％乙醇将所构建的高通量平台消毒1小时，然后置于24孔板中，加入1mL细胞悬液，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养1、3和5天；
再次，将样品取出，利用PBS清洗3次，利用戊二醛固定液在常温下固定2h；
最后，利用PBS清洗3次，加入F-actin和DAPI染料，荧光显微镜观察。
(9)将样品按多肽浓度梯度变化的方向等分为2个区域，根据表面细胞的长宽比衡量细胞分化程度，统计和比较表面不同位置促进细胞分化的生物学性能，筛选出促细胞分化的最佳位置为位置2；
(10)根据步骤(9)得到的最佳位置，得到该位置的HS-CPAPAP-RGD溶液浓度为1μM，反应时间为1h；
(11)将氨解表面浸入HS-R2-RGD溶液中，溶液浓度和时间和步骤(10)一致；
(12)将步骤(11)中所得样品进行清洗，得到神经修复片材；
(13)将步骤(12)中样品卷成导管，得到神经修复材料；
(14)将神经修复材料用于动物坐骨神经修复，12周后实验组SFI为-66.5，比聚己内酯导管组-70.7高，具有一定的促进修复作用，比自体移植-32.4低，比自体移植效果差。
实施例3
(1)将聚己内酯片放入表面条形结构尺寸0.1×100×100μm PDMS模具中，固定，放入真空干燥箱中，抽真空，升温至80℃，保温1h；
(2)恢复常压，取出样品，空冷至室温，取下，得到聚己内酯基底，其表面呈条状隆起和凹状沟壑相间排列组合的结构，条状隆起横断面长100μm、宽0.1μm，任意两相邻的条状隆起之间的间隔为100μm，并标记条带方向；
(3)沿条带方向将聚己内酯基底裁剪成10×10mm；
(4)将步骤(3)基底材料，浸入带有氨基和双键的分子溶液中，处理表面，溶液浓度0.001M，反应时间1h，清洗；
(5)竖直置于孔板中，其中表面条带沟壑结构方向与水平面垂直；
(6)加入浓度为10μM的HS-CPAP-YIGSR溶液，使其在12h范围内恰好浸没基底材料；
(7)将步骤(6)中所得到的样品进行清洗，得到一种高通量实验平台；
(8)在材料表面培养神经细胞，利用荧光染色的方法观察表面细胞的形貌，具体步骤如下：
首先，将神经细胞混于完全培养基中，配置1×104/mL细胞浓度的细胞悬液；
其次，利用75％乙醇将所构建的高通量平台消毒1小时，然后置于24孔板中，加入1mL细胞悬液，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养1、3和5天；
再次，将样品取出，利用PBS清洗3次，利用戊二醛固定液在常温下固定2h；
最后，利用PBS清洗3次，加入F-actin和DAPI染料，荧光显微镜观察。
(9)将样品按多肽浓度梯度变化的方向等分为10个区域，根据表面细胞的长宽比衡量细胞分化程度，统计和比较表面不同位置促进细胞分化的生物学性能，筛选出促细胞分化的最佳位置为位置8；
(10)根据步骤(9)得到的最佳位置，得到该位置的HS-CPAP-YIGSR溶液浓度为10μM，反应时间为9.6h；
(11)将氨解表面浸入HS-CPAP-YIGSR溶液中，溶液浓度和时间和步骤(10)一致；
(12)将步骤(11)中所得样品进行清洗，得到神经修复片材；
(13)将步骤(12)中样品卷成导管，得到神经修复材料；
(14)将神经修复材料用于动物坐骨神经修复，12周后实验组SFI为-35.9，比聚己内酯导管组-70.7高，具有一定的促进修复作用，与自体移植-32.4接近，与自体移植效果相当。
实施例4
(1)将聚己内酯片放入表面条形结构尺寸100×100×100μm PDMS模具中，固定，放入真空干燥箱中，抽真空，升温至80℃，保温1h；
(2)恢复常压，取出样品，空冷至室温，取下，得到聚己内酯基底，其表面呈条状隆起和凹状沟壑相间排列组合的结构，条状隆起横断面长100μm、宽100μm，任意两相邻的条状隆起之间的间隔为100μm，并标记条带方向；
(3)沿条带方向将聚己内酯基底裁剪成10×10mm；
(4)将步骤(3)基底材料，浸入带有氨基和双键的分子溶液中，处理表面，溶液浓度10M，反应时间1h，清洗；
(5)竖直置于孔板中，其中表面条带沟壑结构方向与水平面平行；
(6)加入浓度为10μM的HS-R2-YIGSR溶液，使其在12h范围内恰好浸没基底材料；
(7)将步骤(6)中所得到的样品进行清洗，得到一种高通量实验平台；
