CN114539242A

CN114539242A - 一种原小檗碱-尖防己型生物碱二聚体及其应用和制备

Info

Publication number: CN114539242A
Application number: CN202011344874.0A
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 魏红丽; 刘艳芳; 王纪霞; 侯滔
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN114539242B

Abstract

本发明涉及一种来自蝙蝠葛根的一种原小檗碱‑尖防己型生物碱二聚体及其应用和制备，所述二聚体经阿片Delta受体靶点测试表明具有一定的药理活性，可用于制备预防或治疗与该受体相关疾病的药物开发中。

Description

一种原小檗碱-尖防己型生物碱二聚体及其应用和制备

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，涉及一种原小檗碱-尖防己型生物碱二聚体及其应用和制备及其在预防或治疗与阿片delta受体相关疾病的药物开发中的应用。

背景技术

异喹啉类生物碱是一类重要的天然产物代谢物，具有多种多样的药理活性包括抗肿瘤、抗疟疾、抗抑郁、抗菌、抗炎、抗心率失常等。异喹啉类生物碱具有结构多样性，包括很多亚型如苄基异喹啉、啊朴啡、小檗碱、吗啡烷、双苄基异喹啉、异喹啉二聚体、简单异喹啉等。其中，对于二聚的异喹啉分子，目前分离并鉴定的很少，多数为双苄基异喹啉、啊朴啡-苄基异喹啉二聚、啊朴啡-小檗碱二聚等，然而，不同亚型的异喹啉生物碱分子多种多样，在生物体内结合的方式也会多种多样，因此，在天然产物中可能存在很多不同类型且聚合方式新颖的二聚体，这些活性多样的分子聚合在一起也会产生不同的活性。为了进一步发现这样新颖的异喹啉二聚体分子，我们在之前的工作基础上，继续以传统植物蝙蝠葛根为研究对象(又名北豆根，富含异喹啉生物碱)，通过现代高效液相色谱多维纯化制备手段以及高通量的活性筛选技术的结合，以期发现更多更有价值的药物先导化合物。

发明内容

本发明提供了一种新颖的原小檗碱-尖防己型生物碱二聚体在制备预防或治疗与该受体相关疾病的药物中的用途，其中，所述化合物的结构式如下：

其中：

R₁～R₁₀分别独立地选自为氢、卤素、羟基、羧基、烷氧基、糖基、C1～C6的烷基、C2～C6的烯基。

进一步地，R₁、R₅、R₆选自羟基，R₂、R₇、R₈选自甲氧基,R₃和R₄相连为亚甲二氧基，所述式(A)化合物如式(B)所示

进一步地，R₉选自氢或卤素、R₁₀选自氢或甲基。

进一步地，所述化合物的结构如式(C)所示：

进一步地，所述化合物(C)构型选自(16S,24S,11R,12S,13S)或(16R,24S,11R,12S,13S)。

进一步地，所述化合物(C)构型优选(16S,24S,11R,12S,13S)，结构如式(Ⅰ)所示。

本发明还提供一种制备上述化合物Ⅰ的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)药材提取：北豆根干燥药材1公斤～100公斤，每公斤药材加入6～10L体积分数50％～90％的乙醇浸泡，浸泡1～24h，加热至50℃～90℃，回流提取1～5次，合并提取液，浓缩，即得北豆根提取液；

(2)总碱制备：在上述提取液中加入0.1％～3％的硫酸调pH至1～4后，加入为酸调后的溶液体积1～3倍的乙酸乙酯萃取1～5次，每次萃取后在酸水层中均加入0.1％～3％的硫酸调pH至1～4，最后获得酸水层。然后在酸水层中加入弱碱调pH至8～10，接着加入为碱调后的溶液体积1～3倍体积的正丁醇萃取1～5次，合并1～5次获得的正丁醇层，浓缩，即得北豆根粗碱，然后通过离子交换色谱柱，脱色除杂，即得精制的总碱；

(3)将步骤(2)所得总碱采用反相制备级HPLC制备，色谱柱固定相为C18HCE(5～60μm，20×250～100×250mm)，流速为10mL/min～350mL/min，体积比为0：100～100：0的(0.01％～5％)甲酸-甲醇/(0.01％～5％)甲酸-水溶液洗脱，按时间收集得到馏分F1～F8；

(4)将步骤(3)所得子馏分F6经过反相制备级HPLC制备，色谱柱为C18CE固定相(5～60μm，20×250～100×250mm)，流速为10mL/min～350mL/min，流动相为甲醇(A)和水(B，含体积分数为0.01％～2％的质量浓度为25％～28％的氨水)，洗脱梯度为0～80min，0％A～95％A，按时间收集共得到8个子馏分，分别为F6-1～F6-8；

