CN114569641A - 缓解急性酒精性肝损伤的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药制备技术领域，具体涉及一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物及其制备方法和应用。包括：活性多糖、天然活性化合物和益生菌,活性多糖、益生菌和天然活性化合物的质量比为3‑21:0.04‑4:0.003‑3。本发明通过简单的、活性追踪的方法获得天然活性小分子、麒麟菜多糖、枸杞多糖、山楂多糖最优抗酒精性肝损伤活性成分，然后将其优化组合并复配具有抗酒精性肝损伤活性的嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌冻干菌粉，将这种活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物用于治疗酒精导致的急性肝损伤有非常显著的活性，且无副作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药制备技术领域，具体涉及一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物及其制备方法和应用。
背景技术
酒精主要在肝脏进行代谢，因此长期大量饮酒会严重损伤肝脏。酒精进入肝脏后，先被氧化为乙醛，再氧化为乙酸，最后转变为二氧化碳和水排出体外。而乙醛对肝细胞具有明显的毒害作用，而导致肝细胞变性、坏死及纤维化。随着酒精性肝损伤的发病率逐渐增加，病毒性肝炎、肝硬化甚至是肝癌等肝脏疾病随之增加。其中，一次性大量饮酒会造成急性酒精性肝损伤。
研究表明，中药复方制剂对肝脏具有较好的保护作用，可以提升肝脏抗酒精的损伤的能力。中药有着“标本兼治”的优势，尤其在改善肝功能方面，具有抗氧化以及抗凋亡活性的作用。
引用中药天然产物进行酒精性肝损伤的治疗，也是开发保肝、护肝功能食品、药品的重要方法。因此，研究中药成分的缓解急性酒精性肝损伤的组合物很有必要。
发明内容
本发明的目的是要提供一种采用中医药、副作用小、疗效独特的缓解急性酒精性肝损伤的组合物及其制备方法和应用。
为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其包括：活性多糖、天然活性化合物和益生菌,活性多糖、益生菌和天然活性化合物的质量比为3-21:0.04-4:0.003-3。
上述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其所述活性多糖包括麒麟菜活性多糖、枸杞活性多糖、山楂活性多糖,所述麒麟菜活性多糖、枸杞活性多糖、山楂活性多糖分别为麒麟菜多糖、枸杞多糖、山楂多糖通过不同孔径透析膜分离，低温冻干制得。
上述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其所述活性多糖的分子量小于15KD。
上述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其所述天然活性化合物为从菠萝中分离得到的活性酚类化合物，包括结构式为
的菠萝多酚-1，结构式为
的菠萝多酚-2，结构式为
的菠萝多酚-3。
上述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其所述天然活性化合物的分子量小于15KD。
上述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其所述益生菌包括嗜热链球菌冻干粉、嗜酸乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、干酪乳杆菌冻干粉。
一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物的制备方法，其包括：
(1)活性多糖的制备
将植物多糖溶解于10-15倍的纯净水中，植物多糖溶液依次用孔径1kD、3kD、5kD、10kD或15kD的透析袋进行透析，分别收集透析液，冻干得到活性多糖；
(2)天然活性化合物的制备
将新鲜菠萝粉碎，加50-100倍的纯净水，5000g离心10分钟，取上清液，将上清液减压浓缩，得到浸膏，将浸膏加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位以及水部位；将乙酸乙酯部位采用200-300目的硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，获得若干馏分，将具有保护活性的馏分经制备型甲醇-乙酸水系统HPLC得到所述的菠萝多酚-1、菠萝多酚-2、菠萝多酚-3；
