CN114426945A - 胶质瘤类器官原代促活液、培养液及制备、培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胶质瘤类器官原代促活液、培养液及培养方法，属于胶质瘤类器官原代分离技术领域，所述胶质瘤类器官原代促活液主要成分包含有效浓度范围为1‑20μmol/L的丁苯酞和0.02‑0.5mol/L的异氟醚。本发明提供的一种胶质瘤类器官原代促活液，可显著提高胶质瘤类器官得率和活力，提高胶质瘤类器官传代后的活力；且不含动物血清及异质源蛋白，可避免病毒、细菌及支原体等污染。
Description
技术领域
本发明属于胶质瘤类器官原代分离技术领域，具体涉及一种胶质瘤类器官原代促活液、培养液及制备、培养方法。
背景技术
胶质瘤是一种常见的中枢神经系统恶性肿瘤，多以浸润性生长方式生长，与周围脑组织分界不清，手术完全切除难度较大，且术后易复发，因此对胶质瘤的体外研究尤为重要。
原代培养是指从肿瘤患者体内直接获得胶质瘤组织开始的细胞培养，它与人体真实的肿瘤细胞生存状态最为相似，并且包含胶质瘤细胞所具有的绝大部分特性，到目前为止，对胶质瘤类器官的研究大大增强了研究者对胶质瘤形成和代谢的理解，帮助研究者们制定和实施新的胶质瘤治疗策略。
然而，胶质瘤细胞的原代培养技术尚不成熟，目前现有的技术分离胶质瘤原代细胞往往细胞得率较低，因此提高胶质瘤原代细胞得率及细胞活力，对胶质瘤的研究有重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术中存在的难题，提供一种胶质瘤类器官原代促活液，能够提高胶质瘤细胞的得率和活力，加快胶质瘤细胞的增殖速度。
本发明的第二个目的是提供一种胶质瘤类器官原代培养液，能够提高胶质瘤细胞的得率和活力，加快胶质瘤细胞的增殖速度。
本发明的第三个目的是提供一种胶质瘤类器官原代培养液的制备方法。
本发明的第四个目的是提供一种原代胶质瘤细胞的培养方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供一种胶质瘤类器官原代促活液，包含丁苯酞和异氟醚。
进一步地，所述胶质瘤类器官原代促活液包含有效浓度范围为1-20μmol/L 的丁苯酞和0.02-0.5mol/L的异氟醚。
本发明的第二个方面，提供一种胶质瘤类器官原代培养液，包含上述胶质瘤类器官原代促活液。
本发明的第三个方面，提供一种胶质瘤类器官原代培养液的制备方法，具体包括：
(1)配制100倍浓缩的胶质瘤类器官原代促活液母液：分别称取丁苯酞和异氟醚，放入离心管中，加无菌水，轻轻摇晃离心管至丁苯酞和异氟醚完全溶解，过滤除菌；
(2)配制胶质瘤类器官原代培养液：取预热的生长培养液，按照生长培养液的体积将步骤(1)过滤除菌后的胶质瘤类器官原代促活液母液稀释100倍，混匀即得。
进一步地，所述胶质瘤类器官原代促活液母液中含有100-2000μmol/L的丁苯酞和2-50mol/L的异氟醚。
进一步地，所述生长培养液中包含DMEM高糖细胞培养液、1×B27血清替代物、20ng/mL EGF、10mM尼克酰胺、10μM抗坏血酸、25ng/mL FGF10、5μM A83-01、25ng/mL R-spondin-1。
本发明的第四个方面，提供一种原代胶质瘤细胞的培养方法，采用上述胶质瘤类器官原代培养液对原代胶质瘤细胞进行培养，具体包括以下步骤：
(1)使用含有30mL 4℃预冷的DMEM高糖培养液的无菌离心管保存手术切除的新鲜肿瘤标本，尽量避开边缘、囊变、坏死液化等部位；
(2)标本在4℃低温储存条件下6小时内送至实验室；提前30min打开生物安全柜，开启紫外线灯消毒灭菌；
(3)在生物安全柜内，将标本置于培养皿中，生理盐水洗净浮血，用无菌眼科剪将标本剪成糊状，加入约3-5倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃培养箱中消化15分钟，用200目不锈钢筛网过滤；1000rpm离心5min后弃上清液；
(4)加入生长培养液，轻轻混悬细胞至浓度为50000细胞/20μL的培养液；
(5)将细胞悬液与基质胶以1:5的体积比混合，混匀后将混合物以20μL/ 滴接种在培养皿中，注意不要产生气泡，静置3min，将培养皿放入37℃培养箱 30分钟使基质胶凝固；
