CN114644704B

CN114644704B - 一种具有调控植物胁迫功能的蛋白质及一种提高植物胁迫的培育方法

Info

Publication number: CN114644704B
Application number: CN202210183912.1A
Authority: CN
Inventors: 赵琳; 许崇晶; 单金明
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-02-24
Filing date: 2022-02-24
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2042-02-24
Also published as: CN114644704A

Abstract

本发明公开一种具有调控植物胁迫功能的蛋白质及一种提高植物胁迫的培育方法，属于生物技术领域。为了提供一种提高植物耐盐和植物抗旱的方法。本发明公开一种应用在调控植物胁迫方面的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4，并验证了在大豆耐盐和耐旱方面的应用，包括提高脯氨酸含量、降低丙二醛含量和提高SOD活性。在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值，本发明提供的蛋白质序列在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

一种具有调控植物胁迫功能的蛋白质及一种提高植物胁迫的培育方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有调控植物胁迫功能的蛋白质及一种提高植物胁迫的培育方法。

背景技术

土壤盐害和干旱严重影响了作物的产量，成为限制农业生产的重要因素之一。在逆境胁迫下植物体内会伴随着许多生理生化及发育上的变化，严重影响大豆的产量和品质。大豆是重要的油料作物，是蛋白质和油分的来源。大豆在生产过程中，受干旱影响极为明显，可导致大豆株高、生物量和叶面积的降低。盐胁迫是抑制植物的正常生长发育，减少农作物生产率的主要原因之一。进行大豆的耐盐性和抗旱性相关研究，是培育大豆抗逆境品种的基础，对加强盐碱地的利用和选育优良抗逆品种，提高我国大豆总产量具有积极的推动作用。因此，通过基因工程手段，得到具有耐盐抗旱性的转基因植株，明确植物在逆境环境下的反应机制，对提高植物耐盐抗旱能力具有重要的研究和应用价值。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种提高植物耐盐和植物抗旱的方法。

本发明提供了一种蛋白质在调控植物胁迫方面的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地限定，所述应用包括植物耐盐和植物抗旱。

进一步地限定，所述应用包括提高脯氨酸含量、降低丙二醛含量和提高SOD活性。

本发明提供了一种提高植物胁迫的培育方法，所述方法的步骤如下：

(1)扩增编码氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示基因序列，将基因序列插入到表达载体；

(2)将步骤(1)获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到植物中得到转基因植株；

(3)鉴定步骤(2)获得的转基因植株得到阳性植株。

进一步地限定，步骤(1)所述基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地限定，步骤(1)中利用上游引物如SEQ ID NO.1所示和下游引物如SEQ IDNO.2所示的序列扩增编码氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的基因序列。

进一步地限定，步骤(1)利用的表达载体为pB7WG2。

进一步地限定，步骤(2)所述的农杆菌为根癌农杆菌LBA4404、EHA105或GV3101。

进一步地限定，步骤(2)所述的植物为大豆。

本发明提供了SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或编码SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的基因在提高植物胁迫中的应用。

有益效果：利用蛋白质GmCONSTANS(GmCO)能增强植物的抗逆性：在高盐胁迫下，与野生型大豆和敲除转基因大豆植株相比，T₃代纯合转GmCO基因大豆株系生长状态良好、发芽率升高、根长量增加、存活率显著提高、脯氨酸含量增加、丙二醛含量降低和SOD活性升高。在干旱胁迫下，与野生型大豆和敲除转基因大豆植株相比，T₃代纯合转GmCO基因大豆株系生长状态良好、株高增加、生物量增加、存活率显著提高、脯氨酸含量增加、丙二醛含量降低和SOD活性升高。因此，蛋白质GmCO在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为重组质粒pB7WG2-GmCO的构建过程图谱；

图2为采用免疫胶体金试纸条检测T₀代转GmCO基因大豆的检测结构，其中，WT为大豆品种东农50，1；2和3为T₀代转GmCO基因大豆。

图3为草铵膦涂抹鉴定T₁代转GmCO基因大豆，其中，A是大豆品种东农50，B是T₁代转GmCO基因大豆的阳性植株；

图4为T₁代纯合转GmCO基因大豆的分子鉴定结果，其中，M是marker(MD114，TIANGEN)，1-3是T₁代转GmCO基因大豆的阳性植株，WT是大豆品种东农50；

图5为T₁代纯合转GmCO基因大豆Western blot检测，其中，M是marker(P0069，Beyotime)，1为阴性对照；2，3和4为T₁代转GmCO基因大豆的阳性植株；

图6为T₁代纯合co敲除转基因大豆的分子鉴定结果，其中，M是marker(MD114，TIANGEN)，WT是大豆品种东农50，1-9为T₁代转co基因敲除大豆的阳性植株；

图7为T₃代纯合转35S:GmCO基因大豆、T₃代co敲除转基因大豆和野生型大豆盐胁迫发芽率统计结果，其中，A是发芽率统计图；B是采集整株幼苗图像；C是WT和转基因株系在0mM(对照)和250mM NaCl处理下的下胚轴长度，横坐标是下胚轴长度，纵坐标是不同盐浓度处理；D是发芽率统计，横坐标是组别，纵坐标是发芽率；