(3)活性益生菌筛选制备
筛选嗜热链球菌冻干粉、嗜酸乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、干酪乳杆菌冻干粉备用；
(4)按配方比例称取各组分，活性多糖、益生菌和天然活性化合物的质量比为3-21:0.04-4:0.003-3，将步骤(1)至(3)制备好的各活性组分及益生菌进行混合均匀，制得缓解急性酒精性肝损伤的组合物。
上述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物的制备方法，其所述活性多糖包括分子量1-3kD的麒麟菜活性多糖、分子量3-5kD的枸杞活性多糖、分子量1-3kD的山楂活性多糖，所述麒麟菜活性多糖与枸杞活性多糖、山楂活性多糖、嗜热链球菌冻干粉、嗜酸乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、干酪乳杆菌冻干粉、菠萝多酚-1、菠萝多酚-2、菠萝多酚-3的质量比为1：1-10：1-10：0.01-1：0.01-1：0.01-1：0.01-1：0.001-1：0.001-1：0.001-1。
上述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物的制备方法，其所述麒麟菜活性多糖与枸杞活性多糖、山楂活性多糖、嗜热链球菌冻干粉、嗜酸乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、干酪乳杆菌冻干粉、菠萝多酚-1、菠萝多酚-2、菠萝多酚-3的质量比为1：5：5：0.05：0.05：0.05：0.05：0.005：0.005：0.005。
一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物的应用，其所述缓解急性酒精性肝损伤的组合物添加辅料，制备抗乙醇、药物所致的肝损伤的食物、功能性食品、药物。
有益效果：
本发明通过简单的、活性追踪的方法获得天然活性小分子、麒麟菜多糖、枸杞多糖、山楂多糖最优抗酒精性肝损伤活性成分，然后将其优化组合并复配具有抗酒精性肝损伤活性的嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌冻干菌粉，将这种活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物用于治疗酒精导致的急性肝损伤有非常显著的活性，且无副作用。
说明书附图
图1为本发明菠萝多酚-1的HR-ESI-MS图
图2为本发明菠萝多酚-1的1H NMR谱
图3为本发明菠萝多酚-1的13C NMR谱
图4为本发明菠萝多酚-1DEPT-135谱
图5为本发明菠萝多酚-1 1H-1H COSY谱
图6为本发明菠萝多酚-1 C-2″′,C-3″′HMBC谱
图7为本发明菠萝多酚-1 C-3′HMBC谱
图8为本发明菠萝多酚-2 HR-ESI-MS图
图9为本发明菠萝多酚-2 1H NMR谱
图10为本发明菠萝多酚-2 13C NMR谱
图11为本发明菠萝多酚-2 DEPT-135谱
图12为本发明菠萝多酚-3的HR-ESI-MS图
图13为本发明菠萝多酚-3的1H NMR谱
图14为本发明菠萝多酚-3的13C NMR谱
图15为本发明菠萝多酚-3的DEPT-135谱
图16为本发明菠萝多酚-3的HMBC谱
图17为本发明菠萝多酚-3的1H-1H COSY谱
图18为本发明菠萝多酚-3的HMBC谱
图19为本发明对乙醇所致急性肝损伤小鼠肝组织中TLR2、TLR4及MyD88蛋白表达影响
图20为本发明对乙醇所致急性肝损伤小鼠肝组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9蛋白表达影响
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的缓解急性酒精性肝损伤的组合物，包括：活性多糖、天然活性化合物和益生菌,活性多糖包括麒麟菜活性多糖、枸杞活性多糖、山楂活性多糖,所述麒麟菜活性多糖、枸杞活性多糖、山楂活性多糖分别为麒麟菜多糖、枸杞多糖、山楂多糖通过不同孔径透析膜分离，低温冻干制得。天然活性化合物为从菠萝中分离得到的活性酚类化合物，包括结构式为
的菠萝多酚-1，结构式为
的菠萝多酚-2，结构式为
的菠萝多酚-3。益生菌包括嗜热链球菌冻干粉、嗜酸乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、干酪乳杆菌冻干粉。
本实施例的制备步骤包括：
(1)麒麟菜活性多糖的制备
将麒麟菜多糖100g溶解于1200g纯净水中，麒麟菜多糖溶液用孔径为3kD的透析袋进行透析，收集透析液，冻干得到分子量为1-3kD的麒麟菜活性多糖。
