CN114437991A - 一种植物乳杆菌160及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种植物乳杆菌160及其应用，所述植物乳杆菌160其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23166；所述植物乳杆菌160处理的青贮饲料有氧稳定性较好，可降低pH，耐冻融性和耐酸性佳，对环境的适应性佳，提高了青贮发酵品质，可达到长期保存青贮饲料的效果；在青贮开窖时，采用所述植物乳杆菌160处理的青贮饲料可避免二次发酵。

Description

一种植物乳杆菌160及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌160及其应用。
背景技术
青贮是将青饲料压实密封，通过饲草附生微生物乳酸菌进行厌氧发酵，将水溶性碳水化合物转变成有机酸(主要是乳酸)，从而减少养分流失又有利于动物消化吸收的一种技术。
燕麦是高寒地区冬春饲补的主要饲料作物，由于高寒地区温度低海拔高，不利于乳酸菌的生长，很难发酵出品质优良并可以长期贮存的饲料。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种植物乳杆菌160及其应用，所述植物乳杆菌160其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23166；所述植物乳杆菌160处理的青贮饲料有氧稳定性较好，可降低pH，有效的抑制有害杂菌的生长或产生，可降低干物质损失，可降低氨态氮/总氮比值，增加了干物质含量、乳酸含量和乳酸/乙酸值，有氧变败时间长，具有耐冻融性和耐酸性，对环境的适应性佳，提高了青贮发酵品质，达到长期保存青贮饲料的效果；在青贮开窖时，采用所述植物乳杆菌160处理的青贮饲料可避免二次发酵。
为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)160，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23166，保藏日期为2021年08月20日
一种菌剂，所述菌剂的活性成分包括上述的植物乳杆菌160。
优选地，所述菌剂的活性成分为上述的植物乳杆菌160。
一种青贮饲料添加剂，所述青贮饲料添加剂的活性成分包括上述的植物乳杆菌160。
优选地，所述青贮饲料添加剂的活性成分为上述的植物乳杆菌160。
优选地，所述青贮添加剂为燕麦青贮添加剂。
一种青贮饲料，所述青贮饲料中含有上述的青贮饲料添加剂。
本发明还提供了上述植物乳杆菌160或上述的菌剂在如下任一种或多种的应用：
(a1)制备抑菌制剂；
(a2)制备青贮饲料添加剂；
(a3)制备青贮饲料。
优选地，所述抑菌制剂为抑制细菌或真菌的制剂。
优选地，所述细菌为大肠杆菌。
优选地，所述真菌为酵母菌、霉菌。
本发明还提供了上述的青贮饲料添加剂在制备青贮饲料中的应用。
本发明提供了一种制备青贮饲料的方法，包括：将青贮原料与上述的植物乳杆菌160混合，进行发酵，得到所述青贮饲料。
优选地，所述青贮原料为燕麦。
优选地，所述发酵的发酵温度为-5℃～37℃。
优选地，所述发酵的发酵温度为-5℃～20℃。
优选地，所述发酵的发酵温度为20℃。
优选地，所述发酵的pH值条件为pH3～6。
优选地，所述发酵的时间60天。
优选地，所述发酵为固体厌氧。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
本发明提供了一种植物乳杆菌160及其应用；所述植物乳杆菌160处理的青贮饲料有氧稳定性较好，可降低pH，有效的抑制有害杂菌的生长或产生，可降低干物质损失，可降低氨态氮/总氮比值，增加了干物质含量、乳酸含量和乳酸/乙酸值，有氧变败时间长，具有耐冻融性和耐酸性，对环境的适应性佳，提高了青贮发酵品质，达到长期保存青贮饲料的效果。
在青贮开窖时，采用本发明植物乳杆菌160处理的青贮饲料可避免二次发酵。
本发明植物乳杆菌160可作为高寒地区(例如：青藏高原地区)燕麦青贮饲料的候选菌株，应用于制备抑菌制剂、制备青贮饲料添加剂、制备青贮饲料，能发酵出品质优良并可以长期贮存的青贮饲料。
附图说明
图1 37℃条件下乳酸菌生长曲线；
图2 20/-5℃条件下乳酸菌生长曲线；
图3 37℃条件下乳酸菌产酸曲线；
图4 20/-5℃条件下乳酸菌产酸曲线；
图5乳酸菌系统发育树。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
燕麦具有较高的粗蛋白含量、营养成分高、缓冲能低，青贮后的营养品质要高于青干草,但是附生乳酸菌的数量较少，低于5log10cfu/gFM。加之，高寒地区，例如青藏高原地区冷季昼夜温差大，燕麦青贮存在反复冻融现象，容易出现以下结果：一、发酵不足：附生乳酸菌量较少，在发酵初期难以成为优势菌群、底物竞争力差；二、发酵不稳定：由于附生乳酸菌数量少，难以迅速形成酸性环境，无法有效抑制霉菌和腐败菌的大量繁殖，容易出现霉变，营养品质层次不齐；
三、二次发酵；青贮开窖后真菌、霉菌大量滋生，容易发生二次发酵，进而导致短时间内有氧变败，难以储存。
所以浮生乳酸菌的种类和数量以及环境温差是影响高寒地区(例如：青藏高原地区)燕麦青贮的主要难题。