图8为T₃代纯合转35S:GmCO基因大豆、T₃代co敲除转基因大豆和野生型大豆盐胁迫根长统计结果，其中，A是植物根长图；B是植物根成统计，横坐标是组别，纵坐标是根长；

图9为T₃代纯合转35S:GmCO基因大豆、T₃代co敲除转基因大豆和野生型大豆盐胁迫存活率统计结果，其中，A是植物存活率；B是植物存活率，横坐标是组别，纵坐标是存活率；

图10为T₃代纯合转35S:GmCO基因大豆、T₃代co敲除转基因大豆和野生型大豆干旱胁迫存活率统计结果，其中，A是植物存活率；B是植物存活率，横坐标是组别，纵坐标是存活率；

图11为胁迫条件下转GmCO基因的表达模式分析，其中，横坐标是时间，纵坐标是相对表达量。

图12为胁迫条件下转GmCO基因大豆的生理变化，其中，图A是脯氨酸含量测定，横坐标是组别，纵坐标是脯氨酸含量；图B是丙二醛含量测定，横坐标是组别，纵坐标是丙二醛含量；图C是SOD活性测定，横坐标是组别，纵坐标是SOD活性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

大豆品种东农42记载于如下文献中：陈立君.不同播期对大豆东农42产质量性状动态变化规律研究.[J].大豆科学，2008.。在下文中，大豆品种东农42简称为东农42。大豆品种东农50记载于如下文献中：Yu JIN，Juanjuan QU，Guangming REN，Lei DONG.Effectsof Transgenic DREB Soybean Dongnong50 on the Diversity of Soil Ammonia-oxidizing Bacteria.Agricultural Science&Technology.2013，14(7):988-992.在下文中，大豆品种东农50简称为东农50。

根癌农杆菌LBA4404记载于如下文献中：陈中健，刘兵，王宏斌，王金发，刘良.(2003)水稻重复序列RRD3缺失体介导gusA在水稻愈伤组织中的表达式.热带亚热带植物学报，lI(2)：127-131.

pB7WG2载体为invitrogen公司的产品。

实施例1.构建含有GmCO的编码基因的载体

1、采用Trizo1法提取生长30天的东农42幼苗的叶片的总RNA，然后利用反转录酶反转录出第一链cDNA，得到东农42的cDNA。

2.以步骤1获得的东农42的cDNA为模板，采用5’-TGGAGCTCGGTACCCCTTCATCAAAACACCACTCTGA -3’(序列如SEQ ID NO.1所示)和5’-GATCCTGGGATCCCCGAGAAAGAGGGAACAATGCCATAT-3’(序列如SEQ ID NO.2所示)组成的引物对进行PCR扩增，得到约1083bp的双链DNA分子。

反应条件为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，36个循环；72℃10min。

将步骤2得到的双链DNA分子进行测序。测序结果表明，步骤2得到的双链DNA分子(GmCO基因)的核苷酸序列如序列如SEQ ID NO.3所示。

3.完成步骤2后，将回收的DNA片段和SmaI单酶切线性化的pENTRY-FLAG载体(invitrogen公司的产品)，pENTRY-FLAG载体相关信息：Yang X,Li X,Shan J,Li Y,ZhangY,Wang Y,Li W,Zhao L.Overexpression of GmGAMYB Accelerates the Transition toFlowering and Increases Plant Height in Soybean.Front Plant Sci.2021May 10；12:667242.载体线性化的步骤如表1所示，进行In-Fusion无缝连接反应，得到重组质粒pENTRY-FLAG-GmCO。

表1 SmaI酶切体系

30℃金属浴，1-16h。

4.完成步骤3后，将重组质粒pENTRY-FLAG-GmCO和pB7WG2载体(商品名称就是pB7WG2，大小是10898bp)进行Logistic Regression(LR)反应如表2所示，得到重组质粒pB7WG2-GmCO。

表2 LR反应体系

25℃金属浴，16h。

将重组质粒pB7WG2-GmCO进行测序。测序结果表明，重组质粒pB7WG2-GmCO中含有SEQ ID NO.3所示所示的DNA分子。

实施例2.获得转GmCO基因大豆的方法

1.将实施例1获得的重组质粒pB7WG2-GmCO导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，命名为LBA4404/pB7WG2-GmCO。

2.T₃代转GmCO基因大豆的阳性植株的获得

(1)T₀代拟转GmCO基因大豆的获得

采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法(记载于如下文献中Olhoft P M，Donovan C M，Somers D A.Soybean(Glycine max)transformation using maturecotyledonary node explants[J].Methodsin Molecular Biology，2006，343(12)：385)，将步骤二获得的LBA4404/pB7WG2-GmCO转至大豆品种东农50中，获得T₀代转GmCO基因大豆。具体步骤如下：

