CN114540450A - 一种调节hprt1基因和oat1蛋白的汉麻仁生物活性肽及其制备方法 - Google Patents

一种调节hprt1基因和oat1蛋白的汉麻仁生物活性肽及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种调节HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽及其制备方法，属于功能食品研制技术领域。本发明的目的是为了解决目前汉麻仁加工副产物利用率低以及痛风的治疗药物大多存在较严重的副作用的问题，从分子机制层面上研究汉麻仁生物活性肽降尿酸作用途径，所述方法为：汉麻仁蛋白粉，超微粉碎100目以上，加水，超高压均质，酶解(外切氨肽酶1％温度为55℃作用时间90min)，动态错流浓缩膜过滤，收集滤液，冷冻干燥即可。本发明利用物理超高压结合外切蛋白酶酶法进行水解制备汉麻仁生物活性肽并采用动态错流浓缩膜过滤技术获得可上调HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽，是一种安全且高效的途径。

Description

一种调节HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽及其制 备方法
技术领域
本发明属于功能食品研制技术领域，具体涉及一种调节HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽及其制备方法。
背景技术
汉麻仁别名大麻仁、麻子仁、线麻子、麻子、麻仁，为桑科植物大麻(Cannabissativa L.)的干燥成熟种子，具有润燥、滑肠、通淋、活血的作用，在我国被广泛地用作中药材。汉麻在我国黑龙江、辽宁、吉林、四川、甘肃、云南、广西、浙江等地均有种植，其中以广西巴马种植和食用汉麻仁的历史最为悠久。
汉麻仁始载于《神农本草经》，其性甘、平，归脾、胃、大肠经，具有润燥、滑肠、通淋、活血的作用。临床上用于治疗胃癌、血虚津亏、肠燥便秘、热淋、风痹、痢疾、月经不调、疥疮等。古医籍中关于汉麻仁作用的记载《食疗本草》：“取汁煮粥，去五脏风、润肺。治关节不通、发落，通血脉”。《别录》：“主中风汗出，逐水，利小便，破积血，复血脉，乳妇产后余疾”。《药性论》：“治大肠风热结湿及热淋”。《本草拾遗》：“下气，利小便，去风痹皮顽，炒令香捣碎，小便浸取汁服；妇人倒产吞二七枚”。《纲目》：“利女人经脉，调大肠下痢；涂诸疮癞，杀虫；取汁煮粥食，止呕逆”。《分类草药性》：“治跌打损伤，去瘀血，生新血”。现代研究证明其化学成份中含葫芦巴碱、异亮氨酸甜菜碱、麻仁球朊酶、亚麻酸、亚油酸等。张民庆、龚惠民等认为汉麻仁有抗肿瘤作用，口服大麻酚能对白血病P388、小鼠肝癌和胃癌有明显的抑制作用，另用含100mg葫芦巴碱的栓剂外用于子宫颈癌，用药1个月后检查，宫颈光滑，病理检查未见癌细胞。同时，抑制小鼠肺癌的生长。
现代研究亦发现汉麻仁富含脂肪油等物质，经药理研究证明它不仅对消化系统有作用，而且对人体的其他系统也有较好的疗效。曹俊岭等将其与六味地黄丸比较汉麻仁油能显著降低D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠血清及脑组织升高的NO及脂质代谢产物MDA的水平，并显著升高血清及脑组织中SOD，GSH-PX的水平，说明汉麻仁油可通过增强机体的抗氧化能力而抗衰老，并且汉麻仁油能显著增高D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠胸腺指数及脾脏指数。亦可能通过机体的免疫系统而延缓衰老，汉麻仁油可延缓衰老。汉麻仁成分中的植物蛋白在机体的免疫调节方面发挥重要作用。它们对机体特异性免疫与获得性免疫，细胞免疫与体液免疫均有影响，主要影响淋巴细胞、巨噬细胞、网状内皮系统、白细胞以及DNA、RNA和蛋白质的合成、体内cAMP与cGMP的含量，其结果是使抗体生成，白细胞介素、干扰素等细胞因子诱生增多而调节机体的免疫功能。血液中T淋巴细胞亚群的检测是观察机体细胞免疫水平的重要方法，对恶性肿瘤的诊断、治疗及预后判断有重要作用，T淋巴细胞亚群的数目和比值测定是评价体内免疫调节平衡状态的最有意义的参数。当CD4+数量和功能提高时免疫效应增强，相反，CD4+与CD8+比值减少时反应机体免疫受到抑制，李永进等认为汉麻仁蛋白可显著提高脾淋巴细胞中CD4+T辅助细胞(Th细胞)的百分比，CD4+与CD8+的比值也有所提高。提示其可能通过上述变化而实现增强免疫调节功能的作用。近年来，全世界对草本植物的开发利用达到空前的热门，各国开始重视资源的可持续开发包括蛋白资源和其他低值蛋白资源的利用。大豆蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白、花生蛋白、菜籽蛋白、葵花籽蛋白、动物皮和鱼皮等酶解产物中相继发现多种功能性肽并成功产业化。一些植物蛋白副产品如榨油后的葵花籽蛋白和油菜籽蛋白的开发和研究也开始有所报道，昆虫、酵母、螺旋藻、血液等食品加工中副产品得到综合利用，同时，多种商业肽的应用越来越受到大众的认识，人们对于昂贵医药费的沉重负担，对于预防疾病的重视，因此，从不同的蛋白源开发肽类是非常有意义的。
