CN114606157A

CN114606157A - 双歧杆菌微生物制剂及其在开菲尔乳酒制备中的应用

Info

Publication number: CN114606157A
Application number: CN202210200531.XA
Authority: CN
Inventors: 邓小华; 任涛; 郑巧双; 郭荣
Original assignee: Wuhan Industrial Control Industrial Technology Institute Co ltd
Current assignee: Hubei Microindustry Biotechnology Research Co ltd
Priority date: 2022-03-01
Filing date: 2022-03-01
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-03-01
Also published as: CN114606157B

Abstract

本发明属于乳酒酿造技术领域，公开了一种双歧杆菌微生物制剂及其在开菲尔乳酒制备中的应用，所述双歧杆菌微生物制剂包括长双歧杆菌HB07，保藏编号为CCTCC NO:M 20211175；和/或两歧双歧杆菌HB029，保藏编号为CCTCCNO:M 20211176；该微生物制剂可用于制备开菲尔乳酒，其方法具体为：将果汁与牛乳混合，接入微生物制剂进行发酵得到发酵液；加入糖化液后再接入酵母菌进行酒精发酵，分离沉淀，取上清液进行后发酵处理；发酵结束后，沉淀过滤澄清即得。所得乳酒含有丰富的营养成分，且兼具酸奶香气与浓郁果香，同时口感丰富爽口、余香绵长。

Description

双歧杆菌微生物制剂及其在开菲尔乳酒制备中的应用

技术领域

本发明属于乳酒酿造技术领域，具体涉及一种双歧杆菌微生物制剂及其在开菲尔乳酒制备中的应用。

背景技术

开菲尔乳酒是最古老的发酵乳制品之一，起源于高加索山区，但是在其他许多国家也生产开菲尔，如中国。开菲尔乳酒是利用开菲尔粒发酵的、具有低酒精含量的风味酸奶，此类酸奶风味独特，乳白色，营养丰富。但是，现有的开菲尔乳酒有以下缺点：酒精度较低，不易保存；口感独特不易被大众所接受；开菲尔粒是由数种乳酸菌与酵母菌等微生物之间的共生作用而形成的特殊粒状结构，其菌种不明，有一定的安全风险；乳酒中糖含量高，而氨基酸等小分子含量较少。

双歧杆菌是一种广泛存在于人、动物的消化道等生境中严格厌氧的细菌属，是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一，其代谢产物对于肠道菌群平衡有非常重要的作用。目前，双歧杆菌菌种基本为严格厌氧菌，不耐氧且耐酸能力较弱，发酵酸奶能力较弱，纯双歧杆菌发酵酸奶菌种较少。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于筛选驯化得到耐氧、耐酸的双岐杆菌生物制剂，并以开菲尔乳酒为基本原则，采用该生物制剂制备得到了兼具功能性和营养性的乳酒，且该乳酒兼具酸奶香气与浓郁果香，同时口感丰富爽口、余香绵长，解决了现有开菲尔乳酒的口感、营养等问题。

本发明的技术方案具体如下：

本发明第一方面提供了一种双岐杆菌生物制剂，所述生物制剂包括：

长双歧杆菌HB07(Bifidobacterium longum HB07)，保藏编号为CCTCC NO:M20211175；和/或两歧双歧杆菌HB029(Bifidobacterium bifidum HB029)，保藏编号为CCTCC NO:M 20211176。

长双歧杆菌HB07和两歧双歧杆菌HB029的筛选驯化过程为：从1983年婴儿体内分离纯化出的数株双歧杆菌中，以牛乳为唯一培养基，经过300代以上的耐氧驯化和发酵驯化获得的高活力菌株。

本发明第二方面提供了上述双歧杆菌微生物制剂在食品中的应用，尤其在开菲尔乳酒制备中的应用。

优选地，制备开菲尔乳酒的过程具体如下：

S1.将果汁与牛乳混合，接入所述双歧杆菌微生物制剂进行发酵，得到发酵液；同时将淀粉基质糖化发酵制备成糖化液；

S2.按比例混合发酵液和糖化液，再接入酵母菌进行酒精发酵和陈酿处理；

S3.对步骤S2的最终发酵产物进行冷冻沉淀处理，过滤澄清即得。

更为优选地，所述牛乳为鲜牛乳、乳粉或乳清粉中的一种或多种。

更为优选地，所述果汁与牛乳的体积比为1:1～9；最佳地，果汁与牛乳的体积比为1:4。

更为优选地，果汁为水果进行压榨处理后，并加入果胶酶和二氧化硫所得的新鲜果汁；在具体的实施例中，果胶酶添加量可以为2～10ppm，二氧化硫添加量可以为0～50ppm，所用水果包括但并不限于橘子、鲜橙、葡萄、胡柚、草莓、荔枝、黄桃、蜜桃等水果中的一种或多种。