1)取大豆品种东农50的种子，先用氯气灭菌16h，然后无菌水浸泡12h，得到吸涨的大豆。

2)完成步骤1)后，取吸涨的大豆，去皮，将2个子叶分开，用刀片在子叶节附近轻划出伤口，然后将其放入农杆菌重悬液中侵染30min。

农杆菌重悬液的制备方法如下：取步骤二获得的重组农杆菌的单克隆，加入20mLYEP液体培养基，28℃、200rpm震荡培养，得到OD_600nm值为0.5左右的菌液1；将菌液1接种至200mL YEP液体培养基，28℃、200rpm震荡培养，得到OD_600nm值为1.6-2.0的菌液2；取菌液2，室温、5000rpm离心10min，收集沉淀；取沉淀，用液体浸染培养基重悬，得到OD_600nm值为0.8的农杆菌重悬液。

液体浸染培养基的溶质及其浓度为0.321g/L B5培养基(Gamborg B-5BasalMedium)，30g/L蔗糖，3.9g/L MES，1.67mg/L 6-BA，0.25mg/L GA₃和0.04g/L AS；溶剂为水；pH值为5.4。

3)完成步骤2)后，取大豆子叶，先用滤纸吸干重悬液，然后置于固体共培养培养基，25℃光照培养5天。

固体共培养培养基的溶质及其浓度为0.321g/L B5培养基，30g/L蔗糖，3.9g/LMES，1.67mg/L 6-BA，0.25mg/L GA₃，0.04g/L AS，0.4g/L L-Cys，0.15g/L DTT，0.5％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；pH值为5.4。

4)完成步骤3)后，将大豆子叶转移至丛生芽诱导培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)28天。

丛生芽诱导培养基的溶质及其浓度为0.321g/L B5培养基，30g/L蔗糖，0.59g/LMES，1.67mg/L 6-BA，200mg/L Cef，200mg/L Tim，5mg/L草铵膦和0.75％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；pH值为5.4。

5)完成步骤4)后，先从大豆子叶上切下丛生芽，然后将该丛生芽转移至丛生芽伸长培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)至丛生芽中再生的植株伸长至2cm。

丛生芽伸长培养基的溶质及其浓度为4.43g/L MS，30g/L蔗糖，0.59g/L MES，0.5mg/L GA₃，1mg/L ZR，1mg/L Asp，0.1mg/L IAA，200mg/L Cef，200mg/L Tim，3mg/L草铵膦和0.75％(w/v)琼脂；溶剂为水；pH值为5.6。

6)完成步骤5)后，将丛生芽中再生的植株从基部切下，然后转移至生根培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)，得到T₀代拟转GmCO基因大豆。

生根培养基的溶质及其浓度为0.321g/L B5培养基，20g/L蔗糖，3.9g/L MES，1mg/L IBA和0.8％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；pH值为5.6。

3.T₀代转GmCO基因大豆的鉴定

(1)分别取大豆品种东农50的植株或T₀代转GmCO基因大豆的植株，采用免疫胶体金试纸条(EnviroLogix公司的产品)检测是否有BAR蛋白的表达(具体步骤参考免疫胶体金试纸条的说明书)。有BAR蛋白的表达即为T₀代转GmCO基因大豆。部分检测结果图2(WT为大豆品种东农50，1；2和3为T₀代转GmCO基因大豆)。

(2)提取T₀代转GmCO基因大豆植株的叶片的蛋白，通过Western blot检测大豆阳性转化植株，目的带大小约为58KDa。

4.T₁代转GmCO基因大豆的获得和鉴定

(1)待T₀代转GmCO基因大豆成熟后采收，自交，得到T₁代转GmCO基因大豆。

(2)将大豆品种东农50或T₁代转GmCO基因大豆的种子播种于温室中，当三出复叶完全展开后，通过在新鲜叶片上涂抹浓度为130mg/L的草铵膦溶液进行抗性鉴定。具有草铵膦抗性的植株即为T₁代转GmCO基因大豆的阳性植株。部分鉴定结果见图3(图3中的A为大豆品种东农50，图3中的B为T₁代转GmCO基因大豆的阳性植株)。

(3)提取T₁代转GmCO基因大豆植株的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用35S:GmCO-F：5’-CACCATGTTGGATGGAGAAGCAACAA-3’(SEQ ID NO.5)和35S:GmCO-R：5’-TCAGAAAGAGGGAACAATGCCA-3’(SEQ ID NO.6)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约1047bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的T₁代转GmCO基因大豆植株再次被鉴定为T₁代转GmCO基因大豆植株。部分鉴定结果见图4(图4中的WT为大豆品种东农50，图4中的1-3为T₁代转GmCO基因大豆的阳性植株)。

(4)提取T₁代转GmCO基因大豆植株的叶片的蛋白，通过Western blot检测大豆阳性转化植株，目的带大小约为58KDa。部分鉴定结果见图5(M为PageRuler Prestained蛋白Marker；WT为大豆品种东农50，1为阴性对照；2，3和5为T₁代转GmCO基因大豆的阳性植株)。

