CN114644669A - 一种黄体酮共晶体的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄体酮共晶体的制备方法及其应用。所述的黄体酮共晶体是由活性成分黄体酮和共晶形成物硝基苯甲酸形成，黄体酮与硝基苯甲酸之间通过氢键连接；其中黄体酮与硝基苯甲酸的摩尔比为1:1。本发明制备的黄体酮‑硝基苯甲酸共晶(邻硝基苯甲酸、间硝基苯甲酸、对硝基苯甲酸)的稳定性好，溶解性显著提高，增加黄体酮溶解度可以降低黄体酮的刺激性和不良反应。而且共晶技术可以控制黄体酮释放，延长黄体酮递送，具有减少剂量及相关副作用的应用价值。该制备方法使用的共晶试剂价格便宜，且制备中采用球磨等生产成本较低的方法，在提高药物水溶性时不会显著增加药物生产成本，可保证共晶药物价格的基本稳定。
Description
技术领域
本发明属于药物共晶制备技术领域，具体涉及一种黄体酮共晶体的制备方法及其应用。
背景技术
药物共晶是将药物分子与共晶试剂通过氢键等分子间作用力形成具有固定组成和单一熔点的“超分子”。已有的研究结果表明，利用水溶性较好的共晶试剂与难溶性药物形成药物共晶，可在不改变药物分子结构的情况下显著提高难溶性药物的水溶性和生物利用度，是改善药物水溶性、渗透性和稳定性等理化性质的最新关键技术。美国FDA在2013年出台了药物共晶业界指导原则，将药物共晶列为药物赋形剂；2016年又对该原则进行了修订，进一步将药物共晶归属为“固态”药物溶剂合物，为共晶药物的审批和上市提供了指导原则。2014年，两个个治疗糖尿病的共晶药物farxiga和Suglat被批准上市，2015年，诺华治疗抗心衰的重磅共晶药物LCZ696批准上市。
黄体酮(Progesterone，C21H30O2)是卵巢分泌的具有生物活性的主要孕激素。黄体酮不仅能够诱导子宫内膜向分泌期转变，增加内膜容受性以利于受精卵着床，同时还作用于子宫局部，为妊娠的维持提供良好的内环境。
因为黄体酮溶解性差，在临床上经常采用黄体酮油性注射液注射给药。其优点主要为疗效确切，价格低廉，缺点主要是：注射部位疼痛和刺激，易形成局部硬结，局部硬结、无菌脓肿的吸收恢复需较长时间，这些都属于肌注黄体酮的正常现象，没有特殊有效的治疗方法。此外，肌肉注射黄体酮需要每日注射。
采用药物共晶方法为提高甾体激素类难溶口服避孕药物的水溶性和稳定性提供了一种新的思路和尝试。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄体酮共晶体的制备方法及其应用。由于硝基是吸电子基团，造成硝基苯甲酸不是好的氢键供体，不能作为共晶试剂用于药物共晶体的制备。本发明制备黄体酮共晶体时加入助溶剂，成功制成了黄体酮-硝基苯甲酸共晶，拓展了共晶试剂的选择范围。
所述的黄体酮共晶体是由活性成分黄体酮和共晶形成物硝基苯甲酸形成，黄体酮与硝基苯甲酸之间通过氢键连接。其中黄体酮与硝基苯甲酸的摩尔比为1:1。
所述硝基苯甲酸为邻硝基苯甲酸、间硝基苯甲酸或对硝基苯甲酸。
黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶属于正交晶系，空间群为P212121，晶胞参数为：
α＝90°，β＝90°，γ＝90°，Z＝4，晶胞体积为
黄体酮-间硝基苯甲酸共晶属于三斜晶系，空间群为P1，晶胞参数为：
α＝62.763(7)°，β＝86.884(6)°，γ＝77.261(6)°，Z＝2，晶胞体积为
黄体酮-对硝基苯甲酸共晶属于正交晶系，空间群为P212121，晶胞参数为：
α＝90°，β＝90°，γ＝90°，Z＝4，晶胞体积为
黄体酮-邻硝基苯甲酸以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图在4.1°、6.5°、9.2°、10.1°、10.4°、10.5°、21.7°、23.2°处具有特征峰，其中每个特征峰2θ的误差范围为±0.2°；黄体酮-间硝基苯甲酸以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图在3.5°、4.6°、5.7°、6.9°、8.4°、8.6°、12°、21°处具有特征峰，其中每个特征峰2θ的误差范围为±0.2°；黄体酮-对硝基苯甲酸以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图在2.2°、2.8°、3.4°、3.5°、5.4°、7.7°、9.1°、38.7°处具有特征峰，其中每个特征峰2θ的误差范围为±0.2°。
