CN114660199A - 一种莲子标准汤剂质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种莲子标准汤剂质量检测方法，包括通过对莲子标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及腺苷含量测定，将莲子标准汤剂含量标准限定为每1g含腺苷为0.13～0.30mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及腺苷含量测定均采用液相色谱法测定。本发明的莲子标准汤剂质量检测方法，通过多方面测量，来评定莲子标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立莲子汤剂可行的质量标准，实现莲子标准汤剂质量的有效控制。
Description
技术领域
本发明涉及中药材质量控制技术领域，具体涉及一种莲子标准汤剂质量检测方法。
背景技术
现代药物需要具有稳定均一、安全和有效的三大特性，中成药在这几个方面难以比拟西 药，因此，更需要采用多种手段进行检测，保证检测结果的可靠性和稳定性。莲子为为睡莲 科植物莲Nelunbo nucifera Gaertn.的干燥成熟种子，补脾止泻，益肾涩精，养心安神，用于脾 虚久泻，遗精带下，心悸失眠。目前，关于莲子的标准汤剂还未形成一个系统的质量检测方 法，仅采用现有的检测手段来检测莲子汤剂是不够全面的，无法达到中药配方颗粒质量控制 要求。因此，建立一种用于药材质量控制的莲子标准汤剂质量检测方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的就是要解决现有技术的不足，提供一种莲子标准汤剂质量检测方法，以更 好的控制莲子汤剂的质量，表征药物质量，提高药物稳定性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种莲子标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，
通过对莲子标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及腺苷含量 测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含腺苷为0.13～0.30mg，其中，干浸膏出膏率测定采 用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图 谱及腺苷含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以莲子对照药材制成的溶液 作为参照物溶液b，以腺苷对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以莲子标准汤剂样品制成的 溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取参照物溶液b、对照品溶液b和供试品溶液b，分别注 入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：Agilentporoshell 120EC-C18 (250mmx4.6mm，4um)；流动相：以醋酸铵含量为0.01mol/L的0.1％醋酸水溶液为流动相A， 以乙腈为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；
表a梯度洗脱程序
流速：1.0mL/min；柱温：20℃；进样量：10μL；检测波长：282nm。
在其中一实施例中，所述煎煮法包括：取莲子饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一 次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩 干燥，制得莲子标准汤剂干膏粉。
在其中一实施例中，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
(1)制备莲子标准汤剂供试品溶液：取莲子标准汤剂样品3g，加三氯甲烷30mL，放置 过夜，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，制得供试品溶液a1；
(2)制备莲子药材供试品溶液：取莲子药材粗粉2g，加三氯甲烷20ml，放置过夜，滤过，将滤液旋干，残渣加1ml乙酸乙酯完全溶解，制得供试品溶液a2；
(3)制备莲子对照药材溶液：取莲子对照药材2g，加三氯甲烷20mL，放置过夜，滤过， 滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，制得对照药材溶液a；
(4)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：HSGF254薄层层析硅胶板；点样量：莲子标准汤剂供试品溶液10ul，莲子药材供试品溶液2ul，莲子对照药材溶液2ul；展开剂：体积比为7：3的环己烷-丙酮溶液；展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，在105℃加热，紫外光灯365nm下检视。
在其中一实施例中，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法 测定浸出物范围。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液b：取莲子对照药材5g，精密称定，加入50％甲醇20mL，超声60min， 放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为参照物溶液b；
(2)制备对照品溶液b：取腺苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶解，制得浓度为 0.1mg/mL的对照品溶液b；
(3)制备供试品溶液b：取莲子标准汤剂样品1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入 精密称定的50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理60min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液b。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定腺苷含量包括：进行液相色谱仪分析，以莲子 对照药材制成的溶液作为参照物溶液c，以腺苷对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以莲子 标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取参照物溶液c、对照品溶液c和供 试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：Agilent poroshell 120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)；流动相：以醋酸铵含量为0.01mol/L的0.1％醋 酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温： 20℃；进样量：10μL；检测波长：260nm。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定腺苷含量还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液：取莲子对照药材5g，精密称定，加入50％甲醇20mL，超声60min， 放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为参照物溶液c；