(6)取出培养皿，在培养皿内加入配制的胶质瘤类器官原代培养液，置于培养箱中培养；
(7)48h后更培养液，加入生长培养液继续培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的一种胶质瘤类器官原代促活液，可显著提高胶质瘤类器官得率和活力，提高胶质瘤类器官传代后的活力。
本发明提供的一种胶质瘤类器官原代促活液，不含动物血清及异质源蛋白，可避免病毒、细菌及支原体等污染。
附图说明
图1为丁苯酞浓度优化的CCK8实验数据分析；
图2为异氟醚浓度优化的CCK8实验数据分析；
图3为不同浓度药物组合的CCK8实验数据分析；
图4为免疫组织化学染色结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述：
本发明提供一种胶质瘤类器官原代促活液，主要成分包含丁苯酞和异氟醚。
作为一种优选方案，所述胶质瘤类器官原代促活液主要成分包含有效浓度范围为1-20μmol/L的丁苯酞和0.02-0.5mol/L的异氟醚。
具体使用时其实是采用加了促活液的培养液对细胞进行培养，有效浓度范围指的是丁苯酞和异氟醚在胶质瘤类器官原代培养液中的浓度。
构建本发明所述胶质瘤类器官原代促活液的依据为：
丁苯酞具有促血管增生、改善能量代谢、降低细胞凋亡等多种作用；且丁苯酞可明显抑制缺氧条件下细胞内线粒体ROS的产生，最终达到调节缺氧诱导因子(HIF-1α)，因此在缺氧条件下，丁苯酞可保护细胞免受损伤，大大提高细胞的存活率。
异氟醚是一种临床常用的麻醉药，大量研究表明，异氟醚可诱导缺氧诱导因子(HIF-1α)的高表达，进而调控HIF-1α下游靶基因如血管内皮生长因子 (VEGF)，血红素氧合酶-1(HO-1)和诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的表达，降低细胞在缺氧状态下的损伤，促进细胞成活。
本发明还提供了一种胶质瘤类器官原代培养液，包含上述胶质瘤类器官原代促活液。
所述胶质瘤类器官原代培养液的制备方法包括：
(1)配制100倍浓缩的胶质瘤类器官原代促活液母液：分别称取丁苯酞和异氟醚，放入离心管中，加适量无菌水，轻轻摇晃离心管至丁苯酞和异氟醚完全溶解，其中母液中含有100-2000μmol/L的丁苯酞和2-50mol/L的异氟醚；
(2)过滤除菌：将步骤(1)配制的促活液母液，通过物料通道传入实验室，在生物安全柜中用0.22μm的过滤器过滤除菌；
(3)配制胶质瘤类器官原代培养液：取预热的生长培养液(其中，生长培养液中包含DMEM高糖细胞培养液、1×B27血清替代物、20ng/mL EGF、10mM 尼克酰胺、10μM抗坏血酸、25ng/mL FGF10、5μM A83-01、25ng/mL R-spondin-1)，按照生长培养液的体积将步骤(2)过滤除菌后的胶质瘤类器官原代促活液母液稀释100倍(也就是说，用生长培养液将过滤除菌后的胶质瘤类器官原代促活液母液稀释100倍)，混匀后备用。
本发明还提供了一种原代胶质瘤细胞的培养方法，采用上述胶质瘤类器官原代培养液对原代胶质瘤细胞进行培养，具体包括以下步骤：
(1)将基质胶提前放入4℃融化，实验前置于冰上，实验所需枪头需在-20℃冰箱提前预冷，所需培养皿提前放入培养箱预热；
(2)使用含有30mL 4℃预冷的DMEM高糖培养液的无菌离心管保存手术切除的新鲜肿瘤标本，尽量避开边缘、囊变、坏死液化等部位；
(3)标本在4℃低温储存条件下6小时内送至实验室；提前30min打开生物安全柜，开启紫外线灯消毒灭菌；
(4)在生物安全柜内，将标本置于培养皿中，生理盐水洗净浮血，用无菌眼科剪将标本剪成糊状，加入约3-5倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃培养箱中消化15分钟，用200目不锈钢筛网过滤；1000rpm离心5min后弃上清液；
(5)加入适量生长培养液，轻轻混悬细胞至浓度为50000细胞/20μL的培养液；
(6)将细胞悬液与基质胶以1:5的比例混合，混匀后将混合物以20μL/滴接种在培养皿中，注意不要产生气泡，静置3min，将培养皿放入37℃培养箱30 分钟使基质胶凝固；
(7)取出培养皿，在培养皿内加入配制的胶质瘤类器官原代培养液，置于 37℃，5％CO2的培养箱中培养；