(2)枸杞活性多糖的制备
将枸杞多糖100g溶解于1000g纯净水中，枸杞多糖溶液用孔径为5kD的透析袋进行透析，收集透析液，冻干得到分子量3-5kD的枸杞活性多糖。
(3)山楂活性多糖的制备
将山楂多糖100g溶解于1500g纯净水中，山楂多糖溶液用孔径为3kD的透析袋进行透析，收集透析液，冻干得到分子量1-3kD的山楂活性多糖。
(4)天然活性化合物的制备
新鲜菠萝2kg，粉碎，加水2L，5000g离心10分钟，取上清液液，减压浓缩，得到浸膏100g。浸膏加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚部位10g、乙酸乙酯部位64g以及水部位。将具有最佳保护活性的乙酸乙酯部位采用200-300目的硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯系统(100:0→0:100)梯度洗脱，获得10个馏分(Fr.1-10)。将具有最佳保护活性的Fr.7经制备型甲醇-乙酸水系统HPLC得到含量最多的组分，并最终鉴定为菠萝多酚-1(786.4mg)、菠萝多酚-2(718.9mg)、菠萝多酚-3(1020.5mg)。
菠萝多酚-1：黄色油状物，薄层层析后，香草醛-浓硫酸加热反应显红色。参照图1，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 341.1729[M+Na]+(C19H26O4Na,理论计算值:341.1723)，确定分子式为C19H26O4，不饱和度为7。
参照图2，化合物菠萝多酚-1的1H NMR(300MHz,MeOD)谱中共显示24个质子信号。δH13.74(1H,s)提示有1个苯环上的羟基氢信号；δH 5.19(1H,t,J＝6.6Hz),5.87(1H,d,J＝10.8Hz),5.69(1H,dd,J＝10.8,9.9Hz)提示分子中有3个烯烃质子信号；δH 3.30(2H,d,J＝6.6Hz)为1个连氧次甲基氢信号；δH 2.21(1H,m)为1个连氧次甲基氢信号；δH 3.72(3H,s),2.66(3H,s),1.76(3H,s),1.66(3H,s),0.92(6H,d,J＝6.6Hz)提示该化合物还有6个甲基质子信号，其中δH 3.72(3H,s),2.66(3H,s)为2个连氧甲基信号。
参照图3、图4，化合物菠萝多酚-1的13C NMR(75MHz,MeOD)谱中共出现19个碳信号，结合DEPT-135谱可知其分别为8个季碳、4个次甲基、1个亚甲基和6个甲基。低场区可见δC204.9的1个酮羰基信号；δC 132.0,124.6和δC 146.2,117.1为2对双键碳信号；δC 162.1,161.7,161.3,115.5,109.9,109.3可推测为苯环的碳信号。根据以上数据，推测化合物菠萝多酚-1可能是2′,4′,6′-三羟基苯乙酮类衍生物。
参照图5，在1H-1H COSY谱中，H-2″′(δH 5.69)与H-1″′(δH 5.87),H-3″′(δH 2.21)有相关，同时H-3″′(δH 2.21)与H-4″′/5″′(δH 0.92)有相关，可以推测此化合物中存在3-甲基-1-丁烯基团。
参照图6、图7，在HMBC谱中，H-1″′(δH 5.87)和H-4″′/5″′(δH 0.92)皆与C-2″′(δC146.2),C-3″′(δC 30.0)有相关，可进一步证实此结构中存在一个3-甲基-1-丁烯片段。同时，在HMBC谱中可观察到H-2″′(δH 5.69)与C-3′(δC 109.9)有相关，证明该结构片段在苯环上的连接位置是C-3′位。
综合以上数据，证实了苯环上的取代基团的结构，从而推断出该化合物结构如式I所示。结合1D和2D NMR谱信息，对菠萝多酚-1进行了全归属，如表1。
表1菠萝多酚-1 1D and 2D NMR数据(MeOD,δppm)
综合以上的结构解析，鉴定化合物的结构式为
命名为菠萝多酚-1。
菠萝多酚-2：
黄色油状物，薄层层析后，香草醛-浓硫酸加热反应显红色。参照图8，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 319.1904[M+H]+(C19H27O4,理论计算值:319.1904)确定分子式为C19H26O4，不饱和度为6。
参照图9，菠萝多酚-2的1H NMR(400MHz,CDCl3)图谱中共显示26个质子信号。δH13.56(1H,s),6.31(1H,s)提示该化合物中有2个苯环上的羟基氢信号；此外，该化合物还有2个烯烃质子信号[δH 5.22(1H,overlapped),5.21(1H,overlapped)]；2个亚甲基质子信号[δH 3.36(2H,overlapped),3.33(2H,overlapped)]；以及6个甲基单峰质子信号[δH 3.70(3H,s),2.67(3H,s),1.80(6H,s),1.74(3H,s),1.72(3H,s)]，其中δH 3.70(3H,s),2.67(3H,s)是2个连氧甲基质子信号。