(2)制备对照品溶液：取腺苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成含腺苷的浓度为 0.1mg/ml的溶液，作为对照品溶液c；
(3)制备供试品溶液：取莲子标准汤剂样品约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密 加入50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理60min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，取 续滤液作为供试品溶液c。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)通过对莲子标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及腺苷 含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定莲子标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定 坚实的基础，能够建立莲子汤剂可行的质量标准，实现莲子标准汤剂质量的有效控制，并且， 采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。
(2)莲子饮片煎煮制得莲子饮片标准汤剂，腺苷平均含量为0.217mg/g，测得含量范围 为0.191～0.285mg/g，SD(标准差)为0.029，按均值±3SD来算，腺苷含量允许范围为0.13～ 0.30mg/g，故拟定本标准汤剂的腺苷含量范围为：0.13mg/g～0.30mg/g；腺苷平均转移率为 68.19％，转移率范围为50.40％～88.60％，SD为11.76，依据《中药配方颗粒质量控制与标准 制定技术要求》，腺苷含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为47.7％～ 88.6％，按照±3SD来算，为32.9％～103.5％，故拟定本标准汤剂的腺苷含量转移率范围为： 48％～89％，结果表明，本发明多个批次标准汤剂中腺苷含量及其转移率均在允许范围之内， 因此本发明可为莲子配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图 作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一实施例中15批次莲子标准汤剂薄层图谱；其中，S组为莲子对照药材薄 层图谱，1～15组为15批次莲子标准汤剂薄层图谱。
图2为本发明一实施例中15批次莲子药材薄层图谱；其中，S组为莲子对照药材薄层图 谱，1～15组为15批次莲子药材薄层图谱。
图3为莲子标准汤剂照薄层色谱法的检测波长考察中不同检测波长对比图；其中，S1的 检测波长为254nm，S2的检测波长为283nm，S3的检测波长为260nm。
图4为莲子饮片标准汤剂照薄层色谱法的流动相考察中不同流动相对比图；其中，S1的 流动相为乙腈-0.1％醋酸(含0.01mol/l醋酸铵)溶液，S2的流动相为乙腈-0.1％磷酸水，S3 的流动相为乙腈-水。
图5为莲子标准汤剂照薄层色谱法的色谱柱考察中不同色谱柱对比图；其中，S1为色谱 柱Agilent 5TC-C18，S2为色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18，S3为色谱柱Agilentporoshell 120 EC-C18。
图6为莲子标准汤剂照薄层色谱法的柱温考察中不同柱温对比图；其中，S1的柱温为 30℃，S2的柱温为25℃，S3的柱温为20℃。
图7为莲子标准汤剂照薄层色谱法的流速考察中不同流速对比图；其中，S1的流速为 1.0mL/min，S2的流速为0.8mL/min，S3的流速为1.2mL/min。
图8为莲子标准汤剂照薄层色谱法的洗脱梯度考察中梯度1的特征图。
图9为莲子标准汤剂照薄层色谱法的洗脱梯度考察中梯度2的特征图。
图10为莲子标准汤剂照薄层色谱法的洗脱梯度考察中梯度3的特征图。
图11为本发明提取时间考察中不同提取时间对比图；其中，S1为超声提取90min供试 品溶液特征图谱；S2为超声提取30min供试品溶液特征图谱；S3为超声提取60min供试品溶液特征图谱。
图12为本发明提取溶剂考察中不同提取溶剂对比图；其中，S1为100％甲醇提取制备的 供试品溶液特征图谱；S2为50％甲醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S3为水提取制备的 供试品溶液特征图谱。
图13为本发明样品取用量考察中不同样品量对比图；其中，S1为样品取用量2.0g的供 试品溶液特征图谱；S2为样品取用量1.0g的供试品溶液特征图谱；S3为样品取用量0.5g的 供试品溶液特征图谱。
图14为本发明专属性考察中空白溶剂(80％甲醇)特征图谱。
图15为本发明专属性考察中腺苷对照品溶液特征图谱。
图16为本发明专属性考察中莲子标准汤剂溶液特征图谱。
图17为本发明专属性考察中莲子对照药材溶液特征图谱。