随着生活水平的提高，人们的饮食习惯也产生很大的改变，如高嘌呤物质的摄入，患上高尿酸血症、痛风的人群越来越大。目前针对此类疾病的治疗药物存在较大的毒副作用，促使人们从安全的自然产物中挖掘新的有效的降尿酸活性物质，以便改善和治疗高尿酸血症、痛风疾病。汉麻仁全身是宝，除了富含优质蛋白质和优质油脂外，还有丰富的膳食纤维和多糖，这种非常规种子比大豆更优越。目前汉麻仁主要作为中药材使用，然而，中药材在煮制约30min的过程中，只是利用了汉麻仁中的一部分油，大量的有功效的营养素，包括蛋白质、大部分油脂、大部分多糖随着药渣而浪费掉。汉麻仁是目前尚未被充分利用的一类低值完美蛋白资源之一。如何综合利用这些传统药食同源的植物，充分利用和节约自然资源，具有较大的研究价值。HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因)催化5-磷酸核糖基-1-焦磷酸与次黄嘌呤、鸟嘌呤或6-巯基嘌呤转变成相应的5′-单核苷酸及焦磷酸的酶。对于嘌呤的生物合成及中枢神经系统功能都很重要。该酶的部分缺乏可导致尿酸过量生成。OAT家族是一类能够转运各种不同化学结构的有机阴离子的跨膜转运体，已经确证在肾脏表达的OAT族转运蛋白有OAT1～4和URAT1。一般来说，OAT1～4介导有机小分子阴离子的转运，其中OAT1～3位于基底侧膜，负责底物的摄取，OAT4、OAT5位于刷状缘膜，负责底物向肾小管的外排。OATs底物结构多样，其不同亚型转运体间的底物也相互交叉，OATs的典型底物药物包括非甾体抗炎药、β-内酰胺抗生素、抗病毒药、抗肿瘤药、利尿药及血管紧张素转化酶抑制剂等。Oat1基因于1997年从大鼠肾脏中首先克隆得到，其蛋白含有551个氨基酸残基，12个跨膜结构域。免疫组织化学表明，OAT1是肾脏OATs家族转运体中分布最广的一种，对氨基马尿酸(PAH)是其经典探针底物，OAT2、3、4对PAH的亲和力较弱。在肾脏表达水平较高的另外2个转运体是OAT3和OAT4，OAT3对头孢类抗生素的转运能力强于OAT1，OAT4对甾体硫酸结合物、青霉素、赭曲霉素A、吲哚美辛等的亲和性较高。另外，Sekine等在1998年发现OAT2在肝脏组织中有大量的表达，它位于肝实质细胞的基底侧膜，可参与一些相对分子质量较小的亲水性阴离子药物在肝细胞的摄取过程，如对氨基马尿酸、甲氨蝶呤、水杨酸盐、吲哚美辛和核苷酸衍生物等。
肾脏近曲小管的OAT1、OAT3和OAT4介导着一系列小分子亲水有机阴离子化合物经肾脏的排泄。Minematsu等研究发现，唑南帕奈在表达有Oat1、Oat2、Oat3的细胞上的吸收均呈现时间和浓度依赖性，且经静脉同时给予丙磺舒时，唑南帕奈的肾清除率从33.8％降至17.4％，给予西咪替丁时，肾清除率从64.9％降至49.6％，这表明唑南帕奈在大鼠肾脏的清除过程主要由Oat1、Oat2、Oat3介导。Han等用分别表达有OCT2、OAT3和OAT4的HEK293细胞研究了17-α-炔雌醇(EE2)的肝脏代谢产物炔雌醇硫酸盐(EE2sul)经肾脏分泌时的转运行为，发现EE2-Sul在表达有OAT3或OAT4的HEK293细胞上的吸收分别被OAT3抑制剂西咪替丁和丙磺舒、OAT4抑制剂甲氨蝶呤所抑制，此结果说明OAT3和OAT4参与了EE2-Sul在肾脏近曲小管的分泌。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前汉麻仁加工副产物利用率低以及痛风的治疗药物大多存在较严重的副作用的问题，从分子机制层面上研究汉麻仁生物活性肽降尿酸作用途径，提供一种调节HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽及其制备方法，该方法采用汉麻仁蛋白粉为原料，利用物理超高压结合外切蛋白酶法进行水解制备汉麻仁生物活性肽并采用动态错流浓缩膜过滤技术获得可上调HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽。上调HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽，一方面上调HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽可来预防或治疗高尿酸血症、痛风，另一方面给汉麻仁加工副产物创造更高附加值，以提高其经济价值。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种调节HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽的制备方法，所述方法为：汉麻仁蛋白粉，超微粉碎100目以上，加水，超高压均质，酶解，动态错流浓缩膜过滤，收集滤液，冷冻干燥即可。
进一步地，所述汉麻仁蛋白粉与水的添加比例为1g：5-10mL。
进一步地，所述超高压均质的压力为250-300Mpa。
进一步地，所述酶解的具体参数为：外切氨肽酶的添加量为0.5wt.％-5wt.％，温度为45℃-65℃，作用时间60-120min。
进一步地，浓缩膜的分子量为1500Da，1000Da为80％以上。
一种上述方法制备的生物活性肽。
本发明相对于现有技术的有益效果为：利用物理超高压结合外切蛋白酶酶法进行水解制备汉麻仁生物活性肽并采用动态错流浓缩膜过滤技术获得可上调HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽，是一种安全且高效的途径，采用该方法获得汉麻仁生物活性肽分子量小于1500Da，具体分布如图1和2所示，通过体内斑马鱼实验证明具有降尿酸功效。