(8)48h后更培养液，加入生长培养液继续培养；
(9)培养14天后弃掉培养液，用PBS清洗两遍，加入基质胶溶解酶，置于冰上消化1-2小时，再转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，加入PBS 清洗一遍；
(10)离心后弃掉上清液，加入生长培养液，转入96孔板中，每孔100μl 细胞悬液；
(11)每孔加入10μl CCK8试剂，放入37℃的培养箱中培养2小时，用酶标仪检测450nm处的吸光值。
下述实施例中的实验方法，无特殊说明者均为常规方法；所用的实验试剂，无特殊说明者均购自常规试剂厂家。
本发明需要提示说明的实验环境、实验材料和仪器设备如下：
实验环境：GMP环境下实验室内生物安全柜中操作。
实验试剂：异氟醚，丁苯酞，生长培养液，磷酸盐缓冲液PBS(磷酸盐缓冲液PBS为现有常规PBS，这里不再赘述)。
仪器与设备：CO2培养箱，生物安全柜，酶标仪，离心机，电子天平，96 孔板。
本实施例用于介绍本发明一种胶质瘤类器官原代促活液的制备及试剂性能。本发明胶质瘤类器官原代促活液，可显著提高胶质瘤类器官得率和活力，提高胶质瘤类器官传代后的活力。本发明所述的胶质瘤类器官原代促活液不含动物血清及异质源蛋白，可避免病毒、细菌及支原体等污染。
实施例一 胶质瘤原代细胞加丁苯酞组增殖活力的检测
具体地，在本实施例中，所述细胞为胶质瘤细胞。
具体包括以下步骤：
(1)将基质胶提前放入4℃融化，实验前置于冰上，实验所需枪头需在-20℃冰箱提前预冷，所需培养皿提前放入培养箱预热；
(2)配制丁苯酞母液：用分析天平精确称取丁苯酞至离心管中，加适量无菌水，轻轻摇晃离心管至丁苯酞溶解，其中丁苯酞母液的浓度为100、500、1000、 1500和2000μmol/L；
(3)过滤除菌：将上述配制的丁苯酞母液，通过物料通道传入实验室，在生物安全柜中用0.22μm的过滤器过滤除菌；
(4)配制预用培养液：取预热的生长培养液(其中，生长培养液中包含 DMEM高糖细胞培养液、1×B27血清替代物、20ng/mL EGF、10mM尼克酰胺、 10μM抗坏血酸、25ng/mLFGF10、5μM A83-01、25ng/mL R-spondin-1)，按照培养液的体积将丁苯酞母液稀释100倍，混匀后备用；
(5)使用含有生长培养液的无菌瓶保存手术切除的新鲜肿瘤标本，尽量避开边缘、囊变、坏死液化等部位；
(6)标本在液氮储存条件下30min内立即送至实验室；提前30min打开生物安全柜，开启紫外线灯消毒灭菌；
(7)在生物安全柜内，将标本置于培养皿中，生理盐水冲洗至澄清，用无菌眼科剪将标本剪成糊状，加入约3-5倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃温箱中消化5min-10min，用200目不锈钢筛网过滤；1000rpm离心5min后弃上清液；
(8)加入适量生长培养液，轻轻混悬细胞；
(9)将细胞悬液于基质胶以1:5的体积比混合，混匀后将混合物滴在培养皿中，注意不要产生气泡，静置3min，将培养皿放入培养箱15min左右使基质胶凝固；
(10)取出培养皿，在培养皿内加入适量步骤(4)中配制预用培养液，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养；
(11)48h后更换培养液，加入生长培养液继续培养；
(12)培养14天后弃掉培养液，用PBS清洗两遍，加入基质胶溶解酶，置于冰上消化1-2小时，再转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，加入PBS 清洗一遍；
(13)离心后弃掉上清液，加入生长培养液，转入96孔板中，每孔100μl 细胞悬液；
(14)每孔加入10μl CCK8试剂，放入37℃的培养箱中培养2小时；
(15)用酶标仪检测450nm处的吸光值。
实施例二 胶质瘤原代细胞加异氟醚组增殖活力的检测
具体地，在本实施例中，所述细胞为胶质瘤细胞。
具体包括以下步骤：
(1)将基质胶提前放入4℃融化，实验前置于冰上，实验所需枪头需在-20℃冰箱提前预冷，所需培养皿提前放入培养箱预热；
(2)配制异氟醚母液：用分析天平精确称取异氟醚至离心管中，加适量无菌水，轻轻摇晃离心管至试剂溶解，其中异氟醚母液的浓度为2、5、10、20和 50mol/L；