图18为本发明重复性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为重复性1下的供试品溶液 共有峰叠加特征图谱；S2为重复性2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为重复性3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为重复性4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为重复性5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为重复性6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图19为本发明精密度试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为精密度1下的供试品溶液 共有峰叠加特征图谱；S2为精密度2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为精密度3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为精密度4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为精密度5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为精密度6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图20为本发明稳定性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为于0h测定的供试品溶液共 有峰叠加特征图谱；S2为于2h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为于4h测定的供 试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为于8h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为于 12h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为于24h测定的供试品溶液共有峰叠加特征 图谱。
图21为本发明标准汤剂特征图谱测定中腺苷对照品图谱。
图22为本发明标准汤剂特征图谱测定中莲子对照药材图谱。
图23为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批莲子中药饮片叠加图谱。
图24为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批莲子中药材共有峰图谱。
图25为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批莲子标准汤剂叠加图谱。
图26为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批莲子标准汤剂拟合图。
图27为本发明线性范围试验中腺苷对照品不同浓度线性曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图， 对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种莲子标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，通过对莲子标准汤剂 的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及腺苷含量测定，将标准汤剂含量标 准限定为每1g含腺苷为0.13～0.30mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层 鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及腺苷含量测定均采用 液相色谱法测定。
本实施例中：
制备莲子标准汤剂：参照《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药管理局[2009]3 号)中的煎煮法，取15批次莲子饮片加水至没过药材约4-5cm，浸泡30-40min，煎煮两次， 第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，进行固液分离，合并滤液，浓缩 干燥，制得15批次莲子标准汤剂干膏粉。
1.干浸膏出膏率测试
取15批次莲子饮片，按以上制法制得15批次标准汤剂干膏粉，以干膏粉计算干浸膏得率 (见表1)，并计算平均得率为20.80％，按照标准汤剂出膏率允许范围(均值70％～130％) 计算，出膏率允许范围为14.56％-27.04％，故拟定莲子饮片标准汤剂出膏率允许范围为14.6％～ 27.0％。
表1：出膏率
上述结果表明，15批次标准汤剂出膏率为17.3％～26.7％，均符合拟定限度范围14.6％～ 27.0％。
2.性状考察
根据15批次莲子标准汤剂的实物性状特征，描述为粉红色至棕红色的粉末，气微，味甘、 微涩。
3.薄层鉴别
本产品为单味饮片莲子的干燥提取物，参考《中国药典》药名“薄层鉴别”项下的方法， 用莲子药材作对照，建立了本品薄层鉴别方法，经15批次样品试验，供试品斑点清晰，阴性 对照样品无干扰，故拟定为本品[鉴别]项。实验情况和结果如下：
3.1标准汤剂薄层鉴别
试验方法：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验
莲子标准汤剂供试品溶液制备：取莲子标准汤剂约3g，加三氯甲烷30ml，振摇，放置过 夜，滤过后将滤液旋干，用1ml乙酸乙酯完全溶解，作为供试品溶液。
莲子药材供试品溶液制备：取莲子药材粗粉约2g，加三氯甲烷20ml，放置过夜，滤过后 将滤液旋干，用1ml乙酸乙酯完全溶解，作为供试品溶液。
莲子对照药材溶液：取莲子对照药材2g，加三氯甲烷20ml，放置过夜，滤过后将滤液旋 干，用1ml乙酸乙酯完全溶解，作为对照品溶液。
薄层色谱条件：薄层板：硅胶HSGF254薄层板；点样量：莲子标准汤剂供试品溶液10ul， 莲子药材供试品溶液2ul，莲子对照药材溶液2ul，点样宽度：8mm，点样间隔：3mm；展开剂：体积比为7:3的环己烷-丙酮溶液；显色：喷以10％硫酸乙醇，检视：取出，晾干，喷 显色剂，置365nm波长下检视。
结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，15批 次标准汤剂TLC图谱详见图1，15批次饮片TLC图谱详见图2。
3.2拟定薄层鉴别方法：取本品粉末3g，加三氯甲烷30ml，放置过夜，滤过，滤液蒸干， 残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取莲子标准对照药材粗粉2g，加三氯甲烷 20ml，同法作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》附录ⅥB)试验，吸取上述对照品 溶液2μl、供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶HSGF254薄层板上，以环己烷-丙酮(7:3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，在105℃加热，紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
4.浸出物测定
取15批次标准汤剂，以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201) 项下的热浸法测定，结果详见表2。