经过上述步骤，将其中3个T₁代转GmCO基因大豆的阳性植株分别命名为35S:GmCO-2；35S:GmCO-4和35S:GmCO-17，并进行后续实验。

实施例3.构建co编码基因的敲除载体和获得co敲除转基因大豆的方法

使用在线工具CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)设计GmCO基因的目标序列适配器。合成的sgRNA的DNA寡核苷酸对(GmCO-cas9-F：5’-GGATTGTTGAGCAAGAGCCATGAAG-3’(SEQ ID NO.7)和GmCO-cas9-R：5’-AAACCTTCATGGCTCTTGCTCAACA-3’)(SEQ ID NO.8)被退火并生成二聚体，与pGES-201载体结合，参考文献：Bai M,Yuan J,Kuang H,Gong P,Li S,Zhang Z,Liu B,Sun J,Yang M,YangL,Wang D,Song S,Guan Y.Generation of a multiplex mutagenesis population viapooled CRISPR-Cas9 in soya bean.Plant Biotechnol J.2020Mar；18(3):721-731.将重组载体引入农杆菌菌株EHA105，然后转化到大豆'东农50'中，获得转基因大豆植株，参考文献：Zhao L,Li M,Xu C,Yang X,Li D,Zhao X,Wang K,Li Y,Zhang X,Liu L,Ding F,Du H,Wang C,Sun J,Li W.Natural variation in GmGBP1 promoter affects photoperiodcontrol of flowering time and maturity in soybean.Plant J.2018Oct；96(1):147-162.通过在幼苗的初生叶上涂抹130mg/L草铵膦来筛选转基因大豆植株，并通过PCR检测来进一步验证(GmCO-cas9-test-F：5’-CCGAATGTTGGATGGAGAAGC-3’(SEQ ID NO.9)和GmCO-cas9-test-R：5’-GTAATGGTCCGTAGTAGTAGC-3’)(SEQ ID NO.10)，部分鉴定结果见图6(图6中的WT为大豆品种东农50，图6中的1-9为T₁代转co基因敲除大豆的阳性植株。选择一个有代表性的同源品系(co-9)，即获得co-9敲除转基因大豆，进行进一步研究。

实施例4.表达GmCO基因的蛋白质

1.利用实施例2获得的T₁代转GmCO基因大豆的阳性植株：

1).蛋白的提取

称取新鲜转基因大豆叶片(约0.3g)，利用钢珠配合磨样器在液氮下打磨样品；频率20次/s，40s，打磨1-2次，将样品充分研磨。向样品粉末中加入300μL PBS buffer，充分振荡混匀，冰上静置10min后14000rpm，10min，加入2×xSample buffer；热水浴80℃，5min，充分裂解，可放-80℃冰箱备用。

2).Western Blot检测方法

(1)SDS-PAGE电泳

制备SDS-PAGE倒入薄玻璃板中，再放入跑胶槽中，点样跑胶；将电压调至100V进行跑胶，待样品跑出上层胶后，将电压增加至150V，直至样品跑至下层面胶底部，即跑胶结束。

(2)转膜

先用1×Transfer Buffer将大小与凝胶相同的滤纸、硝酸纤维素膜和薄泡沫浸湿；在转膜夹上，从黑色孔处依次放置薄泡沫、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸、薄泡沫(放置过程中，注意及时处理气泡，防止气泡的产生)，最后将转膜夹夹好；将准备好的转膜夹放入转膜槽中，向转膜槽中加入1×Transfer Buffer，放入冰袋，在低温的条件下进行转膜；在100V恒定电压条件下，转膜1h。

(3)丽春红染色

将膜放于1×TBST Buffer中清洗一次；再将膜泡在丽春红染色溶液中，于水平摇床上，室温，50-60rpm，染色1min；染色结束后，用无菌水清洗硝酸纤维素膜3-4次，观察被染色的硝酸纤维膜以确定蛋白提取状况；并根据目的蛋白大小进行剪膜。

(4)封闭

将硝酸纤维素膜泡在Blocking Buffer中，于水平摇床上；室温，50-55rpm，封闭1h。

(5)杂交

将Blocking Buffer倒掉，按照1:2000比例进行稀释抗体；加入杂交液，于水平摇床上；室温，30-40rpm，杂交1h。

(6)洗膜

结束杂交后，将膜放入1×TBST中温育晃动洗膜10min，共3次。

(7)显影

用酒精擦拭化学发光成像仪中的成像板，根据比例配置ECL显影液，现用现配；将配好的显影液用移液器均匀的滴在硝酸纤维素膜上，确保显影液均匀完全的将硝酸纤维膜覆盖，显色3-5min；然后通过化学发光成像仪观察Western Blot结果，目的带大小约为58KDa。

2.测序得到蛋白质的氨基序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例5.一种提高植物胁迫的培育方法

(1)利用上游引物如SEQ ID NO.1所示和下游引物如SEQ ID NO.2所示的序列扩增SEQ ID NO.3所示的序列，将基因序列插入到表达载体pB7WG2；

(2)将步骤(1)获得的载体导入到根癌农杆菌LBA4404中，利用根癌农杆菌LBA4404转入到大豆中得到转基因植株；

(3)鉴定步骤(2)获得的转基因植株得到阳性植株：当三出复叶完全展开后，通过在新鲜叶片上涂抹浓度为130mg/L的草铵膦溶液进行抗性鉴定。具有草铵膦抗性的植株即为T₁代转GmCO基因大豆的阳性植株；

