CN114525218A - 一种长双歧杆菌及其培养方法和其在高产γ-氨基丁酸和5-羟色胺中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种长双歧杆菌及其培养方法和其在高产γ‑氨基丁酸和5‑羟色胺中的应用，涉及微生物领域，本发明提供了一种长双歧杆菌菌株MP‑569，可高产γ‑氨基丁酸和5‑羟色胺，它们是神经系统中的神经抑制剂，对神经元的兴奋程度有着潜在的影响，具有改善人的抑郁症状，增强记忆力，防止人脑损害的潜在能力；并且还能促进生长激素的分泌，在人体生长发育中起着关键性作用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种长双歧杆菌及其培养方法和其在高产γ-氨基丁酸和5-羟色胺中的应用。
背景技术
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。
目前主要有乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌、酪酸梭菌等，越来越广泛的应用于食品、药品、农业、畜牧业、生物工程等。筛选获得具有不同技术效果的益生菌及其新的应用方法具有重要意义。鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长双歧杆菌及其培养方法和其在高产γ-氨基丁酸和5-羟色胺中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种长双歧杆菌，其保藏号为 CGMCC NO.23905。
第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的长双歧杆菌的培养方法，其包括对所述长双歧杆菌进行厌氧培养。
第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的长双歧杆菌在制备用于促进垂体细胞分泌生长激素的产品中的应用。
第四方面，本发明实施例提供了一种用于促进垂体细胞分泌生长激素的产品，其活性成分包括如前述实施例所述的长双歧杆菌。
第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的长双歧杆菌在促进垂体细胞分泌生长激素中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的长双歧杆菌在制备高产γ-氨基丁酸和/或5-羟色胺的产品中的应用。
第七方面，本发明实施例提供了一种高产γ-氨基丁酸和/或5-羟色胺的产品，其活性成分包括如前述实施例所述的长双歧杆菌。
第八方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的长双歧杆菌在生产γ-氨基丁酸和/或5-羟色胺中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种长双歧杆菌菌株MP-569，可高产γ-氨基丁酸和5-羟色胺，它们是神经系统中的神经抑制剂，对神经元的兴奋程度有着潜在的影响，具有改善人的抑郁症状，增强记忆力，防止人脑损害的潜在能力；此外，MP-569还能促进人生长激素的分泌，在人体生长发育中起着关键性作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为产5-羟色胺的检测结果；
图2为产γ-氨基丁酸的检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明实施例提供了一种长双歧杆菌MP-569，Bifidobacterium longum，其保藏号为CGMCC NO.23905，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCG)，邮政编码：100101；保藏日期为2021年11月15日。
长双歧杆菌MP-569的16s rDNA的序列如SEQ ID No.1所示，如下 (5’-3’)：
GATTGCGGGGTGCTACCATGCAGTCGAACGGGATCCATCAAGCTT GCTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCT GCCCCATACACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATG CTCCAGTTGATCGCATGGTCTTCTGGGAAAGCTTTCGCGGTATGGGAT GGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGG CTTCCACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACT GAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAG GCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAGCGAGAGTGAG TTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT AATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCT CGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGT GGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTG GAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACC AATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAAGAGCGAA AGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA AACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGG AGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTA AAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAACATGC GGATTAATTCGATGCACGCGAAAAACCTTACCTGGGCTTGAATGTTCC CGACGGTCGAAAAATACGGCTTCCTTCGGGCGGGTTCCAGGGGGTGC AGGTCTCCCAC。
该菌株已经过全基因组测序，经Blast比对后，未发现与该菌株基因组序列完全相同的菌株。
本发明经筛选获得了一株长双歧杆菌MP-569，其可高产γ-氨基丁酸和 5-羟色胺，它们是神经系统中的神经抑制剂，对神经元的兴奋程度有着潜在的影响，具有改善人的抑郁症状，增强记忆力，防止人脑损害的潜在能力；MP-569还能促进生长激素的分泌，在人体生长发育中起着关键性作用。
本发明实施例还提供了如前述实施例所述的长双歧杆菌的培养方法，其包括对所述长双歧杆菌进行厌氧培养。
在没有限定的情况下，可选用现有的用于培养长双歧杆菌的方法对 MP-569进行培养。
优选地，所述培养的温度为32～42℃，培养的温度具体可以在32℃、 33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃和42℃中的任意一项或任意两项之间的范围，更优选为37℃，培养效果更好。
优选地，所述培养采用的培养基为适用于长双歧杆菌的培养基；
优选地，培养基的pH为6.2～6.9，具体可以包括6.2、6.3、6.4、6.5、 6.6和6.7中的任意一项或任意两项之间的范围。
优选地，所述培养采用的培养基为乳酸细菌培养基MRS。
在一些实施例中，可以将长双歧杆菌MP-569置于乳酸细菌培养基 (MRS)中，pH6.2-6.6，在37℃恒温培养箱静置过夜培养。
本发明还提供了如前述实施例所述的长双歧杆菌在制备用于促进垂体细胞分泌生长激素的产品中的应用。
优选地，所述长双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。
可以理解的是，活菌体可以为长双歧杆菌的菌悬液(活菌状态)，灭菌体，可以通过将菌悬液进行灭菌操作后获得，菌体培养物可以通过将菌体接种到种子培养基中培养获得，菌体发酵物可以通过将菌体或菌体培养物接种到发酵培养基中发酵获得。
在可选的实施例中，垂体细胞可以选自哺乳动物的垂体细胞，优选地，所述垂体细胞为非人的哺乳动物；优选地，所述垂体细胞为大鼠垂体瘤细胞。
本发明实施例还提供了一种用于促进垂体细胞分泌生长激素的产品，其活性成分包括如前述实施例所述的长双歧杆菌。
优选地，所述长双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。
优选地，所述垂体细胞为大鼠垂体瘤细胞。
可选地，所述产品选自食品、药品和保健品中的任意一种。
优选地，所述产品还可以包括另一种具有促进垂体细胞分泌生长激素的物质。
本发明实施例还提供了如前述实施例所述的长双歧杆菌在促进垂体细胞分泌生长激素中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的，比如在体外进行相关研发和新药开发时的应用。
优选地，所述垂体细胞为大鼠垂体瘤细胞(GH3细胞)。
本发明还提供了如前述实施例所述的长双歧杆菌在制备高产γ-氨基丁酸和/或5-羟色胺的产品中的应用。
本发明实施例还提供了一种高产γ-氨基丁酸和/或5-羟色胺的产品，其活性成分包括如签署实施例所述的长双歧杆菌。
优选地，所述长双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。
本发明实施例还提供了如前述实施例所述的长双歧杆菌在生产γ-氨基丁酸和/或5-羟色胺中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种长双歧杆菌MP-569，来源于25岁左右健康成人粪便中，在乳酸细菌培养基(MRS)中混合2.5mg/L莫匹罗星锂盐分离得到。于乳酸细菌培养基(MRS)中，pH 6.2～6.6，在37℃恒温培养箱静置过夜培养。
实施例2
MP-569菌株产5-羟色胺检测。
方法：(1)将菌株活化，按2％接种量接入含0.2％色氨酸培养基中培养48h，离心取上清，用0.22μm滤膜过滤得到待测样本；将样本点样于薄层层析硅胶板GF，在层析缸用展开剂(正丁醇：醋酸：水＝4:1:5)展开，用显色剂(对二甲氨基苯甲醛1g，乙醇9ml，盐酸2.3ml，加乙醇至100ml) 显色，以5-羟色胺为对照，观察结果。
(2)高效液相色谱检测：①5-羟色胺标准溶液的配制：精确称取5-羟色胺标准品，用超纯水溶解，得到的标准溶液，于4℃冰箱保存备用。②样品衍生化：四硼酸钠粉末称重后，配制100mM水溶液备用，加热后溶解。取10μL样品加入1.5mL离心管中，然后依次加入25μL四硼酸钠水溶液和25μL 2％苯甲酰氯乙腈溶液，摇匀之后室温震荡30min，反应完成。然后测定5-羟色胺衍生物的含量，根据衍生化产物的峰面积，作出标准曲线，根据标准曲线计算5-羟色胺含量。③HPLC色谱条件：流动相A:5mM 甲酸铵+0.1％甲酸水，B：0.1％甲酸-乙腈，色谱柱：Waters BEH C18 2.1×100mm×1.7μm，流速：0.3mL/min，梯度：0-1min(5％B)；1-2min (90％B)；2-4.5min(90％B)；4.5-4.6min(5％B)；4.6-7min(Stop)。
