CN114377119A

CN114377119A - 重组鞭毛蛋白在制备水产动物抗哈维氏弧菌药物中的应用

Info

Publication number: CN114377119A
Application number: CN202210150352.XA
Authority: CN
Inventors: 孙云; 王君芳; 周永灿; 曹贞洁
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2022-02-18
Filing date: 2022-02-18
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2042-02-18
Also published as: CN114377119B

Abstract

本发明涉及一种重组鞭毛蛋白在制备水产动物抗哈维氏弧菌药物中的应用；属于生物工程和免疫学技术领域，所述重组鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述重组鞭毛蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述重组载体包括表达载体和所述重组鞭毛蛋白的基因；所述表达载体为原核表达载体pET32a；所述重组菌包括宿主细菌和所述重组载体；所述宿主细菌为Rosetta工程菌株。本发明的重组鞭毛蛋白制备的疫苗对哈维氏弧菌的免疫保护率达83.77％。

Description

重组鞭毛蛋白在制备水产动物抗哈维氏弧菌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物工程和免疫学技术领域，具体涉及一种重组鞭毛蛋白在制备水产动物抗哈维氏弧菌药物中的应用。

背景技术

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)能引起多种海水养殖鱼类的病害，而且弧菌性疾病发病迅速、控制困难，对渔业生产造成严重的经济损失。在哈维氏弧菌的防治中，抗生素为主要的防治方法，但是容易产生耐药性，而且还会破坏环境微生态。免疫防治药效维持的时间长、还能避免产生耐药性，具有很好的发展前景。

鞭毛是附着在菌体上呈细长波状弯曲的丝状体，是细菌的运动器官，与致病性有关。鞭毛自细胞膜长出，游离于菌细胞膜外，有基础小体、钩状体和丝状体三个部分组成。由菌体内形成的鞭毛蛋白分子不断地添加到鞭毛的末端堆积而形成。鞭毛蛋白单体(flagellin，30-60kDa，基于细菌分类群)由鞭毛蛋白输出系统从细菌中分泌出来。由于鞭毛蛋白在各种细菌物种中广泛存在，且在单个细菌细胞中含量丰富，细菌鞭毛在侵染过程中发挥了重要作用。

发明内容

本发明目的在于提供一种重组鞭毛蛋白在制备水产动物抗哈维氏弧菌药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组鞭毛蛋白在制备水产动物抗哈维氏弧菌药物中的应用；

所述重组鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述重组鞭毛蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述重组载体包括表达载体和所述重组鞭毛蛋白的基因；所述表达载体为原核表达载体pET32a；

所述重组菌包括宿主细菌和所述重组载体；所述宿主细菌为Rosetta工程菌株。

一种抗哈维氏弧菌药物，包括重组鞭毛蛋白；所述重组鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1.保护性强，本发明利用所述重组鞭毛蛋白制备的亚单位疫苗对哈维氏弧菌的免疫保护率达83.77％。

2.安全性高，不含有感染性组分，但可以诱导机体产生保护性的免疫力。

3.为哈维式弧菌的病害防治提供了新途径。

附图说明

图1是哈维氏弧菌鞭毛蛋白基因的PCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶中的电泳图，M:DNA Marker DL2000；1：鞭毛蛋白基因的PCR扩增产物；

图2是重组鞭毛蛋白表达的SDS-PAGE检测图，1：未诱导重组全菌；2：诱导后重组菌；3：pET-32a诱导全菌；M:蛋白Marker；

图3是重组蛋白纯化后的鞭毛蛋白检SDS-PAGE测图，1：重组蛋白纯化后的鞭毛蛋白；2：纯化后的pET-32a；M:蛋白Marker；

图4是接种疫苗四周后的攻毒实验数据统计结果。

具体实施方式

实施例1T1-Simple-B质粒构建

取保存的哈维氏弧菌活化培养后转接，30℃，180rpm震荡培养16小时。

使用天根公司的细菌DNA提取试剂盒提取哈维氏弧菌GDH11385的DNA。

根据GeneBank上的哈维氏弧菌鞭毛蛋白序列设计引物，引物序列如下：

引物F1：5’-CCCGGGATGGCGATTAACGTTAATACTAACG-3’；SEQ ID No.2；

引物R1：5’-CCCGGGGCCCAACAAGCTTAGCGCTGC-3’；SEQ ID No.3。

以提取的哈维氏弧菌DNA为模板，以引物F1、R1为引物进行PCR扩增，获得条带大小为1128bp的目的基因(如图1所示)。

PCR反应体系：

TaqBuffer,2.5μL；2.5mM dNTPs,2μL；DNAPolymerase,1μL；F1(10μM),0.5μL；R1(10μM),0.5μL；扩增条件为：94℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃90s,35cycles；72℃5min。