基于上述问题，本发明提供一种植物乳杆菌160及其应用，根据低pH生长和高乳酸产量的潜力，本发明植物乳杆菌160从青贮燕麦中分离得到。
实施例提供了植物乳杆菌160对燕麦发酵品质、营养品质和有氧稳定性的影响。
所述植物乳杆菌160根据生理、生化特征和16SrRNA测序分析，鉴定为植物乳杆菌。
所述植物乳杆菌160处理的青贮饲料有氧稳定性较好，可降低pH，可降低干物质损失，可降低氨态氮/总氮比值，增加了干物质含量、乳酸含量和乳酸/乙酸值高，耐冻融性和耐酸性佳，对环境的适应性佳。
所述植物乳杆菌160在20/-5℃条件培养下，本发明植物乳杆菌160生长和产酸无明显的迟缓期，能达到快速产酸以实现较低pH的效果。
在青贮开窖时，采用所述植物乳杆菌160处理的青贮饲料可避免二次发酵。
所述植物乳杆菌160可作为高寒地区(例如：青藏高原地区)燕麦青贮饲料的候选菌株，应用于制备抑菌制剂、制备青贮饲料添加剂、制备青贮饲料，能发酵出品质优良并可以长期贮存的青贮饲料。
实施例1
一、菌株的分离筛选
样品于2021年1月到4月底在青海省海北、海东、海南和西宁地区采集，共从19个采样地采取了57份青贮样品和1份牧民自制酸奶样品(样品采集地信息如表1所示)。
采样后，从青贮样品中分别称取20g于180mL无菌蒸馏水中在4℃下震荡1h，再在无菌蒸馏水中连续稀释10-1至10-5，分别取原液，10-3、10-5倍样品稀释液涂布在固体MRS培养基(陆桥科技有限公司，北京，中国)上培养48h。挑选出生长速度快的乳酸菌将其接种到液体MRS培养基中37℃培养48h后，进行不断划线纯化，对乳酸菌进行分离。为了确保更真实的反应原料和青贮中乳酸菌群落结构，从每种样品固体MRS培养基中随机抽取10株左右菌株，共收集437株菌，通过革兰氏染色试验确定其中437株为乳酸菌，将437株乳酸菌放入加有甘油的保藏管中 -20℃保存。
对挑选出的437株乳酸菌进行初次筛选，分别在0℃24h、先-5℃12h后20℃ 12h、先20℃12h后-5℃12h培养，然后测其pH值和OD值，从中筛选出生长效率最高、产酸能力最强(pH值小且OD大)的菌株作为候选菌株，共挑选出15株菌，再对这15株菌的进行革兰氏染色、菌落形态和葡萄糖产气试验。糖发酵试验采用试剂盒方法(陆桥科技有限公司，北京，中国)。
表1供试材料信息
Figure BDA0003528528930000051
Figure BDA0003528528930000061
(1)耐温试验：将筛选的15株菌接种至MRS液体培养基中，分别置于5、 10、15、20、30、50℃培养箱中，培养2d后测定各组发酵液的OD600nm值，每个处理重复3次。
(2)耐酸试验：用经过无菌处理的HCl溶液和NaOH溶液调整MRS液体培养基pH，将上述菌株分别接种至pH为3.0、3.5、4.0、5.0、6.0的MRS液体培养基中，分为两组，分别在37℃和10℃的培养箱中培养2d，测定培养基OD600nm 值。
(3)耐盐试验：将上述活化的乳酸菌接入NaCl溶液体积分数为3.0％和6.5％的MRS液体培养基中，分为两组，分别在37℃和10℃的培养箱中培养2d，于 600nm处测定培养基OD值。OD600nm<0.05代表不生长(-)，OD600nm小于 0.3表示微弱生长(W)，OD600nm在0.3–0.5之间表示生长(+)，OD600nm>0.5 代表生长良好(++)。
对筛选出的15株菌进行基因组提取。将15株乳酸菌置于37℃中过夜培养， 10,000g离心5min，用TE缓冲液在15mL离心管中洗涤2次后再离心。DNA提取采用TIANamp细菌DNA试剂盒(DP302-02，天根，北京，中国)。DNA使用前保存在-20℃。对15株乳酸菌16S rRNA序列进行PCR扩增。1μL DNA作为模板，PCR引物为27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r (5'-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3')，反应体系为20μL体系。
PCR程序：95℃下处理5min，94℃变性30s，在55℃下退火1min，循环 30次，72℃延伸15min，最后72℃保温10min。用1.5％琼脂糖凝胶电泳在1×TBE 缓冲液中检测PCR产物质量，合格的PCR产物送上海生工公司进行序列分析。利用BLAST分析方法，将测得的16S rDNA序列与GenBank的16S rRNA序列进行比对，相似度高于99％的序列被认为是同一株菌。
对筛选出的15株菌进行绿汁发酵实验(结果如表4)，每4个小时测其pH值，连续测60h后从中选出能快速降低pH的菌株。
结合糖发酵特性、生理生化特性、绿汁发酵和测序结果筛选出了160、248和 260三株菌，做它们的生长曲线和产酸曲线。利用MEGA7软件，以枯草芽孢杆菌 NCDO1769为外群构建系统发育树，160与植物乳杆菌亲缘关系最近，248与短乳杆菌亲缘关系最近，260与戊糖乳杆菌亲缘关系最近。
二、青贮饲料的制备：
