CN114502595A - 针对脊髓灰质炎病毒受体(pvr)的抗体及其用途 - Google Patents

针对脊髓灰质炎病毒受体(pvr)的抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114502595A
CN114502595A CN202080071097.9A CN202080071097A CN114502595A CN 114502595 A CN114502595 A CN 114502595A CN 202080071097 A CN202080071097 A CN 202080071097A CN 114502595 A CN114502595 A CN 114502595A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
cancer
antigen
antibody
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080071097.9A
Other languages
English (en)
Inventor
菲利普·阿尔伯茨
阿里夫·杰萨
约翰·弗兰松
亚赞·吉梅安
乔安妮·休姆
皮恩卡斯·茨克尔曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nextin Treatment Co ltd
Original Assignee
Nextin Treatment Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nextin Treatment Co ltd filed Critical Nextin Treatment Co ltd
Publication of CN114502595A publication Critical patent/CN114502595A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了与人类脊髓灰质炎病毒(PVR)结合的人源化抗体及其抗原结合片段。所述抗体可用于治疗肿瘤或癌症。

Description

针对脊髓灰质炎病毒受体(PVR)的抗体及其用途
发明领域
本发明属于免疫治疗领域，并涉及与人类脊髓灰质炎病毒受体(PVR)特异性结合的人源化抗体，包含CDR和框架序列的特定组。还包括包含这些人源化抗体的药物组合物及其用途。
发明背景
脊髓灰质炎病毒受体(PVR)又称CD155，是一种跨膜糖蛋白，参与介导细胞与细胞外基质分子的黏附。它以前被描述为一种肿瘤抗原，并作为治疗性干预的潜在靶，因为它在神经外胚层癌中的表达上调，所述神经外胚层癌包括多形胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤和结肠直肠癌(Solecki等人,J.Biol.Chem.2002,277:25697-700)以及胰腺癌(Nishiwada等人,Anticancer Res.2015,35(4):2287-97)。还已知PVR增强血清诱导的Ras-Raf-MEK-ERK信号传导激活，上调细胞周期蛋白D2和E，和下调p27Kip1，最终缩短细胞周期的G0/G1期的时间段(Kakunaga 2004,J.Biological Chemistry,279,36419-36425)。因此，阻断肿瘤细胞上的PVR预计会降低其生存力。PVR在血管生成中也具有关键作用，并被认为通过控制血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)与整合素α(v)β(3)的相互作用以及VEGFR2介导的Rap1-Akt信号传导通路来调节VEGF诱导的血管生成(Kinugasa等人,2012,Circ Res.2012,110(5),716-26)。此外，PVR与IGF1R复合，并参与酪氨酸-蛋白激酶Met(cMet)信号传导和阻断复合物形成，降低细胞生存力和血管生成(Lee等人,Scientific Reports 2014,20,4,7139)。
近年来，PVR是关键的免疫检查点配体变得明显(Brilc P.K.等人2019Cell MolImmunology)。PVR在人类和小鼠的恶性细胞和肿瘤浸润性髓系细胞二者中表达上调。PVR-/-小鼠展示出分别通过CD8+T和NK细胞的DNAM-1(CD226)上调和增强的效应物功能来降低的肿瘤生长和转移。阻断程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或阻断PD-1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)二者在PVR受限的环境中更为有效，表明了使用PD-1/PD-L1和PVR阻断的联合疗法的临床潜力(LI X.Y等人JCI 2018)。此外，在临床环境中，PD-L1和PVR的表达是被独立调节的，这允许根据PD-L1和PVR的表达水平将用抗PD-1抗体治疗的患者分层为4组。在PD-L1低表达患者中的高PVR表达富集了无应答者。使用遗传工程化的癌症模型进一步验证了这一点。这些发现支持了PVR作为肿瘤免疫治疗中关键免疫检查点的重要性(Lee B.R等人JCI.Insight 2020)。通过将癌细胞注射到小鼠尾和测量肺转移，展示出PVR参与转移。已经表明，癌细胞中上调的PVR与血小板中的其反式受体以反式相互作用，并且这种反式相互作用增强了癌细胞向肺的转移(Morimoto等人,Oncogene(2008)27,264-273)。
本发明的发明人之一的WO2017149538公开了与PVR结合的鼠抗体及其片段以及编码多核苷酸序列和产生这些抗体的杂交瘤细胞。
美国专利申请第20070041985号公开了与PVR的至少一个胞内或胞外结构域特异性结合的分子，其中所述分子具有调节表达PVR或其任何衍生物的细胞的由受体介导的黏附、转运和/或侵袭行为的能力。
美国专利申请第20090215175号提供了调节细胞的黏附、转运、侵袭和/或转移潜能所必需的PVR功能的分子(例如小化合物、寡核苷酸、多肽、抗体和抗体片段)。所述分子可用于治疗具有转移潜能的细胞、转移癌(metastasis)和癌症。
存在提供识别人类PVR的人源化抗体的未满足的需求，所述抗体更安全、更有效，并可在诊断上和治疗上用于涉及PVR表达的疾病。
发明概述
根据一些实施方案，本文描述了人源化抗体，所述人源化抗体与人类脊髓灰质炎病毒受体(PVR；CD155)特异性地结合并阻止PVR与以下配体中的至少一种结合：Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96和CD226(DNAM-1)。本发明的人源化抗体选自抗体克隆的更大集合，与其他已知的抗PVR抗体相比具有改进的特性。这些改进的特性包括但不限于降低的免疫原性潜力、改进的结合亲和力和活性、生物物理特性和改进的表达。由于PVR与CD226结合导致T和NK细胞上CD226的表面表达下调以及CD226刺激T和NK细胞和肿瘤细胞杀伤的活性降低，本发明的抗体可以恢复这些细胞上CD226的表达和/或活性。CD226的正确表达和发挥功能允许免疫细胞尤其是CD8+T细胞和NK细胞对肿瘤的杀伤增强。
通过将CDR序列的特定集合和人类框架序列组合，并在这些序列中引入特定的突变，产生具有修饰的可变区的改进抗体，从而产生了人源化抗体的大集合。新设计的人源化可变区保留了对维持抗体构象和结合亲和力至关重要的残基，同时具有最低的潜在T细胞表位发生率，从而最大限度地降低了对抗体的不良免疫应答风险。本文公开的抗体基于包括同源性、T细胞表位、关键残基和预测结构在内的因素进行设计。
出乎意料的是，具有特定人类框架与在轻链可变区CDR2的最后一个残基(根据Kabat编号，位置56)中谷氨酸到天冬酰胺的点突变的组合的变体，显示出对人类PVR的强亲和力和改进的免疫活性。
发现根据本发明的若干种人源化抗体变体由于亲和力较低而特别适合于嵌合抗原受体(CAR)应用，这可能有助于靶向高度表达的PVR肿瘤细胞，而不靶向正常组织。
有利的是，根据本发明的若干种人源化抗体变体具有改进的可生产性(producibility)，并且与其他变体相比能够以异常高的产率产生。
现已公开，本文所述的人源化抗体在细胞毒性T和NK细胞刺激以及在人源化小鼠模型(包括胰腺癌和肺癌的体内模型)中治疗癌症方面显示出高效力。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗人类PVR的高特异性、非免疫原性、人源化抗体，其具有改进的亲和力、活性和/或重现性。
根据一方面，本发明提供了与人类脊髓灰质炎病毒受体(PVR，CD155)特异性结合的人源化抗体或其至少包含抗原结合位点的片段，其中所述抗体或其片段包含重链和轻链，其中所述重链包含可变区，所述可变区具有与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述轻链包含可变区，所述可变区具有与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列至少约90％相同的氨基酸序列。
根据一些实施方案，抗体包含重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中所列的CDR序列，并且所述轻链可变区氨基酸序列包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15中所列的CDR序列。
根据一些实施方案，人源化抗体或其片段是IgG单克隆抗体。根据一些实施方案，人源化单克隆抗体具有选自IgG4和IgG1的重链恒定区。在某些实施方案中，人源化抗体或其片段是IgG4亚类。在某些实施方案中，人源化抗体或其抗原结合片段是IgG1亚类。
根据一些实施方案，人源化抗体或其片段包含在铰链区具有S228P(也称为S241P)取代的人类IgG4恒定区。
根据一些实施方案，人源化抗体或其片段是单克隆抗体、Fab、F(ab)2、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。
根据一些实施方案，人源化抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(I/V)SCKATGYTFSNYWIEW(I/V)(K/R)QAPGQGLEW(I/M)GEIFPGSGRINFNEKFKGR(A/V)TFTADTSI(D/S)T(T/A)YM(Q/E)LS(S/R)L(T/R)SDD(S/T)AVYYCARTKIYGNSFDYWGQGT(T/L)VTVSS(SEQ ID NO:47)；并且所述轻链可变区包含氨基酸序列DI(M/Q)MTQSPS(F/S)LSASVGDRVTITC(K/R)ASQDVGTAV(V/A)WYQQKPGKAPK(L/S)LIYWASSRHEGVP(D/S)RF(T/S)GSGSGTDFTLTISSLQ(S/P)EDFA(D/T)YFCQQYSRYPLTFGQGT KLEIK(SEQ ID NO:48)。
根据一些实施方案，人源化抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含：
i.一组三个CDR序列，包含SEQ ID No.10-12中所列的序列；和
ii.一组四个重链框架(FR)序列：(A)选自由SEQ ID NO:18、22和26组成的组的FR-H1；(B)选自由SEQ ID NO:19、23和28组成的组的FR-H2；(C)选自由SEQ ID NO:20、24、27和29组成的组的FR-H3；和(D)选自由SEQ ID NO:21和25组成的组的FR-H4。
根据一些实施方案，人源化抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含：
i.一组三个CDR序列，包含SEQ ID No.13-15中所列的序列；和
ii.一组四个轻链框架序列：(A)选自由SEQ ID NO:30和34组成的组的FR-L1；(B)选自由SEQ ID NO:31和37组成的组的FR-L2；(C)选自由SEQ ID NO:32、35和36组成的组的FR-L3；和(D)FR-L4是SEQ ID NO:33。
根据一些实施方案，人源化抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含：
i.一组三个CDR序列，包含SEQ ID No.10-12中所列的序列；和
ii.一组四个重链(HC)框架(FR)序列：(A)选自由SEQ ID NO:18、22和26组成的组的FR-H1；(B)选自由SEQ ID NO:19、23和28组成的组的FR-H2；(C)选自由SEQ ID NO:20、24、27和29组成的组的FR-H3；和(D)选自由SEQ ID NO:21和25组成的组的FR-H4；
并且所述轻链可变区包含：
i.一组三个CDR序列，包含SEQ ID No.13-15中所列的序列；和
ii.一组四个轻链(LC)框架(FR)序列：(A)选自由SEQ ID NO:30和34组成的组的FR-L1；(B)选自由SEQ ID NO:31和37组成的组的FR-L2；(C)选自由SEQ ID NO:32、35和36组成的组的FR-L3；和(D)FR-L4是SEQ ID NO:33。
根据一些实施方案，人源化单克隆抗体的重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列至少约90％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，人源化单克隆抗体的重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列至少约95％相同的氨基酸序列；并且轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列至少约95％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，人源化单克隆抗体的重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列至少约97％相同的氨基酸序列，并且轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列至少约97％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，人源化单克隆抗体的重链可变区包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列，并且轻链可变区包含选自由SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列。
根据一些实施方案，人源化抗体包含重链可变区和轻链可变区的组合，其中所述组合选自由以下组成的组：
i.SEQ ID NO:1中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:2中所列的轻链可变区序列；
ii.SEQ ID NO:4中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:8中所列的轻链可变区序列；
iii.SEQ ID NO:5中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:2中所列的轻链可变区序列；
iv.SEQ ID NO:5中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:8中所列的轻链可变区序列；
v.SEQ ID NO:4中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:2中所列的轻链可变区序列；
vi.SEQ ID NO:1中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:8中所列的轻链可变区序列；
vii.SEQ ID NO:6中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:2中所列的轻链可变区序列；和
viii.SEQ ID NO:6中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:8中所列的轻链可变区序列。
根据一些实施方案，人源化单克隆抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列，并且轻链可变区包含与SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。
根据一些实施方案，人源化单克隆抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，并且轻链可变区包含与SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
根据一些实施方案，人源化抗体抑制PVR与TIGIT、CD96和CD226中的至少一种的结合。
根据一些实施方案，抗体抑制PVR与TIGIT、CD96和CD226的结合。
根据一些实施方案，人源化抗体是IgG4抗体，包含SEQ ID NO:49中所列的重链序列或具有至少90％同一性的序列。根据一些实施方案，人源化抗体是IgG1，包含SEQ ID NO:50中所列的重链序列或具有至少90％同一性的序列。
根据一些实施方案，人源化抗体包含SEQ ID NO:49中所列的轻链序列。
根据一些实施方案，与其他已知抗体相比，人源化抗体表现出改进的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
根据本发明的另一方面，提供了编码人源化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。
根据一些实施方案，提供了编码如上文所述的重链可变区、轻链可变区或二者的氨基酸序列的多核苷酸序列。
根据一些实施方案，提供了编码包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的重链可变区的多核苷酸。
根据一些实施方案，提供了编码包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列的轻链可变区的多核苷酸。
根据一些实施方案，多核苷酸编码人源化抗体或其抗体片段，所述人源化抗体包含：重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列；并且所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列。重链可变区和轻链可变区的每个组合代表本发明的单独实施方案。
根据一些实施方案，编码人源化抗体重链可变区的多核苷酸序列包含选自由SEQID NO:38-42组成的组的序列或其具有至少90％序列同一性的变体。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，编码人源化抗体轻链可变区的多核苷酸序列包含选自由SEQID NO:43-46组成的组的序列或其具有至少90％序列同一性的变体。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
在另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码至少一种如本文所述的人源化抗体链或其片段的核酸分子。根据一些实施方案，核酸构建体是质粒。
还描述了包含编码本发明抗体的核酸的细胞系。细胞系用于表达如本文所述的人源化抗体或其片段。在某些实施方案中，细胞系是哺乳动物细胞系，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
根据一些实施方案，细胞系是细菌、植物、鼠(例如NS0和SP2/0)、大鼠(例如YB2/0)、仓鼠(例如BHK和CHO)或人类(例如PER.C6)。
根据一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含细胞外部分(结合结构域)，包含如本文所述的任何人源化抗体或其片段。根据一些实施方案，提供了包含上文所述重链可变区序列和轻链可变区序列的组合的CAR，该CAR具有CDR和框架序列的独特组合以及改进的结合和其他性质。
根据一些实施方案，CAR包含重链可变区和轻链可变区的组合，所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述轻链可变区包含与选自由SEQID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
根据一些实施方案，CAR包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQID NO:9组成的组的氨基酸序列。
根据一些实施方案，CAR包含人源化抗体重链可变区和轻链可变区的组合，其中所述组合选自由以下组成的组：
i.SEQ ID NO:1中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列；
ii.SEQ ID NO:3中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列；
iii.SEQ ID NO:4中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列；
iv.SEQ ID NO:5中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列；和
v.SEQ ID NO:6中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列。
根据一些实施方案，CAR包含选自由SEQ ID NO:1、3、4、5和6组成的组的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列、跨膜结构域以及细胞内T细胞信号传导结构域。