PCR产物进行跑胶检测后割胶对正确片段进行胶回收，使用Vazyme公司的胶回收试剂盒，按照试剂盒中的说明书进行胶回收。DNA保存于-20℃。

按照T1Simple说明书上的方式将目的基因与T1Simple进行连接，转化至DH5α细胞中；挑单菌落检测，阳性菌株摇菌保种，送至华大基因有限公司进行测序，测序。

测序正确的菌株以及实验室保存的pET-32a菌株，摇菌，按照Vazyme公司的质粒提取试剂盒提取质粒T1simple-B、pET-32a，提取过后的质粒存放于-20℃冰箱里。

实施例2原核表达载体的构建

酶切质粒T1simple-B和质粒pET-32a，将酶切产物进行凝胶回收，回收产物按照6：1的比例混匀，加入10×buffer溶液1μL后再加入T4连接酶溶液0.5μL，再使用ddH₂O补至10μL，于16℃的金属浴锅中过夜放置，然后再转入DH5α，挑单菌落检测，阳性菌株摇菌保种，送至华大基因有限公司进行测序，测序，测序结果显示pET-32a-B含有SEQ ID No.1中的碱基序列。

将测序正确的菌株按照Vazyme公司的质粒提取试剂盒提取质粒pET-32a-B，转入Rosetta(DE3)感受态中，检测阳性菌株保存。

实施例3重组蛋白的表达纯化

取出含有pET-32a-B的Rosetta(DE3)表达菌株进行活化；转接到含有1‰Amp的100mL LB培养基中，30℃培养至细菌浓度OD₆₀₀为0.6，加入IPTG至终浓度为0.1mM诱导12小时；转化pET-32a质粒的Rosetta(DE3)菌株作为对照(30℃摇床，IPTG的浓度为0.1mM)。

6000g，15min离心，收集诱导完的菌体；将菌体沉淀转入50mL离心管中，加12mL的裂解Buffer重悬菌体，将50mL离心管置于冰水混合物中，使用超声波破碎仪进行细胞破碎；程序设定为：功率300w，3s/次，间歇10s，重复70次

将裂解液分装至2mL的离心管中，13000g×20min，收集上清，利用镍柱亲和层析对蛋白进行纯化，纯化后进行SDS-PAGE检测(如图2)。

纯化过后的蛋白使用移液枪转移入透析袋中，透析袋放入PBS溶液中处理20小时，尿素的浓度逐渐以每2M的倍数依次递减，每5小时换次液体，一共透析20小时。

取出少量纯化透析过后的重组蛋白进行蛋白胶检测(如图3)，使用Solarbio公司的BCA蛋白浓度试剂盒去测定上述纯化透析过后的重组蛋白的蛋白浓度。

实施例4疫苗制备及免疫

氢氧化铝胶体配制(25mL)：使用量筒取5％硫酸铝溶液的25mL，取5％的氢氧化钠溶液的10mL，玻璃棒搅拌至溶液出现乳白色的沉淀，用灭菌后的PBS洗涤沉淀5次，再使用灭菌后的PBS定容至25ml。

将上述透析后的蛋白使用PBS稀释至300μg/μL，与氢氧化铝胶体1：1混匀，即为鞭毛蛋白亚单位疫苗，对哈维氏弧菌具有较好的免疫保护效果。

将100尾平均体重约为20g的珍珠龙胆石斑鱼平均分为两组，实验组每尾腹腔注射100μL制备的亚单位疫苗，对照组注射等量的PBS。在第三周补注射一次。

实施例5疫苗的免疫保护效应检测

在注射疫苗四周后，将哈维氏弧菌摇至对数期，用PBS洗涤3次后用PBS重悬至6×10⁵CFU/mL，实验组和对照组各取20尾，每尾注射100μL菌液进行攻毒实验，在之后的一周中，每天记录各组鱼的死亡情况，一周后进行统计(图4)，根据公式计算出该疫苗的相对免疫保护率(RPS)。