(8)在材料表面培养神经细胞，利用荧光染色的方法观察表面细胞的形貌，具体步骤如下：
首先，将神经细胞混于完全培养基中，配置1×104/mL细胞浓度的细胞悬液；
其次，利用75％乙醇将所构建的高通量平台消毒1小时，然后置于24孔板中，加入1mL细胞悬液，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养1、3和5天；
再次，将样品取出，利用PBS清洗3次，利用戊二醛固定液在常温下固定2h；
最后，利用PBS清洗3次，加入F-actin和DAPI染料，荧光显微镜观察。
(9)将样品按多肽浓度梯度变化的方向等分为10个区域，根据表面细胞的长宽比衡量细胞分化程度，统计和比较表面不同位置促进细胞分化的生物学性能，筛选出促细胞分化的最佳位置为位置6；
(10)根据步骤(9)得到的最佳位置，得到该位置的HS-CPAP-YIGSR溶液浓度为10μM，反应时间为7.2h；
(11)将氨解表面浸入HS-CPAP-YIGSR溶液中，溶液浓度和时间和步骤(10)一致；
(12)将步骤(11)中所得样品进行清洗，得到神经修复片材；
(13)将步骤(12)中样品卷成导管，得到神经修复材料；
(14)将神经修复材料用于动物坐骨神经修复，12周后实验组SFI为-33.8，比聚己内酯导管组-70.7高，具有一定的促进修复作用，与自体移植-32.4接近，与自体移植效果相当。
实施例5
(1)将聚己内酯片放入表面条形结构尺寸10×10×10μm PDMS模具中，固定，放入真空干燥箱中，抽真空，升温至80℃，保温1h；
(2)恢复常压，取出样品，空冷至室温，取下，得到聚己内酯基底，其表面呈条状隆起和凹状沟壑相间排列组合的结构，条状隆起横断面长10μm、宽10μm，任意两相邻的条状隆起之间的间隔为10μm，并标记条带方向；
(3)沿条带方向将聚己内酯基底裁剪成100×100mm；
(4)将步骤(3)基底材料，浸入带有氨基和双键的分子溶液中，处理表面，溶液浓度10M，反应时间24h，清洗；
(5)竖直置于孔板中，其中表面条带沟壑结构方向与水平面平行；
(6)加入浓度为10μM的HS-R2-RGD溶液，使其在24h范围内恰好浸没基底材料；
(7)将步骤(6)中所得到的样品进行清洗，得到一种高通量实验平台；
(8)在材料表面培养神经细胞，利用荧光染色的方法观察表面细胞的形貌，具体步骤如下：
首先，将神经细胞混于完全培养基中，配置1×104/mL细胞浓度的细胞悬液；
其次，利用75％乙醇将所构建的高通量平台消毒1小时，然后置于24孔板中，加入1mL细胞悬液，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养1、3和5天；
再次，将样品取出，利用PBS清洗3次，利用戊二醛固定液在常温下固定2h；
最后，利用PBS清洗3次，加入F-actin和DAPI染料，荧光显微镜观察。
(9)将样品按多肽浓度梯度变化的方向等分为100个区域，根据表面细胞的长宽比衡量细胞分化程度，统计和比较表面不同位置促进细胞分化的生物学性能，筛选出促细胞分化的最佳位置为位置50；
(10)根据步骤(9)得到的最佳位置，得到该位置的HS-CPAP-YIGSR溶液浓度为100μM，反应时间为12h；
(11)将氨解表面浸入HS-CPAP-RGD溶液中，溶液浓度和时间和步骤(10)一致；
(12)将步骤(11)中所得样品进行清洗，得到神经修复片材；
(13)将步骤(12)中样品卷成导管，得到神经修复材料；
(14)将神经修复材料用于动物坐骨神经修复，12周后实验组SFI为-39.7，比聚己内酯导管组-70.7高，具有一定的促进修复作用，与自体移植-32.4接近，与自体移植效果相当。
实施例6
(1)将聚己内酯片放入表面条形结构尺寸0.1×0.1×100μm PDMS模具中，固定，放入真空干燥箱中，抽真空，升温至80℃，保温1h；
(2)恢复常压，取出样品，空冷至室温，取下，得到聚己内酯基底，其表面呈条状隆起和凹状沟壑相间排列组合的结构，条状隆起横断面长0.1μm、宽0.1μm，任意两相邻的条状隆起之间的间隔为100μm，并标记条带方向；
(3)沿条带方向将聚己内酯基底裁剪成100×100mm；
(4)将步骤(3)基底材料，浸入带有氨基和双键的分子溶液中，处理表面，溶液浓度10M，反应时间24h，清洗；
(5)竖直置于孔板中，其中表面条带沟壑结构方向与水平面平行；