根据本发明还提供了包含本文所述抗体的重链可变区和轻链可变区的单链可变片段(scFv)。根据某些实施方案，在可变区之间存在铰链区。
根据一些实施方案，scFv的氨基酸序列在以下中列出：选自SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57的序列，及其与任一所述序列具有至少90％序列相似性的类似物。
根据一些实施方案，CAR包含SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57的任何一个中所列的氨基酸序列。
根据一些实施方案，CAR包含scFv序列和至少一个选自由CD8 Stalk结构域、CD28TM结构域、41BB结构域和CD3δ(CD3Z，Zetta)结构域组成的组的蛋白结构域。根据一些实施方案，CAR包含CD8 Stalk结构域。根据一些实施方案，CAR包含CD28 TM结构域。根据一些实施方案，CAR包含CD3Z结构域。根据一些实施方案，CAR包含41BB结构域。根据具体实施方案，CAR包含CD8 Stalk结构域、CD28 TM结构域、41BB结构域和CD3Z结构域。
根据一些实施方案，CAR包含含有上文公开的任何抗体的PVR结合位点的scFv序列，和至少一个选自由以下组成的组的结构域：CD8 Stalk结构域、CD28 TM结构域、41BB结构域和CD3Z结构域。根据具体实施方案，CAR包含含有上文公开的任何抗体的PVR结合位点的scFv序列，和CD8 Stalk结构域、CD28 TM结构域、41BB结构域和CD3Z结构域。
根据一些实施方案，提供了一种经工程化以表达本文所述CAR的淋巴细胞。根据一些实施方案，提供了经工程化以表达本文所述CAR的T细胞。根据另外的实施方案，提供了经工程化以表达本文所述CAR的NK细胞。
根据具体实施方案，提供了一种工程化T细胞，所述工程化T细胞表达选自由以下组成的组的scFv序列：SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57，或其与所述序列中的任一序列具有至少90％序列相似性的类似物；CD8 Stalk结构域、CD28 TM结构域、41BB结构域和CD3Z结构域。
根据一方面，本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的至少一种包含本文所述CAR的淋巴细胞。
根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文描述的人源化抗体或抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
可以使用任何施用方式向有相应需要的受试者施用本发明的组合物，包括胃肠外和肠内施用方式。
根据一些实施方案，药物组合物被配制用于注射或输注。根据一些实施方案，药物组合物被配制用于静脉内施用。根据一些实施方案，药物组合物被配制用于瘤内施用。
根据一些实施方案，人源化抗体或其抗原结合片段或者药物组合物用于在增加CD8+和CD4+T细胞上CD226的表面表达和/或信号传导中使用。
根据实施方案，人源化抗体或其抗原结合片段或者药物组合物用于在治疗个体的癌症中使用。在某些实施方案中，癌症包括实体瘤。在某些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：肺癌、结肠癌、胶质母细胞瘤、肾上腺癌、子宫癌、头颈癌、胰腺癌和乳腺癌。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，癌症为血液学癌症。
根据一些实施方案，血液学癌症选自白血病，包括急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)；淋巴瘤，包括霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤；以及多发性骨髓瘤。
根据一些实施方案，个体是人类。
根据本发明的一些实施方案，所述使用还包括使用使免疫共抑制受体的活性或表达下调的剂。
根据一些实施方案，免疫共抑制受体选自由以下组成的组：PD-1、PD-L1、TIGIT、CTLA-4、LAG3、TIM3、BTLA、VISTA、B7H4、CD96、BY55(CD 160)、LAIR1、SIGLEC10、CD112R、CD112、ILT-4和2B4。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据本发明的一些实施方案，所述使用还包括与抗内皮生长因子受体(EGFR)抗体联合使用。
根据另一方面，本发明提供了一种增加个体的CD8+和CD4+T细胞中CD226的表面表达和/或信号传导的方法，该方法包括向个体施用治疗有效量的本文描述的人源化抗体或其抗原结合片段或者药物组合物。在某些实施方案中，CD8+T细胞是肿瘤浸润性CD8+T细胞。
根据另一方面，本发明提供了一种治疗需要这样的治疗的个体的癌症的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的人源化抗体或其抗原结合片段或者药物组合物。在某些实施方案中，癌症包括实体瘤。根据另外的实施方案，癌症是非实体瘤。在某些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌和肺癌。在某些实施方案中，治疗癌症的方法包括阻止或减少受试者中转移癌的形成、生长或扩散。
根据另一方面，本发明提供了一种治疗患有癌症的个体的癌症的方法，所述方法包括向该个体施用治疗有效量的人源化抗体或其抗原结合片段或者药物组合物，以及PD-1信号传导抑制剂、PD-L1信号传导抑制剂、CTLA-4信号传导抑制剂或CD112R信号传导抑制剂。在某些实施方案中，癌症包括实体瘤。在某些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。在某些实施方案中，PD-1信号传导抑制剂是与PD-1结合的抗体或其片段。在某些实施方案中，与PD-1结合的抗体或其片段是派姆单抗(Pembrolizumab)、纳武单抗(Nivolumab)、AMP-514、替雷利珠单抗(Tislelizumab)、斯巴达珠单抗(Spartalizumab)，或它们的PD-1结合片段。在某些实施方案中，PD-1信号传导抑制剂是与PD-L-1或PD-L-2特异性结合的抗体。在某些实施方案中，与PD-L1或PD-L2特异性结合的抗体包括德瓦鲁单抗、阿特珠单抗、阿维单抗(Avelumab)、BMS-936559或FAZ053，或它们的PD-L1或PD-L2结合片段。在某些实施方案中，PD-1信号传导抑制剂包括与PD-1、PD-L1或PD-L2结合的Fc-融合蛋白。在某些实施方案中，Fc-融合蛋白包括AMP-224或其PD-1结合片段。在某些实施方案中，PD-1信号传导抑制剂包括PD-1、PD-L1或PD-L2的小分子抑制剂。在某些实施方案中，PD-1、PD-L1或PD-L2信号传导的小分子抑制剂包括以下中的一种或更多种：N-{2-[({2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]吡啶-3-基}甲基)氨基]乙基}乙酰胺(BMS202)；(2-((3-氰基苄基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-甲基苄基)-D-丝氨酸盐酸盐；(2R,4R)-1-(5-氯-2-((3-氰基苄基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)-4-羟基吡咯烷-2-羧酸；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基吲哚；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基-1h-吲哚；L-α-谷氨酰胺,N2,N6-双(L-丝氨酰-L-天冬酰胺酰-L-苏氨酰-L-丝氨酰-L-α-谷氨酰-L-丝氨酰-L-苯丙氨酰)-L-赖氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-缬氨酰-L-苏氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-赖氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-异亮氨酰-L-赖氨酰；(2S)-1-[[2,6-二甲氧基-4-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]苯基]甲基]-2-哌啶甲酸；甘氨酰胺,N-(2-巯基乙酰基)-L-苯基丙氨酰-N-甲基-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-N-甲基甘氨酰-L-色氨酰-L-丝氨酰-L-色氨酰-N-甲基-L-正亮氨酰-N-甲基-L-正亮氨酰-L-精氨酰-L-半胱氨酸基-,环(1→14)-硫醚；或它们的衍生物或类似物。
本文还描述了一种制备用于治疗患有癌症的个体的癌症的组合物的方法，所述方法包括混合人源化抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在某些实施方案中，癌症包括实体瘤。在某些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌和肺癌。本文还描述了一种产生人源化抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在足以允许表达和分泌人源化抗体或其抗原结合片段的条件下，在细胞培养基中孵育本文描述的细胞系。
根据一方面，本发明还提供了一种诊断或预后受试者中的癌症的方法，该方法包括使用至少一种如本文所述的人源化抗体、片段或scFv来确定所述受试者的生物样品中PVR的表达水平。
根据另一方面，本发明还提供了一种确定或定量PVR表达的方法，该方法包括使生物样品与本文所述的抗体或抗体片段接触，并测量复合物形成的水平。
根据一些实施方案，用于检测或定量PVR表达的方法包括以下步骤：
i.将样品与对PVR有特异性的抗体或其至少包含抗原结合部分的抗体片段一起孵育；
ii.使用可检测探针检测结合的PVR。
根据一些实施方案，方法还包括以下步骤：
iii.将(ii)的量与从含有已知量PVR的参考样品获得的标准曲线进行比较；和
iv.从标准曲线计算样品中PVR的量。
根据一些实施方案，方法包括如果PVR量高于对照或给定参考，则指示受试者患有PVR阳性癌。
根据一些特定的实施方案，样品是体液或实体组织。在一些实施方案中，方法在体外或离体进行。
还提供了一种用于测量生物样品中PVR表达的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种如本文所述的抗体或抗体片段和用于测量PVR表达的工具(means)。在一些实施方案中，试剂盒还包含指导试剂盒使用的说明材料。
本发明的可适用性的另外的实施方案和全部范围将从下文给出的详细描述变得明显。然而，应当理解，详细描述和具体实例，虽然指示本发明的优选的实施方案，但仅通过说明性方式给出，因为对本领域技术人员而言，本发明的精神和范围内的各种变化和修改从该详细描述将是明显的。
附图简述
本文描述的新颖的特征特别地在所附权利要求书中阐述。通过参考以下详细描述和附图将获得对本文描述的特征和特点的优点的更好理解，详细描述阐述了利用了本文描述的特点的原理的说明性示例，在附图中：
图1A-图1B.N56取代的亲和力和竞争测定。图1A.N56E和N56D变体改进了PVR结合的亲和力。Biacore测定显示N56取代(hIgG4变体)对PVR-加HIS标签(Sino Cat.no.10109-H08H)的相对和绝对亲和力。>25％的亲和力改变被认为是显著的。(*)每种变体的相对KD通过将取代的KD除以亲本N56变体(VH0VK0)的KD来确定。图1B比较了可变区携带具有单个氨基酸取代(以去除一个脱酰胺位点)的LC CDR2序列的嵌合抗体(5B9野生型-WT，具有IgG4(S241P)HC)的效力。使用亲本5B9在竞争测定中测量效力。每种变体的相对IC50通过将其IC50除以平行测试的嵌合WT抗体的IC50来确定。
图2A-图2B.N56E和N56D变体改进对猴PVR结合的交叉反应性。为了评估最大结合，用饱和剂量(10ug/ml)的N56变体单克隆抗体(在X轴示出)染色表达PVR的细胞，并通过FACS分析确定平均荧光强度(MFI)值。将每种变体的MFI除以亲本抗体(K0)的MFI来计算倍数变化。(图2A)NCI-H1975(人类肺)细胞和(图2B)Vero(非洲绿猴肾)细胞。>25％的亲和力改变被认为是显著的。
图3.N56E和N56T变体改进NK激活。为了表征N56取代变体，使用来自健康供体的人类NK细胞和作为靶细胞的MDA-MB-231以2:1的比进行CD107a诱导测定。以600pM添加Ab。K0为亲本克隆(N56)。所有变体导致显著的CD107a诱导(高于同种型IgG1的>240％)。另外，与K0相比，N56取代N56E&N56T显著改进了CD107a诱导。(*p<0.04,**p<0.01)。
图4.N56E和N56T变体改进CD8 T细胞增殖。为了表征N56变体，进行了T细胞增殖测定。在存在2.5ul/ml PHA-L的情况下并使用CFSE标记的新鲜人类PBMC，以4:1效应物靶比使用A549癌细胞。所有N56变体单克隆抗体(X轴)以4ug/ml加入，并将共培养物孵育96小时。呈现了对CD8+T细胞进行门控的FACS分析的结果。将IgG处理组的MFI除以每种变体的MFI来计算CFSE标记的相对MFI。由于增殖的增加导致CFSE信号减少，Y轴描绘了该比值的倒数值。N56E和N56T变体比亲本克隆(K0)显著增加CD8 T细胞增殖，以#标出。(*p<0.05,#<0.04,**p<0.01)。
图5A-图5B图示了通过表面等离子体共振(SPR)测量的人源化变体对人类PVR的亲和力(图5A)或通过流式细胞术测量的它们与表达PVR的HEK 293细胞的表面结合(图5B)。使用嵌合N56E突变亲本抗体(N56EVH0/Vk0)作为基线，示出了绝对结果和相对结果。
图6A-图6B显示人源化变体的表达水平(图6A)和与人类可变结构域种系序列的相似性(图6B)。显示了各个变体在HEK 293EBNA细胞中瞬时表达后的滴度(图6A)。显示了人源化重链和轻链变体与人类种系序列的可变结构域序列同一性(图6B)。
图7A-图7B比较了人源化先导变体NB1088(右图)与携带LC CDR25B9 WT序列的人源化变体NB941(左图)的生物物理特性。图7A和图7B显示NB1088在低pH(图7A)或在40℃在高浓度(图7B)胁迫测试(stress test)后，酸性物质(acidic species)的生成随时间减少。
图8A-图8D图示了NB1088与PVR结合的EC50(图8A)；NB1088抑制PVR-TIGIT结合的IC50(图8B)；NB1088抑制PVR-CD96结合的IC50(图8C)；以及NB1088抑制PVR-CD226结合的IC50(图8D)。
图9A-图9B图示了，单独的NB1088(图9A和图9B)和与派姆单抗抑制PD1联合(图9B)在使用抗原特异性T细胞测定(人类乳头瘤病毒；HPV)(图9A)或非特异性同种异体T细胞测定(图9B)的肿瘤/T细胞共培养系统中增加干扰素γ释放。**p<0.01，单因素Anova。
图10A-图10B图示了，NB1088在与内皮生长因子受体(EGFR)结合抗体联合时，在表达EGFR的乳腺癌细胞系A549中增加抗体依赖性细胞毒性(图10A)，并且这与增加的干扰素γ释放(图10B)相吻合。(*p<0.05,**p<0.01，单因素Anova)。
图11A-图11B图示了，表达PVR的肿瘤细胞系(A549或CaSki)可诱导CD8 T细胞(图11A)和NK细胞(图11B)上表达的CD226的下调，这可以被NB1088恢复，而不能被抗TIGIT恢复(图11A和图11B)。图11A显示了使用抗原特异性T细胞测定(人类乳头瘤病毒；HPV)或非特异性同种异体T细胞测定在共培养系统中获得的结果。
图12A-图12B图示了同种异体或抗原响应性CD8+T细胞对干扰素γ释放的NB1088依赖性增加(图12A)或NB1088在存在EGFR阻断的情况下诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)响应性NK细胞(图12B)依赖于CD226的活性，并且在这两种情况下，NB1088显示出优于TIGIT抑制的活性(两种Ab在10ug/ml)。
图13A-图13E图示了，NB1088在胰腺癌的人源化小鼠模型(图13A)(与派姆单抗(抗PD-1，按为这些模型建立的标准剂量给予)相当(图13B))和肺腺癌的人源化小鼠模型(图13C，人源化小鼠)中作为单一治疗(monotherapy)具有疗效，并且在这种肺腺癌模型中，疗效取决于人类免疫细胞的存在(图13D，非人源化小鼠)并与肿瘤浸润性CD8+T细胞上CD226表达增加有关(图13E)。(*p<0.05,***p<0.001，通过双因素Anova)。
图14A-图14D与图13C和图13E的模型相关并图示了，NB1088增加干扰素γ阳性(图14A)和干扰素γ/CD107a双阳性(图14B)CD8 TIL细胞的频率，并且NB1088增加干扰素γ+/CD226+双阳性CD8 T细胞的频率(图14D)，但不增加干扰素γ+/CD226-单阳性CD8 T细胞的频率(图14C)。*p＝0.0210***<0.0001，未配对T检验。
图15A-图15B图示了在用不同剂量的抗体治疗一次(20mg/kg剂量和50mg/kg剂量)或间隔一周治疗4次(200mg/kg剂量)的食蟹猴中NB1088的药代动力学(图15A)和循环CD4 T细胞上相应的CD226表面表达的药效学变化(图15B)。
图16显示了通过免疫组织化学测量并通过H-评分评价的人类PVR跨越不同癌症类型的活组织检查中的表达。
图17是CAR-T构建体的一般示意绘图。scFv包含根据本发明的人源化抗体的重链和轻链(分别地，VH和VL)。
图18图示了过表达αPVR CAR-T构建体的Jurkat细胞的白细胞介素2(IL2)分泌比亲本Jurkat细胞稳健。将亲本Jurkat细胞或过表达αPVR CAR-T构建体H4K2-NTX1088C或H3K4-NTX1034C的Jurkat细胞(40K个细胞/孔)与A549或MDA-231细胞按1:1E:T比一起孵育24小时。使用Biolegend hIL-2(cat.431804)定量IL2分泌。在存在所示靶的情况下，两个CAR-T驱动物(drivers)使IL2分泌比亲本Jurkat细胞增加了超过100倍。
图19A-图19C图示了抗PVR(αPVR)CAR-T增加了靶细胞杀伤。将A549(图19A)或MDA-231(图19B)细胞(均以200K个细胞)分别以0.4和0.8比1的E:T比(基于GFP阳性)在含有CAR-T-PVR变体NTX-1088C和NTX-1034C的12孔板中在NK培养基中铺板72小时。使用标准CTG方案(Promega G9241)评估肿瘤细胞杀伤。
图20.图示了αPVR CAR-T对血液靶细胞的有效杀伤。按X轴所示的E:T比，将K562(一种AML模型)细胞与αPVR CAR-T变体NTX-1088C和NTX-1034C在RPMI+IL-2中一起孵育18小时。使用流式细胞术评估肿瘤细胞杀伤。观察到两个CAR-T驱动物的明显靶细胞杀伤。
发明详述
本发明提供了识别脊髓灰质炎病毒受体(PVR)的人源化单克隆抗体。有利的是，本发明的抗体是几乎完全人源化的，因此避免了对抗体的不利免疫应答的风险，并因此对人类体内使用是安全的。本发明的抗体的特征在于具有独特的CDR序列和新颖的人源化框架序列和设计。更具体地，本发明提供的单克隆抗体具有CDR和非完全人源化框架序列的特定组合，并且具有独特的性质，并且具有超过已知抗PVR抗体的改进的安全性和效力。
与包含相同CDR区的其他人源化PVR抗体相比，本文描述的一些变体具有增加的可生产性并且以更高的水平表达。本文还公开了使用这些抗体治疗个体的癌症的方法。
在下面的描述中，为了提供对各种实施方案的透彻理解，列出了某些具体细节。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践所提供的实施方案。除非上下文另有要求，否则在说明书和所附权利要求书中，“包括(comprise)”一词及其变化形式诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”，应以开放式、包含的意义解释，即“包括但不限于”。如本说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另有清楚指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数的提示物。还应当注意，术语“或”通常以其包括“和/或”的意义使用，除非上下文另有明确规定。此外，本文提供的标题仅是为了方便，并不解释所要求保护的实施方案的范围或含义。
本文使用的术语“PVR”是指脊髓灰质炎病毒受体，根据一些实施方案也称为CD155(分化簇155)，蛋白ID：Q92692。PVR是一种跨膜糖蛋白，具有N末端信号序列、三个胞外免疫球蛋白(Ig)样结构域、跨膜结构域和胞质尾。PVR具有的分子大小为约80kDa，并且结构包含三个Ig样结构域，具体为最外侧的一个V样结构域和随后两个C2样结构域。本文所述的人源化抗体具有针对人类PVR(hPVR)的亲和力。在一些实施方案中，抗体具有对来自其他动物，特别是灵长类的PVR蛋白的一定亲和力。有利的是，对其他灵长类动物诸如非洲绿猴的亲和力，使得能够在非临床试验中进一步测试人源化抗体的安全性和有效性。没有观察到对来自进化上较远的动物诸如啮齿类的PVR的亲和力。
如本文所用的，术语“约”是指以10％或更少的差额接近所述量的量。
如本文所用的，术语“个体”、“患者”或“受试者”是指被诊断患有、怀疑患有至少一种疾病或处于发展至少一种疾病风险的个体，所述组合物和方法可用于治疗该疾病。根据一些实施方案，个体是哺乳动物。根据一些实施方案，哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马、奶牛、绵羊、猪、山羊、美洲驼、羊驼或牦牛。根据一些实施方案，个体是人类。