供试燕麦于乳熟期离地10cm刈割，揉丝机切短揉丝后，经短暂晾晒后充分混合，接种剂有筛选出的3株优质抗冻融乳酸菌(160、248、260)、商业菌(市售，购买自中国台湾亚芯生物科技有限公司，植物乳杆菌)、植物乳杆菌160与短乳杆菌248 复配菌剂A(160+248，160与248按照重量比1:1混合，复配后检测活菌数)，植物乳杆菌160与鼠李糖乳杆菌753复配菌剂B(160+753，160与753按照重量比 1:1混合，复配后检测活菌数，753为前期筛选菌株，保藏编号为CGMCC No.18233，已获得发明专利授权)。将菌株培养溶解稀释至106cfu/mL左右，每100g切碎的原料(1-2cm)中均匀喷洒3mL菌液，充分混合，对照喷洒量的灭菌蒸馏水。将处理好的700g燕麦装入聚乙烯塑料袋中压实后抽真空，每个处理3个重复，分别放置在20℃、20/-5℃(交替，各12h)培养箱中，于青贮60天开袋，所有样品进行微生物群落分析以及化学成分、发酵品质分析。
1、青贮饲料的检测：
将样品置于65℃的空气循环烘箱中72h后测定干物质(DM)，并将干燥的样品用研磨机研磨后过1mm筛子用于化学成分分析。使用Ankom 200系统(Ankom TechnologyCorporation，Fairport，纽约，美国)测试中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)。粗蛋白(CP)用凯氏定氮法测定，可溶性碳水化物(WSC) 用蒽酮-硫酸法测定。
称取20g鲜样和180mL双蒸水置于搅拌机中搅拌1min后使用双层棉纱布过滤，滤液一部分用于测试pH((PHSJ-5；LEICI，上海，中国)，另取一部分用于测试有机酸和NH3-N。测有机酸部分用50％的H2SO4酸化，并12,000rpm，4℃离心15分钟(5810R，Eppendorf，汉堡，德国)，取上清液过0.22um滤膜过滤，滤液通过具有UV检测器(210nm)和色谱柱柱(KC-811，Shimadzu Co.Ltd.，京都，日本)的高效液相色谱(1100，Agilent Technologies Inc，加州，美国)测试乳酸、乙酸、丁酸和丙酸的含量。流动相为0.1％的H3PO4，柱温为50℃，流速为0.5mL/min。为测试NH3-N含量，将滤液与三氯乙酸以4:1的体积比混合，并放置在4℃的冰箱中过夜以沉积蛋白质。随后，12,000g离心15min，取上清液用于测定NH3-N。
2、微生物检测：
用平板计数法对青贮微生物进行计数。无菌环境中准确称取20g加入180mL 灭菌生理盐水(0.85％)，4℃震荡1h。然后用无菌水进行10-1到10-7梯度稀释，选三个适宜稀释度，每个稀释度取0.lmL分别涂布计数培养基上。
MRS培养基、马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培养基和结晶紫中性红胆盐琼脂培养基(VRBA)分别用于乳酸菌、酵母菌、霉菌、肠道菌的计数。MRS在30℃下厌氧培养48h对乳酸菌计数，PDA在30℃下有氧培养72h 对酵母菌、霉菌计数，VRBA在37℃下有氧培养24h对肠道菌计数。酵母菌和霉菌的培养都在PDA培养基中，培养后根据菌落形态区分酵母菌和霉菌(霉菌要长毛)。待培养结束后，选取菌落数为30–300的平板培养基进行计数，计数后按照以下公式进行计算：cfu/g＝同一稀释度的重复平板上菌落平均数*稀释倍数/含菌样品克数。
3、有氧稳定性：
青贮60d后打开青贮袋，均匀取800g的样品放入2L干净的无菌烧杯中压实，用两层粗棉布覆盖。将所有样品分别放置在室温(27.88-30.45℃)中5天。通过实时温度记录仪(MT-X；神华科技有限公司，中国深圳)每5分钟测量一次青贮核心区域(深度为10cm)的温度，持续5d。通过测量有氧暴露前后样品重量的差值来计算DM的损失。取有氧暴露5d后的样品，分析其发酵质量(20g)和微生物计数(20g)。有氧稳定性的计算基于暴露于空气中的青贮饲料的温度超过基准环境温度2℃所持续的时间。
三、数据分析
采用社会科学统计软件包(SPSS Version 19.0,SPSS Inc.，Chicago,IL,USA)的GLM程序进行统计分析。采用单因素方差分析法(ANOVA)，对发酵过程中的化学成分、发酵特性、微生物计数、a-曲霉毒素b1和好氧稳定性进行了分析。采用Turkey诚实显著性差异(HSD)检验对不同的样本均值进行检验，p<0.05为显著。
四、结果分析
1、菌株筛选
15株菌的糖发酵特性如表2所示，160和260可利用的糖源较多，248的糖发酵特性比较特殊，虽然248利用的糖源较少但是如表3(乳酸菌耐酸、耐温、耐盐特性)和表4(乳酸菌耐酸、耐温、耐盐特性)所示，248同160、和260一样，生长迅速且可以快速产酸。
如生长曲线(图1)和产酸曲线(图3)所示，在37℃生长条件下，筛选出的4株菌可以在14小时内迅速生长，且将pH降到4以下。
20/-5℃(先20℃培养12h后-5℃培养12h)条件下的生长曲线(图2)和产酸曲线(图4)所示，筛选出的4株菌也能在两天内生长到最大值，且将pH降到4 以下。
通过利用MEGA7软件，以枯草芽孢杆菌NCDO1769为外群构建了筛选出的4 株菌的系统发育树，如图5所示，160与植物乳杆菌亲缘关系最近，248与短乳杆菌亲缘关系最近，260与戊糖乳杆菌亲缘关系最近。
结合生理、生化特征和16S rRNA测序分析，鉴定160为植物乳杆菌、248为短乳杆菌、260为戊糖乳杆菌。