(3)过滤除菌：将上述配制的异氟醚母液，通过物料通道传入实验室，在生物安全柜中用0.22μm的过滤器过滤除菌；
(4)配制预用培养液，取预热的生长培养液，按照培养液的体积将所述异氟醚母液稀释100倍，混匀后备用；
(5)使用含有生长培养液的无菌瓶保存手术切除的新鲜肿瘤标本，尽量避开边缘、囊变、坏死液化等部位；
(6)标本在液氮储存条件下30min内立即送至实验室；提前30min打开生物安全柜，开启紫外线灯消毒灭菌；
(7)在生物安全柜内，将标本置于培养皿中，生理盐水冲洗至澄清，用无菌眼科剪将标本剪成糊状，加入约3-5倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃温箱中消化5min-10min，用200目不锈钢筛网过滤；1000rpm离心5min后弃上清液；
(8)加入适量生长培养液，轻轻混悬细胞；
(9)将细胞悬液于基质胶以1:5的体积比混合，混匀后将混合物滴在培养皿中，注意不要产生气泡，静置3min，将培养皿放入培养箱15min左右使基质胶凝固；
(10)取出培养皿，在培养皿内加入适量步骤(4)中配制的预用培养液，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养；
(11)48h后更换培养液，加入生长培养液继续培养；
(12)培养14天后弃掉培养液，用PBS清洗两遍，加入基质胶溶解酶，置于冰上消化1-2小时，再转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，加入PBS 清洗一遍；
(13)离心后弃掉上清液，加入生长培养液，转入96孔板中，每孔100μl 细胞悬液；
(14)每孔加入10μl CCK8试剂，放入37℃的培养箱中培养2小时；
(15)用酶标仪检测450nm处的吸光值。
实施例三 胶质瘤原代细胞加丁苯酞和异氟醚组增殖活力的检测
一种胶质瘤类器官原代促活液，主要成分包含有效浓度范围为1-20μmol/L 的丁苯酞、0.02-0.5mol/L的异氟醚。
具体地，在本实施例中，所述胶质瘤类器官原代促活液包含10μmol/L丁苯酞和0.02mol/L异氟醚、10μmol/L丁苯酞和0.1mol/L异氟醚、10μmol/L丁苯酞和0.5mol/L异氟醚、5μmol/L丁苯酞和0.1mol/L异氟醚、15μmol/L丁苯酞和 0.1mol/L异氟醚。
具体地，在本实施例中，所述细胞为胶质瘤细胞。
具体包括以下步骤：
(1)将基质胶提前放入4℃融化，实验前置于冰上，实验所需枪头需在-20℃冰箱提前预冷，所需培养皿提前放入培养箱预热；
(2)配制100倍浓缩的胶质瘤类器官原代促活液母液：用分析天平分别精确称取丁苯酞和异氟醚至离心管中，加适量无菌水，轻轻摇晃离心管至丁苯酞和异氟醚溶解，其中配置的母液中丁苯酞和异氟醚的浓度分别为：1000μmol/L 丁苯酞和2mol/L异氟醚、1000μmol/L丁苯酞和10mol/L异氟醚、1000μmol/L 丁苯酞和50mol/L异氟醚、500μmol/L丁苯酞和10mol/L异氟醚、1500μmol/L 丁苯酞和10mol/L异氟醚；
(3)过滤除菌：将上述配制的胶质瘤类器官原代促活液母液，通过物料通道传入实验室，在生物安全柜中用0.22μm的过滤器过滤除菌；
(4)配制预用培养液，取预热的生长培养液，按照培养液的体积将所述胶质瘤类器官原代促活液母液稀释100倍，混匀后备用；
(5)使用含有生长培养液的无菌瓶保存手术切除的新鲜肿瘤标本，尽量避开边缘、囊变、坏死液化等部位；
(6)标本在液氮储存条件下30min内立即送至实验室；提前30min打开生物安全柜，开启紫外线灯消毒灭菌；
(7)在生物安全柜内，将标本置于培养皿中，生理盐水冲洗至澄清，用无菌眼科剪将标本剪成糊状，加入约3-5倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃温箱中消化5min-10min，用200目不锈钢筛网过滤；1000rpm离心5min后弃上清液；
(8)加入适量生长培养液，轻轻混悬细胞；
(9)将细胞悬液于基质胶以1:5的比例混合，混匀后将混合物滴在培养皿中，注意不要产生气泡，静置3min，将培养皿放入培养箱15min左右使基质胶凝固；