如本文所用的，术语“联合(combination)”或“联合治疗”可以指待联合的物品的并行施用或待联合的物品的相继施用。如本文所述，当联合指的是物品的相继施用时，可以以任何时间顺序施用物品。
术语“癌症”和“肿瘤”是指哺乳动物的以细胞生长失控为特征的生理状况。癌症是其中一组细胞表现出不受控制的生长或不期望的生长的一类疾病。癌细胞也可以扩散到其他位置，这可导致转移癌的形成。例如，癌细胞在体内的扩散可以通过淋巴或血液发生。不受控制的生长、侵入和转移形成也被称为癌症的恶性特征。这些恶性特性将癌症与良性肿瘤区分开来，良性肿瘤通常不会侵袭或转移。
如本文所用，术语“有效量”是指向哺乳动物施用时引起生物效应的治疗剂的量。生物学效应包括但不限于抑制或阻断受体配体相互作用(例如，PVR-TIGIT、PD-1-PD-L1/PD-L-2)、抑制信号传导途径、减少肿瘤生长、减少肿瘤转移或延长携带肿瘤的动物的生存期。“治疗量”是一种被计算以发挥治疗作用的药物的浓度。治疗量涵盖能够在个体群体中引起治疗反应的剂量范围。哺乳动物可以是人类个体。人类个体可以患有或怀疑患有或正患有肿瘤。
如本文所用，“检查点抑制剂”是指抑制由生物体产生的负调节生物体中T细胞的抗肿瘤/癌症活性的生物分子(“检查点分子”)的药物。检查点分子包括但不限于PD-1、PD-L-1、PD-L-2、CTLA4、TIM-3、LAG-3、VISTA、SIGLEC7、PVR、TIGIT、IDO、KIR、A2AR、B7-H3、B7H4、CEACAM1、NOX2、CD112R和CD112。
所提供的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体和多反应性抗体)和抗体片段。抗体包括抗体缀合物和包含抗体的分子，诸如嵌合分子。因此，抗体包括但不限于全长，以及其保留其结合特异性的片段和部分，诸如其任何特异性结合部分，包括具有任何数量的免疫球蛋白类别和/或同种型(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE和IgM)的片段和部分；以及生物相关(抗原结合)片段或其特异性结合部分，包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fv和scFv(单链或相关实体)。单克隆抗体通常是基本上均一的抗体的组合物中的一种；因此，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，包含在单克隆抗体组合物中的任何单个抗体都是相同的。多克隆抗体是包括不同序列的不同抗体的制品，通常针对两种或更多种不同的决定簇(表位)。单克隆抗体可包含人类IgG1恒定区。单克隆抗体可包含人类IgG4恒定区。
本文的术语“抗体”以最广义使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和其功能(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段，包括单链可变片段(sFv或scFv)和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语涵盖遗传工程化的和/或其他修饰形式的免疫球蛋白，诸如内抗体(intrabodies)、肽体(peptibodies)、完全人类抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性抗体，例如双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联双scFv、串联三scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。该术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD。抗体可包含人类IgG1恒定区。抗体可包含人类IgG4恒定区。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在本领域中已知是指抗体可变区中氨基酸的非连续序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。一般来说，每个重链可变区有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)并且每个轻链可变区有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中已知是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。一般来说，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任何一个来容易地确定，包括以下描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)，Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysisand binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorvariable domains and Ig superfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003Jan；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numberingscheme for immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysistool,”J Mol Biol,2001Jun 8；309(3):657-70,(“Aho”编号方案)；以及Whitelegg NR和Rees AR,“WAM:an improved algorithm for modelling antibodies on the WEB,”Protein Eng.2000Dec；13(12):819-24(“AbM”编号方案)。在某些实施方案中，本文所述抗体的CDR可以通过选自Kabat、Chothia、IMGT、Aho、AbM或其组合的方法来定义。
给定CDR或FR的边界可以根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案基于结构对比(structural alignments)，而Chothia方案基于结构信息。Kabat和Chothia方案二者的编号基于最常见的抗体区域序列长度，其中插入通过插入字母(例如“30a”)来顺应，并且一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“得失位(indels)”)放置在不同的位置，导致不同的编号。Contact方案基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别地，VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包括四个保守框架区(FR)和三个CDR(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,6thed.,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以通过以下来分离：使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域来分别筛选互补VL或VH结构域的文库(参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991))。
提供的抗体中有抗体片段。“抗体片段”是指包含完整抗体的一部分、与完整抗体所结合的抗原结合的不同于完整抗体的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv或sFv)；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。在特定的实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，诸如scFv。
本文使用的术语“抗原”是指能够引发抗体形成并被抗体特异性结合的分子或分子的一部分。抗原可能具有一个或多于一个表位。上文提到的特异性结合意指抗原以高度选择性的方式与其相应抗体反应，并且不与可能由其他抗原激起的大量其他抗体反应。根据本发明的一些实施方案的抗原是人类PVR。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是通过重组产生的片段，诸如包含不是天然存在的排列的片段，诸如具有两个或更多个由合成接头(例如多肽接头)连接的抗体区域或链的片段，和/或那些不是通过酶消化天然存在的完整抗体而产生的片段。根据一些实施方案，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是其中全部或基本上全部CDR氨基酸残基来源于非人类CDR并且全部或基本上全部FR氨基酸残基来源于人类FR的抗体。人源化抗体可任选地包括源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人类抗体的“人源化形式”是指经过人源化的非人类抗体的变体，通常是为了降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性和亲和力。根据一些实施方案，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人类抗体(例如，从其衍生CDR残基的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
“人类抗体”是具有与由人类或人类细胞、或利用人类抗体谱库(repertoires)或其他人类抗体编码序列的非人类来源、包括人类抗体文库产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。该术语不包括含有非人类抗原结合区域的非人类抗体的人源化形式，诸如其中所有或基本上所有CDR是非人类的抗体。
术语“多肽”和“蛋白”可互换地用于指氨基酸残基的聚合物，并且不限于某个最小长度。多肽，包括所提供的抗体和抗体链以及其他肽，例如接头和结合肽，可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。根据一些实施方案，只要蛋白质保持期望的活性，多肽可以包含关于自然或天然序列的修饰。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是偶然的，诸如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误。
关于参考多肽序列的序列同一性百分比(％)是在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中与参考多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以各种已知的方式实现，例如使用公共可得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。能够确定用于对比序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大对比所需的算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已与用户文档一起在美国版权局(U.S.CopyrightOffice,Washington D.C.,20559)注册，在美国版权局它以美国版权注册号TXU510087注册。公众可以从Genentech,Inc.,South San Francisco,Calif.获得ALIGN-2程序，也可以从源代码编译。ALIGN-2程序应编译为在UNIX操作系统上使用，包括digital UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置，并且没有改变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A对、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可替换地被表述为具有或包含对、与或针对给定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另有特别说明，否则本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是使用ALIGN-2计算机程序如前一段所述获得的。
当在本文用于描述氨基酸序列或核酸序列时，相对于参考序列的术语“同源的”、“同源性”或“同源性百分比”可以使用Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990,根据Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877,1993修改)描述的公式来确定。这样的公式被并入Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中。序列的同源性百分比可以使用截至本申请提交日期的最新版本的BLAST来确定。
在一些实施方案中，设想了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。变体典型地在一个或更多个取代、缺失、添加和/或插入方面不同于本文具体公开的多肽。这样的变体可以是天然存在的，或者可以是通过合成产生的，例如，通过修饰本发明的一个或更多个上文的多肽序列和评价如本文所述的多肽的一种或更多种生物活性和/或使用许多已知技术中的任何一种。例如，可能期望改进抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。这样的修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列中缺失和/或插入和/或取代残基。可以进行缺失、插入和取代的任何组合来得到最终构建体，条件是最终构建体具有期望的特征例如抗原结合。
在一些实施方案中，提供了具有一个或更多个氨基酸取代的抗体变体。用于通过取代进行诱变的感兴趣的位点包括CDR和FR。可以将氨基酸取代引入感兴趣的抗体中，并筛选产物的期望活性，例如，保留/改进抗原结合，降低免疫原性，或改进抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一些实施方案中，取代、插入或缺失可以发生在一个或更多个CDR内，其中所述取代、插入或缺失并不实质上降低抗体与抗原的结合。例如，可以在CDR中进行不实质上降低结合亲和力的保守取代。这样的改变可以在CDR“热点”之外。在变体VH和VL序列的一些实施方案中，每个CDR是不变的。
改变(例如，取代)可以在CDR中进行，例如以改进抗体亲和力。在体细胞成熟过程中，这样的改变可能在编码高突变率密码子的CDR中进行(参见例如，Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))，并且可以测试所产生的变体的结合亲和力。亲和力成熟(例如，使用易错PCR、链改组、CDR随机化或寡核苷酸定向诱变)可用于改进抗体亲和力(参见例如，Hoogenboom等人，于Methods in Molecular Biology 178:1-37(2001))。参与抗原结合的CDR残基可以具体地鉴定，例如使用丙氨酸扫描诱变或建模(参见例如，Cunningham和Wells Science,244:1081-1085(1989))。特别是CDR-H3和CDR-L3经常被靶向。可选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构，以识别抗体和抗原之间的接触点。这样的接触残基和邻近残基可以被靶向或作为取代的候选物被消除。可以对变体进行筛选，以确定它们是否包含期望的特性。
氨基酸序列插入和缺失包括长度范围为一个残基到含有100个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多于一个氨基酸残基的序列内插入和缺失。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酸残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-末端与酶(例如，对于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。抗体分子的序列内插入变体的实例包括在轻链中插入3个氨基酸。末端缺失的实例包括在轻链末端缺失7个或更少氨基酸的抗体。
在一些实施方案中，本文提供的抗体对抗体靶人类脊髓灰质炎病毒受体(CD155)具有的解离常数(KD)为约1μm、100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM或0.001nM或更小(例如，10-8M或更小，例如，10-8M至10-13M，例如，10- 9M至10-13M)。KD可以通过任何合适的测定来测量。在某些实施方案中，KD可以使用表面等离子体共振(SPR)测定(例如，使用
Figure BDA0003587397400000262
或
Figure BDA0003587397400000261
)来测量。
在一些实施方案中，可以将一个或更多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区，从而产生Fc区变体。本文的Fc区是含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C末端区。Fc区包括天然序列Fc区和变体Fc区。Fc区变体可包括在一个或更多个氨基酸位置处包含修饰(例如，取代)的人类Fc区序列(例如，人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体是具有一些但不是所有效应物功能的变体，这使得其成为用于其中抗体在体内的半衰期是重要的而某些效应物功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的应用的期望候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利第5,500,362号和第5,821,337号。可选地，可以采用非放射性测定方法(例如，ACTITM和CytoTox
Figure BDA0003587397400000271
非放射性细胞毒性测定)。用于这样的测定的有用效应物细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞。
抗体可以具有增加的半衰期和改进的与新生Fc受体(FcRn)的结合(参见，US2005/0014934)。这样的抗体可以包含其中具有改进Fc区与FcRn结合的一个或更多个取代的Fc区，并且包括在以下Fc区残基中的一个或更多个处具有取代的那些：根据EU编号系统(参见例如美国专利第7,371,826号)的238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434。还设想了Fc区变体的其他实例(参见例如，Duncan&Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260和5,624,821号；和WO94/29351)。
在一些实施方案中，可以期望产生半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或更多个残基被半胱氨酸残基取代。根据一些实施方案，取代的残基出现在抗体的可及位点。反应性硫醇基团可以定位在用于与其他部分诸如药物部分或接头药物部分缀合的位点处，以产生免疫缀合物。在一些实施方案中，以下残基中的任何一个或更多个可被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。
在一些实施方案中，本文提供的抗体可进一步修饰以包含已知和可得的另外的非蛋白部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和右旋糖酐或聚(n乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基多元醇(例如，甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性，在制造上可以具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支化的或非支化的。附接至抗体的聚合物的数量可以不同，并且如果附接了两个或更多个聚合物，聚合物可以是相同的或不同的分子。
本文描述的抗体可以由核酸编码。核酸是包含两个或更多个核苷酸碱基的多核苷酸的类型。在某些实施方案中，核酸是可用于将编码多肽的多核苷酸转移到细胞中的载体的组分。如本文使用的，术语“载体”是指能够转运与其相连的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合载体，或“整合载体”，它可以被整合到宿主细胞的染色体DNA中。另一种类型的载体是“附加体”载体，例如能够在染色体外复制的核酸。能够指导与它们可操作地连接的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。合适的载体包括质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、病毒载体等。在表达载体中，用于控制转录的调控元件诸如启动子、增强子、多腺苷酸信号可以来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫的基因。在宿主中复制的能力，通常是由复制起点赋予的，并且促进识别转化体的选择基因也可以另外地被掺入。可以使用来源于病毒的载体，诸如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。质粒载体可以是线性化的以整合到染色体位置中。载体可以包含指导位点特异性整合到基因组中定义的位置或限制性位点集合(例如，AttP-AttB重组)的序列。此外，载体可以包括来源于转座元件的序列。