植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)160，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23166，保藏日期为2021年08月20日。
所述短乳杆菌248(Levilactobacillus brevis)248保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.23167，保藏日期为2021年08月20日。
所述戊糖乳杆菌260(Lactiplantibacillus pentosus)260保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.23168，保藏日期为2021年08月20日。
植物乳杆菌160的16s rDNA如SEQ ID NO.1所示:
CGGGGGTGGCGGGTGCTATACATGCAGTCGTACGAACTGCTGTGTATT GGATTGGTGCTTGCATCATGAGTTTACATTGTGAGTGAGTGGCGAACTGGT GAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAAC AGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAG ATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGG TGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTA ATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGC AGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGT GAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACAT ATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGG CTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCG GATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAA AGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTG CAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATA TGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTG AGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAT ACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTG CAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAA ACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA ATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATC TAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTT GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA CCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCG GTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTA TGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCT GCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGC CGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAG AGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCT AAGGTGATCC
综上所述，植物乳杆菌160、短乳杆菌248和戊糖乳杆菌260的生长速度快，产酸能力强，对糖源利用范围广，对酸性环境有较好的适应性。可以作为冻融条件下燕麦青贮的候选菌株添加剂。
表2乳酸菌糖发酵特性
Figure BDA0003528528930000121
表中+，90％及以上菌株可发酵该物质；-，90％及以上菌株不可发酵该物质； W.可发酵少量该物质；
表3乳酸菌耐酸、耐温、耐盐特性
Figure BDA0003528528930000122
Figure BDA0003528528930000131
w,OD<0.3；+,0.3<OD<0.5；++,OD>0.5.