表2：浸出物测定结果
上述结果表明，15批次标准汤剂浸出物均值为18.51％，参考标准限度允许范围(均值 70％～130％)的下限，拟定本品醇溶性浸出物不得少于13％，15批次标准汤剂测定结果均符 合拟定限度要求。
5.特征图谱测试
5.1仪器、试剂与试药
(1)仪器：Agilent高效液相色谱仪(1260Infinity，安捷伦科技(中国)有限公司)；色谱柱：Agilent poroshell 120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)；超声波清洗器(JP-040S，深圳洁盟清洗设备有限公司)；万分之一天平(NewClassic MF，梅特勒-托利多集团)；百万 分之一天平(METTLERAE100，梅特勒-托利多集团)。
(2)试剂：甲醇(国药集团化学试剂有限公司)为色谱纯；乙腈(德国默克化学试剂有 限公司)为色谱纯，水(华润怡宝有限公司)，乙酸铵(天津市光复科技发展有限公司)分析纯；乙酸(国药集团化学试剂有限公司分析纯。
(3)试药：腺苷(批号：ST09400120，含量：98％，上海诗丹德标准技术有限公司)、莲子对照药材(批号：P2046273，中检所)。
5.2试验方法
5.2.1色谱条件的确定
(1)最佳吸收波长的确定
对检测波长210nm、260nm、280nm进行研究，确定最佳吸收波长。
取莲子标准汤剂(批号：Y210601T)适量，约1.0g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：Agilent poroshell 120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)；流动相：以0.1％ 醋酸(含0.01mol/l醋酸铵)水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表3中的规定进行梯度 洗脱；流速：每分钟1.0ml；柱温：20℃；检测波长：210nm、260nm、282nm，进样量：10μL。
表3：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 98→95 | 2→5 |
| 5～20 | 95→94 | 5→6 |
| 20～35 | 94→92 | 6→8 |
| 35～55 | 92→85 | 8→15 |
| 55～65 | 85→80 | 15→20 |
| 65～70 | 80 | 20 |
结果显示，通过对比3种检测波长色谱图，选取282nm作为检测波长时，如图3所示，各 特征峰响应值较大，基线平稳，干扰较小，故选取282nm作为检测波长。
(2)流动相的考察
本次实验选取乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％醋酸(0.01mol/l醋酸铵溶液)三种 流动相进行比较，确定合适的流动相。
取莲子标准汤剂(批号：Y210601T)适量，约1.0g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：Agilent poroshell 120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)；流动相：以0.1％ 醋酸-0.01mol/l醋酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表4的规定进行梯度洗脱；1.0ml/min；柱温：20℃；检测波长：282nm，进样量：10μL。
表4：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 98→95 | 2→5 |
| 5～20 | 95→94 | 5→6 |
| 20～35 | 94→92 | 6→8 |
| 35～55 | 92→85 | 8→15 |
| 55～65 | 85→80 | 15→20 |
| 65～70 | 80 | 20 |
结果显示，通过对比3种不同流动相的色谱图，如图4所示，选取0.1％醋酸(含0.01mol/l 醋酸铵)溶液作为流动相水相时峰的信息完整，分离效果优于水相为水溶液和0.1％磷酸溶液， 故选取0.1％醋酸(含0.01mol/l醋酸铵)作为水相。
(3)不同色谱柱的考察
在方法优化的过程中发现，不同型号的色谱柱对莲子标准汤剂特征图谱的分离度影响较 大，因此选择了安捷伦不同型号色谱柱Agilent poroshell 120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)、 Agilent Eclipse XDB-C18(250mmx4.6mm，5um)、Agilent 5TC-C18(250mmx4.6mm，5um)进 行考察。
取莲子标准汤剂(批号：Y210601T)适量，约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加 入50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：三种不同型号色谱柱Agilent poroshell 120EC-C18(250mmx4.6mm， 4um)、Agilent Eclipse XDB-C18(250mmx4.6mm，5um)、Agilent 5TC-C18(250mmx4.6mm， 5um)；流动相：以0.1％醋酸-0.01mol/l醋酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表5中的 规定进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：20℃；检测波长：282nm，进样量：10μL。
表5：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 98→95 | 2→5 |
| 5～35 | 95→92 | 5→8 |
| 35～50 | 92→85 | 8→15 |
| 50～65 | 85→80 | 15→20 |
如图5所示，不同型号的色谱柱对峰形影响较大，其中色谱柱Agilentporoshell120EC-C18 (250mmx4.6mm，4um)所得谱图峰形较好，因此选择色谱柱Agilent poroshell120EC-C18 (250mmx4.6mm，4um)作为分析柱。
(4)柱温的考察
本次实验选取20℃、25℃、30℃3种柱温进行比较，选择合适柱温。
取莲子标准汤剂(批号：Y210601T)适量，约1.0g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：Agilent poroshell 120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)；流动相：以0.1％ 醋酸-0.01mol/l醋酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表6中的规定进行梯度洗脱；流 速：每分钟1.0ml；柱温：20℃、25℃、30℃；检测波长：282nm，进样量：10μL。