编码本文所述抗体的核酸可用于感染、转染、转化或以其他方式使适合的细胞对核酸是转基因的，从而使得能够产生用于商业或治疗用途的抗体。用于从大规模细胞培养物产生抗体的标准细胞系和方法是本领域已知的。在某些实施方案中，细胞为真核细胞。在某些实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞是可用于产生抗体的细胞系，是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞或
Figure BDA0003587397400000281
细胞。在某些实施方案中，编码抗体的核酸被整合到可用于产生抗体的细胞的基因组位点中。在某些实施方案中，本文描述了一种制备抗体的方法，所述方法包括在体外足以允许所述抗体的产生和分泌的条件下培养包含编码抗体的核酸的细胞。
在某些实施方案中，本文描述了主细胞库，包含：(a)哺乳动物细胞系，其包含在基因组位置整合的编码本文所述抗体的核酸；和(b)冷冻保护剂。在某些实施方案中，冷冻保护剂包括甘油。在某些实施方案中，主细胞库包含：(a)CHO细胞系，其包含在基因组位置整合的编码抗体的核酸，所述抗体具有(i)由SEQ ID NO:1、3、4、5或6中的任一种所列的重链氨基酸序列和(ii)由SEQ ID NO:2、7、8或9中的任一种所列的轻链氨基酸序列；和(b)冷冻保护剂。在某些实施方案中，冷冻保护剂包括甘油。在某些实施方案中，主细胞库被容纳在能够经受液氮冷冻的合适的小瓶或容器中。
本文还描述了制备本文所述抗体的方法。这样的方法包括在足以允许抗体表达和分泌的条件下在细胞培养基中孵育包含编码抗体的核酸的细胞或细胞系，并进一步从细胞培养基收获抗体。收获还可包括一个或更多个纯化步骤，以去除活细胞、细胞碎片、非抗体蛋白或多肽、不希望的盐、缓冲液和培养基成分。在某些实施方案中，另外的纯化步骤包括离心、超速离心、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L纯化和/或离子交换层析。
本文所述抗体
在特定方面，本文描述了抗人类PVR(抗hPVR)抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段在PVR-TIGIT界面处与人类PVR结合。在某些实施方案中，抗hPVR抗体或其抗原结合片段能够与TIGIT、CD96和CD226中的任何一种或更多种竞争。
在某些实施方案中，人源化抗体或其抗原结合片段与人类PVR结合的EC50小于约10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM或0.01nM。在某些实施方案中，hPVR抗体与PVR结合的EC50在约5nM和1nM之间、约5nM和约2nM之间、约4nM和约2nM之间、约4nM和约3nM之间或约3nM和约2nM之间。
半最大有效浓度(EC50)是指在特定的暴露时间后，诱导在基线和最大值之间一半的响应的抗体浓度。
根据一些实施方案，抗体是重组抗体。根据具体实施方案，抗体是重组人源化单克隆抗体。
根据一些实施方案，人源化抗体或其抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的重链序列。
根据一些实施方案，人源化抗体或其抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO:2、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的轻链序列。
根据一些实施方案，人源化抗体或其抗原结合片段是NB1088(SEQ ID NO:1和SEQID NO:2)。
在一方面，本文描述了一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述轻链包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段与人类脊髓灰质炎病毒受体(CD155)结合。
在另一方面，本文描述了一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和免疫球蛋白轻链，其中所述重链包含与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含与SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段与人类脊髓灰质炎病毒受体(CD155)结合。
在某些实施方案中，本文描述了一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列至少约95％相同的氨基酸序列；并且其中所述轻链包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9组成的组的序列至少约95％相同的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段与人类脊髓灰质炎病毒受体(CD155)结合。
在某些实施方案中，本文描述了一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中所述抗体或抗原结合片段与人类脊髓灰质炎病毒受体(CD155)结合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
在某些实施方案中，本文描述了一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链包含与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列至少约98％相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含与SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列至少约98％相同的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段与人类脊髓灰质炎病毒受体(CD155)结合。
在某些实施方案中，本文描述了一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链包含与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列至少约99％相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含与SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列至少约99％相同的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段与人类脊髓灰质炎病毒受体(CD155)结合。
在某些实施方案中，本文描述了一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链包含与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含与SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段与人类脊髓灰质炎病毒受体(CD155)结合。
根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1中所列的重链序列和SEQ ID NO:7中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:1中所列的重链序列和SEQ ID NO:8中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1中所列的重链序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:3中所列的重链序列和SEQ ID NO:2中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:3中所列的重链序列和SEQ ID NO:7中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:3中所列的重链序列和SEQ ID NO:8中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:3中所列的重链序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4中所列的重链序列和SEQID NO:2中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4中所列的重链序列和SEQ ID NO:7中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4中所列的重链序列和SEQ ID NO:8中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4中所列的重链序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:5中所列的重链序列和SEQ ID NO:2中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:5中所列的重链序列和SEQ ID NO:7中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:5中所列的重链序列和SEQ ID NO:8中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:5中所列的重链序列和SEQ IDNO:9中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:6中所列的重链序列和SEQ ID NO:2中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:6中所列的重链序列和SEQ ID NO:7中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:6中所列的重链序列和SEQ ID NO:8中所列的轻链序列。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:6中所列的重链序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链序列。
根据一些实施方案，人源化抗体或其抗原结合片段包含的重链包含氨基酸序列QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(I/V)SCKATGYTFSNYWIEW(I/V)(K/R)QAPGQGLEW(I/M)GEIFPGSGRINFNEKFKGR(A/V)TFTADTSI(D/S)T(T/A)YM(Q/E)LS(S/R)L(T/R)SDD(S/T)AVYYCARTKIYGNSFDYWGQGT(T/L)VTVSS(SEQ ID NO:47)；并且轻链包含氨基酸序列DI(M/Q)MTQSPS(F/S)LSASVGDRVTITC(K/R)ASQDVGTAV(V/A)WYQQ KPGKAPK(L/S)LIYWASSRHEGVP(D/S)RF(T/S)GSGSGTDFTLTISSLQ(S/P)EDFA(D/T)YFCQQYSRYPLTFGQGT KLEIK(SEQ ID NO:48)。
根据一些实施方案，重链包含SEQ ID NO:47中所列的氨基酸序列，其中位置11是L，或者位置20是I，或者位置37是I，或者位置38是K，或者位置48是I，或者位置68是A，或者位置77是D，或者位置79是T，或者位置82是Q，或者位置85是S，或者位置87是T，或者位置91是S，或者位置114是T，或者它们的任何组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，所述重链包含SEQ ID NO:47中所列的氨基酸序列，其中位置11是V，或者位置20是I，或者位置37是I，或者位置38是K，或者位置48是I，或者位置68是A，或者位置77是D，或者位置79是T，或者位置82是E，或者位置85是R，或者位置87是R，或者位置91是T，或者位置114是L，或者它们的任何组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，重链包含SEQ ID NO:47中所列的氨基酸序列，其中位置11是V，或者位置20是V，或者位置37是V，或者位置38是R，或者位置48是M，或者位置68是V，或者位置77是S，或者位置79是A，或者位置82是E，或者位置85是R，或者位置87是R，或者位置91是T，或者位置114是L，或者它们的任何组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，重链包含SEQ ID NO:47中所列的氨基酸序列，其中位置11是V，或者位置20是V，或者位置37是I，或者位置38是K，或者位置48是I，或者位置68是V，或者位置77是S，或者位置79是T，或者位置82是E，或者位置85是R，或者位置87是R，或者位置91是T，或者位置114是L，或者它们的任何组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，重链包含SEQ ID NO:47中所列的氨基酸序列，其中位置11是V，或者位置20是V，或者位置37是V，或者位置38是R，或者位置48是I，或者位置68是V，或者位置77是S，或者位置79是T，或者位置82是E，或者位置85是R，或者位置87是R，或者位置91是T，或者位置114是L，或者它们的任何组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，轻链包含SEQ ID NO:48中所列的氨基酸序列，其中位置3是M，或者位置10是F，或者位置24是K，或者位置34是V，或者位置46是L，或者位置60是D，或者位置63是T，或者位置80是S，或者位置85是D，或者它们的任何组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，轻链包含SEQ ID NO:48中所列的氨基酸序列，其中位置3是Q，或者位置10是S，或者位置24是K，或者位置34是V，或者位置46是L，或者位置60是D，或者位置63是S，或者位置80是P，或者位置85是D，或者它们的任何组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，轻链包含SEQ ID NO:48中所列的氨基酸序列，其中位置3是Q，或者位置10是S，或者位置24是R，或者位置34是V，或者位置46是L，或者位置60是S，或者位置63是S，或者位置80是P，或者位置85是T，或者它们的任何组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，轻链包含SEQ ID NO:48中所列的氨基酸序列，其中位置3是Q，或者位置10是S，或者位置24是R，或者位置34是A，或者位置46是L，或者位置60是S，或者位置63是S，或者位置80是P，或者位置85是T，或者它们的任何组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，人源化抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链包含SEQ ID NO:47中所列的氨基酸序列，其中位置11是V，或位置20是V，或位置37是V，或位置38是R，或位置48是I，或位置68是V，或位置77是S，或位置79是T，或位置82是E，或位置85是R，或位置87是R，或位置91是T，或位置114是L，或它们的任何组合；并且所述轻链包含SEQ ID NO:48中所列的氨基酸序列，其中位置3是Q，或者位置10是S，或者位置24是K，或者位置34是V，或者位置46是L，或者位置60是D，或者位置63是S，或者位置80是P，或者位置85是D，或者它们的任何组合。
根据另外的实施方案，重链CDR1序列是GYTFSNYWIE(SEQ ID NO:58)。
根据一些实施方案，抗体的人类恒定区选自由以下组成的组：人类IgG1、人类IgG2、人类IgG3和人类IgG4。
根据一些实施方案，抗体的人类恒定区选自由以下组成的组：人类IgG1和人类IgG4。
根据一些实施方案，人源化抗体是IgG4抗体，包含SEQ ID NO:49中所列的重链序列或具有至少90％同一性的序列。根据一些实施方案，人源化抗体是IgG1，包含SEQ ID NO:50中所列的重链序列或具有至少90％同一性的序列。
根据一些实施方案，人源化抗体包含SEQ ID NO:49中所列的轻链序列。
治疗方法
在某些实施方案中，本文公开了可用于治疗癌症或肿瘤的抗hPVR抗体。治疗是指寻求改善或减轻被治疗的状况的方法。对于癌症，治疗包括但不限于，减少肿瘤体积，减少肿瘤体积的增长，增加无进展存活期，或总体寿命预期。在某些实施方案中，治疗会影响被治疗的癌症的缓解。在某些实施方案中，治疗包括作为意在防止先前治疗的癌症或肿瘤的再次发生或进展的预防或维持剂量的使用。本领域的技术人员理解，并非所有的个体都会对所施用的治疗做出同样的或全然的反应，然而这些个体被认为是被治疗的。
在某些实施方案中，本文所述的抗hPVR抗体和抗原结合片段用于制造用于治疗PVR阳性癌症的药物或在用于治疗PVR阳性癌症的方法中使用的药物。
在某些实施方案中，本文所述的抗hPVR抗体或抗原结合片段用于治疗用检查点抑制剂治疗作为单一治疗难治的癌症或肿瘤。难治的癌症是指尽管使用单独的检查点抑制剂治疗，但仍发展进展性疾病的癌症/肿瘤。在某些实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂。在某些实施方案中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂是与PD-1(CD279)特异性结合的抗体或抗原结合片段，包括派姆单抗、纳武单抗、AMP-514、斯巴达珠单抗、替雷利珠单抗(BGB-A317)或它们的PD-1(CD279)结合片段。在某些实施方案中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂是PD-L2 Fc融合蛋白(例如AMP-224)。在某些实施方案中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂包括与PD-L1(CD274)特异性结合的抗体或PD-L1结合片段。在某些实施方案中，与PD-L1(CD274)特异性结合的抗体或抗原结合片段包括德瓦鲁单抗(MEDI 4376)、阿特珠单抗、阿维单抗、BMS-936559或FAZ053，或它们的PD-L1(CD274)结合片段。在某些实施方案中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂包括与PD-L2(CD273)特异性结合的抗体或其PD-L2结合片段。在某些实施方案中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂包括一种或更多种小分子抑制剂，诸如N-{2-[({2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]吡啶-3-基}甲基)氨基]乙基}乙酰胺(BMS202)；(2-((3-氰基苄基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-甲基苄基)-D-丝氨酸盐酸盐；(2R,4R)-1-(5-氯-2-((3-氰基苄基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)-4-羟基吡咯烷-2-羧酸；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基吲哚；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基-1h-吲哚；L-α-谷氨酰胺,N2,N6-双(L-丝氨酰-L-天冬酰胺酰-L-苏氨酰-L-丝氨酰-L-α-谷氨酰-L-丝氨酰-L-苯丙氨酰)-L-赖氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-缬氨酰-L-苏氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-赖氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-异亮氨酰-L-赖氨酰；(2S)-1-[[2,6-二甲氧基-4-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]苯基]甲基]-2-哌啶甲酸；甘氨酰胺,N-(2-巯基乙酰基)-L-苯基丙氨酰-N-甲基-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-N-甲基甘氨酰-L-色氨酰-L-丝氨酰-L-色氨酰-N-甲基-L-正亮氨酰-N-甲基-L-正亮氨酰-L-精氨酰-L-半胱氨酸基-,环(1→14)-硫醚；或它们的衍生物或类似物。