更为优选地，步骤S1中的糖化液由糯米经根霉菌发酵所得。

更为优选地，步骤S2中的发酵液与糖化液的体积比为100:20～50；最佳的，发酵液与糖化液的体积比为100:30。

更为优选地，步骤S2中，前发酵终点时的酸度为70～80T⁰，后发酵的时间为15～20d；在某一实施例中，前发酵终点时的酸度为70T⁰，后发酵的时间为15d。

更为优选地，步骤S3具体可以为：对发酵产物进行冷冻和热处理交替沉淀，并澄清后进行粗滤和膜过滤澄清，杀菌并封装。

本发明生物材料保藏信息如下：

保藏编号为CCTCC NO:M 20211175的长双歧杆菌HB07(Bifidobacterium longumHB07)于2021年9月15日在中国典型培养物保藏中心(地址：武汉市武汉大学)注册保藏。

保藏编号为CCTCC NO:M 20211176的两歧双歧杆菌HB029(Bifidobacteriumbifidum HB029)于2021年9月15日在中国典型培养物保藏中心(地址：武汉市武汉大学)注册保藏。

本发明的有益效果为：

本发明采用两阶段发酵工艺，先用特定的双歧杆菌预处理牛乳，充分分离释放牛奶营养物质，形成可被利用或人体易吸收的小分子营养物质，增加了牛乳利用率的同时也增加了乳酒的营养性；再用酵母菌充分利用牛奶中经双歧杆菌分解得到的半乳糖，进行生长和发酵，避免了部分人乳糖不耐受的可能，并充分利用了牛奶中的营养物质和糖类。发酵过程中添加了果汁和糯米糖化料液，经过酵母菌发酵和澄清处理后，获得了兼具酸奶香气与浓郁果香的乳酒。

本发明通过双歧杆菌和酵母菌两阶段发酵制备的乳酒含有多种人体易消化、吸收的蛋白质、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸，维生素B1、维生素B2、维生素B6，生物素、叶酸、有机酸等丰富的营养成分，能调节人体免疫机能、提高物质代谢、调整肠胃功能等，是一种理想的高端健康酒类饮品。

附图说明

图1为实施例1中不同双歧杆菌菌种凝乳能力对比图；

图2为实施例1中所得HB07菌种的驯化传代对比图；

图3为实施例2制备的乳酒与对比例1制备的乳酒的营养成分含量对比图；

图4为实施例5中糖化液添加量与乳酒酒精含量的关系图；

图5为实施例6中双歧杆菌发酵程度与乳酒营养成分的关系图；

图6为实施例7中酒精发酵时间与乳酒成分的关系图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1耐氧、耐酸、高活力双歧杆菌的筛选及驯化

使用1983年从婴儿体内分离纯化的30株双歧杆菌，将其依次编号为 HBB-01、HBB-02、HBB-03…HBB-30，对上述菌种分别进行了生化鉴定和表型鉴定，均为双歧杆菌属。

将上述菌种分别接入12％的脱脂牛奶中，于37℃培养，直至凝乳(约为24h)，取样镜检，将凝乳样品并取样20％接种量接种传代，经过20～30代传代筛选，选取凝乳最快的几个菌株作为驯化菌株，结果如图1所示：经过初步筛选，选择了编号为HBB-03、HBB-07、HBB-029三株菌种继续传代驯化工作。

将上述三株菌种继续进行耐氧和产酸筛选，随着凝乳时间的减少，逐渐减少接种量，并置于有氧条件下培养，最终传代超过300代以上，选择凝乳时间最快，且在凝乳结束后进行活菌检测，选择耐酸存活数量最多的菌种为目标菌。结果显示，有两株菌种均有较好的耐酸效果，分别记录为HB07和HB029，其中，编号为HB07的菌种驯化传代对比图如图2所示，其凝乳时间可缩短至5h。

对驯化得到的菌株进行16S rDNA测序鉴定，具体过程如下：

1)在BBL液体培养基中培养菌液2～3mL，然后用细菌基因组试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)提取基因组，测定浓度，-20℃保存。

2)以步骤1)提取的基因组为模板，扩增目标片段，扩增体系如表1所示，扩增程序为：94℃4min；94℃30s，48℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。