表6：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 98→95 | 2→5 |
| 5～20 | 95→94 | 5→6 |
| 20～35 | 94→92 | 6→8 |
| 35～55 | 92→85 | 8→15 |
| 55～65 | 85→80 | 15→20 |
| 65～70 | 80 | 20 |
结果显示，通过对比3种不同柱温的色谱图，如图6所示，3种流动相的色谱峰信息及峰形 差异不大，选取20℃作为柱温时，峰分离度较好，故选取20℃作为柱温。
(5)流速的考察
本次实验选取0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min3种流速进行比较，选择合适流速。
取莲子标准汤剂(批号：Y210601T)适量，约1.0g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：Agilent poroshell 120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)；流动相：以0.1％ 醋酸-0.01mol/l醋酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表7的规定进行梯度洗脱；流速： 0.8、1.0、1.2ml/min；柱温：20℃；检测波长：282nm，进样量：10μL。
表7：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 98→95 | 2→5 |
| 5～20 | 95→94 | 5→6 |
| 20～35 | 94→92 | 6→8 |
| 35～55 | 92→85 | 8→15 |
| 55～65 | 85→80 | 15→20 |
| 65～70 | 80 | 20 |
结果显示，通过对比3种不同流速的色谱图，如图7所示，3种流动相的色谱峰信息及峰形 差异不大，选取1.0ml/min作为流速时，峰分离度较好，故选取1.0ml/min作为流速。
(6)梯度优化
对莲子标准汤剂特征图谱的洗脱梯度进行优化，确定最优梯度。
对莲子标准汤剂特征图谱的洗脱梯度进行优化，确定最优梯度。
取莲子标准汤剂(批号：Y210601T)适量，约1.0g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：Agilent poroshell 120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)；流动相：以0.1％ 醋酸(含0.01mol/l醋酸铵)水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，分别按表8、表9、表10的 规定进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：20℃；检测波长：282nm，进样量：10μL。
表8：梯度1
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～30 | 98→92 | 2→8 |
| 30～35 | 92→90 | 8→10 |
| 35～45 | 90→85 | 10→15 |
| 45～60 | 85→80 | 15→20 |
表9：梯度2
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 98→95 | 2→5 |
| 5～35 | 95→92 | 5→8 |
| 35～50 | 92→85 | 8→15 |
| 50～65 | 85→80 | 15→20 |
表10：梯度3
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 98→95 | 2→5 |
| 5～20 | 95→94 | 5→6 |
| 20～35 | 94→92 | 6→8 |
| 35～55 | 92→85 | 8→15 |
| 55～65 | 85→80 | 15→20 |
| 65～70 | 80 | 20 |
结合参阅图8、图9、图10，通过对莲子标准汤剂特征图谱的洗脱梯度进行优化，最终确 定分离度较好的梯度3作为莲子标准汤剂特征图谱的洗脱梯度。
5.2.2色谱条件
色谱条件：色谱柱：Agilent poroshell 120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)；流动相：以0.1％ 醋酸(含0.01mol/l醋酸铵)水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表11的规定进行梯度洗 脱；流速：1.0ml/min；柱温：20℃；检测波长：282nm，进样量：10μL。
表11：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 98→95 | 2→5 |
| 5～20 | 95→94 | 5→6 |
| 20～35 | 94→92 | 6→8 |
| 35～55 | 92→85 | 8→15 |
| 55～65 | 85→80 | 15→20 |
| 65～70 | 80 | 20 |
5.2.3制备对照品溶液：取5g莲子对照药材，精密称定，加入50％甲醇20mL，超声60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
另取腺苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含腺苷0.1mg的溶液，摇匀， 即得。
5.2.4制备供试品溶液：取本品莲子标准汤剂样品粉末1.0g,精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即 得。
5.2.5测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定， 即得。
5.3方法学考察
5.3.1提取时间的考察：分别以不同时间超声制备供试品溶液，按上述5.2试验方法进行测 定。结果表明，主峰个数一致，样品提取完全，提取时间为60min时“总峰面积/取样量”最 大，如图11和表12所示，故确定供试品提取时间为60min。
表12：
| 提取时间 | 取样量 | 总峰面积 | 总峰面积/取样量 |
| 30min | 1.0003 | 2754.27 | 2753.444 |
| 60min | 1.0001 | 2787.14 | 2786.861 |
| 90min | 1.0005 | 2779.39 | 2778.001 |
5.3.2提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按5.2试验方法进行测定。 结果表明，如图12和表13所示，提提取溶剂为50％甲醇时“总峰面积/取样量”最大，分离度 较高，故确定以50％甲醇为提取溶剂。