在某些实施方案中，抗hPVR抗体或其抗原结合片段与PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂联合使用。在某些实施方案中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂是与PD-1(CD279)特异性结合的抗体或抗原结合片段，包括派姆单抗、纳武单抗、AMP-514、斯巴达珠单抗、替雷利珠单抗(BGB-A317)或它们的PD-1(CD279)结合片段。在某些实施方案中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂是PD-L2 Fc融合蛋白(例如AMP-224)。在某些实施方案中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂包括与PD-L-1(CD274)特异性结合的抗体或PD-L-1结合片段。在某些实施方案中，与PD-L-1(CD274)特异性结合的抗体或抗原结合片段包括德瓦鲁单抗(MEDI 4376)、阿特珠单抗、阿维单抗、BMS-936559或FAZ053，或它们的PD-L-1(CD274)结合片段。在某些实施方案中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂包括与PD-L2(CD273)特异性结合的抗体或其PD-L2结合片段。在某些实施方案中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂包括一种或更多种小分子抑制剂，诸如N-{2-[({2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]吡啶-3-基}甲基)氨基]乙基}乙酰胺(BMS202)；(2-((3-氰基苄基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)-2-甲基苄基)氧基)-5-甲基苄基)-D-丝氨酸盐酸盐；(2R,4R)-1-(5-氯-2-((3-氰基苄基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)-2-甲基苄基)氧基)苄基)-4-羟基吡咯烷-2-羧酸；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基吲哚；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基-1h-吲哚；L-α-谷氨酰胺,N2,N6-双(L-丝氨酰-L-天冬酰胺酰-L-苏氨酰-L-丝氨酰-L-α-谷氨酰-L-丝氨酰-L-苯丙氨酰)-L-赖氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-缬氨酰-L-苏氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-赖氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-异亮氨酰-L-赖氨酰；(2S)-1-[[2,6-二甲氧基-4-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]苯基]甲基]-2-哌啶甲酸；甘氨酰胺,N-(2-巯基乙酰基)-L-苯基丙氨酰-N-甲基-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-N-甲基甘氨酰-L-色氨酰-L-丝氨酰-L-色氨酰-N-甲基-L-正亮氨酰-N-甲基-L-正亮氨酰-L-精氨酰-L-半胱氨酸基-,环(1→14)-硫醚；或它们的衍生物或类似物。
在某些实施方案中，抗hPVR抗体或其抗原结合片段与EGFR抑制剂或EGFR结合抗体联合使用。
在某些实施方案中，抗hPVR抗体或其抗原结合片段用于在治疗癌症或肿瘤中使用。在某些实施方案中，癌症或肿瘤是实体癌症或肿瘤。在某些实施方案中，癌症或肿瘤是血液癌症或肿瘤。在某些实施方案中，癌症或肿瘤包括乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头、颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸和/或肝的肿瘤。在某些实施方案中，可用本发明抗体治疗的肿瘤包括腺瘤、腺癌、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和/或畸胎瘤。在某些实施方案中，肿瘤/癌症选自由以下组成的组：肢端雀斑痣样黑素瘤、光化性角化病、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞状癌、星形细胞肿瘤、巴氏腺癌(Bartholin gland carcinoma)、基底细胞癌、支气管腺癌、毛细血管类癌、上皮癌(carcinoma)、癌肉瘤、胆管癌、软骨肉瘤、囊腺瘤、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、室管膜肉瘤、尤因肉瘤、局灶性结节增生、胃泌素瘤、生殖细胞肿瘤、胶质母细胞瘤、胰升血糖素瘤、血管成母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝细胞癌、insulinite、上皮内瘤形成、上皮内鳞状细胞瘤形成、侵袭性鳞状细胞癌、大细胞癌、脂肪肉瘤、肺癌、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、平滑肌肉瘤、黑素瘤、恶性黑素瘤、恶性间皮瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、间皮瘤、黏液表皮样癌、髓系白血病、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状浆液性腺癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、前列腺癌、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、软组织癌、生长抑素分泌瘤、鳞状癌、鳞状细胞癌、未分化癌、葡萄膜黑素瘤、疣状癌、阴道/外阴癌、舒血管肠肽瘤和肾母细胞瘤。在某些实施方案中，待用本发明的一种或更多种抗体治疗的肿瘤/癌症包括脑癌、头颈癌、结肠直肠癌、急性髓系白血病、前B细胞急性淋巴母细胞白血病、膀胱癌、星形细胞瘤，优选地II、III或IV级星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、小细胞癌和非小细胞癌，优选地非小细胞肺癌、肺腺癌、转移性黑素瘤、雄激素非依赖性转移性前列腺癌、雄激素依赖性转移性前列腺癌、前列腺腺癌和乳腺癌，优选地乳腺导管癌和/或乳腺上皮癌。在某些实施方案中，用本公开内容的抗体治疗的癌症包括胶质母细胞瘤。在某些实施方案中，用本公开内容的一种或更多种抗体治疗的癌症包括胰腺癌。在某些实施方案中，用本公开内容的一种或更多种抗体治疗的癌症包括卵巢癌。在某些实施方案中，用本公开内容的一种或更多种抗体治疗的癌症包括肺癌。在某些实施方案中，用本公开内容的一种或更多种抗体治疗的癌症包括前列腺癌。在某些实施方案中，用本公开内容的一种或更多种抗体治疗的癌症包括结肠癌。在某些实施方案中，治疗的癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌或肺癌。在某些实施方案中，癌症是其他治疗难治的。在特定实施方案中，治疗的癌症是复发的。在特定实施方案中，癌症是复发/难治性胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌，结肠癌、前列腺癌或肺癌。
对于本领域的普通技术人员明显的是，根据本发明的分子的治疗有效量特别取决于施用时间表、施用的分子的单位剂量、该分子是否与其他治疗剂联合施用、患者的免疫状态和健康、施用的分子的治疗活性、其在血液循环中的持久性以及治疗医生的判断。
在某些实施方案中，抗体可以通过适合于施用含抗体的药物组合物的任何途径向有相应需要的受试者施用，诸如，例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、瘤内或脑内等。在某些实施方案中，静脉内施用抗体。在某些实施方案中，皮下施用抗体。在某些实施方案中，瘤内施用抗体。在某些实施方案中，抗体按适当的剂量时间表施用，例如，每周一次、每周两次、每月一次、每月两次、每两周一次、每三周一次或每月一次等。在某些实施方案中，抗体每三周施用一次。抗体可以以任何治疗有效的量施用。在某些实施方案中，治疗上可接受的量在约0.1mg/kg和约50mg/kg之间。在某些实施方案中，治疗上可接受的量在约1mg/kg和约40mg/kg之间。在某些实施方案中，治疗上可接受的量在约5mg/kg和约30mg/kg之间。治疗有效量包括那些足以减轻与要治疗的疾病或疾患相关的一个或更多个症状的量。
本发明的抗体可用于基于CAR的过继免疫疗法(adoptive immunotherapies)，该疗法利用包含CAR的工程化淋巴细胞治疗癌症。本文描述CAR-T系统作为非限制性实例。
T细胞疗法利用嵌合抗原受体(CAR)治疗癌症或肿瘤(即CAR-T细胞疗法)。CAR-T细胞疗法是一种细胞免疫疗法，它包括向癌症患者施用作用于肿瘤细胞并导致肿瘤细胞凋亡的遗传工程化T细胞。通过使用基因转移技术在T细胞上表达CAR来制备遗传工程化T细胞，所述CAR具有与细胞内结构域(诸如CD3δ链序列的片段)组合的抗体可变区(VL和VH)。CAR是其中对肿瘤抗原有特异性的单克隆抗体的可变区的轻链和重链相互连接，然后在C末端侧连接到T细胞受体(TCR)链的嵌合蛋白的一般术语。
根据一些实施方案，CAR包含至少一个选自由CD8 Stalk结构域、CD28 TM结构域、41BB结构域和CD3δ结构域组成的组的蛋白结构域。根据一些实施方案，CAR包含CD8 Stalk结构域。根据一些实施方案，CAR包含CD28 TM结构域。根据一些实施方案，CAR包含CD3δ信号传导结构域。根据一些实施方案，CAR包含41BB结构域。根据具体实施方案，CAR包含CD8Stalk结构域、CD28 TM结构域、41BB结构域和CD3δ结构域。
根据一些实施方案，提供了包含根据本发明的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的嵌合抗原受体(CAR)。根据某些实施方案，提供了在其表面上表达CAR的经遗传修饰的淋巴细胞。根据一些具体实施方案，提供了在其表面上表达CAR的经遗传修饰的T细胞(CAR-T细胞)。
根据一些实施方案，CAR包含重链可变区和轻链可变区的组合，所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列具有至少90％、92％、94％、96％或98％序列同一性的氨基酸序列；并且所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列具有至少90％、92％、94％、96％或98％序列同一性的氨基酸序列。
根据一些实施方案，CAR包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQID NO:9组成的组的氨基酸序列。
根据一些实施方案，CAR包含人源化抗体重链可变区和轻链可变区的组合，其中所述组合选自由以下组成的组：
i.SEQ ID NO:1中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列；
ii.SEQ ID NO:3中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列；
iii.SEQ ID NO:4中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列；
iv.SEQ ID NO:5中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列；和
v.SEQ ID NO:6中所列的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列。
根据一些实施方案，CAR包含选自由SEQ ID NO:1、3、4、5和6组成的组的重链可变区序列和SEQ ID NO:9中所列的轻链可变区序列、跨膜结构域以及细胞内T细胞信号传导结构域。
根据一些实施方案，CAR包含SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57中所列的scFv序列，或其与提供的所述序列中的任一序列具有至少90％、92％、94％、96％或98％序列相似性的类似物。根据特定方面，本发明提供了包含本文描述的CAR的细胞。根据一些实施方案，细胞表达或能够表达本发明的CAR。根据一些实施方案，细胞是淋巴细胞。根据一些实施方案，细胞选自T细胞和自然杀伤(NK)细胞。
根据一些实施方案，提供了一种经工程化以表达本文所述CAR的淋巴细胞。根据一些实施方案，提供了经工程化以表达本文所述CAR的T细胞。
根据另外的实施方案，提供了经工程化以表达本文所述CAR的NK细胞。
本发明还公开了用于诊断和预后癌症的方法。
根据一方面，本发明提供了一种受试者的癌症或感染性疾病的诊断和/或预后方法，所述方法包括使用本文所述的至少一种抗体确定所述受试者的生物样品中PVR表达水平的步骤。
药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂
在某些实施方案中，本公开内容的抗PVR抗体被包含在包含一种或更多种药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂的药物组合物中。载体必须是药学上可接受的，其含义是与制剂的其他成分相容并且不对其接受者过度有害。活性剂以有效实现如上所述的期望药理效果的量和适合于实现期望暴露的量提供。
在某些实施方案中，本公开内容的抗体悬浮在无菌溶液中施用。在某些实施方案中，溶液包含约0.9％NaCl。在某些实施方案中，溶液包含约5.0％右旋糖。在某些实施方案中，溶液还包含以下中的一种或更多种：缓冲剂，例如，乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐和羟甲基氨基甲烷(Tris)；表面活性剂，例如，聚山梨酯80(吐温80)、聚山梨酯20(吐温20)和泊洛沙姆188；多元醇/二糖/多糖，例如葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖和右旋糖酐40；氨基酸，例如甘氨酸或精氨酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸、甲硫氨酸；或螯合剂，例如EDTA或EGTA。
通常，本发明的抗体及其包含抗体的抗原结合部分或包含包括肽模拟物在内的另一种多肽的片段和缀合物悬浮在无菌盐水溶液中，用于治疗性用途。药物组合物可以被可选地配制成控制活性成分(包含抗体的抗原结合部分的分子)的释放或延长其在患者的系统中的存在。大量适合的药物递送系统是已知的，并且包括例如可植入药物释放系统、水凝胶、羟甲基纤维素、微胶囊、脂质体、微乳液、微球等。受控释放制品可以通过使用聚合物复合或吸附根据本发明的分子来制备。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)的基质，以及硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物的基质。根据本发明的分子即抗体或抗体片段从这样的基质释放的速率取决于所述分子的分子量、所述基质内所述分子的量和被分散粒子的尺寸。
在某些实施方案中，本公开内容的抗体被冻干运输/储存和在施用前重构。在某些实施方案中，冻干的抗体制剂包含膨胀剂，诸如甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐40或其组合。冻干制剂可以被包含在由玻璃或其他合适的非反应性材料制成的小瓶中。抗体在配制时，无论是否重构，都可以在一定的pH(通常小于7.0)缓冲。在某些实施方案中，pH可以在4.5和6.5之间、4.5和6.0之间、4.5和5.5之间、4.5和5.0之间或5.0和6.0之间。
在某些实施方案中，在使用之前运输/储存具有本文所述CAR的淋巴细胞。当不立即使用时，细胞通常被冷冻保存。适用于具有CAR的细胞的低温保存方法和储存介质是本领域已知的，参见例如Wang,等人，2019May；21(5):566-578。
本文还描述了试剂盒，该试剂盒包含合适的容器中的一种或更多种本文所述抗体和选自以下的一种或更多种另外的组分：使用说明；稀释剂、赋形剂、载体和施用装置。在一些实施方案中，试剂盒包含用于测量人类PVR表达的工具。
在某些实施方案中，本文描述了一种制备癌症治疗的方法，所述方法包括混合一种或更多种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂和本公开内容的抗体。在某些实施方案中，本文描述了一种制备用于储存或运输的癌症治疗的方法，所述方法包括冻干本公开内容的一种或更多种抗体。
实施例
以下说明性实施例代表本文所述组合物和方法的实施方案，并不意味着以任何方式进行限制。
实施例1-N56E和N56D变体改进了PVR结合的亲和力
WO2017149538中公开的嵌合抗PVR抗体5B9的可变区在轻链CDR2(WASSRHNG,SEQID NO:17)中携带脱酰胺序列(天冬酰胺-甘氨酸)。通过在残基天冬酰胺N56处引入点突变，产生了7种嵌合变体。为了评估N56取代变体的结合亲和力，将野生型(WT)和取代变体IgG4(S241P)单克隆抗体固定在蛋白A捕获芯片上。测试了与组氨酸标签缀合的分析物PVR(PVR-HIS,Sino Cat.no.10109-H08H)的结合。稀释范围：5点二倍稀释，从50nM至3.125nM。使用的条件：仪器：运行Biacore T200评价软件V2.0.1的Biacore T200(序列号1909913)。运行缓冲液：HBS-P+、300mM NaCl、1mg/ml BSA。流量：30μl/min。缔合：350s，解离：800s。再生：10mM甘氨酸pH 1.5。分析：1:1结合。每种取代的相对KD通过将取代的KD除以亲本N56变体(VH0VK0)的KD来确定。注意到N56E(Asp)和N56D(Glu)变体的亲和力显著改进(>25％)(图1A)。嵌合变体与HEK 293EBNA细胞上表达的人类PVR的结合通过流式细胞术在使用亲本5B9抗体(WT，图1B)的竞争测定中评估。
实施例2-N56E和N56D变体改进对猴PVR结合的交叉反应性。
检查了N56取代变体抗体与细胞结合的人类PVR(蛋白id:Q92692)和绿猴属(chlorocebus)PVR(非洲绿猴，蛋白id:UniProtKB-P32506)的结合。图2A描绘了以饱和浓度(10ug/ml)加入的所有变体与表达人类PVR的NCI-H1975细胞的相对结合。图2B描绘了以饱和浓度(10ug/ml)加入的所有变体与表达绿猴属PVR的Vero细胞的相对结合。对于检测，以1:250稀释使用山羊抗人类-647抗体(Jackson ImunomeResearch 109-606-088)。通过FACS分析Ab的细胞结合。将每种变体的MFI除以亲本抗体(K0)的MFI来计算倍数变化。观察到N56E和N56D变体的交叉反应性显著(>25％)增加。
实施例3-N56E和N56T变体改进NK激活
将来自健康供体的NK细胞在存在选择的N56取代变体和靶乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)的情况下在37℃以2:1的E:T比孵育2小时。通过诱导CD107a表面表达来测量NK细胞激活，并计算每种变体超过对照IgG的倍数变化(Y轴)。所有单克隆抗体均以600pM(0.09ug/ml)使用。(通过双尾student t检验，*p<0.04,**p<0.01)。如图3所示，与K0相比，N56E和N56T变体显示改进的NK激活，如通过CD107a的表达升高表现的。
实施例4-N56E和N56T变体改进CD8 T细胞增殖
将人类PBMC用CFSE(C34554 ThermoFischer)荧光标记，并在存在2.5ul/ml PHA-L(Roche)的情况下与A549靶乳腺癌细胞和4ug/ml所示抗体变体一起孵育。孵育96小时后收集免疫细胞，通过抗人类CD8染色，并通过FACS分析。通过CFSE信号强度评估CD8+T细胞的细胞增殖。IgG处理的细胞的CFSE水平设为1。结果呈现为相对于此对照的增殖增加倍数。由于增殖的增加导致CFSE信号减少，Y轴描绘了该比值的倒数值。实验以一式四份进行；所示为单个PBMC供体的结果。数据表明，在存在肿瘤细胞的情况下，变体N56E和N56T对CD8+T细胞增殖的影响明显强于亲本抗体(图4；通过双尾student t检验，*p<0.05,**p<0.01)。
实施例5-具有改进的可生产性的人源化5B9变体的鉴定
N56E抗体变体在竞争测定中表现最好，并被选为人源化的先导变体。基于结构分析，鉴定了一大组初步序列区段，用于创建5B9人源化变体。利用用于计算机分析与人类MHCII类等位基因结合的肽的iTopeTM技术(Perry等人2008)，并使用已知抗体序列相关的T细胞表位的TCEDTM(Bryson等人2010)，对这些区段进行了选择和分析。被鉴定为与人类MHC II类结合的显著非人类种系结合物或被评分为对TCEDTM的显著击中(hit)的序列区段被丢弃。这得到减少的一组区段，并如上文所述，进一步分析这些的组合，以确保区段之间的连接不包含潜在的T细胞表位。将选择的序列区段组装成没有显著T细胞表位的完整V区序列。然后选择5条重链(VH1至VH5)和4条轻链(含N56E取代)(Vκ1至Vκ4)序列。
表1.可变区和CDR序列
Figure BDA0003587397400000451
Figure BDA0003587397400000461
表2.人源化重链可变区的框架(非CDR)序列。
Figure BDA0003587397400000462
表3.人源化轻链可变区的框架(非CDR)序列。
Figure BDA0003587397400000471
通过SPR测试所有变体的结合(图5A)并且通过流式细胞术测试亲和力为亲本抗体2x的变体的细胞表面PVR结合(图5B)。除含有Vk4的变体外，所有变体显示与携带N56E取代的亲本鼠/人类嵌合分子(IgG4(S241P)N56E_VH0/Vκ0)的结合非常相似。注意到，人源化去除了N20位FR1轻链处的N-连接的糖基化。