表4乳酸菌的绿汁发酵实验pH
Figure BDA0003528528930000132
Figure BDA0003528528930000141
2、青贮品质
表5是青贮前原料的特性，供试燕麦的干物质含量为28.96％，粗蛋白为 11.01％DM，中酸洗分别为65.17％DM和29.69％DM，水溶性碳水化合物为13.30％DM。通过微生物计数，供试燕麦原料附生了一定数量的乳酸菌、大肠杆菌、酵母和霉菌，且附生的大肠杆菌和霉菌较多。
表5燕麦青贮原料特性
Figure BDA0003528528930000142
Figure BDA0003528528930000151
如表6所示，青贮60d后，160+248、160处理组的大肠杆菌、酵母和霉菌数量与CK相比有所降低，乳酸菌数量增加。在20/-5℃条件下，160+248和160处理组的乳酸菌数量较20℃条件下多，可能在冻融条件下这两种菌生长的更快。160处理组在20/-5℃条件下均能有效抑制了大肠杆菌、酵母菌和霉菌的生长。
表6燕麦青贮60d后微生物计数
Figure BDA0003528528930000152
如表7所示，青贮60d后160+248、160、248和260处理组的pH显著低于CK 组和商业菌以及160+753处理组，乳酸菌计数时虽然160+248和160处理组的乳酸菌含量较少，但是这些少量的乳酸菌产酸速率高，不论在20℃还是20/-5℃下pH都在4左右，且4株菌之间无显著性差异。160+248、160、248和260处理组氨态氮占总氮的比例显著低于CK组，且260处理组最低，但在两个温度条件下均与248 处理组没有显著性差异。160+248、160、248和260处理组的乳酸含量显著高于CK、商业菌和160+753处理组，160处理组在20/-5℃条件下乳酸含量最高，160+248、 160、248和260处理组的乙酸显著高于CK处理组，除了160处理外，其他三个处理组的乳酸/乙酸显著低于对照。丙酸和丁酸在各个处理组中均未发现。通过双因素方差分析，氨态氮/总氮、乳酸、乙酸和乳酸/乙酸与温度、菌剂和两者交互都极显著相关，而pH只与菌剂显著相关。160+248、160、248和260，能够在青贮中产生更多乳酸以快速降低pH，减缓青贮过程中饲料腐败变质。
表7燕麦青贮60d的发酵特性
Figure BDA0003528528930000161
同列数据后不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(*p<0.05,**p<0.01).NS,不显著；SEM,标准误；DM, 干物质；TN,总氮；ND,没有检测到。
筛选出的菌株160具有高产乳酸、保持青贮牧草营养品质、延长有氧变败时间等优点，可以作为青贮饲料中的接种菌剂。
青贮60d后，如表8所示，160+248、160、248和260处理组的干物质损失均有降低，但是在0.05水平上未达到显著性，在20/-5℃条件下248处理组的干物损失最低。160+248、160、248和260处理组的中、酸洗含量与CK相比有所降低，但是不显著，显著低于160+753处理组的含量。248处理组在两个温度条件下的粗蛋白含量均为最高。通过双因素方差分析，除了灰分所有的指标都与温度和菌剂极显著相关，且干物质、干物质损失、中、酸洗和可溶性糖都与温度和菌剂的交互显著相关。菌株有效保持了燕麦青贮的营养品质。
表8燕麦青贮60d的营养品质
Figure BDA0003528528930000171
同列数据后不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(*p<0.05,**p<0.01).NS,不显著；SEM,标准误；DM, 干物质。
如表9所示，有氧暴露5天后，在20℃条件下，160+248、160和248处理组的pH仍可以维持在4.2左右；在20/-5℃条件下，160+248、160、248和260处理组的pH显著低于CK组、商业菌处理组和160+753处理组。160+248、160、248 和260处理组的乳酸含量显著高于CK组，乙酸含量除了160处理组外其他菌株处理组的含量都显著高于CK组，160+248、160、248和260处理组的乳酸/乙酸比也显著高于CK组。
表9燕麦青贮有氧暴露5d后的发酵特性
Figure BDA0003528528930000181
Figure BDA0003528528930000191
同列数据后不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(*p<0.05,**p<0.01).NS,不显著；SEM,标准误；DM, 干物质；TN,总氮；ND,没有检测到。
表10中，160+248、160处理组的有氧变败时长明显高于CK组、商业菌处理组和160+753处理组，说明160+248、160处理组通过产生大量乳酸和乙酸，形成酸性环境，有效抑制酵母菌、霉菌等的生长，从而提高了燕麦青贮的有氧稳定性。
表10燕麦青贮有氧变败时长
Figure BDA0003528528930000192
筛选出的菌株160具有高产乳酸、保持青贮牧草营养品质、延长有氧变败时间等优点，可以作为青贮饲料中的接种菌剂。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青海省畜牧兽医科学院
西南民族大学
青海师范大学
<120> 一种植物乳杆菌160及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)
<400> 1