附图说明
图1为汉麻仁生物活性肽分子量分布图；
图2为汉麻仁生物活性肽MALDI-TOF分子量测试质谱图；
图3为样品处理后斑马鱼尿酸荧光信号强度图；
图4为HPRT1基因相对表达量示意图；
图5为OAT1基因相对表达量示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
实施例1：
一种调节HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽的制备方法，所述方法为：汉麻仁蛋白粉，超微粉碎100目以上，加水，超高压均质，酶解，动态错流浓缩膜过滤，收集滤液，冷冻干燥即可；所述汉麻仁蛋白粉与水的添加比例为1g：5mL；所述超高压均质的压力为260Mpa；所述酶解的具体参数为：外切氨肽酶1％温度为55℃作用时间90min；浓缩膜的分子量为1500Da。
以下对本发明辅助降尿酸功效研究给出说明：
(1)检测材料
(1.1)样品配制信息
取实施例1制备得到的汉麻仁生物活性肽粉用标准稀释水配制成10.0mg/mL母液，现配现用。
阳性对照：别嘌呤醇，白色粉末，Sigma，批号为MKCM1316，4℃保存。用100％DMSO配成13.6mg/mL母液，-20℃保存。
(1.2)实验动物
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO3)，由本公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后5天(5dpf)的斑马鱼用于样品辅助降尿酸功效最大检测浓度(MTC)测定及其功效评价。
(1.3)仪器、耗材与试剂
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；多功能酶标仪(SPARK，TECAN，Switzerland)；精密电子天平(CP214，OHAUS，USA)；6孔板(Nest Biotech，China)；96孔板(Nest Biotech，China)。
AmplexTM Red UricAcid/Uricase Assay Kit(批号2286863，赛默飞世尔科技(中国)有限公司，USA)；氧嗪酸钾(批号为C1808048，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；黄嘌呤钠盐(批号为SLBV3159，Sigma，USA)；二甲基亚砜(DMSO，批号BCCD8942，Sigma，Switzerland)。
(2)检测方法
(2.1)MTC测定
随机选取5dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品(浓度见表1)，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予氧嗪酸钾和黄嘌呤钠盐建立斑马鱼高尿酸模型。28℃处理20h后，测定样品对模型斑马鱼的MTC。
(2.2)辅助降尿酸功效评价
随机选取5dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品(浓度见表2)，阳性对照别嘌呤醇136μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予氧嗪酸钾和黄嘌呤钠盐建立斑马鱼高尿酸模型。28℃处理20h后，利用尿酸荧光检测试剂盒，使用多功能酶标仪软件采集数据，分析斑马鱼体内尿酸荧光信号强度，以该指标的统计学分析结果评价样品辅助降尿酸功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
(3)检测结果
(3.1)MTC
在本实验条件下，汉麻仁生物活性肽粉对模型斑马鱼的MTC均为2000μg/mL。详见表1。
表1样品辅助降尿酸功效评价浓度摸索实验结果(n＝30)
Figure BDA0003535109640000061
(3.2)辅助降尿酸功效评价
在本实验条件下，汉麻仁生物活性肽粉和汉麻仁蛋白粉均具有辅助降尿酸功效。详见表2、图3。
表2样品辅助降尿酸功效评价实验结果(n＝3)
Figure BDA0003535109640000062
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
如图3所示，与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
以下对本发明辅助降尿酸功效机制研究给出说明：
(1)检测材料
(1.1)样品配制信息
取实施例1制备得到的汉麻仁生物活性肽粉，用标准稀释水配制成10.0mg/mL母液，现配现用。
阳性对照：别嘌呤醇，白色粉末，Sigma，批号为MKCM1316，4℃保存。用100％DMSO配成13.6mg/mL母液，-20℃保存。
(1.2)实验动物
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO3)，由本公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为5dpf的斑马鱼用于样品辅助降尿酸功效机制研究。
(1.3)仪器、耗材与试剂