参照图10，菠萝多酚-2的13C NMR(100MHz,CDCl3)谱中共出现19个碳信号，结合图11，DEPT-135谱可知其分别为9个季碳、2个次甲基、2个亚甲基和6个甲基。低场区可见δC203.6的1个酮羰基信号；δC 122.4,134.5和δC 121.8,134.3为2对双键碳信号；δC 161.7,160.7,159.3,112.8,111.1,109.1可推测为苯环的碳信号。根据以上数据，推测化合物菠萝多酚-2可能是酰基间苯三酚类化合物。
表2菠萝多酚-2 1D and 2D NMR数据(CDCl3,δppm)
综合表2的结构解析，鉴定化合物的结构式为
命名为菠萝多酚-2。
菠萝多酚-3：黄色油状物，薄层层析后，香草醛-浓硫酸加热反应显红色。参照图12，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 319.1904[M+H]+(C19H27O4,理论计算值:319.1904)，确定分子式为C19H26O4，不饱和度为7。
参照图13，菠萝多酚-3的1H NMR(300MHz,MeOD)谱中共显示24个质子信号。δH 6.36(1H,overlapped),6.35(1H,overlapped),5.21(1H,t,J＝6.7Hz)提示结构中有3个烯烃质子信号。δH 3.34(2H,d,J＝6.7Hz)为1个连氧亚甲基氢信号；δH 2.47(1H,m)为1个连氧次甲基氢信号；δH 3.73(3H,s),2.69(3H,s),1.80(3H,s),1.71(3H,s),1.12(6H,d,J＝6.7Hz)提示该化合物还有6个甲基质子信号，其中δH 3.73(3H,s),2.69(3H,s)为连氧甲基信号。
参照图14，菠萝多酚-3的13C NMR(75MHz,MeOD)谱中共出现19个碳信号，结合图15，DEPT-135谱可知其分别为8个季碳、4个次甲基、1个亚甲基和6个甲基。低场区可见δC 205.7的1个酮羰基信号；δC 132.5,124.4和δC 143.8,117.8为2对双键碳信号；δC 162.8,161.3,161.1,115.7,111.1,109.6可推测为苯环的碳信号。根据以上数据，推测化合物菠萝多酚-3可能是酰基间苯三酚类化合物。
参照图16，在HMBC谱中，H-2″(δH 6.35)与C-3″(δC 33.9),C-4″/5″(δC 23.0)有相关，结合图17，1H-1H COSY数据，H-3″(δH 2.47)与H-2″(δH 6.35),H-4″/5″(δH 1.12)有相关，可证实此结构中存在一个3-甲基-1-丁烯片段。
参照图18，在HMBC谱中可观察到H-1″(δH 6.36)与C-4′(δC 162.8),C-5′(δC111.1),C-6′(δC 161.1)有相关，证明该结构片段在苯环上的连接位置是C-5′位。
综合以上数据，证实了苯环上的取代基团的结构，从而推断出该化合物结构。结合表31D和2D NMR谱信息，对菠萝多酚-3进行了全归属。
综合以上的结构解析，鉴定化合物的结构式
命名为菠萝多酚-3。
表3菠萝多酚-3 1D and 2D NMR数据(CDCl3,δppm)
(5)活性益生菌筛选制备
基于构建的急性酒精性肝损伤小鼠模型，筛选不同益生菌，包括活菌、灭活菌及菌体裂解物的保护活性。结果选用嗜热链球菌冻干粉、嗜酸乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、干酪乳杆菌冻干粉备用。
(6)活性多糖、天然活性化合物及益生菌组合物具体配方如下：
1-3kD的麒麟菜活性多糖与3-5kD的枸杞活性多糖，1-3kD的山楂活性多糖，嗜热链球菌冻干粉，嗜酸乳杆菌冻干粉，植物乳杆菌冻干粉，干酪乳杆菌冻干粉，菠萝多酚-1，菠萝多酚-2，菠萝多酚-3的质量比为1：5：5：0.05：0.05：0.05：0.05：0.005：0.005：0.005。
配方：1-3kD的麒麟菜活性多糖1g，3-5kD的枸杞活性多糖5g，1-3kD的山楂活性多糖5g，嗜热链球菌冻干粉0.05g，嗜酸乳杆菌冻干粉0.05g，植物乳杆菌冻干粉0.05g，干酪乳杆菌冻干粉0.05g，菠萝多酚-1 0.005g，菠萝多酚-2 0.005g，菠萝多酚-3 0.005g。
将制备好的各种活性组分及益生菌按照上述配方比进行混合均匀，制得缓解急性酒精性肝损伤的组合物。
效果实施例
为了评估本发明的效果，进行如下效果实施例。