黄体酮-邻硝基苯甲酸的熔点为143.08±0.1℃；黄体酮-间硝基苯甲酸的熔点为95.06±0.1℃；黄体酮-邻硝基苯甲酸的熔点为157.03±0.1℃。
所述的黄体酮共晶体的制备方法为：将黄体酮、硝基苯甲酸、乙酸乙酯或甲醇置入球磨仪中球磨20-60分钟，得到的白色固体粉末即为黄体酮-硝基苯甲酸共晶；所述硝基苯甲酸为邻硝基苯甲酸、间硝基苯甲酸或对硝基苯甲酸。
所述的黄体酮共晶体单晶的制备方法为：将黄体酮-硝基苯甲酸共晶粉末加入甲醇中溶解，溶剂挥发得到无色块状晶体，即为黄体酮-硝基苯甲酸共晶体的单晶。
一种药物组合物，包括上述黄体酮共晶体以及药学上可接受的载体或助剂。
本发明制备的黄体酮-硝基苯甲酸共晶(邻硝基苯甲酸、间硝基苯甲酸、对硝基苯甲酸)的稳定性好，溶解性显著提高，增加黄体酮溶解度可以降低黄体酮的刺激性和不良反应。而且共晶技术可以控制黄体酮释放，延长黄体酮递送，具有减少剂量及相关副作用的应用价值。该制备方法使用的共晶试剂价格便宜，且制备中采用球磨等生产成本较低的方法，在提高药物水溶性时不会显著增加药物生产成本，可保证共晶药物价格的基本稳定。
附图说明
图1为实施例1制备的黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶的粉末X-射线衍射(PXRD)谱图。
图2为实施例1制备的黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶的同步热分析(TG-DSC)结果图。
图3为实施例1制备的黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。
图4为实施例1制备的黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶的SEM照片。
图5为实施例1制备的黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶的核磁氢谱(1H-NMR)。
图6为实施例1制备的黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶的结构分析图。
图7为实施例1制备的黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶的稳定性评价结果图。
图8为实施例1制备的黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶的水溶性评价结果图。
图9为实施例1制备的黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶的生物利用度评价结果图。
图10为实施例1制备的黄体酮-间硝基苯甲酸共晶的粉末X-射线衍射(PXRD)谱图。
图11为实施例1制备的黄体酮-间硝基苯甲酸共晶的同步热分析(TG-DSC)结果图。
图12为实施例1制备的黄体酮-间硝基苯甲酸共晶的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。
图13为实施例1制备的黄体酮-间硝基苯甲酸共晶的SEM照片。
图14为实施例1制备的黄体酮-间硝基苯甲酸共晶的核磁氢谱(1H-NMR)。
图15为实施例1制备的黄体酮-间硝基苯甲酸共晶的结构分析图。
图16为实施例1制备的黄体酮-间硝基苯甲酸共晶的稳定性评价结果图。
图17为实施例1制备的黄体酮-间硝基苯甲酸共晶的水溶性评价结果图。
图18为实施例1制备的黄体酮-间硝基苯甲酸共晶的生物利用度评价结果图。
图19为实施例1制备的黄体酮-对硝基苯甲酸共晶的粉末X-射线衍射(PXRD)谱图。
图20为实施例1制备的黄体酮-对硝基苯甲酸共晶的同步热分析(TG-DSC)结果图。
图21为实施例1制备的黄体酮-对硝基苯甲酸共晶的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。
图22为实施例1制备的黄体酮-对硝基苯甲酸共晶的SEM照片。