为了选择先导候选物，考虑了在HEK 293EBNA细胞中瞬时表达后的表达水平，以及与人类种系序列的相似性(图6)。图6A总结了瞬时转染后所有变体的滴度。变体VH4/Vk2显示出最高的表达滴度，并且与人类种系基因具有高的序列同一性百分比(图6B)。最后，对VH4/Vk2变体(NB1088)进行了可生产性评估，与被称为NB0941的变体进行比较，所述被称为NB0941的变体与NB1088相同但具有5B9的有脱酰胺能力的原始LC CDR2(WASSRHNG)。确定了NB0941和NB1088的生物物理特性。如图7A和7B所示，高pH胁迫和在40℃孵育揭示了毛细管等电聚焦(cIEF)的变化，特别是酸性物质的百分比增加，可能是由于脱酰胺。与NB1088相比，NB0941的这些变化更为明显。因此，NB1088具有优化的免疫原性、表达和结合谱以及期望的生物物理特性，被选为功能分析的先导人源化变体。
鉴于正常组织以最低水平表达PVR的事实，所观察到的一些变体中的亲和力下降在设计CAR驱动物时尤其有利。结果(图16)表明，PVR在各种肿瘤中过表达，允许PVR驱动的CAR-T有效地靶向这些肿瘤。潜在的安全性问题可以容易地通过亲和力“下调”的抗PVR变体来解决，如Liu等人(Cancer research,2015；第75卷第17期)所述。
实施例6-NB1088抑制PVR与TIGIT、CD96和CD226的结合
测试了NB1088阻断TIGIT、CD96和CD226与PVR结合的能力。将稳定表达人类PVR的分离的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞与所示浓度的NB1088在冰上一起孵育20分钟，然后以10ug/ml分别添加生物素化重组TIGIT、CD96或CD226-Fc，在冰上孵育另外120分钟。洗涤后，用抗人类Alexa-488缀合的二级抗体检测表面结合的NB1088，并用Alexa647缀合的链霉亲和素检测生物素化蛋白，并通过流式细胞术分析。图8A显示，NB1088以约3.3纳摩尔/升的EC50与PVR结合。NB1088与TIGIT、CD96或CD226竞争PVR结合的IC50分别为1.1nM、1.1nM和1.9nM，如图8B到8D所示。
实施例7-NB1088刺激细胞毒性T细胞和NK细胞
确定了NB1088体外刺激T和NK细胞活性的能力。使用抗原特异性人类乳头瘤病毒(HPV)测定，将30,000个HPV+人类宫颈表皮样癌细胞系(CaSki细胞)和30,000个HPV特异性CD8 T细胞与10μg/ml对照IgG或NB1088共孵育过夜。使用人类干扰素γ特异性MSD系统检测上清液中的干扰素γ释放。如图9A所示，当与HPV+CaSki细胞一起孵育时，NB1088增加HPV特异性人类CD8+(细胞毒性)T细胞的干扰素γ释放。为了测试同种异体系统中的CD8 T细胞活性，用植物血凝素(PHA)和白细胞介素2(IL2)预激活PBMC三天，在没有PHA/IL2的情况下静置过夜，然后使用磁性负性分离程序分离CD8 T细胞。在存在100U/ml IL2和1ug/ml抗CD28抗体的情况下，将10,000个A549肿瘤细胞和100,000个健康供体CD8+T细胞共培养过夜。如图9B所示，NB1088增加从CD8+T细胞的干扰素γ释放的程度大于抗PD-1(派姆单抗)，而NB1088与抗PD-1抗体的联合进一步增加了干扰素γ释放。
还确定了NB1088对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的影响。使用磁性负性分离程序从静置过夜的PBMC分离来自正常供体的NK细胞。将10,000个PVR+和EGFR+A549肿瘤细胞和50,000个NK细胞与以下一起孵育：对照IgG；对照IgG和抗EGFR抗体西妥昔单抗(5μg/ml)；或西妥昔单抗和NB1088。用细胞滴度发光通过分析黏附性A549细胞在共培养和去除NK细胞后的生存力，或如上文通过MSD分析上清液，确定NK细胞介导抗体依赖性细胞毒性或干扰素γ释放的活性。如图10A和图10B所示，NB1088当与西妥昔单抗一起孵育时，能增加NK细胞介导的A549细胞杀伤以及干扰素γ释放。
实施例8-NB1088恢复CD8 T和NK细胞上CD226的表达和活性
确定了NB1088影响CD226功能的能力。CD226(DNAM-1)是一种由NK和T细胞表达的细胞表面糖蛋白受体，用作PVR的配体，并帮助CD8+T和NK细胞的肿瘤杀伤。在功能上，CD226被T和NK细胞上表达的抑制分子TIGIT和CD96所对抗。因此，由于NB1088引起的CD226功能的增加表明，NB1088增强T细胞和NK细胞的活性，并具有广泛的抗肿瘤活性。在如上文描述的抗原特异性和同种异体共培养系统中测试NB1088对CD226表达和功能的影响。如图11A和图11B所示，CD8 T细胞和NK细胞与PVR+靶细胞的共培养导致显著降低CD8 T细胞和NK细胞上CD226的表面表达。无论共培养系统如何，NB1088恢复CD8 T细胞或NK细胞上CD226的细胞表面表达(图11A和图11B)，而抗TIGIT不恢复。使用上文描述的抗原特异性和同种异体共培养系统与少量修改，评价了NB1088处理后T和NK细胞上CD226表达增加的功能后果(图12A和图12B)。与对照IgG或抗TIGIT处理相比，NB1088处理后CD226表达增加与显著更高的干扰素γ释放水平相关(图12A和图12B)。NB1088处理的优异T细胞和NK细胞活性至少部分地通过CD226活性介导。抗CD226(DX11,20ug/ml)将由同种异体和抗原刺激的CD8 T细胞二者(图12A)和NK细胞(图12B)在A549共培养后产生的NB1088依赖的干扰素γ释放减少到用抗TIGIT观察到的水平。这些数据展示出，NB1088通过增加CD226的表达和/或功能，使之超过TIGIT阻断来改进T和NK细胞的活性。
实施例9-人源化小鼠肿瘤异种移植模型中的NB1088单一治疗功效
在人源化小鼠模型A549(肺腺癌)或HPAF(胰腺癌)中，确定了NB1088杀伤肿瘤的能力。简而言之，将5x106个肿瘤细胞(A549或HPAF)与活化的人类外周血单个核细胞以1:1的比例混合在matrigel中，并皮下植入免疫缺陷NOD/SCID小鼠的胁腹(每种条件12只动物)。如图13A和13B所示，NB1088至少能与抗PD-1抗体派姆单抗一样减小肿瘤体积。NB1088在A549/PBMC模型中也能减小肿瘤体积(图13C)，但对单独A549细胞不能减小肿瘤体积(图13D)。在A549/PBMC模型中，肿瘤体积的减小与从NB1088治疗的肿瘤分离的CD8 T细胞上CD226表达的增加相关。(图13E)。还离体评估了NB1088对CD8 T细胞效应物功能的影响(图14A和图14B)。在存在布雷菲德菌素A和抗CD107a的情况下，在37℃用抗CD28/抗CD3刺激消化的肿瘤单细胞悬液5小时。刺激后，通过标准表面/细胞内染色法将细胞染色以使用流式细胞术检测CD8+T细胞产生干扰素γ。如图14A和图14B所示，NB1088增加了总的干扰素γ阳性(图14A)和多功能干扰素γ/CD107a双阳性(图14B)肿瘤来源的CD8 T细胞的频率。此外，在NB1088治疗的肿瘤中，干扰素γ阳性CD8+T细胞的频率增加完全来源于CD226阳性CD8+T细胞(图14C和图14D)，表明了CD226功能对NB1088抗肿瘤活性的重要体内贡献。
实施例10-食蟹猴中的NB1088药代动力学和CD4 T细胞上CD226表达的药效学变化
在食蟹猴(2只雌猴/剂量组)中，以2mg/kg、50mg/kg或200mg/kg剂量水平单次或4×1每周IV推注后，测量NB1088的药代动力学特性。此外，还评价了循环外周CD4 T细胞上CD226表达的变化。图15A显示NB1088的血浆浓度(ug/ml)随时间(小时)和剂量的变化。基于利用食蟹猴PBMC测定的体外功效测定计算IC90和10x IC90。在200mg/kg剂量水平重复给药后，NB1088在研究持续期间表现出典型的PK曲线并达到高于10x IC90的浓度。图15B显示归一化至给药前的在循环CD4 T细胞上的CD226表达水平，如通过用特异性抗体的流式细胞术测量的。NB1088在50mg/kg剂量组和200mg/kg重复剂量组中使CD226表面表达水平增加至1.5倍，并且在200mg/kg重复剂量组中保持升高。这些数据提示，NB1088能参与和调节食蟹猴中CD4 T细胞上CD226的表达。
实施例11-人类PVR跨越不同肿瘤类型的表达
评价了PVR在不同来源的人类癌症中的表达水平。通过标准免疫组化程序使用市售可得的兔单克隆抗体克隆D3G7H和癌组织微阵列检测PVR表达。将染色数字化并定量强度，以计算适应症内和适应症间的H-评分。图16显示PVR在分析的大多数适应症中的表达水平以不同的频率升高。PVR显示出在以下中表达升高：肝癌、结肠癌、肾上腺癌、子宫癌、睾丸癌、鳞状细胞肺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、胆管癌、皮肤癌、HNSCC癌、乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和黑素瘤。这些数据表明PVR在人类癌症的多种适应症中对肿瘤进展的贡献。
实施例12-设计人源化抗体
人源化IgG抗体基于其中一个分别具有重链和轻链VH4和VK2的变体进行设计。示例的VK2序列在SEQ ID NO:49中列出。hIgG4(S241P)的示例性VH4序列在SEQ ID NO:50中列出，并且hIgG1的示例性VH4序列在SEQ ID NO:51中列出。此外，对于在CHO细胞中表达氨基酸序列优化的示例性核苷酸序列设计如下：对于VK2，核苷酸序列在SEQ ID NO:52或SEQ IDNO:53中列出。对于IgG4的VH4，核苷酸序列在SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:55中列出。
实施例12-表达来源于人源化抗PVR抗体变体的scFv的CAR-T细胞在存在肿瘤细胞的情况下被特异性激活
基于变体H4K2-NTX-1088C和H3K4-NTX-1034C设计了CAR-T构建体。scFv分子的氨基酸序列分别在SEQ ID No:56和57中列出。将亲本Jurkat细胞或过表达抗hPVR CAR-T(40K/孔)的Jurkat细胞与A549或MDA-231乳腺癌细胞(PVR阳性)以1:1的E:T一起孵育24h。如图18所示，在存在所示的靶的情况下，两个CAR-T驱动物都导致分泌数百pg的IL2，而亲本Jurkat细胞没有检测到IL2的分泌。使用Biolegend hIL2(cat 431804)定量IL2分泌。这些结果表明，在存在表达PVR的靶细胞的情况下，基于αPVR的CAR-T驱动物在诱导T细胞激活方面是有高度功能的。
为了检查CAR-T的肿瘤细胞杀伤，将200K个A549或MDA-231细胞分别以0.4和0.8比1的E:T(基于GFP阳性)铺板于12孔的带有CAR-T-PVR变体(NTX-1088C或NTX1034C)的板中在NK培养基中72小时。使用标准CTG方案(Promega G9241)评估肿瘤细胞杀伤。如图19A-19C所示的，与激活的PBMC相比，两种PVR变体表现出对MDA-231细胞的杀伤增加了超过2倍，并且对A549细胞的杀伤增加了超过8倍。这些发现强烈地表明，αPVR CAR-T构建体显著地增加了对表达PVR的靶的杀伤。
实施例13-αPVR CAR-T有效杀伤血液学靶细胞。
基于变体H4K2-NTX-1088C和H3K4-NTX-1034C设计了CAR-T构建体。scFv序列分别在SEQ ID No:56和57中列出。
为检查CAR-T的血液肿瘤细胞杀伤，以范围为3.4至0.22比1的E:T将20K/孔的K562细胞单独或与CAR-T-PVR变体(NTX-1088C或NTX1034C)一起铺板到96孔板中在补充有100IU/IL-2/ml的RPMI中18小时。通过流式细胞术评价肿瘤细胞杀伤。NTX-1034C和NTX-1088C二者在较高E:T极其有效地消除靶。在低E:T时NTX-1088C明显优于NTX-1034C可能是由于K562上表达中等水平的PVR。这些结果表明，αPVR CAR-T可以有效针对表达PVR的血液学肿瘤。
序列表
<110> 以色列耶路撒冷的奈克汀治疗有限公司
<120> 针对脊髓灰质炎病毒受体(PVR)的抗体及其用途
<130> NECTIN/001 PCT
<150> US 62/912534
<151> 2019-10-08
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Glu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Asp Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Asp Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 7
Asp Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Glu Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 10
Asn Tyr Trp Ile Glu
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 11
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 12
Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=K或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=V或A
<400> 13
Xaa Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Xaa
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 14
Trp Ala Ser Ser Arg His Glu
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 15
Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asp Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Pro
115
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 17
Asp Ile Met Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Asn Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ser Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 19
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 20
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 20
Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Thr Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 21
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 23
Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 24
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial seuence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 24
Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Asp Thr Thr Tyr Met Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 25
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 27
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 27
Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Asp Thr Thr Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 28
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 29
Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 30
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 31
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 32
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 32
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 33
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 34
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 34
Asp Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 35
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 35
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 36
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 36
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 37
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 38
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 38
caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa ctgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaaatt 60
agctgcaaag cgaccggcta tacctttagc aactattgga ttgaatggat taaacaggcg 120
ccgggccagg gcctggaatg gattggcgaa atttttccgg gcagcggccg cattaacttt 180
aacgaaaaat ttaaaggccg cgcgaccttt accgcggata ccagcattga taccacctat 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgatgat agcgcggtgt attattgcgc gcgcaccaaa 300
atttatggca acagctttga ttattggggc cagggcacca ccgtgaccgt gagcagc 357
<210> 39
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 39
caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaaatt 60
agctgcaaag cgaccggcta tacctttagc aactattgga ttgaatggat taaacaggcg 120
ccgggccagg gcctggaatg gattggcgaa atttttccgg gcagcggccg cattaacttt 180
aacgaaaaat ttaaaggccg cgcgaccttt accgcggata ccagcattga taccacctat 240
atggaactga gccgcctgcg cagcgatgat accgcggtgt attattgcgc gcgcaccaaa 300
atttatggca acagctttga ttattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357
<210> 40
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 40
caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60
agctgcaaag cgaccggcta tacctttagc aactattgga ttgaatggat taaacaggcg 120
ccgggccagg gcctggaatg gattggcgaa atttttccgg gcagcggccg cattaacttt 180
aacgaaaaat ttaaaggccg cgtgaccttt accgcggata ccagcattag caccacctat 240
atggaactga gccgcctgcg cagcgatgat accgcggtgt attattgcgc gcgcaccaaa 300
atttatggca acagctttga ttattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357
<210> 41