提取转基因大豆植株的叶片的蛋白，通过Western blot检测大豆阳性转化植株，目的带大小约为58KDa。

利用下述实验验证实验效果：

1、发芽率

对获得的转基因大豆植株进行盐胁迫分析。将GmCO过表达转基因大豆(35S:GmCO-2；35S:GmCO-4和35S:GmCO-17)、co-9敲除转基因大豆和野生型大豆(东农50)置于含有0mM和250mM浓度的盐胁迫发芽率培养基(B5和2％蔗糖)上生长6天。在正常条件下，观察到转基因大豆和野生型大豆的表型没有明显差异；在250mM NaCl处理下，野生型大豆种子和敲除转基因大豆种子显示出比转基因大豆种子(87.67％、78.33％、82％)更低的发芽率(25％、19.67％)。此外，虽然盐胁迫对转基因大豆和野生型大豆的生长速率具有不利的影响，但是GmCO过表达转基因种子的植物高度显著高于盐胁迫下野生型大豆和co-9敲除转基因大豆植物的高度(图7)。

2、根长

将转基因大豆种子和野生型大豆种子置于草炭土与蛭石1：1混合的基质上25℃培养4天。将大小均匀的幼苗转移到25℃，相对湿度60％，250μmol m^-2s^-1白光的长日照(16h/8h光/暗)培养箱中，并在半强度Hoagland溶液中水培生长(用于表型分析)。通过添加0mM和100mM NaCl到水培溶液中，处理21天。发现在0mM NaCl溶液处理中的转基因大豆植株与野生型大豆植株和敲除转基因大豆植株相比没有差异性，而100mM NaCl溶液处理中的过表达转基因大豆植株与野生型大豆植株和敲除转基因大豆植株相比表现出根长更长的表型(图8)。

3、胁迫处理

为了检验GmCO基因过表达植物的抗逆性，对转基因株系模拟高盐和干旱胁迫，并以野生型大豆(DN50)为对照。实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：分别播种30粒大豆(大豆品种东农50、co-9、35S:GmCO-2；35S:GmCO-4和35S:GmCO-17)置于营养土：蛭石(1：1)中，长日照培养(光培养(16h)和暗培养(8h)交替进行；光培养时为白光，光照强度为250μmol m^-2s^-1)。

高盐胁迫：待大豆幼苗第一个三出复叶完全展开后，取长势一致的大豆幼苗进行盐胁迫处理，每盆浇灌等体积NaCl溶液(200mM)，并浇透，每3天浇一次，观察表型变化，并统计存活率。存活率＝存活的大豆幼苗数/30×100％。不同株系大豆盐胁迫8天的生长状态如图9所示。结果显示，在一定程度高盐胁迫处理下，T₃代纯合过表达GmCO转基因大豆比野生型大豆和敲除转基因大豆的生长状态更好。与野生型大豆和敲除转基因大豆的存活率(存活率为30.33％和28.33％)相比，T₃代纯合过表达GmCO转基因大豆的存活率显著提高(存活率为85.67％、62％和80.67％)。表明过量表达GmCO可在一定程度上提高大豆植株的耐盐能力。

干旱胁迫：待大豆幼苗第一个三出复叶完全展开后，取长势一致的大豆幼苗进行干旱胁迫处理，不同株系大豆干旱5天和8天的生长状态如图10所示。结果显示，在一定程度干旱胁迫下，野生型大豆叶片萎蔫，生长基本停止，T₃代纯合过表达GmCO转基因大豆仅有少数叶片萎蔫，植株仍显绿色。与野生型大豆和敲除转基因大豆的存活率(存活率为32.33％和30.33％)相比，T₃代纯合过表达GmCO转基因大豆的存活率显著提高(存活率为85％、73.67％和80.67％)，表明过量表达GmCO可在一定程度上提高大豆植株的抗旱能力。

4、不同胁迫下GmCO基因的表达模式分析

提取不同时间点(0h、1h、3h、6h)150mM NaCl和10％PEG处理的野生型大豆东农42的RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR，以半强度Hoagland溶液处理作为对照。

以GmActin4作为内参，引物序列为：

GmActin4-F：GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT(序列如SEQ ID NO.11所示)

GmActin4-R：GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA(序列如SEQ ID NO.12所示)

GmCO引物序列为：

GmCO-F：TGACTGCGACAACCACCACTTT(序列如SEQ ID NO.13所示)

GmCO-R：CCCCAGCATAACTCTTGTGAGA(序列如SEQ ID NO.14所示)

qRT-PCR结果如图11所示，结果表明GmCO基因在盐和干旱胁迫下，均促进GmCOmRNA的表达。

5、脯氨酸含量的测定

植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、盐等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。

参照He等(He SZ,Han YF,Wang YP,Zhai H,Liu QC.In vitro selection andidentification of sweetpotato(Ipomoea batatas(L.)Lam.)plants tolerant toNaCl.Plant Cell Tissue Organ Cult,2009,96:69-74)的方法，对大豆植株的脯氨酸含量进行测定。

将第一片三出复叶完全展开的转基因大豆株系(35S:GmCO-2、35S:GmCO-4、35S:GmCO-17)、敲除转基因株系(co-9)和野生型大豆植株(东农50)分别于含有150mM NaCl和10％PEG6000的半强度Hoagland溶液中培养6h，取其叶片进行脯氨酸含量的测定，重复3次。