表13：不同提取溶剂考察结果
| 提取溶剂 | 取样量 | 总峰面积 | 总峰面积/取样量 |
| 水 | 1.0005 | 2353.022 | 2351.846 |
| 50％甲醇 | 1.0008 | 2787.144 | 2784.912 |
| 100％甲醇 | 1.0003 | 593.672 | 593.372 |
5.3.3样品取用量考察：分别取不同样品称样量(0.5g、1.0g、2.0g)超声处理制备供试品 溶液，按5.2试验方法进行测定。结果表明，不同取样量，如图13所示，主峰个数一致，提取 样品称样量为1.0g时，“总峰面积/取样量”最大(详见表14)，故确定提取样品称样量为1.0g。
表14：不同样品取用量考察结果
| 取样量 | 取样量 | 总峰面积 | 总峰面积/取样量 |
| 0.3 | 0.3022 | 47.552 | 157.3527 |
| 0.5 | 0.5016 | 81.837 | 163.1519 |
| 0.7 | 0.7018 | 112.784 | 160.7068 |
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取本品粉末，约1.0g,精密称定， 置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声60min，放冷，再称定重 量，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.4特征图谱分析方法验证
5.4.1专属性考察：取供试品用溶剂50％甲醇10ul，按以上5.2项下色谱条件进行测定。试 验表明，如图14、15、16、17所示，空白溶剂无干扰。
5.4.2重复性试验：取同批样品(批号：Y210601T)，共6份，按5.2色谱条件进行测定， 采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2004A版)”，对指定的9个共有特征峰(其中3号峰为腺苷)进行相似度评价，相对保留时间及保留时间的RSD均在合格范围内(详见表15、16及图18)，表明该方法重现性良好。
表15：重复性试验特征图谱相对保留时间
表16：重复性试验特征图谱相对峰面积
5.4.3精密度试验：取一批样品(批号：Y210601T)，按5.2色谱条件进行测定，连续进 样6针测定，峰形、峰数基本一致，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的9个共有特征峰进行相似度评价，相对保留时间及保留时间的RSD均在合格范围内(详见表17、18以及图19)，表明该方法精密度良好。
表17：精密度试验特征图谱相对保留时间
表18：精密度试验特征图谱相对峰面积
5.4.4稳定性试验：取一批样品(批号：Y210610T)，按5.2色谱条件进行测定，分别于 0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，峰形、峰数基本稳定，并采用“中药色谱指纹图相似 度评价系统(2004A版)”，对指定的9个共有特征峰进行相似度评价，相对保留时间及保 留时间的RSD均在合格范围内(详见表19、20及图20)，表明供试品溶液在24小时内较 稳定。
表19：稳定性试验特征图谱相对保留时间
表20：稳定性试验特征图谱相对峰面积
小结：该特征图谱方法经专属性，精密度，重复性和稳定性验证，均符合规定，经中间 精密度和耐用性考察，相对保留时间较稳定。
5.5标准汤剂特征图谱表征分析
5.5.1标准汤剂特征图谱测定
照上述拟定的特征图谱分析方法，测定15批莲子标准汤剂及其制备使用的15批次中药饮 片特征图谱，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有9个共有峰，并应 与对照药材参照物色谱中的9个特征峰保留时间相对应，其中腺苷对应的峰为峰3，共有峰特 征图谱详见图21至26。
5.5.2特征色谱图相似度评价
采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对选定的9个共有特征峰进行相似 度的评价，结果显示，15批莲子饮片标准汤剂特征色谱图相似度均在0.9以上，表明本标准汤 剂质量相对稳定。以腺苷参照物峰相对应的峰(3)为S峰，计算共有峰与S峰的相对保留时间， 其相对保留时间及范围详见表21。
表21：15批标准汤剂共有峰相对保留时间(注：S1、S2～S15分别对应批号：Y210601T、 Y210701T～Y210714T)
综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》 2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性、 稳定性验证，且符合要求。采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2004A版)”对15批标准汤 剂样品的特征图谱进行相似度评价，标定了9个共有特征峰，其中峰3为对照品名。以对照品 名参照物相对应的峰为S峰，计算另8个特征峰相对保留时间，以15批次样品峰相对保留时间 均值拟定为规定值分别为：0.78(峰1)、0.93(峰2)、1.11(峰4)、1.18(峰5)、1.75(峰6)、2.03(峰7)、4.33(峰8)、4.51(峰9)，考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差， 其相对保留时间允许范围拟定为±10％。
6.含量测定
6.1试验方法
莲子配方颗粒选择腺苷作为含量测定成分。
色谱条件：色谱柱：Agilent poroshell 120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)；流动相：以0.1％ 醋酸(含0.01mol/l醋酸铵)水溶液水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表22中的规定进 行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：20℃；检测波长：260nm，进样量：10ul。
表22：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 98→95 | 2→5 |
| 5～20 | 95→94 | 5→6 |
制备参照物溶液：5g莲子对照药材，精密称定，加入50％甲醇20mL，超声60分钟，放冷， 摇匀，滤过，取续滤液，即得。
制备对照品溶液：取腺苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含腺苷0.1mg的 溶液，摇匀，即得。
制备供试品溶液：取莲子标准汤剂粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％ 甲醇20mL，密塞，称定重量，超声60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪， 测定，即得。