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 41
caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60
agctgcaaag cgaccggcta tacctttagc aactattgga ttgaatgggt gcgccaggcg 120
ccgggccagg gcctggaatg gattggcgaa atttttccgg gcagcggccg cattaacttt 180
aacgaaaaat ttaaaggccg cgtgaccttt accgcggata ccagcattag caccacctat 240
atggaactga gccgcctgcg cagcgatgat accgcggtgt attattgcgc gcgcaccaaa 300
atttatggca acagctttga ttattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357
<210> 42
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 42
caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60
agctgcaaag cgaccggcta tacctttagc aactattgga ttgaatgggt gcgccaggcg 120
ccgggccagg gcctggaatg gatgggcgaa atttttccgg gcagcggccg cattaacttt 180
aacgaaaaat ttaaaggccg cgtgaccttt accgcggata ccagcattag caccgcgtat 240
atggaactga gccgcctgcg cagcgatgat accgcggtgt attattgcgc gcgcaccaaa 300
atttatggca acagctttga ttattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357
<210> 43
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 43
gatattatga tgacccagag cccgagcttt ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60
attacctgca aagcgagcca ggatgtgggc accgcggtgg tgtggtatca gcagaaaccg 120
ggcaaagcgc cgaaactgct gatttattgg gcgagcagcc gccatgaagg cgtgccggat 180
cgctttaccg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagagc 240
gaagattttg cggattattt ttgccagcag tatagccgct atccgctgac ctttggccag 300
ggcaccaaac tggaaattaa a 321
<210> 44
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 44
gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60
attacctgca aagcgagcca ggatgtgggc accgcggtgg tgtggtatca gcagaaaccg 120
ggcaaagcgc cgaaactgct gatttattgg gcgagcagcc gccatgaagg cgtgccggat 180
cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240
gaagattttg cggattattt ttgccagcag tatagccgct atccgctgac ctttggccag 300
ggcaccaaac tggaaattaa a 321
<210> 45
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 45
gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60
attacctgcc gcgcgagcca ggatgtgggc accgcggtgg tgtggtatca gcagaaaccg 120
ggcaaagcgc cgaaactgct gatttattgg gcgagcagcc gccatgaagg cgtgccgagc 180
cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240
gaagattttg cgacctattt ttgccagcag tatagccgct atccgctgac ctttggccag 300
ggcaccaaac tggaaattaa a 321
<210> 46
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 46
gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60
attacctgcc gcgcgagcca ggatgtgggc accgcggtgg cgtggtatca gcagaaaccg 120
ggcaaagcgc cgaaaagcct gatttattgg gcgagcagcc gccatgaagg cgtgccgagc 180
cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240
gaagattttg cgacctattt ttgccagcag tatagccgct atccgctgac ctttggccag 300
ggcaccaaac tggaaattaa a 321
<210> 47
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial seuence)
<220>
<223> 氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=L或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X=I或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> X=I或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> X=K或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> X=I或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (68)..(68)
<223> X=A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> X=D或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> X=T或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> X=Q或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> X=S或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (87)..(87)
<223> X=T或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (91)..(91)
<223> X=S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (114)..(114)
<223> X=T或L
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Xaa Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Xaa Xaa Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Xaa Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Xaa Thr Xaa Tyr
65 70 75 80
Met Xaa Leu Ser Xaa Leu Xaa Ser Asp Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=M或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=F或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X=K或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=V或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> X=L或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(60)
<223> X=D或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (63)..(63)
<223> X=T或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> X=S或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> X=D或T
<400> 48
Asp Ile Xaa Met Thr Gln Ser Pro Ser Xaa Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Xaa Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Glu Gly Val Pro Xaa Arg Phe Xaa Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Xaa
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Xaa Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 49
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Glu Gly Val
65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 50
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 51
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 52
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 52
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60
agatgtgaca tccagatgac ccagtcccct tcctctttat ccgcttccgt gggcgatagg 120
gtgaccatca cttgtaaggc ctcccaagat gtgggcacag ctgtggtgtg gtaccagcag 180
aagcccggca aggcccccaa gctgctgatc tactgggctt cctctcgtca cgagggcgtg 240
cccgatcgtt tctccggctc cggatccggc accgacttca ctttaaccat ctcctcttta 300
cagcccgagg acttcgccga ctacttctgc cagcagtact ctcgttaccc tttaaccttt 360
ggccaaggta ccaagctgga gatcaagcgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgttg a 711
<210> 53
<211> 718
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 53
atggacatga gagtgcctgc tcagctgctg ggactgctgc tgttgtggtt gagaggcgcc 60
agatgcgaca tccagatgac ccagtctcca tcctctctgt ccgcctctgt gggcgacaga 120
gtgaccatca catgcaaggc ctctcaggat gtgggcaccg ccgttgtgtg gtatcagcag 180
aagcctggca aggcccctaa gctgctgatc tactgggcct cctctagaca cgagggcgtg 240
cccgatagat tctccggctc tggctctggc accgacttta ccctgacaat ctccagcctg 300
cagcctgagg acttcgccga ctacttctgc cagcagtaca gcagataccc tctgaccttt 360
ggccagggca ccaagctgga aatcaagcgt acggtggccg ctcccagcgt gttcatcttc 420
cccccaagcg acgagcagct gaagagcggc accgccagcg tggtgtgtct gctgaacaac 480
ttctacccca gggaggccaa ggtgcagtgg aaggtggaca acgccctgca gagcggcaac 540
agccaggaga gcgtcaccga gcaggacagc aaggactcca cctacagcct gagcagcacc 600
ctgaccctga gcaaggccga ctacgagaag cacaaggtgt acgcctgtga ggtgacccac 660
cagggcctgt ccagccccgt gaccaagagc ttcaacaggg gcgagtgctg atgaattc 718
<210> 54
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 54
atggggtcaa ccgccatcct tggcctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgcccaa 60
gttcagctgg tgcagagcgg cgctgaggtg aagaagcccg gtgcctccgt gaaggtgtct 120
tgtaaggcca ccggctacac cttctccaac tactggatcg agtgggtgag gcaagctccc 180
ggtcaaggtt tagagtggat cggagagatc ttccccggct ccggccggat caacttcaac 240
gagaagttca agggccgggt gacctttacc gccgacacca gcatctccac cacctacatg 300
gagctgtctc gtctgaggtc cgacgacacc gccgtgtact actgcgctcg taccaagatc 360
tacggcaact ccttcgacta ctggggccaa ggtactttag tgacagtgtc ctccgctagc 420
accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 660
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 720
ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg 780
ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840
gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 900
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 960
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020
gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080
ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1140
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260
tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1320
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1380
ctgtctctgg gtaaatga 1398
<210> 55
<211> 1402
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 核酸
<400> 55
atgggctcta cagctatcct gggactgctg ctggctgtgc tgcaaggcgt ttgtgctcag 60
gtgcagctgg ttcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgcctctgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcta ccggctacac cttctccaac tactggatcg agtgggtccg acaggctcct 180
ggacaaggcc tggaatggat cggcgagatc tttcctggca gcggccggat caacttcaac 240
gagaagttca agggcagagt gaccttcacc gccgacacct ccatctccac cacctacatg 300
gaactgtccc ggctgagatc tgacgacacc gccgtgtact actgcgcccg gaccaagatc 360
tacggcaact ccttcgatta ctggggccag ggcacactgg tcaccgtgtc ctctgcttct 420
acaaagggcc caagcgtgtt ccccctggcc ccctgctcca gaagcaccag cgagagcaca 480
gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 540
agcggagccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg 600
tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgccc agcagcagcc tgggcaccaa gacctacacc 660
tgtaacgtgg accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagggtgga gagcaagtac 720
ggcccaccct gccccccctg cccagccccc gagttcctgg gcggacccag cgtgttcctg 780
ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacctgtgtg 840
gtggtggacg tgtcccagga ggaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggagcagt ttaacagcac ctaccgggtg 960
gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta caagtgtaag 1020
gtctccaaca agggcctgcc aagcagcatc gaaaagacca tcagcaaggc caagggccag 1080
cctagagagc cccaggtcta caccctgcca cccagccaag aggagatgac caagaaccag 1140
gtgtccctga cctgtctggt gaagggcttc tacccaagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc cagtgctgga cagcgacggc 1260
agcttcttcc tgtacagcag gctgaccgtg gacaagtcca gatggcagga gggcaacgtc 1320
tttagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 1380
ctgtccctgg gctgatgaat tc 1402
<210> 56
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 56
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Thr Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