1)主要试剂及配方

(1)6M磷酸：量取102.5mL 85％的磷酸于250mL容量瓶中，定容至刻度；

(2)2.5％酸性茚三酮：称取5.0g茚三酮，加入120mL冰醋酸和80mL 6M磷酸，70℃下水浴至溶解，冷却后贮存于棕色瓶中尽快使用。4℃冰箱中保存可用3d。

2)测定方法

(1)称取10mg脯氨酸，用少量无水乙醇溶解，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容配成100μg/mL的母液；

(2)取上述母液0、0.625、1.25、2.5、3.75、5.0、6.25和7.5mL分别放入8个25mL的容量瓶中，再分别加入蒸馏水定容至刻度，充分混匀，配制成0、1.25、2.5、5、7.5、10、12.5和15μg/mL系列浓度的脯氨酸溶液；

(3)分别取上述溶液2mL，加入2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮(注意不要接触皮肤)，

充分混匀，沸水浴显色15min，冷却后于520nm处测吸光度；

(4)以吸光度值为横坐标，脯氨酸含量为纵坐标。

植物样品的提取及测定：

(1)称取植株叶片1.0g，剪碎，加入5mL 80％乙醇，研磨至匀浆；

(2)将匀浆液体移入试管中，加水补足25mL，充分混匀，80℃水浴20min；

(3)分别加入0.5g人造沸石和0.2g活性炭，于漩涡振荡器上振荡1min混匀，然后用

一层滤纸过滤；

(4)从制作的脯氨酸标准曲线上检出1mL被测样品脯氨酸的含量，最后通过下式计

算得到游离脯氨酸的平均含量：

脯氨酸含量(μg/g)＝(C×V1/V2)/W

C——曲线查C值(μg)；

V1——提取液总体积(mL)；

V2——测定液体积(mL)；

W——样品质量(g)。

脯氨酸含量测定结果见图12中A，结果显示，在含有150mM NaCl和10％PEG的3个过表达转基因大豆株系的脯氨酸含量均高于野生型大豆植株和敲除转基因植株；差异显著性分析表明，其脯氨酸含量均显著高于野生型大豆植株和敲除转基因植株。

6、丙二醛(MDA)含量测定

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置上释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，改变这些大分子的构型，或者使之产生交联反应，从而丧失功能，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。

参照Gao等(Gao S,Yuan L,Zhai H,Liu CL,He SZ,et al.Transgenicsweetpotato plants expressing an LOS5 gene are tolerant to salt stress.PlantCell Tissue Organ Cult,2011,107:205-213)的方法，对烟草植株的MDA含量进行测定。

将第一片三出复叶完全展开的转基因大豆株系(35S:GmCO-2、35S:GmCO-4、35S:GmCO-17)、敲除转基因株系(co-9)和野生型大豆植株(东农50)分别于含有150mM NaCl和10％PEG6000的半强度霍格兰营养液中培养6h，取其叶片进行MDA含量的测定，重复3次。

1)主要试剂及配方

(1)5％三氯乙酸(TCA)：称取5g三氯乙酸，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中定容，充分混匀；

(2)0.5％硫代巴比妥酸(TBA)：称取0.5g硫代巴比妥酸，用少量5％TCA溶解后，移

入100mL容量瓶中定容，充分混匀；

(3)石英砂。

2)提取及测定方法

(1)称取1.0g材料，加入10mL 5％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆；

(2)3,000rpm离心10min，取上清即为丙二醛提取液；

(3)取1.5mL上述提取液(对照管取1.5mL 5％TCA)，加入2.5mL 0.5％TBA，混匀后

于沸水浴中反应15min，迅速冰浴冷却；

(4)1,800g离心10min；

(5)以蒸馏水调零，在532nm和600nm波长下测定上清液的吸光度；

(6)含量计算：

MDA含量(nM/g)＝(OD532-OD600)×V1×V2/(0.155×FW×V3)

OD532——样品管在532nm处的光吸收值；

OD600——样品管在600nm处的光吸收值；

V1——反应液总体积(mL)；

V2——提取液总体积(mL)；

FW——样品鲜重(g)；

V3——测定用液总体积(mL)。

转基因35S:GmCO-2、35S:GmCO-4、35S:GmCO-17大豆株系、野生型大豆植株和敲除转基因株系co-9的SOD活性测定结果见图12中B，结果显示，在含有150mM NaCl和10％PEG的3个过表达转基因大豆株系的MDA含量均低于野生型大豆植株和敲除转基因植株；差异显著性分析表明，其MDA含量均显著低于野生型大豆植株和敲除转基因植株。

7、SOD活性测定

SOD活性是鉴定植物耐盐性的重要生理生化指标。参照He等(2009)的方法，对大豆植株的SOD活性进行测定。

将第一片三出复叶完全展开的转基因大豆株系(35S:GmCO-2、35S:GmCO-4、35S:GmCO-17)、敲除转基因株系(co-9)和野生型大豆植株(东农50)分别于含有100mM NaCl和10％PEG的半强度的霍格兰营养液中培养6h，取其叶片进行SOD活性的测定，重复3次。