(5)将步骤(4)所得子馏分F6-5经过制备级HPLC制备，色谱柱采用C18YE0.2固定相(5～60μm，4.6×250～30×250mm)，流动相为甲醇(A)和水(B)(各含浓度1～100mM的醋酸铵)，洗脱梯度为0～60分钟，5％A～95％A，所得馏分再经过C18CE(5～60μm，4.6×250～20×250mm)，洗脱梯度为0～60分钟，0％A～90％A，所得馏分再通过C18CE固定相(5～60μm，4.6×250～20×250mm)，流动相A为(体积分数0.01％～10％)的(质量浓度为25％～28％的氨水)-甲醇，B为(体积分数0.01％～10％)的(质量浓度为25％氨水)-水，洗脱梯度为0～80分钟，0％A～95％A，所得馏分再继续通过C18HCE固定相(5～60μm，4.6×250～20×250mm)，流动相A为体积分数(0.01～1％)甲酸-甲醇，B为体积分数(0.01～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～40分钟，0％A～90％A，得到化合物Ⅰ。

本发明中：所述糖基是指包括但不限于葡萄糖基、葡萄糖醛酸基、甘露糖基、半乳糖基、阿洛糖基、果糖基、山梨糖基、夫糖基、鼠李糖基、鸡纳糖基、阿拉伯糖基、来苏糖基、木糖基、核糖基，以及由上述单糖所形成的各种二糖基及多糖基；所述C₁～C₆的烷基是指C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆的烷基，即具有1～6个碳原子的直链或支链的烷基；C₁～C₆的烯基是指具有2～6个碳原子的带双键的直链或支链的烯基。

本发明的另一个目的是，提供一种原小檗碱类生物碱与尖防己型生物碱二聚体，或其结晶物、或其异构体或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物作为活性成分，或由所述的任一种或几种作为阿片delta受体配体，在制备预防和/或治疗与该受体相关的疾病药物开发研究中。

所述与该受体相关疾病包括但不限于疼痛、止咳、阿兹海默症、胃肠功能紊乱、及抑制阿片类镇痛药物引起的副作用等。

所述药物组合物是指本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用，也可选择将本发明的化合物与任何其它活性试剂结合使用。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。本发明中药物组合物中活性成分(即本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定的加以应用，活性化合物的剂量或浓度在一个较宽的范围内调节，活性化合物的含量范围为药物组合物的1％～90％。

显然，根据本发明的上述内容，按照本科领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1化合物I的制备流程图

图2化合物I的ESI⁺一级质谱图

图3化合物I的¹HNMR谱图和¹³CNMR谱图

图4化合物I的H,H-COSY和HMBC相关

图5化合物I的delta受体拮抗活性测定：在HEK293-delta细胞上的剂量响应曲线

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明而不是本发明的进一步限定，本发明可以按发明内容所述的任一方式实施。

本发明式(Ⅰ)化合物的制备实施例：

化合物制备

北豆根药材100公斤，

(1)药材提取：称取100kg北豆根药材，加入1000L体积浓度为70％的乙醇，浸泡24h，60℃加热回流提取2h，抽滤后获得提取液1，将过滤后的滤渣再加入1000L体积浓度为70％的乙醇，60℃加热回流提取2h，过滤后获得提取液2，继续将过滤后的滤渣再加入1000L体积浓度为70％的乙醇，60℃加热回流提取2h，过滤后获得提取液3，合并提取液1～3，浓缩至50L，即获得北豆根提取液。

(2)总碱制备：在北豆根提取液中加入体积浓度为1％的稀硫酸调pH至2～3之间，然后加入与该酸调后的提取液相同体积的乙酸乙酯萃取第一次，静置分层，获得乙酸乙酯萃取层1和酸水层1，然后在酸水层1中继续加入体积浓度0.2％的稀硫酸调pH至2～3之间，然后加入与该酸调后的提取液相同体积的乙酸乙酯萃取第二次，即得乙酸乙酯层2和酸水层2，然后在酸水层2中加入体积浓度1％的稀硫酸调pH至2～3之间，然后加入与该酸调后的提取液相同体积的乙酸乙酯萃取第三次，即得乙酸乙酯层3和酸水层3。在酸水层3中加入质量浓度为25％～28％的氨水调pH至9～10之间，加入与碱调后的样品相同体积的正丁醇萃取，静置分层，即得正丁醇层1和碱水层1，然后在碱水层1中加入质量浓度为25％～28％的氨水调pH至9～10之间，然后加入与该碱调后的提取液相同体积的正丁醇萃取第二次，即得正丁醇层2和碱水层2。然后在碱水层2中加入质量浓度为25％～28％的氨水调pH至9～10之间，然后加入与该碱调后的提取液相同体积的正丁醇萃取第三次，即得正丁醇层3和碱水层3，合并正丁醇层1～3并浓缩成浸膏，采用甲醇复溶至12L，取10ml浓缩测固含量约为500g/L，计算即得北豆根粗碱约6.0kg，占药材质量的6.0％。以此计算，取约1L甲醇复溶的粗碱样品，加入1L纯水稀释溶解，离心过滤获得上清液，然后上清液通过琼脂糖凝胶基质的离子交换Q柱，脱色除杂，即得精制的总碱约500g，回收率约97％。