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；精密电子天平(CP214，OHAUS，USA)；6孔板(Nest Biotech，China)；普通PCR扩增仪(T100，Bio-rad，Singapore)；荧光定量PCR仪(CFXConnect，Bio-rad，Singapore)；高速冷冻离心机(PICO17/21，ThermoFisher，Germany)；紫外-可见光分光光度计(Nanodrop2000，Thermo，Austria)；微孔板迷你离心机(BE-6100，海门市其林贝尔仪器制造有限公司，China)；低位裙边96孔板(透明)(货号HSP9601，Bio-rad，USA)；PCR封口膜(货号MSB1001，Bio-rad，USA)。
无水乙醇(批号20210529，国药集团化学试剂有限公司，China)；氧嗪酸钾(批号为C1808048，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；黄嘌呤钠盐(批号为SLBV3159，Sigma，USA)；二甲基亚砜(DMSO，批号BCCD8942，Sigma，Switzerland)；iTaq UniversalSYBR Green Supermix(货号1725124，Bio-rad，USA)；FastQuant RTKit试剂盒(货号KR106-02，天根生化科技(北京)有限公司，China)；RNA-Quick Purification Kit(RNA快速提取试剂盒)(货号RN001，上海奕杉生物，China)。
(2)检测方法
随机选取5dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品(浓度见表5)，阳性对照别嘌呤醇136μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予氧嗪酸钾和黄嘌呤钠盐建立斑马鱼高尿酸模型。28℃处理20h后，使用RNA快速提取试剂盒提取各组斑马鱼总RNA，利用紫外-可见光分光光度计对总RNA浓度和纯度进行测定。取2.00μg斑马鱼样品总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，合成20.0μL cDNA，通过q-PCR检测β-actin、HPRT1和OAT1基因的表达。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
(3)检测结果
(3.1)RNA提取结果及引物序列信息
样品处理结束后，提取斑马鱼总RNA，用紫外-可见光分光光度计测定RNA的浓度及A260/A280比值(表3)，A260/A280比值均在1.8-2.2之间，表明提取得到斑马鱼总RNA质量较好，可用于后续q-PCR实验。引物序列见表4。
表3总RNA的浓度及A260/A280比值(n＝30)
Figure BDA0003535109640000081
表4引物序列信息
Figure BDA0003535109640000082
(3.2)q-PCR检测
在本实验条件下，汉麻仁生物活性肽粉能上调HPRT1和OAT1基因的表达，汉麻仁蛋白粉能上调HPRT1基因的表达，但上调OAT1基因的表达不明显。详见表5、图4和图5。
表5样品辅助降尿酸功效机制研究相关基因表达的影响(n＝3)
Figure BDA0003535109640000083
Figure BDA0003535109640000091
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
如图4所示，与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。如图5所示，与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01。

Claims (6)

1.一种调节HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽的制备方法，其特征在于：所述方法为：汉麻仁蛋白粉，超微粉碎100目以上，加水，超高压均质，酶解，动态错流浓缩膜过滤，收集滤液，冷冻干燥即可。
2.根据权利要求1所述的一种调节HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽的制备方法，其特征在于：所述汉麻仁蛋白粉与水的添加比例为1g：5-10mL。
3.根据权利要求1所述的一种调节HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽的制备方法，其特征在于：所述超高压均质的压力为250-300Mpa。
4.根据权利要求1所述的一种调节HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽的制备方法，其特征在于：所述酶解的具体参数为：外切氨肽酶的添加量为0.5wt.％-5wt.％，温度为45℃-65℃，作用时间60-120min。
5.根据权利要求1所述的一种调节HPRT1基因和OAT1蛋白的汉麻仁生物活性肽的制备方法，其特征在于：浓缩膜的分子量为1500Da，1000Da为80％以上。
6.一种权利要求1～5任一项所述方法制备的生物活性肽。
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