图23为实施例1制备的黄体酮-对硝基苯甲酸共晶的核磁氢谱(1H-NMR)。
图24为实施例1制备的黄体酮-对硝基苯甲酸共晶的结构分析图。
图25为实施例1制备的黄体酮-对硝基苯甲酸共晶的稳定性评价结果图。
图26为实施例1制备的黄体酮-对硝基苯甲酸共晶的水溶性评价结果图。
图27为实施例1制备的黄体酮-对硝基苯甲酸共晶的生物利用度评价结果图。
具体实施方式
实施例1
称取943.4mg(3.0mmol)黄体酮与501.4mg(3.0mmol)邻硝基苯甲酸加入球磨机(行星式球磨机，南京驰顺科技发展有限公司)中，加入0.2mL乙酸乙酯助溶剂，28Hz球磨40min，得到的白色粉末为黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶。
单晶培养方法：取上述黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶粉末100mg，加入15ml甲醇溶解，溶剂缓慢挥发，1周左右即得无色块状晶体。
实施例2
称取943.4mg(3.0mmol)黄体酮与501.4mg(3.0mmol)间硝基苯甲酸加入球磨机(行星式球磨机，南京驰顺科技发展有限公司)中，加入0.2mL乙酸乙酯助溶剂，28Hz球磨40min，得到的白色粉末为黄体酮-间硝基苯共晶。
单晶培养方法：取上述黄体酮-间硝基苯甲酸共晶粉末100mg，加入15ml甲醇溶解，溶剂缓慢挥发，1周左右即得无色块状晶体。
实施例3
称取943.4mg(3.0mmol)黄体酮与501.4mg(3.0mmol)对硝基苯甲酸加入球磨机(行星式球磨机，南京驰顺科技发展有限公司)中，加入0.2mL乙酸乙酯助溶剂，28Hz球磨40min，得到的白色粉末为黄体酮-对硝基苯共晶。
单晶培养方法：取上述黄体酮-对硝基苯甲酸共晶粉末100mg，加入15ml甲醇溶解，溶剂缓慢挥发，1周左右即得无色块状晶体。
将实施例1-3制备的共晶和单晶进行表征测试：
实验条件
1、热分析(TG-DSC)
仪器型号：TGA/DSC 3+
升温速率：10℃/min
温度范围：40-400℃
气体氛围：氮气
2、红外吸收光谱(IR)
仪器型号：Bruker EQUINOX 55 FT-IR
实验方法：取适量样品置于探头中间测试
3、1H-NMR核磁共振谱
仪器型号：AVANCE III HD 400/500MHz型核磁共振波谱仪
溶剂：d6-DMSO(TMS内标)
4、X-射线单晶衍射(SXRD)
仪器型号：Rigaku AFC-10
实验方法：选取0.31mm×0.22mm×0.18mm大小的无色晶体，采用石墨单色化Mo-K射线，辐射波长
测定温度：173.00(15)K。结构解析和精修采用SHELXT-14以及Olex2程序完成。利用直接法确定原子位置，然后用差值函数法和最小二乘法求出全部非氢原子坐标，用最小二乘法对结构进行修正。
5、粉末X射线衍射谱(PXRD)
仪器型号：德国Bruker公司D8 ADVANCE型X射线粉末仪。
测定条件：铜靶，40KV/40mA，起始角5°，终止角40°/60°，步宽0.02，扫描速度17.7秒/步。波长
石墨单色器。
6、扫描电镜图谱
仪器型号：Jeol JSM-6100
7、稳定性试验
仪器型号：综合药品稳定性试验箱(上海一恒科学仪器有限公司)
实验方法：稳定性实验考察样品在高温、高湿、光照条件下的稳定性和转变规律。取100mg测试样品粉末装入称量瓶中，将样品开口放置分别在高温(60±2℃)、高湿(90％±5％)、光照(4500±500lx)条件下放置10天，于第0天、5天、10天分别取样进行粉末X射线衍射分析。
8、溶解性试验
仪器型号：天大天发RC806D溶出试验仪
实验方法：样品过100目筛，称取供试品各2g，分别加入1000mL去离子水中，浆法，于37℃、100rpm条件下搅拌，分别在5min、15min、30min、45min、60min、90min、120min、180min、240min、300min和360min取样2mL，过滤膜，取滤液作为供试品，进样2针，HPLC检测。