145 150 155 160
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
165 170 175
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys
180 185 190
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His
195 200 205
Glu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
210 215 220
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe
225 230 235 240
Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
245 250 255
Leu Glu Ile Lys
260
<210> 57
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 57
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Thr Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
145 150 155 160
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
165 170 175
Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
180 185 190
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His
195 200 205
Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
210 215 220
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe
225 230 235 240
Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
245 250 255
Leu Glu Ile Lys
260
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 氨基酸
<400> 58
Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Glu
1 5 10

Claims (50)

1.一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段与人类脊髓灰质炎病毒受体(CD155)结合。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQID NO:47中所列的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQID NO:48中所列的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:47中所列的氨基酸序列；并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:48中所列的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含：
i.一组三个CDR序列，包含SEQ ID No.10-12中所列的序列；和
ii.一组四个重链框架(FR)序列：(A)选自由SEQ ID NO:18、22和26组成的组的FR-H1；(B)选自由SEQ ID NO:19、23和28组成的组的FR-H2；(C)选自由SEQ ID NO:20、24、27和29组成的组的FR-H3；和(D)选自由SEQ ID NO:21和25组成的组的FR-H4。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含：
i.一组三个CDR序列，包含SEQ ID No.13-15中所列的序列；和
ii.一组四个轻链框架序列：(A)选自由SEQ ID NO:30和34组成的组的FR-L1；(B)选自由SEQ ID NO:31和37组成的组的FR-L2；(C)选自由SEQ ID NO:32、35和36组成的组的FR-L3；和(D)FR-L4是SEQ ID NO:33。
7.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列至少约95％相同的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列至少约95％相同的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列至少约97％相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列至少约97％相同的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列相同的氨基酸序列。
10.根据权利要求1和9中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段是IgG抗体。
12.根据权利要求11所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段包含IgG4重链恒定区或IgG1重链恒定区。
13.根据权利要求12所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段包含IgG4重链恒定区，所述IgG4重链恒定区在所述IgG4重链恒定区的228位处具有丝氨酸残基取代脯氨酸的改变。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段是Fab、F(ab)2、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。
15.一种单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段(scFv)是根据权利要求1至14中任一项所述的人源化抗体的单链可变片段(scFv)，包含选自SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57的氨基酸序列，及其与所述序列中任何一个具有至少90％序列相似性的类似物。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体抑制PVR结合TIGIT、CD96和CD226中的至少一种。
17.一种核酸，所述核酸编码权利要求1至166中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段。
18.一种细胞系，所述细胞系包含权利要求17所述的核酸。
19.根据权利要求18所述的细胞系，其中所述细胞系是中国仓鼠卵巢细胞系。
20.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含根据权利要求1至16中任一项所述的人源化抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。
21.根据权利要求20所述的CAR，其中所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9组成的组的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的CAR，所述CAR包含含有选自SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57的氨基酸序列的scFv及其与所述序列中任何一个具有至少90％序列相似性的类似物。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的CAR，所述CAR包含选自由以下组成的组的至少一个结构域：CD8 Stalk结构域、CD28 TM结构域、41BB结构域和CD3Z结构域。
24.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至16中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段或根据权利要求20和23中任一项所述的CAR，以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，被配制用于静脉内施用。
26.根据权利要求24所述的药物组合物，被配制用于瘤内施用。
27.根据权利要求1至16中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20或23所述的CAR或者根据权利要求24至26中任一项所述的药物组合物，用于在增加CD8+T细胞上CD226的表面表达和/或信号传导中使用。
28.根据权利要求1至16中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20或23所述的CAR或者根据权利要求24至26中任一项所述的药物组合物，用于在治疗个体的癌症中使用。
29.根据权利要求28所述的用于使用的人源化抗体或其抗原结合片段或CAR或者药物组合物，其中所述癌症包括实体瘤。
30.根据权利要求28所述的用于使用的人源化抗体或其抗原结合片段或CAR或者药物组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、结肠癌、肾上腺癌、子宫癌、头颈癌、胰腺癌和乳腺癌。
31.一种增加个体的CD8+T细胞中CD226的表面表达和/或信号传导的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20或23所述的CAR或者根据权利要求24至26中任一项所述的药物组合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述CD8+T细胞是肿瘤浸润性CD8+T细胞。
33.一种治疗患有癌症的个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20或23所述的CAR或者根据24至26中任一项所述的药物组合物。
34.一种治疗有相应需要的个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20或23所述的CAR或者根据24至26中任一项所述的药物组合物以及PD-1信号传导抑制剂、PD-L1信号传导抑制剂、CTLA-4信号传导抑制剂或CD112R信号传导抑制剂。
35.根据权利要求33和34中任一项所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌和肺癌。
37.根据权利要求33和34中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液学癌症。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述PD-1信号传导抑制剂是与PD-1结合的抗体或其片段。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体或其片段选自派姆单抗、纳武单抗、AMP-514、替雷利珠单抗、斯巴达珠单抗，和它们的PD-1结合片段。
40.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述PD-1信号传导抑制剂是与PD-L1或PD-L2特异性结合的抗体。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述与PD-L1或PD-L2特异性结合的抗体选自德瓦鲁单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、BMS-936559或FAZ053，或它们的PD-L1和PD-L2结合片段。
42.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述PD-1信号传导抑制剂包括PD-1、PD-L1或PD-L2的小分子抑制剂。
43.一种制备用于治疗有相应需要的个体的癌症的组合物的方法，所述方法包括混合根据权利要求1至16中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌和肺癌。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症是血液学癌症。
47.一种产生根据权利要求1至16中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在足以允许表达和分泌所述人源化抗体或其抗原结合片段的条件下在细胞培养基中孵育含有编码所述人源化抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞系。
48.一种诊断或预后受试者中的癌症的方法，所述方法包括使用至少一种根据权利要求1-16中任一项所述的人源化抗体或其片段来确定所述受试者的生物样品中PVR的表达水平。
49.根据权利要求48所述的方法，所述方法包括如果PVR的表达高于对照或参考值，则诊断或预后受试者中的癌症的步骤。
50.一种试剂盒，所述试剂盒包含至少一种根据权利要求1-16中任一项所述的抗体或抗体片段，以及用于测量PVR表达的工具。
CN202080071097.9A 2019-10-08 2020-10-07 针对脊髓灰质炎病毒受体(pvr)的抗体及其用途 Pending CN114502595A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962912534P 2019-10-08 2019-10-08
US62/912,534 2019-10-08
PCT/IL2020/051082 WO2021070181A1 (en) 2019-10-08 2020-10-07 Antibodies against the poliovirus receptor (pvr) and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114502595A true CN114502595A (zh) 2022-05-13

Family

ID=73038283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080071097.9A Pending CN114502595A (zh) 2019-10-08 2020-10-07 针对脊髓灰质炎病毒受体(pvr)的抗体及其用途

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220372161A1 (zh)
EP (1) EP4041392A1 (zh)
JP (1) JP2022553129A (zh)
KR (1) KR20220082007A (zh)
CN (1) CN114502595A (zh)
AU (1) AU2020363041A1 (zh)
BR (1) BR112022006620A2 (zh)
CA (1) CA3156983A1 (zh)
IL (1) IL291540A (zh)
MX (1) MX2022004194A (zh)
WO (1) WO2021070181A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023178192A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Compugen Ltd. Il-18bp antagonist antibodies and their use in monotherapy and combination therapy in the treatment of cancer
KR102615797B1 (ko) * 2022-04-28 2023-12-19 가톨릭대학교 산학협력단 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 방법
WO2024047654A1 (en) 2022-09-04 2024-03-07 Nectin Therapeutics Ltd. Drug conjugates of humanized anti pvr antibodies

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070041985A1 (en) * 2003-02-24 2007-02-22 Unger Christine M Modulation of the poliovirus receptor function
CN109071666A (zh) * 2016-03-01 2018-12-21 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 人脊髓灰质炎病毒受体（pvr）特异性抗体
CN110256558A (zh) * 2014-12-23 2019-09-20 百时美施贵宝公司 针对tigit的抗体

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
MXPA01007170A (es) 1999-01-15 2002-07-30 Genentech Inc Variantes de polipeptidos con funcion efectora alterada.
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070041985A1 (en) * 2003-02-24 2007-02-22 Unger Christine M Modulation of the poliovirus receptor function
CN110256558A (zh) * 2014-12-23 2019-09-20 百时美施贵宝公司 针对tigit的抗体
CN109071666A (zh) * 2016-03-01 2018-12-21 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 人脊髓灰质炎病毒受体（pvr）特异性抗体

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022004194A (es) 2022-05-02
WO2021070181A1 (en) 2021-04-15
AU2020363041A1 (en) 2022-04-14
CA3156983A1 (en) 2021-04-15
EP4041392A1 (en) 2022-08-17
JP2022553129A (ja) 2022-12-22
US20220372161A1 (en) 2022-11-24
BR112022006620A2 (pt) 2022-08-30
IL291540A (en) 2022-05-01
KR20220082007A (ko) 2022-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7450592B2 (ja) 癌治療におけるｆｇｆｒ２阻害剤単独または免疫刺激剤との組み合わせ
JP7080213B2 (ja) 新規抗ｐｄ－ｌ１抗体
JP7366908B2 (ja) Ｐｄ－１に対する単一ドメイン抗体及びその変異体
KR20170065029A (ko) 증강된 면역 반응 및 암 요법을 위한 조성물 및 사용 방법
CN105829345B (zh) 结合egfr和met的多功能抗体
JP7274426B2 (ja) 抗ｇｉｔｒアゴニスト抗体での癌の処置
CN114502595A (zh) 针对脊髓灰质炎病毒受体(pvr)的抗体及其用途
CN111094339B (zh) 抗pd-1抗体和抗lag-3抗体联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途
TWI815306B (zh) PD-1/TGF-beta四價雙特異性抗體、其製備方法和用途
JP2021511372A (ja) Ｔｉｍ３に対する抗体で癌を処置する方法
KR20220042258A (ko) 항 tigit 항체 및 그의 응용
JP2023139243A (ja) 抗ペリオスチン抗体及びその使用
KR20230020379A (ko) 항-tnfr2 항체 및 이의 용도
CN112225809B (zh) 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用
CN114364400A (zh) 使用pd-1轴抑制剂及抗骨膜蛋白抗体治疗癌症的方法
TW202334208A (zh) 用於治療癌症的組合療法
TW202309096A (zh) 抗ｔｎｆｒ２抗體及其用途
CN113544152A (zh) Flt3激动剂抗体及其用途
EA045980B1 (ru) Антитела против рецептора полиовируса (pvr) и их применение
US20240052065A1 (en) Binding molecules for the treatment of cancer
JP2023504675A (ja) ガンの処置のための結合分子
CN114929741A (zh) 针对lif的抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40073145

Country of ref document: HK