(6)加入浓度为10μM的HS-CPAP-RGD溶液，使其在24h范围内恰好浸没基底材料；
(7)将步骤(6)中所得到的样品进行清洗，得到一种高通量实验平台；
(8)在材料表面培养神经细胞，利用荧光染色的方法观察表面细胞的形貌，具体步骤如下：
首先，将神经细胞混于完全培养基中，配置1×104/mL细胞浓度的细胞悬液；
其次，利用75％乙醇将所构建的高通量平台消毒1小时，然后置于24孔板中，加入1mL细胞悬液，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养1、3和5天；
再次，将样品取出，利用PBS清洗3次，利用戊二醛固定液在常温下固定2h；
最后，利用PBS清洗3次，加入F-actin和DAPI染料，荧光显微镜观察。
(9)将样品按多肽浓度梯度变化的方向等分为100个区域，根据表面细胞的长宽比衡量细胞分化程度，统计和比较表面不同位置促进细胞分化的生物学性能，筛选出促细胞分化的最佳位置为位置20；
(10)根据步骤(9)得到的最佳位置，得到该位置的HS-R2-YIGSR溶液浓度为100μM，反应时间为4.8h；
(11)将氨解表面浸入HS-CPAP-RGD溶液中，溶液浓度和时间和步骤(10)一致；
(12)将步骤(11)中所得样品进行清洗，得到神经修复片材；
(13)将步骤(12)中样品卷成导管，得到神经修复材料；
(14)将神经修复材料用于动物坐骨神经修复，12周后实验组SFI为-33.5，比聚己内酯导管组-70.7高，具有一定的促进修复作用，与自体移植-32.4接近，与自体移植效果相当。
实施例7
(1)将聚己内酯片放入表面条形结构尺寸0.1×10×100μm PDMS模具中，固定，放入真空干燥箱中，抽真空，升温至80℃，保温1h；
(2)恢复常压，取出样品，空冷至室温，取下，得到聚己内酯基底，其表面呈条状隆起和凹状沟壑相间排列组合的结构，条状隆起横断面长0.1μm、宽10μm，任意两相邻的条状隆起之间的间隔为100μm，并标记条带方向；
(3)沿条带方向将聚己内酯基底裁剪成100×100mm；
(4)将步骤(3)基底材料，浸入带有氨基和双键的分子溶液中，处理表面，溶液浓度10M，反应时间24h，清洗；
(5)竖直置于孔板中，其中表面条带沟壑结构方向与水平面平行；
(6)加入浓度为10μM的HS-R2-YIGSR溶液，使其在24h范围内恰好浸没基底材料；
(7)将步骤(6)中所得到的样品进行清洗，得到一种高通量实验平台；
(8)在材料表面培养神经细胞，利用荧光染色的方法观察表面细胞的形貌，具体步骤如下：
首先，将神经细胞混于完全培养基中，配置1×104/mL细胞浓度的细胞悬液；
其次，利用75％乙醇将所构建的高通量平台消毒1小时，然后置于24孔板中，加入1mL细胞悬液，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养1、3和5天；
再次，将样品取出，利用PBS清洗3次，利用戊二醛固定液在常温下固定2h；
最后，利用PBS清洗3次，加入F-actin和DAPI染料，荧光显微镜观察。
(9)将样品按多肽浓度梯度变化的方向等分为100个区域，根据表面细胞的长宽比衡量细胞分化程度，统计和比较表面不同位置促进细胞分化的生物学性能，筛选出促细胞分化的最佳位置为位置25；
(10)根据步骤(9)得到的最佳位置，得到该位置的HS-CPAP-YIGSR溶液浓度为100μM，反应时间为6h；
(11)将氨解表面浸入HS-CPAP-YIGSR溶液中，溶液浓度和时间和步骤(10)一致；
(12)将步骤(11)中所得样品进行清洗，得到神经修复片材；
(13)将步骤(12)中样品卷成导管，得到神经修复材料；
将神经修复材料用于动物坐骨神经修复，12周后实验组SFI为-34.3，比聚己内酯导管组-70.7高，具有一定的促进修复作用，与自体移植-32.4接近，与自体移植效果相当。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、表面图案化实验平台的制备：
S11、取片状的聚己内酯基底材料，通过真空热压处理得到表面呈非平整的、图案化形貌的基底材料；
S12、将经步骤S1处理的基底材料浸入带有氨基和双键的分子溶液中，反应完成后取出，清洗，即得到所述的实验平台；
S2：最佳反应参数的确定：