结果见图1和表1。
表1液相色谱检测结果
实施例3
MP-569菌株产γ-氨基丁酸检测。
(1)初筛：将供试菌株活化培养后，收集菌体并用0.9％NaC1清洗3 次。菌体按湿重加入1％的谷氨酸溶液，调pH至4.7，反应24h后离心取上清液，加入混合酸碱指示剂，观察颜色反应，初步判断溶液变绿的具有 GAD活性。
(2)高效液相色谱检测：①γ-氨基丁酸标准溶液的配制：精确称取γ- 氨基丁酸标准品，用超纯水溶解，得到的标准溶液，于4℃冰箱保存备用。②样品衍生化：取浓度为5mg/mL的标准γ-氨基丁酸溶液1mL置于10 mL棕色量瓶中，加人0.5mol/L碳酸氢钠(pH9.0)溶液1mL，再分别加入1％(2，4-二硝基氟苯)FDNB乙腈溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mL，置于60℃水浴中避光加热0.5、1、1.5h后取出，冷却，分别添加 pH7.0的磷酸盐缓冲液至10mL，混匀，10000r/min，离心15min，经 0.22μm微孔过滤，测定γ-氨基丁酸衍生物的含量，根据衍生化产物2， 4-二硝基氟苯丁酸的峰面积，作出γ-氨基丁酸标准曲线，根据标准曲线计算γ-氨基丁酸含量。③HPLC色谱条件：流动相A:5mM甲酸铵+0.1％甲酸水，B：0.1％甲酸-乙腈，色谱柱：Waters BEH C18 2.1х100mmх1.7μm，流速：0.3mL/min，梯度：0-1min(5％B)；1-2min(90％B)；2-4.5min (90％B)；4.5-4.6min(5％B)；4.6-7min(Stop)。
结果见图2和表2。
表2液相色谱检测结果
备注：表2为3次重复实验的结果；CD3Y1、Cd5y6的来源方法与MP- 569相同，具体见实施例1。
实施例4
菌株MP-560促进大鼠垂体瘤GH3细胞产生生长激素的检测。
方法：培养大鼠垂体瘤GH3细胞，待细胞贴壁后，吸弃细胞培养基 20μl/孔，加入细菌发酵液20μl/孔。5％CO2，37℃孵育48小时，用大鼠 GH的ELISA试剂盒(南京建成购买)检测细胞上清液中的生长激素浓度。
检测生长激素：
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法，试剂盒组成见表3。用抗大鼠 GH单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的GH与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠GH，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，GH浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中GH浓度。
表3试剂盒组成(2～8℃保存)
准备试剂与收集血样：
1.收集标本：收集细胞培养上清液，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻(-20℃或-70℃)保存，避免反复冻融。
2.标准品液配制：使用前加入2ml蒸馏水混匀，配成80ng/ml的溶液。设标准管8管，第一管加标本稀释液900μl，第二至第八管加入标本稀释液 500μl。在第一管中加入80ng/ml的标准品溶液100μl混匀后用加样器吸出 500μl移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500μl弃去。第八管为空白对照；
3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例：1ml浓稀释液+9ml 蒸馏水)；
4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释(示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)。
检测程序：
1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置 37℃120分钟；
2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；
3.每孔中加入第一抗体工作液100ul，将反应板充分混匀后置37℃60 分钟；
4.洗板：同前；
5.每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板置37℃30分钟；
6.洗板：同前；
7.每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应15分钟；
8.每孔加入100μl终止液混匀；
9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
结果计算与判断：
1.所有OD值都应减除空白值后再行计算；
2.以标准品8000、4000、2000、1000、500、250、125和0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线；
3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应GH含量，再乘上稀释倍数即可。
结果见表4。
表4检测结果
备注：CD3Y1、Cd5y6的来源方法与MP-569相同，具体见实施例1，进行的检测方法也与实施例1相同；表4为3次重复实验的结果。
综上结果可知，MP-569(长双歧杆菌)可高产γ-氨基丁酸和5-羟色胺，它们是神经系统中的神经抑制剂，对神经元的兴奋程度有着潜在的影响，具有改善人的抑郁症状，增强记忆力，防止人脑损害的潜在能力；并且还有促进人生长激素的分泌，在人体生长发育中起着关键性作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 美益添生物医药(武汉)有限公司