6.2方法学考察
6.2.1提取时间的考察：分别以不同的提取时间制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行 测定。结果表明，提取时间为60分钟时，样品含量相对较高(详见表23)，RSD为0.80％，故 选择样品时间为60分钟。
表23：不同提取时间对比
6.2.2提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测 定。结果表明，提取溶剂为50％甲醇时，腺苷含量最高(详见表24)，RSD为61.63％，故确 定以50％甲醇为提取溶剂。
表24：不同提取溶剂对比
6.2.3样品量考察：分别以不同取样量(0.5g、1.0g、2.0g)制备供试品溶液，按上述6.1 试验方法进行测定。结果表明，取样量为1.0g的样品含量相对较高(详见表25)，故确定取 样量为1.0g。
表25：不同取样量对比
6.2.4供试品溶液制备方法的确定
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取本品粉末，约1.0g，精密称定， 置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声提取60min，放冷，再称 定重量，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.3含量测定方法学验证
6.3.1重复性试验：取同批次标准汤剂样品约1.0g，共6份，按上述6.1试验方法进行测 定，测得样品中腺苷含量RSD值为0.70％，试验表明该方法重现性良好(详见表26)。
表26：
6.3.2精密度试验：取6.1所述的供试品溶液，连续进样6针，照上述6.1试验方法测定其峰 面积，计算样品中腺苷峰面积的RSD值为0.61％，表明仪器精密度良好(详见表27)。
表27：
6.3.3稳定性试验：取一批标准汤剂样品约1.0g，按上述6.1试验方法，分别于0h、2h、 4h、8h、12h、24h进样，测定其峰面积，计算其峰面积的RSD值为0.72％，试验表明供试品溶液在24小时内较稳定(详见表28)。
表28：
6.3.4线性范围试验：取腺苷标准品适量，配制成1.0mg/ml的对照品储备液溶液；将储备 液稀释成一系列浓度的对照品溶液。按上述色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标，供试液 浓度为横坐标(单位：mg/ml)，绘制标准曲线，并进行线性回归，其回归方程为：y＝32217x +84.83，R2＝0.9994，结果详见图27。
6.3.5加样回收率试验：精密称取莲子标准汤剂样品(批号：Y21060T，腺苷含量为0.28mg/g) 约1.0g，共6份，加入腺苷对照品0.300mg，按6.1项下方法制备供试品溶液，并按6.1项下色谱 条件进行测定，计算腺苷平均加样回收率为96.57％，RSD为1.65％。(详见表29)。
表29：腺苷加样回收率试验结果
小结：综上，整个分析方法经专属性、精密度、重复性、稳定性、线性考察、加样回收， 结果均符合要求，说明建立的方法能很好的用于腺苷的含量测定。
6.4标准汤剂及中药材含量测定
莲子药材经净制后加工成莲子饮片，其腺苷含量不会发生变化。
6.4.1按照上述拟定的含量分析方法，测定15批莲子标准汤剂及其制备使用的15批次莲子 饮片及药材的腺苷含量，结果详见表30、31。
表30：15批莲子药材及饮片的腺苷测定结果
表31：15批莲子标准汤剂腺苷测定结果
6.4.2腺苷含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对15批标准汤剂及其 制备使用的中药饮片测定结果，计算腺苷含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内 控标准及其表征参数允许范围提供依据。莲子饮片标准汤剂由莲子饮片加水煎煮2次，滤液浓 缩、冷冻干燥制得。其腺苷含量转移率见表32。
表32：15批莲子饮片标准汤剂腺苷含量转移率
由以上数据可知，莲子饮片依方案煎煮制得莲子饮片标准汤剂，本品腺苷平均转移率为 68.19％，测得转移率范围为50.40％-88.60％，SD为11.76。依据《中药配方颗粒质量控制与标 准制定技术要求》，腺苷含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为 47.7％-88.6％；按照±3SD来算，为32.9～103.5％。故拟定本标准汤剂的腺苷含量转移率范围 为：48％-89％。结果表明，15批次标准汤剂中腺苷转移率均在70％～130％允许范围之内。
本品腺苷平均含量为0.217mg/g，测得含量范围为0.191～0.285mg/g，SD为0.029；按均值 ±3SD计算，腺苷含量允许范围为0.13mg/g～0.30mg/g。故拟定本标准汤剂的腺苷含量范围为： 0.13mg/g～0.30mg/g。结果表明，15批次标准汤剂中腺苷及其转移率均在允许范围之内，可为 莲子配方颗粒质量研究提供参考依据。
本发明提供的莲子标准汤剂质量检测方法，通过对莲子标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、 薄层鉴别、浸出物、特征图谱及腺苷含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定莲子标准 汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立莲子汤剂可行的质量标准，实现 莲子标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离 度更好更清晰的色谱图。莲子饮片煎煮制得莲子饮片标准汤剂，腺苷平均含量为0.217mg/g， 测得含量范围为0.191～0.285mg/g，SD(标准差)为0.029，按均值±3SD来算，腺苷含量允 许范围为0.13～0.30mg/g，故拟定本标准汤剂的腺苷含量范围为：0.13mg/g～0.30mg/g；腺苷 平均转移率为68.19％，转移率范围为50.40％～88.60％，SD为11.76，依据《中药配方颗粒质 量控制与标准制定技术要求》，腺苷含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算， 为47.7％～88.6％，按照±3SD来算，为32.9％～103.5％，故拟定本标准汤剂的腺苷含量转移率 范围为：48％～89％，结果表明，本发明多个批次标准汤剂中腺苷含量及其转移率均在允许 范围之内，因此本发明可为莲子配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