1)主要试剂及配方

(1)0.1M磷酸钠(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)缓冲液(pH＝7.8)

A液(0.1M Na₂HPO₄溶液)：称取Na₂HPO₄·2H2O 7.163g，用少量蒸馏水溶解后，移入200mL容量瓶中定容，充分混匀。4℃冰箱中保存备用；

B液(0.1M NaH₂PO₄溶液)：称取NaH₂PO₄·2H2O 0.780g，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中定容，充分混匀。4℃冰箱中保存备用；

取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1M的磷酸钠缓冲液(pH＝7.8)。4℃冰箱中保存备用。

(2)0.026M甲硫氨酸(Met)磷酸钠缓冲液

称取甲硫氨酸(C₅H₁₁NO₂S)0.388g，用少量0.1M的磷酸钠缓冲液(pH＝7.8)溶解后，移入100mL容量瓶中，再用相同浓度的磷酸钠缓冲液定容，充分混匀。4℃冰箱中保存可用1-2d。

(3)7.5×10-4M NBT溶液

称取NBT(C₄OH₃OCl₂N₁₀O₆)0.153g，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容，充分混匀。4℃冰箱中保存可用2-3d。(4)含1.0μM EDTA的2×10-5M核黄素溶液

A液：称取EDTA0.003g，用少量蒸馏水溶解；

B液：称取核黄素0.075g，用少量蒸馏水溶解；

C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，此溶液即为含0.1mMEDTA的2mM核黄素溶液，避光保存(可用黑纸将装有溶液的棕色瓶包好)。4℃冰箱中保存可用8-10d。当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0μM EDTA的2×10-5M核黄素溶液。

(5)含2％聚乙烯比咯烷酮(PVP)的0.05M磷酸钠缓冲液(pH＝7.8)

取0.1M的磷酸钠缓冲液(pH＝7.8)50mL，加入2g PVP，充分溶解后移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

2)测定方法

(1)称取1.0g样品叶片置于预冷的研钵中，加入预冷的4mL含有2％PVP的0.05M磷

酸钠缓冲液(pH＝7.8)，冰浴研磨匀浆，转入10mL离心管，定容至5mL；

(2)4℃，10,000rpm，离心10min，取上清液即为酶液提取样品；

(3)取透明度好的10mL离心管，每个株系3次重复，按照下表3加入试剂：

表3

(4)设3个对照CK1、CK2和CK3，将CK1包上铝箔避光，与其它样品管(包括CK2和CK3)同时置于4500lux日光灯下，反应温度28℃，25min后，立即用黑布遮蔽以终止反应；

(5)SOD活性测定与计算：以遮光的对照管CK1作为空白调零，在560nm波长下测定各管的吸光度，CK2和CK3的平均值作为对照，按下列公式计算SOD活性(SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位)：

SOD活性(U/g)＝(ODC-ODS)×V1/ODC×0.5×FW×V2

式中SOD活性以每g鲜重酶单位表示；

ODC——照光对照的光吸收值；

ODS——样品管的光吸收值；

V1——样品液总体积(mL)；

FW——样品鲜重(g)；

V2——测定时样品用量(mL)。

转基因35S:GmCO-2、35S:GmCO-4、35S:GmCO-17大豆株系、野生型大豆植株和敲除转基因株系co-9的SOD活性测定结果见图12中C，结果显示，在含有150mM NaCl和10％PEG的3个过表达转基因大豆株系的SOD活性均高于野生型大豆植株和敲除转基因植株；差异显著性分析表明，其SOD活性均显著高于野生型大豆植株和敲除转基因植株。

上述过表达GmCO转基因大豆植株脯氨酸含量、MDA含量和SOD活性的测定结果表明，同野生型大豆植株和敲除转基因大豆植株相比，过表达GmCO转基因大豆植株的耐盐性和抗旱性显著提高，说明蛋白质GmCO及其编码基因可用来调控植物抗逆性，尤其是提高植物耐盐性、抗旱性。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 一种具有调控植物胁迫功能的蛋白质及一种提高植物胁迫的培育方法

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tggagctcgg taccccttca tcaaaacacc actctga 37

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gatcctggga tccccgagaa agagggaaca atgccatat 39