液相条件：高效液相色谱仪：Waters；色谱柱:Waters XBridge C18 4.6*150mm，3.5μm色谱柱；流动相：乙腈:水＝45:55；检测波长:280nm；流速：0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：20μL；运行时间：15min。
9、生物利用度试验
9.1动物：健康雌性SD大鼠(7-9周龄，体重220±30g，每组5只)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
9.2动物给药方法：所有动物在12小时/12小时的光照/黑暗循环下饲养，每笼5只，自由饮食。黄体酮及其共晶与PBS(phosphate buffered solution，磷酸盐缓冲液，含0.1％的DMSO)配成溶液，剂量为相当于黄体酮5.0mg/kg，肌肉注射给药。
9.3生物样品制备方法：于规定时间(15、30min和1、1.5、2、3、5、7、12、24、48h)分批取50μL颈静脉血液样本收集到肝素化管。血液随即离心15min。血浆样本于-20℃保存。将50μL大鼠血浆、5μL甲醇和200μL内标物溶液(丁螺环酮，5ng/mL)加至1mL甲醇：乙腈(1:1，v/v)中。将上述血浆标本涡旋1min，4000rpm离心15min，用甲醇：水(1:1，v/v，0.1％三氟乙酸)稀释上清20倍进样。
9.4生物样品分析方法：LC-MS/MS仪器型号：AB Sciex 5500；LC-MS/MS定量分析软件：1.6.3；电离方式：电喷射正离子；扫描方式：多反应监测(MRM)；分析物MRM：EE-DNS，530.4/171.0；内标MRM：丁螺环酮，386.2/122.2；
液相条件：Shimadzu LC-30AD，ACE Excel 5C4(50mm*2.1mm)，进样量10μL；流动相：A:5mM醋酸铵(0.05％三氟乙酸)，B:乙腈(0.1％三氟乙酸)，流速0.8mL/min，流动相A与B的梯度如下表所示。
流动相A与B的梯度
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 0.4-1.8 | 80.0 | 20.0 |
| 1.8-2.7 | 5.00 | 95.0 |
| 2.7-3.5 | 80.0 | 20.0 |
表征结果
1、黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶
(1)粉末X-射线衍射(PXRD)测试：吸收峰数据如下。
(2)同步热分析(TG-DSC)：差示扫描热量仪(DSC)显示共晶熔点为143.08℃；热重分析(TGA)显示在测试温度范围内观察到邻硝基苯甲酸的分解与黄体酮的分解。
(3)傅里叶变换红外光谱(FT-IR)测试：主要红外吸收峰数据如下。
| 波数ν/cm<sup>-1</sup> | 透过率/％ |
| 3101.40 | 99.4 |
| 3077.21 | 99.4 |
| 2612.78 | 98.3 |
| 2514.00 | 98.4 |
| 1727.62 | 86.6 |
| 1698.29 | 82.3 |
| 1611.78 | 85.5 |
| 1530.72 | 77.6 |
| 1416.62 | 97.7 |
| 1299.67 | 92.3 |
| 1266.56 | 79.0 |
| 1195.43 | 95.9 |
| 1073.74 | 94.4 |
| 947.36 | 92.9 |
| 893.76 | 97.5 |
| 803.15 | 86.9 |
| 784.25 | 91.6 |
| 742.62 | 90.4 |
| 681.43 | 91.6 |
| 664.20 | 98.9 |
| 640.96 | 91.9 |
(4)核磁氢谱(1H-NMR)测试：化学位移数据为1H-NMR(400MHz,d6-DMSO)δ＝13.85(s,1H),7.99(d,1H),7.88(d,1H),7.80(d,2H),5.63(s,1H),2.57-2.55(t,1H),2.42-2.33(m,2H),2.25-2.23(m,2H),2.18-2.14(m,6H),1.77-1.64(d,1H),1.61-1.52(m,5H),1.43-1.38(m,2H),1.18-1.14(m,5H),0.96-0.93(m,2H),0.57(S,3H).