S21、取步骤S1所得实验平台竖直置于容器中，匀速加入具有促神经修复作用的多肽溶液，并于时间T内恰好浸没基底材料；
S22、将经步骤S21处理的实验平台按竖直方向自上而下等分为n个区域，区域标号为1～n；
S23、在所述的实验平台表面培养神经细胞，观察细胞的形貌，筛选出最佳区域k；
S24、确定材料表面构建的最佳反应时间t，t按如下公式进行计算：t＝k/n*T；
S3：神经修复材料的高通量制备：
取步骤S1所得实验平台浸入与步骤S21相同的多肽溶液中，设置反应时间为t；反应完成后取出，清洗，即获得所述的神经修复材料。
2.根据权利要求1所述的基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法，其特征在于：
步骤S11中所述的基底材料的表面呈条状隆起和凹状沟壑相间排列组合的结构；其中，所述的条状隆起的横断面为长宽均在0.1～100μm范围的矩形，任意两相邻的条状隆起之间的间隔为0.1～100μm；
步骤S21中取步骤S1所得实验平台竖直置于容器中的具体操作为：保持条状隆起延伸方向与水平面垂直或平行，将步骤S1所得实验平台，竖直置于容器中。
3.根据权利要求1或2所述的基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法，其特征在于：
所述的带有氨基和双键的分子的分子结构式为H2N-R1-C＝CH2，其中，R1表示CnH2n，n为2～20的整数；化学结构式如式1：
Figure FDA0003542492040000021
4.根据权利要求1或2所述的基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法，其特征在于：
所述的多肽的分子结构式为HS-R2-Peptide，R2表示C(PA)nP，n为1～5的整数，P表示脯氨酸，A表示丙氨酸，Peptide包括但不限于YIGSR和RGD多肽，其化学结构式分别如式2和3：
Figure FDA0003542492040000022
5.根据权利要求1或2所述的基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法，其特征在于：
步骤S11中所述的聚己内酯的分子量为Mw＝40000～120000；
步骤S12中所述的带有氨基和双键的分子溶液的浓度为0.001～10mol/L；
步骤S21中所述的多肽溶液的浓度为1～100mol/L。
6.根据权利要求1或2所述的基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法，其特征在于：
步骤S11中所述的真空热压的条件为：温度75～85℃、时间0.5～1.5h；
步骤S12中所述的反应的时间为时间0.5～24h。
7.根据权利要求1或2所述的基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法，其特征在于：
步骤S21中所述的T的取值在1h～24h范围内；
步骤S21中所述的n的取值在2～20范围内。
8.根据权利要求7所述的基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法，其特征在于：
步骤S21中所述的T的取值在12h～24h范围内；
步骤S21中所述的n的取值为10。
9.根据权利要求1或2所述的基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法，其特征在于：
步骤S23中所述的培养的具体步骤如下：
1)配制1×104/mL细胞浓度的神经细胞悬液；
2)将表面图案化基底置于75％乙醇中消毒1小时，然后加入神经细胞悬液，于37℃、5％CO2条件下培养1～5天；
步骤S23中所述的观察通过荧光显微镜实现。
10.根据权利要求1或2所述的基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法，其特征在于：
步骤S12中所述的基底材料的形状为矩形、圆形或梯形；当形状为矩形时，长宽均在3～100mm范围内；
步骤S23中所述的神经修复材料在使用前先卷成导管结构，内径0.5～5mm，长度1～50mm。
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