(3)将步骤(2)所得总碱采用反相制备级HPLC制备，色谱柱固定相为C18HCE(粒径10μm，直径与高100×250mm)的反相柱进行分离纯化，流速300mL/min，流动相为甲醇(A)和水(B)(各含体积浓度0.1％的甲酸)，洗脱梯度为0-10min，0％B(体积比)；10-20min，10％B；20-35min，20％B；35-45min，25％B；45-60min,30％B；60-75min，90％B洗脱，得到8个馏分分别为F1(RT：0～17min)，F2(RT：17～24min)，F3(RT：24～28min)，F4(RT：28～32.5min)，F5(RT：32.5～38.5min)，F6(RT：38.5～52min)，F7(RT：52～62min),F8(RT：62～74min)；

(4)将步骤(3)所得子馏分F6经过反相制备级HPLC制备，色谱柱为C8GE固定相(粒径10μm，直径与高100×250mm)，流速300mL/min，流动相为甲醇(A)和水(B，含体积分数为0.03％的质量浓度为25％～28％的氨水)，洗脱梯度为0～30min，10％～95％A(线性梯度)，30～40min，95％A(体积比)，共得到8个子馏分，分别为F6-1(RT：2～7min)，F6-2(RT：7～11min)，F6-3(RT：11～13min)，F6-4(RT：13～17min)，F6-5(RT：17～22min)，F6-6(RT：22～27min)，F6-7(RT：27～31min)，F6-8(RT：31～35min)；

(5)将步骤(4)所得子馏分F6-5经过制备级HPLC制备，色谱柱采用C18YE0.2固定相(粒径10μm，直径与高20×250mm)。流速17mL/min，流动相为甲醇(A)和水(B)(各含质量浓度为20mM的醋酸铵)，洗脱梯度为0-40min，20％-50％A(线性梯度)；40-50min，50～90％A；50-60min，90％A。所得馏分F6-5-6(RT：34～36min)再经过C18CE(粒径7μm，直径与高10×250mm)，流速3mL/min，流动相为甲醇(A)和水(B)(各含体积分数0.125％的质量浓度为25％的氨水)，pH10.5)，洗脱梯度为0-20min,10％-95％A(线性梯度),20-30min,95％A。所得馏分F6-5-6-7(RT：18～19min)再继续通过C18HCE固定相(粒径7μm，直径与高10×250mm)，流动相A和B分别为甲醇和水(各含体积分数0.1％甲酸)，洗脱梯度为0-40min,5％-50％A,30-40min,50％A-95％A(线性梯度)，收集峰(RT＝15.5min)得到化合物I；

(6)所述化合物I，其结构通过紫外、质谱以及核磁表征确定，信息如下：

化合物I：1.0mg，C₃₈H₃₈ClN₂O₁₀ ⁺，MW：717，黄色粉末，可溶于甲醇。¹H NMR(CD3OD，600MHz)δ6.99(2H,d,J＝8.5Hz,H-10′,14′),6.37(1H,d,J＝2.1Hz,H-10),6.97(1H,m,H-13),6.99(1H,m,H-14),6.78(2H,d,J＝8.5Hz,H-11′,13′),6.83(1H,s,H-5′),6.59(1H,s,H-5),5.60(1H,s,H-8′),6.01(1H,s,H-8),4.44(1H,dd,J＝11.0,3.0Hz H-1′),3.97-3.67(2H,m,H-3),3.95(1H,dd,J＝12.8,9.5Hz H-3′),3.60(1H,m,H-3′),3.34(1H,m,H-9),2.86(1H,ddd,J＝17.3,6.3,3.0Hz H-4),3.24(2H,m,H-4′),3.63(2H,m,H-9),3.07(1H,dd,J＝13.6,9.0Hz H-9),2.64(1H,dd,J＝12.4,11.2Hz H-9′),4.16(1H,dd,J＝12.4,2.9Hz H-9′),4.62(1H,dd,J＝9.0,3.6Hz H-1),3.66(3H,s,OCH3-6),3.83(3H,s,OCH3-6′),3.31(3H,s,OCH3-7′),3.53(3H,s,NCH3-2),3.30(3H,s,NCH3-2′).

