CN114578063A - 一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF-α的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医疗检测技术领域,具体涉及一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF‑α的方法,包括如下步骤:S1、样品处理;S2、ELISA检测。本发明只需要少量的血清样品,便可以对疾病进行更加便捷的检测,其检测方案中线性、重复性、准确度、区间精密度等检测结果均满足适用血清样本TNF‑α的测定,并且操作简单、检测速度快、可定量检测和大批量检测,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗检测技术领域,具体涉及一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF-α的方法。
背景技术
TNF-α(肿瘤坏死因子α),是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子,是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一。
ELISA检测原理包括向载体酶标板孔中加入捕获抗体,捕获抗体包被在该载体上,形成固相抗体,保持其免疫活性;然后向酶标板孔中加入样品,样品中待检测蛋白与固相抗体特异性结合,形成固相抗原复合物,洗涤除去杂质;再向酶标板孔中加入带有生物素的检测抗体,检测抗体与固相抗原复合物结合;最后向酶标板孔中加入带有亲和素的辣根过氧化酶。再加入底物后,底物被酶催化变为有色产物,有色产物的量与样品中待检测蛋白的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅进行定量分析。
目前市面上存在许多人TNF-α的ELISA检测试剂盒,原理基本一致,通过抗原抗体反应联合TMB显色来检测TNF-α。但这些试剂盒在TNF-α存在标准品稀释浓度偏低,无细胞共培养材料、使用不便等不足之处。
发明内容
针对上述不足,本发明的目的是提供一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子 TNF-α的方法。
本发明提供了如下的技术方案:
一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF-α的方法,包括如下步骤:
S1、样品处理:
血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分);
S2、ELISA检测:
S21、标准品的加样:设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50ul;
S22、加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔,在酶标包被板上待测样品孔中加样品50ul;
S23、加酶:每孔加入酶标试剂100ul,空白孔除外;
S24、温育:用封板膜封板后置37℃温育60分钟;
S25、配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用;
S26、洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔洗涤液(250ul左右),静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干;
S27、显色:每孔先加入显色剂A 50ul,再加入显色剂B 50ul,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟;
S28、终止:每孔加终止液50ul,终止反应(此时蓝色立转黄色);
S29、测定:450nm波长依序测量各孔的吸光度OD值;
S210、计算:以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘出标准曲线,计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
优选地,所述S1样品处理步骤中,收集的上清保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
优选地,所述S22加样步骤中,加样时将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
优选地,所述所述S29测定步骤中,测定应在加终止液后15分钟以内进行。
优选地,所述S1、S2步骤完成后,具体的验证方法分别为:
(1)线性:分别取不同浓度的标准品溶液,按照S2中方法进行检测,分别做3个平行,记录各孔OD值,作标准曲线,并给出标准曲线线性方程及相关系数;
(2)重复性:取来源于3个志愿者的血清,按照S2中的方法进行TNF- α检测,各做6个平行,进行显色后,记录各孔OD值,代入标准曲线计算TNF- α含量及RSD值;
(3)准确度:选择一份血清样品,分别加入浓度为40pg/ml、20pg/ml、 10pg/ml的标准品溶液进行2倍稀释制备加标样品,按照S2中的方法进行检测,分别做3个平行,记录各孔OD值,根据标准曲线计算TNF-α含量,计算回收率重复三次试验;
(4)区间精密度:由两名不同实验人员各自独立操作,按照S2中的方法对来源于3个志愿者的血清进行检测,分别做6个平行,酶标仪读取OD值后,计算样品浓度,求出平均值,并计算所得结果含量的RSD值。
本发明的有益效果是:
1、本发明只需要少量的血清样品,便可以对疾病进行更加便捷的检测;
2、本方法的检测方案中线性、重复性、准确度、区间精密度等检测结果均满足适用血清样本TNF-α的含量测定;
3、本发明操作简单、检测速度快、可定量检测和大批量检测,具有良好的应用前景。
附图说明
图1-3是本发明的OD值与TNF-α浓度三次独立试验标准曲线图。
具体实施方式
方法原理:本法应用双抗体夹心法测定标本中人TNF-α水平。用纯化的人 TNF-α捕获得到的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被的微孔中依次加入含人TNF-α的样品,再与HRP标记的检测抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子(TNF-α)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。
具体的实验过程如下:
1、仪器设备:酶标仪,培养箱(37℃),离心机;
2、试剂与材料:肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(上海酶联生物技术有限公司),含包被板、标准品、酶标试剂、样品稀释液、显色剂、终止液和洗涤液,蒸馏水、1.5ml EP管,多道微量移液器,单通道移液器(2ul、20ul、200ul、1ml),微量移液器吸头(无菌,无致热源),加样槽,烧杯,量筒。
3、检测方法
3.1样品处理
血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/ 分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
3.2 ELISA检测
3.2.1标准品的加样:设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50ul。
3.2.2加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中加样品50ul。加样时将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3.2.3加酶:每孔加入酶标试剂100ul,空白孔除外。
3.2.4温育:用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