<210> 3

<211> 1047

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 3

atgttggatg gagaagcaac aatgggcacg tgggctcgca tgtgcgacac gtgccgttcg 60

gccccctcct ccgtgttctg ccgcgcccac accgccttcc tctgcgccac gtgcgacgcg 120

cgcctccacg cctcgctgac gtggcacgag cgcgtgtggg tgtgcgaggc ctgcgagcgc 180

gcccctgcgg ccttcctctg caaggctgac gccgcctccc tctgcgcctc ctgcgacgcc 240

gacatccacg ccgccaaccc cctcgccagc cgccaccacc gtgtccccat cctccccatc 300

gccgccgccc ccggcaacaa cgacaacgac aacgtcgacg atgctgactt ggacgacgat 360

gacgaaaccg cttcatggct cttgctcaac cctgtcaaaa gcgctagtgt ccctaacaac 420

aataacacta ataatgggtt ctcgtataat ggtgaggttg atgagtattt ggaccttgtt 480

gatgactgcg acaaccacca ctttgcttct gttgctacta ctacggacca ttactctcat 540

cagcaccaac atttcggtgt tgtttctcac aagagttatg ctggggacag tgttgttccg 600

gttcagcacc accagcattt tcagcttggc ttggagtttg acaactccaa agctgccttc 660

agttacaatg cttctgttaa tcaaagtgtt tcagtttcat caatggatat tggtgttgta 720

cctgaatcac cgatgaggga tgtctcaatt ggccatacaa gaacccccaa agggacaatt 780

gacctatttt ctggacctcc cattcaggtg ccttcccatt tttctccaat ggacagggag 840

gccagagtcc taaggtacag ggagaaaaag aagacaagaa aatttgagaa gacaatcagg 900

tatgcctcaa ggaaggccta tgcagagact agaccccgta taaaaggtcg atttgccaag 960

agaacagatg tagaagctga agtggatcag atgttctcca caacactaat tacagaagtt 1020

ggatatggca ttgttccctc tttctga 1047

<210> 4

<211> 348

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 4

Met Leu Asp Gly Glu Ala Thr Met Gly Thr Trp Ala Arg Met Cys Asp

1 5 10 15

Thr Cys Arg Ser Ala Pro Ser Ser Val Phe Cys Arg Ala His Thr Ala

20 25 30

Phe Leu Cys Ala Thr Cys Asp Ala Arg Leu His Ala Ser Leu Thr Trp

35 40 45

His Glu Arg Val Trp Val Cys Glu Ala Cys Glu Arg Ala Pro Ala Ala

50 55 60

Phe Leu Cys Lys Ala Asp Ala Ala Ser Leu Cys Ala Ser Cys Asp Ala

65 70 75 80

Asp Ile His Ala Ala Asn Pro Leu Ala Ser Arg His His Arg Val Pro

85 90 95

Ile Leu Pro Ile Ala Ala Ala Pro Gly Asn Asn Asp Asn Asp Asn Val

100 105 110

Asp Asp Ala Asp Leu Asp Asp Asp Asp Glu Thr Ala Ser Trp Leu Leu

115 120 125

Leu Asn Pro Val Lys Ser Ala Ser Val Pro Asn Asn Asn Asn Thr Asn

130 135 140

Asn Gly Phe Ser Tyr Asn Gly Glu Val Asp Glu Tyr Leu Asp Leu Val

145 150 155 160

Asp Asp Cys Asp Asn His His Phe Ala Ser Val Ala Thr Thr Thr Asp

165 170 175

His Tyr Ser His Gln His Gln His Phe Gly Val Val Ser His Lys Ser

180 185 190

Tyr Ala Gly Asp Ser Val Val Pro Val Gln His His Gln His Phe Gln

195 200 205

Leu Gly Leu Glu Phe Asp Asn Ser Lys Ala Ala Phe Ser Tyr Asn Ala

210 215 220

Ser Val Asn Gln Ser Val Ser Val Ser Ser Met Asp Ile Gly Val Val

225 230 235 240

Pro Glu Ser Pro Met Arg Asp Val Ser Ile Gly His Thr Arg Thr Pro

245 250 255

Lys Gly Thr Ile Asp Leu Phe Ser Gly Pro Pro Ile Gln Val Pro Ser

260 265 270

His Phe Ser Pro Met Asp Arg Glu Ala Arg Val Leu Arg Tyr Arg Glu

275 280 285

Lys Lys Lys Thr Arg Lys Phe Glu Lys Thr Ile Arg Tyr Ala Ser Arg

290 295 300

Lys Ala Tyr Ala Glu Thr Arg Pro Arg Ile Lys Gly Arg Phe Ala Lys

305 310 315 320

Arg Thr Asp Val Glu Ala Glu Val Asp Gln Met Phe Ser Thr Thr Leu

325 330 335

Ile Thr Glu Val Gly Tyr Gly Ile Val Pro Ser Phe

340 345

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

caccatgttg gatggagaag caacaa 26

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tcagaaagag ggaacaatgc ca 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ggattgttga gcaagagcca tgaag 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aaaccttcat ggctcttgct caaca 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ccgaatgttg gatggagaag c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gtaatggtcc gtagtagtag c 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gtgtcagcca tactgtcccc attt 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gtttcaagct cttgctcgta atca 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

tgactgcgac aaccaccact tt 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ccccagcata actcttgtga ga 22

Claims

1.一种蛋白质在调控大豆耐盐和抗旱方面的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括提高脯氨酸含量、降低丙二醛含量和提高SOD活性。

3.一种提高大豆耐盐和抗旱的培育方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：

(1)扩增编码氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的基因序列，将基因序列插入到表达载体；

(3)鉴定步骤(2)获得的转基因植株得到阳性植株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中利用上游引物如SEQ ID NO.1所示和下游引物如SEQ ID NO.2所示的序列扩增编码氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的基因序列。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)利用的表达载体为pB7WG2。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的农杆菌为根癌农杆菌LBA4404、EHA105或GV3101。

8.SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列在提高大豆耐盐和抗旱中的应用。

9.编码SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的基因在提高大豆耐盐和抗旱中的应用。