表1

其中，27F序列为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO.1)，1492R 序列为：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO.2)，扩增体系中，引物的实用浓度为10μM。

PCR扩增结束后，0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，并使用DNA胶回收试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)回收，回收DNA样品送武汉天一辉远测序。

3)根据测序结果，HB07菌种的16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示，HB029 菌种的16S rDNA序列如SEQ ID NO.4所示。

登陆NCBI Blast，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi中进行比对，根据比对结果可知，HB07菌种属于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，HB029菌种属于两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)。

实施例2开菲尔乳酒的制备

(1)将水果进行压榨处理，加入果胶酶和二氧化硫获得新鲜果汁，将新鲜果汁与牛乳按比例1:2混合形成发酵基本原料。

(2)双歧杆菌发酵：

将实施例1得到的长双歧杆菌HB07经一级种活化24h、二级牛奶培养基活化12h、三级种活化10h后接种于步骤(1)制备的发酵基本原料中，接种量优选为0.5％，发酵时间为3.5～4h，至发酵酸度为70T⁰。

另外，将糯米蒸熟、冷水冷却后，接种根霉菌于28℃环境糖化48h，获得糖化液。

(3)酵母菌酒精发酵

将双歧杆菌发酵液和糖化液混合均匀，本实施例中发酵液与糖化液的体积比为100:30，用于补充酒精发酵所需的糖分。

将酵母菌在PDA培养基活化后，接入PDY培养基进行一级种活化、二级种活化，在料液为培养基的三级培养基中活化培养12h，再接入发酵料液中进行酒精发酵。本实施例中，发酵初始pH 4.4，酵母菌接种量为0.1％，发酵时间为15d。

(4)发酵结束后，通过冷冻和热处理交替沉淀并澄清后，进行粗滤和膜过滤，杀菌并封装成为一种澄清黄绿色具有乳香果香、口感清爽的酒精度在 12～17％vol左右的新型乳酒。

对比例1

目前常规乳酒或奶酒等产品工艺除了勾兑配置奶酒外，发酵奶酒主要采用牛奶添加葡萄糖或者蔗糖并利用酵母或开菲尔粒进行发酵生产，且发酵完成后不对酒体沉淀物进行分离，酒体为乳白色浑浊酒体。本实施例的乳酒采用开菲尔粒进行发酵所得。

对实施例2和对比例1制备的乳酒进行了残糖量、口感、香气及营养物质进行了检测(检测方法参考《GB/T15038葡萄酒、果酒通用分析方法》以及《GB 5009.124-2016食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》)，结果如图3所示。从图3可知，本发明的发酵菌种和发酵工艺可以充分的利用糖类物质进行发酵，乳糖利用率高，含糖量低，蛋白物质的转化利用率高，各类氨基酸的含量有一定优势，香气浓郁饱满。

实施例3水果品种对乳酒的影响

参考实施例2的工艺过程，本实施例采用不同的水果果汁与牛乳混合作为发酵原料进行乳酒酿造，获得不同水果风味的乳酒，并对于香气、颜色、口味进行评价，具体如表2所示：

表2

实施例4水果汁与牛乳比例对乳酒的影响

参考实施例2的工艺过程，本实施例采用鲜榨橘子汁，其中，橘子汁的添加量为10～50％(即橘子汁体积占发酵原料总体积的比值)不等，其他同实施例2 一致。对乳酒的香气、颜色和口味进行评价，如表3所示：

表3

从表3可知，乳酒在果汁较少的情况下，发酵的口感柔和、具有香气甜味较少，后味微苦；经过与果汁发酵中和，通过甜味、酸味和涩味的增加，口感更丰富，从表中可看出20％～30％添加量的口感较为均衡。

实施例5糖化液的添加量对乳酒的影响

参考实施例2的工艺过程，本实施例中糖化液的添加量为发酵液体积的0％、10％、20％、30％或40％，其他同实施例2一致。对乳酒的香气、颜色和酒精度进行检测评价，如图4所示。

从图4看出，随着糖化液的增加，酒精度随之提高，对于乳酒的口感和香气都有提升作用，当糖含量超过酵母的耐受和转化能力之后，残糖以及发酵生长环境对于酒口感有所影响，因此，途中可以看出，20％～30％的添加结果较好，30％的酒精度相对较高一下，因此，选择30％添加为最佳组合。