取小鼠48只，雌雄各24只，随机分为6组，每组8只，分别为正常组、酒精组、天然活性小分子组(由等质量的菠萝多酚-1，菠萝多酚-2，菠萝多酚-3组成)、活性多糖组(由等质量的分子大小在1-3kD之间的麒麟菜多糖，分子大小在3-5kD之间的枸杞多糖，分子大小在1-3kD之间的山楂多糖组成)、益生菌组(由等质量的嗜热链球菌冻干粉，嗜酸乳杆菌冻干粉，植物乳杆菌冻干粉，干酪乳杆菌冻干粉组成)、活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物组。实验进行如下，除正常组、酒精组、天然活性小分子组、活性多糖组、益生菌组、活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物组小鼠每天灌胃白酒(酒精:水-v:v-53:47)8mL/kg(约3.5g/kg)一次，灌胃白酒前3h灌胃相应药物(10mg/kg/d)或等容积蒸馏水，灌胃体积均为0.2mL/10g。于造模第9天禁食12h，第10天给予白酒后4h，断头取血，同时立即取肝脏，用冰冷的生理盐水冲尽残血，滤纸拭干。称取剩余部分肝脏0.4g，加入4.0mL生理盐水制成10％肝匀浆，按试剂盒说明书方法测定肝匀浆内SOD、MDA、GSH-PX及NO含量及Western blotting检测小鼠肝组织Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3及TLR4、TLR2、My D88的表达。分离血清，按试剂盒说明书方法测定血清中ALT、AST及SOD、MDA、GSH-PX、NO、IL-6，IL-1β及TNF-α、TC、TG和LDL-C含量。
结果如下：
表4活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物对乙醇所致急性肝损伤小鼠模型肝脏中SOD、MDA、GSH-PX及NO的影响
由表4可看出，与空白对照组相比，酒精组SOD、GSH-PX含量(活性)显著下降，而MDA、NO含量(活性)显著升高，说明饮酒导致小鼠肝脏受到严重的氧化损伤、炎性损伤。而通过活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物治疗，与酒精模型组相比，活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物治疗组SOD、GSH-PX含量(活性)显著增加，MDA、NO含量(活性)显著降低。且活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物治疗活性比单独使用活性多糖或天然活性小分子或益生菌，其治疗效果更佳。
表5活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物对乙醇所致急性肝损伤小鼠模型血清中ALT、ALP、AST及SOD、MDA、GSH-PX及NO的影响
由表5可看出，与空白对照组相比，酒精组SOD、GSH-PX含量(活性)显著下降，而MDA、NO、AST、ALT及ALP含量(活性)显著升高，说明酒精导致小鼠受到严重的氧化损伤及炎性损伤。而通过活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物治疗，与酒精组相比，活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物治疗组SOD、GSH-PX含量(活性)显著增加，MDA、NO、AST、ALT及ALP含量(活性)显著降低。且活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物的保护活性比单独使用活性多糖或天然活性小分子或益生菌治疗效果更好。
表6活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物对乙醇所致急性肝损伤小鼠模型血清中IL-6，IL-1β及TNF-α的影响
由表6可看出，与空白对照组相比，酒精组IL-6，IL-1β及TNF-α含量显著升高，说明酒精导致小鼠受到严重的炎性损伤。而通过活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物治疗，与酒精组相比，活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物治疗组IL-6，IL-1β及TNF-α含量显著降低。且活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物的保护活性比单独使用活性多糖或天然活性小分子或益生菌治疗效果更好。
表7活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物对乙醇所致急性肝损伤小鼠模型血清中TC、TG及LDL-C的影响