(5)单晶X-射线衍射(SXRD)测试：从单晶结构解析结果可知，黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶分子比例为1:1，二者通过氢键相连。
(6)Stability实验结果表明：黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶在高温、高湿、光照条件下是稳定的。
(7)Solubility实验结果表明：形成共晶显著增加了黄体酮的水溶性。
(8)生物利用度测试：由黄体酮及共晶的药时曲线可知黄体酮达峰时间为1h，共晶达峰时间为1.5h，共晶Cmax为黄体酮的1.8倍。
2、黄体酮-间硝基苯甲酸共晶
(1)粉末X-射线衍射(PXRD)测试：吸收峰数据如下。
(2)同步热分析(TG-DSC)：差示扫描热量仪(DSC)显示共晶熔点为95.06℃；热重分析(TGA)显示在测试温度范围内观察到间硝基苯甲酸的分解与黄体酮的分解。
(3)傅里叶变换红外光谱(FT-IR)测试：主要红外吸收峰数据如下。
| 波数ν/cm<sup>-1</sup> | 透过率/％ |
| 2933.0 | 89.1 |
| 1714.3 | 88.0 |
| 1622.5 | 87.6 |
| 1526.6 | 89.6 |
| 1468.5 | 92.8 |
| 1431.5 | 92.6 |
| 1345.0 | 87.1 |
| 1292.9 | 90.1 |
| 1233.5 | 86.1 |
| 1144.2 | 91.2 |
| 1076.6 | 92.9 |
| 898.0 | 91.9 |
| 688.8 | 92.3 |
(4)核磁氢谱(1H-NMR)测试：化学位移数据为1H-NMR(400MHz,d6-DMSO)δ＝13.75(s,1H),8.63(d,1H),8.49(d,1H),8.34(d,1H),7.80(t,1H),5.63(s,1H),2.57-2.55(t,1H),2.42-2.33(m,2H),2.25-2.23(m,2H),2.18-2.14(m,6H),1.77-1.64(d,1H),1.61-1.52(m,5H),1.43-1.38(m,2H),1.18-1.14(m,5H),0.96-0.93(m,2H),0.57(S,3H).
(5)单晶X-射线衍射(SXRD)测试：从单晶结构解析结果可知，黄体酮-间硝基苯甲酸共晶分子比例为1:1，二者通过氢键相连。
(6)Stability实验结果表明：黄体酮-间硝基苯甲酸共晶在高温、高湿、光照条件下是稳定的。
(7)Solubility实验结果表明：形成共晶显著增加了黄体酮的水溶性。
(8)生物利用度测试：由黄体酮及共晶的药时曲线可知黄体酮达峰时间为1h，共晶达峰时间为1.5h，共晶Cmax为黄体酮的2.1倍。
3、黄体酮-对硝基苯甲酸共晶
(1)粉末X-射线衍射(PXRD)测试：吸收峰数据如下。
(2)同步热分析(TG-DSC)：差示扫描热量仪(DSC)显示共晶熔点为157.03℃；热重分析(TGA)显示在测试温度范围内观察到共晶的分解。
(3)傅里叶变换红外光谱(FT-IR)测试：主要红外吸收峰数据如下。
(4)核磁氢谱(1H-NMR)测试：化学位移数据为1H-NMR(400MHz,d6-DMSO)δ＝14.40-12.90(s,1H),8.34(d,2H),8.16(d,2H),5.63(s,1H),2.57-2.55(t,1H),2.42-2.33(m,2H),2.25-2.23(m,2H),2.18-2.14(m,6H),1.77-1.64(d,1H),1.61-1.52(m,5H),1.43-1.38(m,2H),1.18-1.14(m,5H),0.96-0.93(m,2H),0.57(S,3H).