实施例6双歧杆菌发酵程度对乳酒的影响

双歧杆菌发酵时间对乳酒的酵母发酵启动速度、乳酒营养物质含量等均有很多的影响。本实施例控制双歧杆菌发酵结束时的产酸程度依次为40T⁰、50T⁰、 60T⁰、70T⁰、80T⁰。其他同实施例2，对所得乳酒的进行检测，结果如图5所示。

控制发酵的终点酸度是控制双歧杆菌发酵的程度指标，发酵程度越高，表明双歧杆菌对乳糖和蛋白的分解利用程度，发酵的程度也会影响酒体的酸味口感，综合口感和氨基酸的含量等指标，从图5可知，酸度为60T⁰、70T⁰的发酵终点较好，从口感等综合考虑，70T⁰发酵终点为最佳。

实施例7酵母酒精发酵时间对乳酒的影响

不同的酵母发酵时间对开菲尔乳酒的口味、残糖以及香味口感均有较大的影响，本实施例采用了不同的发酵的时间，对所得乳酒进行检测评价，结果如图6 所示。

图6表明，通过15天发酵后，酒体内的糖、酸等物质均衡，口感香气达到了均衡协调的效果，酒体最佳。

实施例8双歧杆菌菌种比例对乳酒的影响

本实施例采用实施例1制备的两歧双歧杆菌、或长双歧杆菌与两双歧杆菌按 1:1比例，分别进行双歧杆菌发酵，其他同实施例2。对制备的乳酒进行检测，发现二者比例对发酵结果无明显影响。

实施例9乳酒对于睡眠和肠道改善的影响

通过征集并筛选出50名志愿者进行实验，随机分组两组，一组做实验组，一组做对比组，对照组和实验组中的男女比例均为1:1.08。

实验前半个月要求每组志愿者记录睡眠时间并对睡眠质量打分、同时记录食欲情况、腹胀腹痛情况、排便情况等。之后半个月给实验组按量发放实施例1制备的乳酒，规定每日睡前一小时内饮用50～100ml，每日记录睡眠时间，并对睡眠质量打分，同时记录食欲情况、腹胀腹痛情况、排便情况等。对比组发放 50～100ml同酒精度酒类，按照规定记录和打分。具体结果见表4～5，其中，表4 为实验组数据统计表，表5为对照组数据统计表。

表4

表5

注：睡眠质量评分根据个人对睡眠是否多梦、睡眠深浅和起床后精神状态进行自评分；食欲根据个人食欲自评分；腹痛腹胀等不适情况：25人每天发生该症状之人每人计1分，15天累计分数；排便情况：25人每天发生该症状之人每人计1分，15天累计分数；变化情况为变化数值/饮用前数值*100％。

从表4～5中可以看出，饮用本发明方案乳酒，对于睡眠时间和睡眠质量有一定改善，并且长期饮用对于肠道不会产生负担和副作用，有利于肠道菌群调节、改善肠道健康状况和胃肠功能。

综上所述，本发明采用特定的双歧杆菌配合两阶段发酵工艺，得到了营养丰富且安全健康的乳酒，且所得乳酒兼具酸奶香气与浓郁果香，口感易于被接受。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉工控工业技术研究院有限公司

<120> 双歧杆菌微生物制剂及其在开菲尔乳酒制备中的应用

<130> 2022.1.10

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1409

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌HB07

<400> 3

gcttaccatg caagtcgaac gggatccatc aagcttgctt ggtggtgaga gtggcgaacg 60

ggtgagtaat gcgtgaccga cctgccccat acaccggaat agctcctgga aacgggtggt 120

aatgccggat gttccagttg atcgcatggt cttctgggaa agctttcgcg gtatgggatg 180

gggtcgcgtc ctatcagctt gacggcgggg taacggccca ccgtggcttc gacgggtagc 240

cggcctgaga gggcgaccgg ccacattggg actgagatac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg 360

atggaggcct tcgggttgta aacctctttt atcggggagc aagcgagagt gagtttaccc 420

gttgaataag caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggtgcaagcg 480

ttatccggaa ttattgggcg taaagggctc gtaggcggtt cgtcgcgtcc ggtgtgaaag 540

tccatcgctt aacggtggat ccgcgccggg tacgggcggg cttgagtgcg gtaggggaga 600

ctggaattcc cggtgtaacg gtggaatgtg tagatatcgg gaagaacacc aatggcgaag 660

gcaggtctct gggccgttac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta 720

gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt ggatgctgga tgtggggccc gttccacggg 780

ttccgtgtcg gagctaacgc gttaagcatc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa 840

actcaaagaa attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgcggatta attcgatgca 900

acgcgaagaa ccttacctgg gcttgacatg ttcccgacgg tcgtagagat acggcttccc 960

ttcggggcgg gttcacaggt ggtgcatggt cgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1020

ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcgcc ccgtgttgcc agcggattat gccgggaact 1080

cacgggggac cgccggggtt aactcggagg aaggtgggga tgacgtcaga tcatcatgcc 1140

ccttacgtcc agggcttcac gcatgctaca atggccggta caacgggatg cgacgcggcg 1200

acgcggagcg gatccctgaa aaccggtctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc 1260

gtgaaggcgg agtcgctagt aatcgcgaat cagcaacgtc gcggtgaatg cgttcccggg 1320

ccttgtacac accgcccgtc aagtcatgaa agtgggcagc acccgaagcc ggtggcctaa 1380

ccccttgtgg gatggagccg tctaagtag 1409

<210> 4

<211> 1413

<212> DNA

<213> 两歧双歧杆菌HB029

<400> 4

tgcttaccat gcagtcgaac gggatccatc gggctttgct tggtggtgag agtggcgaac 60

gggtgagtaa tgcgtgaccg acctgcccca tgctccggaa tagctcctgg aaacgggtgg 120

taatgccgga tgttccacat gatcgcatgt gattgtggga aagatttcat cggcgtggga 180

tggggtcgcg tcctatcagc ttgttggtga ggtaacggct caccaaggct tcgacgggta 240

gccggcctga gagggcgacc ggccacattg ggactgagat acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagcgac gccgcgtgag 360

ggatggaggc cttcgggttg taaacctctt ttgtttggga gcaagccttc gggtgagtgt 420

acctttcgaa taagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgca 480

agcgttatcc ggatttattg ggcgtaaagg gctcgtaggc ggctcgtcgc gtccggtgtg 540

aaagtccatc gcttaacggt ggatctgcgc cgggtacggg cgggctggag tgcggtaggg 600

gagactggaa ttcccggtgt aacggtggaa tgtgtagata tcgggaagaa caccgatggc 660

gaaggcaggt ctctgggccg tcactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg 720

attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cggtggacgc tggatgtggg gcacgttcca 780

cgtgttccgt gtcggagcta acgcgttaag cgtcccgcct ggggagtacg gccgcaaggc 840

taaaactcaa agaaattgac gggggcccgc acaagcggcg gagcatgcgg attaattcga 900

tgcaacgcga agaaccttac ctgggcttga catgttcccg acgacgccag agatggcgtt 960

tcccttcggg gcgggttcac aggtggtgca tggtcgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020

tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct cgccccgtgt tgccagcacg ttatggtggg 1080

aactcacggg ggaccgccgg ggttaactcg gaggaaggtg gggatgacgt cagatcatca 1140

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ctccgtgaag gcggagtcgc tagtaatcgc ggatcagcaa cgccgcggtg aatgcgttcc 1320

cgggccttgt acacaccgcc cgtcaagtca tgaaagtggg cagcacccga agccggtggc 1380

ctaacccctt gtgggatgga gccgtctaag tag 1413

Claims

1.一种双歧杆菌微生物制剂，其特征在于，所述双歧杆菌微生物制剂包括长双歧杆菌HB07，保藏编号为CCTCC NO:M 20211175；和/或两歧双歧杆菌HB029，保藏编号为CCTCC NO:M 20211176。

2.如权利要求1所述双歧杆菌微生物制剂在食品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述双歧杆菌微生物制剂在制备开菲尔乳酒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，制备所述开菲尔乳酒的过程具体为：

S1.将果汁与牛乳混合，接入所述双歧杆菌微生物制剂进行发酵得到发酵液；并将淀粉基质糖化发酵制备成糖化液；

S2.将发酵液与糖化液混合，接入酵母菌进行酒精发酵；

S3.对步骤S2的发酵产物进行冷冻沉淀处理，过滤澄清即得。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述牛乳为鲜牛乳、乳粉或乳清粉中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述果汁与所述牛乳的体积比为1:1～9。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述果汁为水果进行压榨处理后，并加入果胶酶和二氧化硫所得的新鲜果汁；所述水果为橘子、鲜橙、葡萄、胡柚、草莓、荔枝、黄桃、蜜桃中的一种或多种。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述糖化液由糯米经根霉菌发酵所得。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵液与所述糖化液的体积比为100:20～50。

10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤S1所述发酵液的酸度为60～80T°；步骤S2所述酒精发酵的时间为15～20d。