(10)取出培养皿，在皿内加入适量步骤4中配制的预用培养液，置于37℃， 5％CO2的培养箱中培养；
(11)48h后更换培养液，加入生长培养液继续培养；
(12)培养14天后弃掉培养液，用PBS清洗两遍，加入基质胶溶解酶，置于冰上消化1-2小时，再转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，加入PBS 清洗一遍；
(13)离心后弃掉上清液，加入生长培养液，转入96孔板中，每孔100μl 细胞悬液；
(14)每孔加入10μl CCK8试剂，放入37℃的培养箱中培养2小时；
(15)用酶标仪检测450nm处的吸光值。
对照例
具体地，在本对照例中，所述细胞为胶质瘤细胞。
(1)将基质胶提前放入4℃融化，实验前置于冰上，实验所需枪头需在-20℃冰箱提前预冷，所需培养皿提前放入培养箱预热；
(2)使用含有生长培养液的无菌瓶保存手术切除的新鲜肿瘤标本，尽量避开边缘、囊变、坏死液化等部位；
(3)标本在液氮储存条件下30min内立即送至实验室；提前30min打开生物安全柜，开启紫外线灯消毒灭菌；
(4)在生物安全柜内，将标本置于培养皿中，生理盐水冲洗至澄清，用无菌眼科剪将标本剪成糊状，加入约3-5倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃温箱中消化5min-10min，用200目不锈钢筛网过滤；1000rpm离心5min后弃上清液；
(5)加入适量生长培养液，轻轻混悬细胞；
(6)将细胞悬液于基质胶以1:5的比例混合，混匀后将混合物滴在培养皿中，注意不要产生气泡，静置3min，将培养皿放入培养箱15min左右使基质胶凝固；
(7)取出培养皿，在培养皿内加入生长培养液，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养；
(8)48h后换液，加入生长培养液继续培养。
(9)培养14天后弃掉培养液，用PBS清洗两遍，加入基质胶溶解酶，置于冰上消化1-2小时，再转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，加入PBS 清洗一遍；
(10)离心后弃掉上清液，加入生长培养液，转入96孔板中，每孔100μl 细胞悬液；
(11)每孔加入10μl CCK8试剂，放入37℃的培养箱中培养2小时；
(12)用酶标仪检测450nm处的吸光值。
将实施例一与对照例进行对比，其结果如图1所示；表1为丁苯酞浓度优化的CCK8实验数据。
表1
从表1和图1可见，胶质瘤原代类器官吸光度随丁苯酞浓度变化呈现依赖性。在生长培养液中加入不同浓度的丁苯酞，在1μmol/L-10μmol/L的范围内，随着浓度增加，细胞增殖活力越强，浓度为10μg/ml时，细胞增殖活力最强，在10μmol/L-20μmol/L的范围内，细胞增值活力呈下降趋势，因此选10μmol/L 的丁苯酞为最佳浓度。
将实施例二与对照例进行对比，其结果如图2所示；表2为异氟醚浓度优化的CCK8实验数据。
表2
从表2和图2可见，胶质瘤原代类器官吸光度随异氟醚浓度变化呈现依赖性。在培养液中加入不同浓度的异氟醚，在0mol/L-0.1mol/L的范围内，随着浓度增加，细胞增殖活力越强，浓度为0.1mol/L时，细胞增殖活力最强，在 0.1mol/L-0.5mol/L的范围内，细胞增值活力基本呈持平趋势，因此选0.1mol/L 的异氟醚为最佳浓度。
将实施例三与对照例进行对比，结果如图3所示，表3为不同浓度药物组合优化的CCK8实验数据。
表3
从表3和图3可见，胶质瘤原代类器官吸光度随丁苯酞和异氟醚浓度变化呈现依赖性。在培养液中加入不同浓度的丁苯酞和异氟醚，结果显示，不同浓度的组合均可以不同程度地提高细胞增殖活力，其中，10μmol/L丁苯酞和0.1 mol/L异氟醚的组合，对细胞增值活力的提升尤为显著，因此，本发明所述的细胞活力增强液采用10μmol/L丁苯酞和0.1mol/L异氟醚为最佳条件。
空白例
具体步骤如下：
(1)取生长培养液，加入96孔板中，每孔100μl，放入37℃，5％CO2的培养箱中；
(2)培养48小时后，换生长培养液继续培养；