¹³C NMR(CD3OD，150MHz)δ158.3(C,C-12′),149.5(C,C-12),150.8(C,C-6′),149.0(C,C-6),148.2(C-7′),146.8(C-7),145.7(C,C-11),132.6(CH,C-10′,14′),131.9(C,C-9′a),128.5(C,C-9a),127.0(CH,C-14),125.7(C,C-8′a),124.5(C,C-8a),121.8(C,C-4′a),122.1(C,C-4a),118.2(CH,C-11′,13′),123.5(CH,C-10),118.6(CH,C-13),112.6(CH,C-8′),115.9(CH,C-8),112.0(CH,C-5),112.6(CH,C-5′),79.2(CH,C-1′),78.6(CH,C-1),56.4(CH3,6′-OCH3),56.1(CH3,6-OCH3),56.1(CH3,7′-OCH3),60.1(CH2,C-3′),60.6(CH2,C-3),55.8(CH3,2′-NCH3),55.7(CH3,2-NCH3),38.7(CH2,C-9′),39.4(CH2,C-9),26.9(CH2,C-4′),25.3(CH2,C-4).

活性试验实施例：

样品为制备的新化合物；HEK293-delta稳转细胞来构建参考文献(Xu,F.F.；Zhou,H.；Liu,X.M.；Zhang,X.L.；Wang,Z.W.；Hou,T.；Wang,J.X.；Qu,L.L.；Zhang,P.Y.；Piao,H.L.；Liang,X.M.,Label-free cell phenotypic study of FFA4 and FFA1 anddiscovery of novel agonists of FFA4 from natural products.Rsc Advances 2019,9(26),15073-15083.)(所述delta为阿片delta受体)；SNC162(货号：1529)购于Tocris公司；DMEM高糖培养液(货号：C11995500BT)购于ThermoFisher公司，胎牛血清(货号：04000101A)购于沈阳汇佰生物科技有限公司；平衡盐溶液HBSS(货号：14065-056)和HEPES(货号：15630-080)购于Gibco公司。检测平台为康宁第三代

成像仪，检测的信号为细胞动态质量重置(DMR)引起的波长位移。

将处于对数生长期的HEK293-delta细胞接种到

384孔生物感应器微型板中，每孔接种细胞悬液的体积为40μL，每孔接种的细胞数目为2.5×104个，然后将384孔板置于细胞培养箱(体积浓度5％的CO₂的空气、37℃)中培养22-24h，当细胞融合度达95％左右时，进行实验。

拮抗实验分析：首先，加入各10微升不同终浓度(200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.563μM、0.781μM、0.391μM、0.195μM、0.098μM、0.049μM、0.024μM)的化合物I预处理HEK293-delta细胞60min，平行4次，溶剂为含20mM HEPES的HBSS缓冲液；然后，每孔加入10微升固定终浓度(2.5μM)的delta阿片受体选择性激动剂SNC162(溶剂为含20mMHEPES的HBSS缓冲液)继续监测60min，结果如图5所示。实验结果显示化合物I能拮抗delta阿片受体选择性激动剂SNC162的DMR信号，且呈现剂量依赖，其IC50值为46.69±9.28μM。由此说明化合物I具有delta阿片受体拮抗活性，其是delta阿片受体拮抗剂。

目前的研究表明阿片delta受体拮抗剂与疼痛、止咳、阿兹海默症、胃肠功能紊乱、及抑制阿片类镇痛药物引起的副作用相关。本发明的化合物对疼痛、止咳、阿兹海默症、胃肠功能紊乱、及抑制阿片类镇痛药物引起的副作用等疾病有重要的临床应用。

Claims

1.一种原小檗碱-尖防己型生物碱二聚体，其结构通式如式(A)所示；原小檗碱-尖防己型生物碱二聚体包括所述通式(A)所示化合物，或其结晶物、或其手性异构体、或其糖苷、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物；

其中：

R₁～R₁₀分别独立地选自为氢、卤素(F、Cl、Br、I中的一种)、羟基、羧基、C1～C6烷氧基、糖基、C1～C6的烷基、C2～C6的烯基中的一种。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：R₁、R₅、R₆选自羟基，R₂、R₇、R₈选自甲氧基,R₃和R₄相连为亚甲二氧基，所述式(A)化合物如式(B)所示