(5)单晶X-射线衍射(SXRD)测试：从单晶结构解析结果可知，黄体酮-对硝基苯甲酸共晶分子比例为1:1，二者通过氢键相连。
(6)Stability实验结果表明：黄体酮-对硝基苯甲酸共晶在高温、高湿、光照条件下是稳定的。
(7)Solubility实验结果表明：形成共晶显著增加了黄体酮的水溶性。
(8)生物利用度测试：由黄体酮及共晶的药时曲线可知黄体酮达峰时间为1h，共晶达峰时间为1.5h，共晶Cmax为黄体酮的2.0倍。
Claims (8)
1.一种黄体酮共晶体，其特征在于，其由活性成分黄体酮和共晶形成物硝基苯甲酸形成，黄体酮与硝基苯甲酸之间通过氢键连接，所述硝基苯甲酸为邻硝基苯甲酸、间硝基苯甲酸或对硝基苯甲酸。
2.根据权利要求1所述的黄体酮共晶体，其特征在于，黄体酮与硝基苯甲酸的摩尔比为1:1。
3.根据权利要求1所述的黄体酮共晶体，其特征在于，黄体酮-邻硝基苯甲酸共晶属于正交晶系，空间群为P212121，晶胞参数为：
α＝90°，β＝90°，γ＝90°，Z＝4，晶胞体积为
黄体酮-间硝基苯甲酸共晶属于三斜晶系，空间群为P1，晶胞参数为：
α＝62.763(7)°，β＝86.884(6)°，γ＝77.261(6)°，Z＝2，晶胞体积为
黄体酮-对硝基苯甲酸共晶属于正交晶系，空间群为P212121，晶胞参数为：
α＝90°，β＝90°，γ＝90°，Z＝4，晶胞体积为
4.根据权利要求1所述的黄体酮共晶体，其特征在于，黄体酮-邻硝基苯甲酸以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图在4.1°、6.5°、9.2°、10.1°、10.4°、10.5°、21.7°、23.2°处具有特征峰，其中每个特征峰2θ的误差范围为±0.2°；黄体酮-间硝基苯甲酸以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图在3.5°、4.6°、5.7°、6.9°、8.4°、8.6°、12°、21°处具有特征峰，其中每个特征峰2θ的误差范围为±0.2°；黄体酮-对硝基苯甲酸以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图在2.2°、2.8°、3.4°、3.5°、5.4°、7.7°、9.1°、38.7°处具有特征峰，其中每个特征峰2θ的误差范围为±0.2°。
5.根据权利要求1所述的黄体酮共晶体，其特征在于，黄体酮-邻硝基苯甲酸的熔点为143.08±0.1℃；黄体酮-间硝基苯甲酸的熔点为95.06±0.1℃；黄体酮-邻硝基苯甲酸的熔点为157.03±0.1℃。
6.一种黄体酮共晶体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作为：将黄体酮、硝基苯甲酸、乙酸乙酯或甲醇置入球磨仪中球磨20-60分钟，得到的白色固体粉末即为黄体酮-硝基苯甲酸共晶；所述硝基苯甲酸为邻硝基苯甲酸、间硝基苯甲酸或对硝基苯甲酸。
7.一种黄体酮共晶体单晶的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作为：将黄体酮-硝基苯甲酸共晶粉末加入甲醇中溶解，溶剂挥发得到无色块状晶体，即为黄体酮-硝基苯甲酸共晶体的单晶。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的黄体酮共晶体以及药学上可接受的载体或助剂。
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