(3)24小时后弃掉培养液，每孔加入100μl生长培养液，再加10μl CCK8 试剂，放入37℃的培养箱中培养2小时；
(4)用酶标仪检测450nm处的吸光值。
表4为空白组的CCK8实验数据
表4
| 组别 | 空白平行1 | 空白平行2 | 空白平行3 | 空白平行4 |
| OD值 | 0.1684 | 0.1627 | 0.1732 | 0.1689 |
空白例所得数据主要用于计算实施例一、实施例二、实施例三及对照例的吸光度时，排除空白孔中生长培养液的背景吸光度干扰，在计算时予以减去。
实施例四 形态学及免疫组织化学鉴定胶质瘤原代细胞
一种胶质瘤类器官原代促活液，主要成分包含有效浓度范围为1-20μmol/L 的丁苯酞、0.02-0.5mol/L的异氟醚。
具体地，在本实施例中，所述胶质瘤类器官原代促活液包含10μmol/L丁苯酞和0.1mol/L异氟醚。
具体地，在本实施例中，所述细胞为原代胶质瘤细胞。
具体地，在本实施例中，所述一抗为兔抗人(GFAP)抗体、兔抗人(Ki-67) 抗体，所述二抗为羊抗兔抗体。
具体包括以下步骤：
(1)将基质胶提前放入4℃融化，实验前置于冰上，实验所需枪头需在-20℃冰箱提前预冷，所需培养皿提前放入培养箱预热；
(2)配制胶质瘤类器官原代促活液母液：用分析天平精确称取丁苯酞和异氟醚至离心管中，加适量无菌水，轻轻摇晃离心管至丁苯酞和异氟醚溶解，其中丁苯酞和异氟醚的浓度分别为1000μmol/L和10mol/L；
(3)过滤除菌：将上述配制的胶质瘤类器官原代促活液母液，通过物料通道传入实验室，在生物安全柜中用0.22μm的过滤器过滤除菌；
(4)配制预用培养液：取预热的生长培养液，按照培养液的体积将所述胶质瘤类器官原代促活液母液稀释100倍，混匀后备用；
(5)使用含有生长培养液的无菌瓶保存手术切除的新鲜肿瘤标本，尽量避开边缘、囊变、坏死液化等部位；
(6)标本在液氮储存条件下30min内立即送至实验室；提前30min打开生物安全柜，开启紫外线灯消毒灭菌；
(7)在生物安全柜内，将标本置于培养皿中，生理盐水冲洗至澄清，用无菌眼科剪将标本剪成糊状，加入约3-5倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃温箱中消化5min-10min，用200目不锈钢筛网过滤；1000rpm离心5min后弃上清液；
(8)加入适量生长培养液，轻轻混悬细胞；
(9)将细胞悬液于基质胶以1:5的比例混合，混匀后将混合物滴在培养皿中，注意不要产生气泡，静置3min，将培养皿放入培养箱15min左右使基质胶凝固；
(10)取出培养皿，在培养皿内加入适量步骤4中配制的预用培养液，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养；
(11)48h后更换培养液，加入生长培养液继续培养；
(11)继续培养三周，待胶质瘤类器官长至2mm；
(12)制备石蜡包埋切片；
(13)烤片：取石蜡包埋切片，至烘箱烤片2小时；
(14)石蜡包埋切片脱蜡并水化：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-二甲苯III 15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精 5min-75％酒精5min-蒸馏水洗；
(15)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min，保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，自然冷却后将玻片置于 PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
(16)阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育 25min，将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
(17)血清封闭：在组化圈内滴加3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭 30min；
(18)加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)；