3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于：R₉选自氢或卤素、R₁₀选自氢或甲基。

4.根据权利要求1～3所述的化合物，其特征在于：所述化合物的结构如式(C)所示

5.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于：所述化合物(C)构型选自(16S,24S,11R,12S,13S)或(16R,24S,11R,12S,13S)；

6.根据权利要求5所述的化合物，其特征在于：所述化合物(C)构型优选(16S,24S,11R,12S,13S)

7.一种权利要求1-6任一所述的化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)药材提取：北豆根干燥药材1公斤～100公斤，每公斤药材加入6～10L体积分数50％～90％的乙醇浸泡，浸泡1～24h，加热至50℃～90℃提取1～3h，过滤得提取液；共提取1～5次，合并提取液，所得的提取液浓缩至按每公斤药材计0.3～0.6L，即得北豆根提取液；

(2)总碱制备：在上述北豆根提取液中加入体积浓度0.1％～3％的硫酸调pH至1～4后，加入该酸调后的提取液体积的1～3倍体积的乙酸乙酯萃取，分层，获得乙酸乙酯萃取层和酸水层，共萃取1～5次，再在酸水层中加入弱碱调pH至8～10，接着加入碱调后的样品体积的1～3倍体积的正丁醇萃取，分层，获得正丁醇和碱水层，共萃取1～5次，合并有机层，浓缩，即得北豆根粗碱，然后通过离子交换色谱柱，脱色除杂，即得精制的总碱；

(3)将步骤(2)所得总碱采用C18HCE填料(粒径5～60um)的反相柱进行分离纯化，采用体积比为0：100～100：0的(体积浓度0.01％～5％)甲酸-甲醇/(体积浓度0.01％～5％)甲酸-水溶液洗脱，按峰收集，得到馏分F1～F8；

(4)将步骤(3)所得子馏分F6经过反相制备级HPLC制备，色谱柱为C18CE固定相(5～60μm，20×250～100×250mm)，流动相A为(体积分数0.01％～10％)氨水-甲醇，B为(体积分数0.01％～10％)(质量浓度为25％～28％的氨水)-水，洗脱梯度为0～80分钟，0％A～95％A，按峰收集，共得到11个子馏分，分别为F6-1～F6-11；

(5)将步骤(4)所得子馏分F6-5经过制备级HPLC制备，色谱柱采用C18YE0.2固定相(5～60μm，4.6×250～30×250mm)，流动相为甲醇(A)和水(B)(各含浓度1～100mM的醋酸铵)，洗脱梯度为0～60分钟，5％A～95％A，所得馏分再经过C18CE(5～60μm，4.6×250～20×250mm)，洗脱梯度为0～60分钟，0％A～90％A，所得馏分再通过C18CE固定相(5～60μm，4.6×250～20×250mm)，流动相A为(体积分数0.01％～10％)的(质量浓度为25％～28％的氨水)-甲醇，B为(体积分数0.01％～10％)的(质量浓度为25％氨水)-水，洗脱梯度为0～80分钟，0％A～95％A，所得馏分再继续通过C18HCE固定相(5～60μm，4.6×250～20×250mm)，流动相A为体积分数(0.01～1％)甲酸-甲醇，B为体积分数(0.01～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～40分钟，0％A～90％A，按峰收集，得到化合物Ⅰ。

8.根据权利要求7所述的化合物的制备方法，

步骤(1)中回流提取2～5次时，将上次回流提取过程的物料过滤，过滤后的滤渣再按每公斤药材加入6～10L体积分数50％～90％的乙醇，加热至50℃～90℃回流提取1～3h，过滤得提取液；合并提取液；

步骤(2)中乙酸乙酯萃取2～5次时，首先采用体积浓度0.1％～3％的硫酸将上次分层的酸水层调pH至1～4，于酸水层中加入其体积的1～3倍体积的乙酸乙酯萃取，分层，获得乙酸乙酯萃取层和酸水层；

弱碱为质量浓度为10～25％的氨水；

正丁醇萃取2～5次时，首先采用弱碱将上次分层的碱水层调pH至8～10，于碱水层中加入其体积的1～3倍体积的正丁醇萃取分层，获得正丁醇和碱水层。

9.一种权利要求1～6任一项所述化合物I，或其晶型、或其异构体、或其糖苷、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物中的一种或二种以上在制备预防和/或治疗疼痛、止咳、阿兹海默症、胃肠功能紊乱、及抑制阿片类镇痛药物引起的副作用中的应用。

10.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1～3任一项所述化合物，或其晶型、或其异构体、或其糖苷、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物中的一种或二种以上；该药物组合物不添加或可添加有药学上可接受的辅料或载体制备而成的制剂。