3.2.5配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
3.2.6洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔洗涤液(250ul左右),静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
3.2.7显色:每孔先加入显色剂A 50ul,再加入显色剂B 50ul,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟。
3.2.8终止:每孔加终止液50ul,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
3.2.9测定:450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
3.2.10计算:以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘出标准曲线,计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
4、方法验证
4.1线性
分别取不同浓度的标准品溶液,按照3.2中方法进行检测,分别做3个平行。记录各孔OD值,作标准曲线,并给出标准曲线线性方程及相关系数。相关系数应大于0.95。
4.2重复性
取来源于3个志愿者的血清,按照3.2中方法进行TNF-α含量检测,各做 6个平行。进行显色后,记录各孔OD值,代入标准曲线计算TNF-α含量及 RSD值。
4.3准确度
选择一份血清样品,分别加入浓度为40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml的标准品溶液进行2倍稀释制备加标样品。按照3.2中方法进行检测,分别做3个平行。记录各孔OD值,根据标准曲线计算TNF-α含量,计算回收率重复三次试验。
4.4区间精密度
由两名不同实验人员各自独立操作,按照3.2中方法对来源于3个志愿者的血清进行检测,分别做6个平行,酶标仪读取OD值后,计算样品浓度,求出平均值,并计算所得结果含量的RSD值。
5、验证结果
5.1线性
分别取浓度为2.5pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的 TNF-α标准品溶液,按照3.2中方法进行检测,分别做3个平行。记录各孔OD 值,作标准曲线,结果表明TNF-α在浓度范围为2.5pg/ml-80pg/ml的范围内, OD值与TNF-α浓度呈现良好的回归关系,三次独立试验标准曲线及回归系数如图1-3。由图1-3可以看出三次试验相关系数均大于0.95,符合要求。
5.2重复性
取来源于3个志愿者的血清,按照3.2中方法进行TNF-α含量检测,各做 6个平行。进行显色后,记录各孔OD值,代入标准曲线计算TNF-α含量及 RSD值。结果如下:
由上表可看出,三个样本TNF-α含量测定结果RSD均在15%以内,重复性良好。
5.3准确度
选择一份血清样品,分别加入浓度为40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml的标准品溶液进行2倍稀释制备加标样品。按照3.2中方法进行检测,分别做3个平行。记录各孔OD值,根据标准曲线计算TNF-α含量,计算回收率。结果如下:
由上表可看出,高中低三个浓度加标回收率均处于70%-130%之间,符合要求。
5.4区间精密度
取来源于3个志愿者的血清,由本实验室两名不同的实验人员A与B分别独立操作,各检测六次。计算各样本的TNF-α含量及RSD。
由上表可看出两个不同人员分别测定三个样本TNF-α含量,结果RSD均在15%以内,区间精密度良好。
6、结论
本验证方案对该方法的线性、重复性、准确度区间精密度等方面进行了考察,结果表明该方法适于血清样本TNF-α含量测定。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF-α的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、样品处理:
血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分);
S2、ELISA检测:
S21、标准品的加样:设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50ul;
S22、加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔,在酶标包被板上待测样品孔中加样品50ul;
S23、加酶:每孔加入酶标试剂100ul,空白孔除外;
S24、温育:用封板膜封板后置37℃温育60分钟;
S25、配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用;
S26、洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔洗涤液(250ul左右),静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干;
S27、显色:每孔先加入显色剂A 50ul,再加入显色剂B 50ul,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟;
S28、终止:每孔加终止液50ul,终止反应(此时蓝色立转黄色);
S29、测定:450nm波长依序测量各孔的吸光度OD值;
S210、计算:以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘出标准曲线,计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
2.根据权利要求1所述的一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF-α的方法,其特征在于,所述S1样品处理步骤中,收集的上清保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
3.根据权利要求1所述的一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF-α的方法,其特征在于,所述S22加样步骤中,加样时将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
4.根据权利要求1所述的一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF-α的方法,其特征在于,所述S29测定步骤中,测定应在加终止液后15分钟以内进行。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF-α的方法,其特征在于,所述S1、S2步骤完成后,具体的验证方法分别为:
(1)线性:分别取不同浓度的标准品溶液,按照S2中方法进行检测,分别做3个平行,记录各孔OD值,作标准曲线,并给出标准曲线线性方程及相关系数;
(2)重复性:取来源于3个志愿者的血清,按照S2中的方法进行TNF-α检测,各做6个平行,进行显色后,记录各孔OD值,代入标准曲线计算TNF-α含量及RSD值;
(3)准确度:选择一份血清样品,分别加入浓度为40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml的标准品溶液进行2倍稀释制备加标样品,按照S2中的方法进行检测,分别做3个平行,记录各孔OD值,根据标准曲线计算TNF-α含量,计算回收率重复三次试验;
(4)区间精密度:由两名不同实验人员各自独立操作,按照S2中的方法对来源于3个志愿者的血清进行检测,分别做6个平行,酶标仪读取OD值后,计算样品浓度,求出平均值,并计算所得结果含量的RSD值。
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