<120> 一种长双歧杆菌及其培养方法和其在高产γ-氨基丁酸和5-羟色胺中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum
<400> 1
gattgcgggg tgctaccatg cagtcgaacg ggatccatca agcttgcttg gtggtgagag 60
tggcgaacgg gtgagtaatg cgtgaccgac ctgccccata caccggaata gctcctggaa 120
acgggtggta atgccggatg ctccagttga tcgcatggtc ttctgggaaa gctttcgcgg 180
tatgggatgg ggtcgcgtcc tatcagcttg acggcggggt aacggcccac cgtggcttcc 240
acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacattggga ctgagatacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagcgacgcc 360
gcgtgaggga tggaggcctt cgggttgtaa acctctttta tcggggagca agcgagagtg 420
agtttacccg ttgaataagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 480
gtgcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagggctcg taggcggttc gtcgcgtccg 540
gtgtgaaagt ccatcgctta acggtggatc cgcgccgggt acgggcgggc ttgagtgcgg 600
taggggagac tggaattccc ggtgtaacgg tggaatgtgt agatatcggg aagaacacca 660
atggcgaagg caggtctctg ggccgttact gacgctgaag agcgaaagcg tggggagcga 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg gatgctggat gtggggcccg 780
ttccacgggt tccgtgtcgg agctaacgcg ttaagcatcc cgcctgggga gtacggccgc 840
aaggctaaaa ctcaaagaaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggaaca tgcggattaa 900
ttcgatgcac gcgaaaaacc ttacctgggc ttgaatgttc ccgacggtcg aaaaatacgg 960
cttccttcgg gcgggttcca gggggtgcag gtctcccac 999
Claims (10)
1.一种长双歧杆菌，其特征在于，其保藏号为CGMCC NO.23905。
2.如权利要求1所述的长双歧杆菌的培养方法，其特征在于，其包括对所述长双歧杆菌进行厌氧培养；
优选地，所述培养的温度为30～45℃；
优选地，所述培养采用的培养基为MRS培养基。
3.如权利要求1所述的长双歧杆菌在制备用于促进垂体细胞分泌生长激素的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述长双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种；
优选地，所述垂体细胞为大鼠垂体瘤细胞。
5.一种用于促进垂体细胞分泌生长激素的产品，其特征在于，其活性成分包括如权利要求1所述的长双歧杆菌。
6.根据权利要求5所述的用于促进垂体细胞分泌生长激素的产品，其特征在于，所述长双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种；
优选地，所述垂体细胞为大鼠垂体瘤细胞。
7.如权利要求1所述的长双歧杆菌在促进垂体细胞分泌生长激素中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的；
优选地，所述垂体细胞为大鼠垂体瘤细胞。
8.如权利要求1所述的长双歧杆菌在制备高产γ-氨基丁酸和/或5-羟色胺的产品中的应用。
9.一种高产γ-氨基丁酸和/或5-羟色胺的产品，其特征在于，其活性成分包括如权利要求1所述的长双歧杆菌；
优选地，所述长双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。
10.如权利要求1所述的长双歧杆菌在生产γ-氨基丁酸和/或5-羟色胺中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN114181868A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-03-15 | 美益添生物医药(武汉)有限公司 | 一种青春双歧杆菌及其培养方法和其促进背根神经节的神经元细胞生长中的应用 |
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|---|---|
| CN114525218B (zh) | 2024-05-07 |
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