所述领域技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发 明的范围被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之 间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多 其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和 变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种莲子标准汤剂质量检测方法，其特征在于，包括如下检测方法，
通过对莲子标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及腺苷含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含腺苷为0.13～0.30mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及腺苷含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以莲子对照药材制成的溶液作为参照物溶液b，以腺苷对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以莲子标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取参照物溶液b、对照品溶液b和供试品溶液b，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：Agilent poroshell120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)；流动相：以醋酸铵含量为0.01mol/L的0.1％醋酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；
表a梯度洗脱程序
流速：1.0mL/min；柱温：20℃；进样量：10μL；检测波长：282nm。
2.如权利要求1所述的莲子标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述煎煮法包括：取莲子饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，进行固液分离，浓缩干燥，制得莲子标准汤剂干膏粉。
3.如权利要求1所述的莲子标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
(1)制备莲子标准汤剂供试品溶液：取莲子标准汤剂样品3g，加三氯甲烷30mL，放置过夜，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，制得供试品溶液a1；
(2)制备莲子药材供试品溶液：取莲子药材粗粉2g，加三氯甲烷20ml，放置过夜，滤过，将滤液旋干，残渣加1ml乙酸乙酯完全溶解，制得供试品溶液a2；
(3)制备莲子对照药材溶液：取莲子对照药材2g，加三氯甲烷20mL，放置过夜，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，制得对照药材溶液a；
(4)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：HSGF254薄层层析硅胶板；点样量：莲子标准汤剂供试品溶液10ul，莲子药材供试品溶液2ul，莲子对照药材溶液2ul；展开剂：体积比为7：3的环己烷-丙酮溶液；展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，在105℃加热，紫外光灯365nm下检视。
4.如权利要求1所述的莲子标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。
5.如权利要求1所述的莲子标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液b：取莲子对照药材5g，精密称定，加入50％甲醇20mL，超声60min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为参照物溶液b；
(2)制备对照品溶液b：取腺苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶解，制得浓度为0.1mg/mL的对照品溶液b；
(3)制备供试品溶液b：取莲子标准汤剂样品1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理60min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液b。
6.如权利要求1所述的莲子标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定腺苷含量包括：进行液相色谱仪分析，以莲子对照药材制成的溶液作为参照物溶液c，以腺苷对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以莲子标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取参照物溶液c、对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：Agilentporoshell 120EC-C18(250mmx4.6mm，4um)；流动相：以醋酸铵含量为0.01mol/L的0.1％醋酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：20℃；进样量：10μL；检测波长：260nm。
7.如权利要求6所述的莲子标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定腺苷含量还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液：取莲子对照药材5g，精密称定，加入50％甲醇20mL，超声60min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为参照物溶液c；
(2)制备对照品溶液：取腺苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成含腺苷的浓度为0.1mg/ml的溶液，作为对照品溶液c；
(3)制备供试品溶液：取莲子标准汤剂样品约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理60min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，取续滤液作为供试品溶液c。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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