cgggggtggc gggtgctata catgcagtcg tacgaactgc tgtgtattgg attggtgctt 60
gcatcatgag tttacattgt gagtgagtgg cgaactggtg agtaacacgt gggaaacctg 120
cccagaagcg ggggataaca cctggaaaca gatgctaata ccgcataaca acttggaccg 180
catggtccga gcttgaaaga tggcttcggc tatcactttt ggatggtccc gcggcgtatt 240
agctagatgg tggggtaacg gctcaccatg gcaatgatac gtagccgacc tgagagggta 300
atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat 360
cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc 420
tcgtaaaact ctgttgttaa agaagaacat atctgagagt aactgttcag gtattgacgg 480
tatttaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 540
aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt 600
gaaagccttc ggctcaaccg aagaagtgca tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga 660
ggacagtgga actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg 720
cgaaggcggc tgtctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagtatggg tagcaaacag 780
gattagatac cctggtagtc cataccgtaa acgatgaatg ctaagtgttg gagggtttcc 840
gcccttcagt gctgcagcta acgcattaag cattccgcct ggggagtacg gccgcaaggc 900
tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 960
agctacgcga agaaccttac caggtcttga catactatgc aaatctaaga gattagacgt 1020
tcccttcggg gacatggata caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttattatcag ttgccagcat taagttgggc 1140
actctggtga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1200
gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag ttgcgaactc 1260
gcgagagtaa gctaatctct taaagccatt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc 1320
tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg 1380
ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg agagtttgta acacccaaag tcggtggggt 1440
aaccttttag gaaccagccg cctaaggtga tcc 1473

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)160，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23166。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的植物乳杆菌160。
3.一种青贮饲料添加剂，其特征在于，所述青贮饲料添加剂的活性成分包括权利要求1所述的植物乳杆菌160。
4.权利要求3所述的青贮饲料添加剂，其特征在于，所述青贮添加剂为燕麦青贮添加剂。
5.一种青贮饲料，其特征在于，所述青贮饲料中含有权利要求3所述的青贮饲料添加剂。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌160或权利要求2所述的菌剂在如下任一种或多种的应用：
(a1)制备抑菌制剂；
(a2)制备青贮饲料添加剂；
(a3)制备青贮饲料。
7.权利要求3所述的青贮饲料添加剂在制备青贮饲料中的应用。
8.一种制备青贮饲料的方法，包括：将青贮原料与权利要求1所述的植物乳杆菌160混合，进行发酵，得到所述青贮饲料。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述青贮原料为燕麦。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵的发酵温度为-5℃～37℃。
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