(19)加二抗：玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50min；
(20)AEC显色：玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的AEC显色液，避光孵育 10-25min，阳性为红色，自来水冲洗切片终止显色；
(21)复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗；
(22)封片：核镜检完毕后，将片子置于纯水中，稍微晾干后，有甘油明胶封片，自然风干；
(23)镜检：显微镜镜检，图像采集分析。
如图4所示，按照本发明所述方法对胶质瘤类器官的体外培养，不同患者来源的胶质瘤类器官呈现出不同的形态特征，但均可在体外快速增殖，且高表达胶质瘤特异性分子marker。
A，胶质瘤类器官三维培养示例；
B、C，相差照片显示不同个体培养的胶质瘤类器官形态、致密程度不同；
D，胶质瘤类器官HE染色结果；
E、F，胶质瘤类器官免疫荧光染色结果。(E)Ki67阳性指示快速增殖细胞； (F)显示胶质瘤特异性marker GFAP阳性细胞。
最后应说明的是，上述技术方案只是本发明的一种实施方式，对于本领域内的技术人员而言，在本发明公开了应用方法和原理的基础上，很容易做出各种类型的改进或变形，而不仅限于本发明上述具体实施方式所描述的方法，因此前面描述的方式只是优选的，而并不具有限制性的意义。
Claims (7)
1.一种胶质瘤类器官原代促活液，其特征在于，所述促活液包含丁苯酞和异氟醚。
2.根据权利要求1所述的一种胶质瘤类器官原代促活液，其特征在于，所述胶质瘤类器官原代促活液包含有效浓度范围为1-20μmol/L的丁苯酞和0.02-0.5mol/L的异氟醚。
3.一种胶质瘤类器官原代培养液，其特征在于，包含权利要求1或2所述的胶质瘤类器官原代促活液。
4.一种胶质瘤类器官原代培养液的制备方法，其特征在于，具体包括：
(1)配制100倍浓缩的胶质瘤类器官原代促活液母液：分别称取丁苯酞和异氟醚，放入离心管中，加无菌水，轻轻摇晃离心管至丁苯酞和异氟醚完全溶解，过滤除菌；
(2)配制胶质瘤类器官原代培养液：取预热的生长培养液，按照生长培养液的体积将步骤(1)过滤除菌后的胶质瘤类器官原代促活液母液稀释100倍，混匀即得。
5.根据权利要求4所述的一种胶质瘤类器官原代培养液的制备方法，其特征在于，所述胶质瘤类器官原代促活液母液中含有100-2000μmol/L的丁苯酞和2-50mol/L的异氟醚。
6.根据权利要求4所述的一种胶质瘤类器官原代培养液的制备方法，其特征在于，所述生长培养液中包含DMEM高糖细胞培养液、1×B27血清替代物、20ng/mL EGF、10mM尼克酰胺、10μM抗坏血酸、25ng/mL FGF10、5μM A83-01、25ng/mL R-spondin-1。
7.一种原代胶质瘤细胞的培养方法，其特征在于，采用权利要求3所述的胶质瘤类器官原代培养液对原代胶质瘤细胞进行培养，所述培养方法包括以下步骤：
(1)使用含有30mL 4℃预冷的DMEM高糖培养液的无菌离心管保存手术切除的新鲜肿瘤标本，尽量避开边缘、囊变、坏死液化部位；
(2)标本在4℃低温储存条件下6小时内送至实验室；提前30min打开生物安全柜，开启紫外线灯消毒灭菌；
(3)在生物安全柜内，将标本置于培养皿中，生理盐水洗净浮血，用无菌眼科剪将标本剪成糊状，加入3-5倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃培养箱中消化15分钟，用200目不锈钢筛网过滤；1000rpm离心5min后弃上清液；
(4)加入生长培养液，轻轻混悬细胞至浓度为50000细胞/20μL的培养液；
(5)将细胞悬液与基质胶以1:5的体积比混合，混匀后将混合物以20μL/滴接种在培养皿中，注意不要产生气泡，静置3min，将培养皿放入37℃培养箱30分钟使基质胶凝固；
(6)取出培养皿，在培养皿内加入配制的胶质瘤类器官原代培养液，置于培养箱中培养；
(7)48h后更培养液，加入生长培养液继续培养。
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