如表7所示，与正常组比较，酒精组小鼠血清TG、LDL-C和TC的水平显著上升，而天然活性小分子组、活性多糖组、益生菌组小鼠血清TG和TC的水平均有不同程度的下降，其中以活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物组下降最多。且活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物的保护活性比单独使用活性多糖或天然活性小分子或益生菌治疗效果更好。
参照图19，与正常组相比较，酒精组小鼠TLR4、TLR2、MyD88的表达显著上升；与酒精组相比较，活性多糖、天然活性小分子和益生菌组小鼠TLR4、TLR2、My D88的表达均有不同程度的下降，其中以活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物组降幅最大。
参照图20所示，与正常组相比较，酒精组小鼠Bax、Caspase-3及Caspase-9的表达显著上升，Bcl-2的表达显著降低；与酒精组相比较，活性多糖、天然活性小分子和益生菌组小鼠Bax、Caspase-3及Caspase-9的表达均有不同程度的下降，Bcl-2的表达有一定的升高。其中，以活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物组Bax、Caspase-3及Caspase-9的表达降幅最大，Bcl-2的表达升高最大。
本发明的急性毒性实验:
实验动物：1、昆明种小鼠，体重20±2g，由广东省实验动物中心提供
2、药物：本发明的活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物。
3、实验方法：根据国家药品监督管理局颁布修订的“中药新药研究技术要求”，对本发明的活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物进行急性毒性实验。因受药物浓度及体积限制，无法测定LD50，故进行最大给药量实验。取昆明种小鼠30只，雌性各半，灌胃给予活性多糖、天然活性小分子及益生菌组合物1g/mL，每只0.8mL，即小鼠的最大灌胃体积用药后观察小鼠活动状态、饮食、粪便、呼吸、体重及死亡情况，连续观察14d。
4、实验结果：各组小鼠灌胃给药后生长良好，体重增加，行为正常，均未见死亡及明显反应。将动物处死后，肉眼观察各主要脏器无异常现象。
结果表明，本发明的活性多糖、天然活性小分子及益生菌最大剂量口服应用，对动物无明显损害，未发现对机体产生的毒性反应，是一种安全可靠的食物或膳食补充剂或药物。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例选用10-15kD的麒麟菜活性多糖与10-15kD的枸杞活性多糖，10-15kD的山楂活性多糖，嗜热链球菌冻干粉，嗜酸乳杆菌冻干粉，植物乳杆菌冻干粉，干酪乳杆菌冻干粉，菠萝多酚-1，菠萝多酚-2，菠萝多酚-3的质量比为1：10：10：1：1：1：1：1：1：1。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例选用5-10kD的麒麟菜活性多糖与10-15kD的枸杞活性多糖，5-10kD的山楂活性多糖，嗜热链球菌冻干粉，嗜酸乳杆菌冻干粉，植物乳杆菌冻干粉，干酪乳杆菌冻干粉，菠萝多酚-1，菠萝多酚-2，菠萝多酚-3的质量比为1：1：1：0.01：0.01：0.01：0.01：0.001：0.001：0.001。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例选用低于1kD的麒麟菜活性多糖与1-3kD的枸杞活性多糖，1-3kD的山楂活性多糖，嗜热链球菌冻干粉，嗜酸乳杆菌冻干粉，植物乳杆菌冻干粉，干酪乳杆菌冻干粉，菠萝多酚-1，菠萝多酚-2，菠萝多酚-3的质量比为1：8：4：1.5：1.5：1.5：1.5：2：2：2。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例选用低于1kD的麒麟菜活性多糖与1-3kD的枸杞活性多糖，3-5kD的山楂活性多糖，嗜热链球菌冻干粉，嗜酸乳杆菌冻干粉，植物乳杆菌冻干粉，干酪乳杆菌冻干粉，菠萝多酚-1，菠萝多酚-2，菠萝多酚-3的质量比为1：8：4：2：1.5：2.5：1.5：2：1.5：2.5。
本发明适用于乙醇、药物所致的肝损伤，缓解急性酒精性肝损伤的组合物添加辅料，制备成食物、功能性食品、药物。
制备治疗急性肝损伤的食物、功能性食品、药物中的应用。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其特征在于，包括：活性多糖、天然活性化合物和益生菌,活性多糖、益生菌和天然活性化合物的质量比为3-21:0.04-4:0.003-3。
2.根据权利要求1所述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其特征在于，所述活性多糖包括麒麟菜活性多糖、枸杞活性多糖、山楂活性多糖,所述麒麟菜活性多糖、枸杞活性多糖、山楂活性多糖分别为麒麟菜多糖、枸杞多糖、山楂多糖通过不同孔径透析膜分离，低温冻干制得。
3.根据权利要求1所述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其特征在于，所述活性多糖的分子量小于15KD。
4.根据权利要求1所述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其特征在于，所述天然活性化合物为从菠萝中分离得到的活性酚类化合物，包括结构式为
的菠萝多酚-1，结构式为
的菠萝多酚-2，结构式为
的菠萝多酚-3。
5.根据权利要求1所述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其特征在于，所述天然活性化合物的分子量小于15KD。
6.根据权利要求1所述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物，其特征在于，所述益生菌包括嗜热链球菌冻干粉、嗜酸乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、干酪乳杆菌冻干粉。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物的制备方法，其特征在于，包括：
(1)活性多糖的制备
将植物多糖溶解于10-15倍的纯净水中，植物多糖溶液依次用孔径1kD、3kD、5kD、10kD或15kD的透析袋进行透析，分别收集透析液，冻干得到活性多糖；
(2)天然活性化合物的制备
将新鲜菠萝粉碎，加50-100倍的纯净水，5000g离心10分钟，取上清液，将上清液减压浓缩，得到浸膏，将浸膏加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位以及水部位；将乙酸乙酯部位采用200-300目的硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，获得若干馏分，将具有保护活性的馏分经制备型甲醇-乙酸水系统HPLC得到所述的菠萝多酚-1、菠萝多酚-2、菠萝多酚-3；
(3)活性益生菌筛选制备
筛选嗜热链球菌冻干粉、嗜酸乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、干酪乳杆菌冻干粉备用；
(4)按配方比例称取各组分，活性多糖、益生菌和天然活性化合物的质量比为3-21:0.04-4:0.003-3，将步骤(1)至(3)制备好的各活性组分及益生菌进行混合均匀，制得缓解急性酒精性肝损伤的组合物。
8.根据权利要求7所述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物的制备方法，其特征在于，所述活性多糖包括分子量1-3kD的麒麟菜活性多糖、分子量3-5kD的枸杞活性多糖、分子量1-3kD的山楂活性多糖，所述麒麟菜活性多糖与枸杞活性多糖、山楂活性多糖、嗜热链球菌冻干粉、嗜酸乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、干酪乳杆菌冻干粉、菠萝多酚-1、菠萝多酚-2、菠萝多酚-3的质量比为1：1-10：1-10：0.01-1：0.01-1：0.01-1：0.01-1：0.001-1：0.001-1：0.001-1。
9.根据权利要求8所述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物的制备方法，其特征在于，所述麒麟菜活性多糖与枸杞活性多糖、山楂活性多糖、嗜热链球菌冻干粉、嗜酸乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、干酪乳杆菌冻干粉、菠萝多酚-1、菠萝多酚-2、菠萝多酚-3的质量比为1：5：5：0.05：0.05：0.05：0.05：0.005：0.005：0.005。
10.根据权利要求1-6任意一项所述的一种缓解急性酒精性肝损伤的组合物的应用，其特征在于，所述缓解急性酒精性肝损伤的组合物添加辅料，制备乙醇、药物所致的肝损伤的食物、功能性食品、药物。
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