RPS＝100×(1-实验组鱼的死亡百分比/对照组鱼的死亡百分比)。得到哈维氏弧菌鞭毛蛋白亚单位疫苗针对哈维氏弧菌的免疫保护效率为83.77％。

由此得出哈维氏弧菌鞭毛蛋白亚单位疫苗可以高效保护珍珠龙胆石斑鱼抵御哈维氏弧菌的侵染。

序列表

<110> 海南大学

<120> 重组鞭毛蛋白在制备水产动物抗哈维氏弧菌药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1176

<212> DNA

<213> 哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)

<400> 1

ggtgagagac acgacggtgc atcaactaaa gccttaagga gatcaattat ggcgattaac 60

gttaatacta acgtttctgc gatgaccgca cagcgttacc taaaccaagc ggctgaaggt 120

caacaaaaat caatggagcg tttgtcttcg ggttataaaa tcaatagcgc gaaagatgat 180

gctgcaggtc tacagatttc taaccgtttg aacgcacaga gccgtggtct agacatggct 240

gtgaaaaacg cgaacgacgg tatttctatt gcacaggttg ctgaaggtgc aatgaatgaa 300

tctaccaaca tcctacaacg tatgcgtgac ctatcgcttc aatctgcgaa cggttcgaac 360

tcaaaatcag aacgtgtagc gatccaagaa gaagtaacag cgcttaacga cgagctaaac 420

cgtatcgctg aaacaacctc tttcggtggt aacaagcttc taaacggtac ttacggtact 480

caatctttcc aaatcggtgc ggactctggt gaagcagtaa tgctttctat gggtaaccta 540

cgttctgata cttctgcaat gggcggtaag agctacgcag cagaagacgg taaagatgcg 600

tcatggacag tgagcgataa aactgaactt aaaatgacgt acaccaacaa gcaaggcgaa 660

gagcaagagc ttactgtcca agcaaaacaa ggcgacgata ttgagcagct agcgacttac 720

atcaacggtc aaagcgaaga tgtaaaagcg tctgttggtg aagatggcaa actacaagta 780

tttgcttctt ctcaaaaagt aacgggtgac gttgagttct ctggtaacct agcgggtgag 840

atcggcttcg gtgacgcaaa agacgtaacg gttaaagaca tcgacgtaac aagcgttgca 900

ggctctcaag aagcggtagc tatcattgat ggcgcactaa aatcagtaga cagccaacgt 960

gcgtctcttg gtgcattcca aaaccgtttc aaccacgcta tcagcaacct agacaacatt 1020

aacgagaacg ttaatgcgtc taacagccgt attaaagata ctgactacgc gaaggaaaca 1080

acggcaatga ctaagtcgca aatccttcaa caagcaagta cttcaatctt ggctcaagcg 1140

aagcagtcac catctgcagc gctaagcttg ttgggc 1176

<210> 3

<211> 392

<212> PRT

<213> 哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)

<400> 3

Gly Glu Arg His Asp Gly Ala Ser Thr Lys Ala Leu Arg Arg Ser Ile

1 5 10 15

Met Ala Ile Asn Val Asn Thr Asn Val Ser Ala Met Thr Ala Gln Arg

20 25 30

Tyr Leu Asn Gln Ala Ala Glu Gly Gln Gln Lys Ser Met Glu Arg Leu

35 40 45

Ser Ser Gly Tyr Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

50 55 60

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Ala Gln Ser Arg Gly Leu Asp Met Ala

65 70 75 80

Val Lys Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Val Ala Glu Gly

85 90 95

Ala Met Asn Glu Ser Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

100 105 110

Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

115 120 125

Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

130 135 140

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

145 150 155 160

Gln Ser Phe Gln Ile Gly Ala Asp Ser Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

165 170 175

Met Gly Asn Leu Arg Ser Asp Thr Ser Ala Met Gly Gly Lys Ser Tyr

180 185 190

Ala Ala Glu Asp Gly Lys Asp Ala Ser Trp Thr Val Ser Asp Lys Thr

195 200 205

Glu Leu Lys Met Thr Tyr Thr Asn Lys Gln Gly Glu Glu Gln Glu Leu

210 215 220

Thr Val Gln Ala Lys Gln Gly Asp Asp Ile Glu Gln Leu Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Ile Asn Gly Gln Ser Glu Asp Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Asp Gly

245 250 255

Lys Leu Gln Val Phe Ala Ser Ser Gln Lys Val Thr Gly Asp Val Glu

260 265 270

Phe Ser Gly Asn Leu Ala Gly Glu Ile Gly Phe Gly Asp Ala Lys Asp

275 280 285

Val Thr Val Lys Asp Ile Asp Val Thr Ser Val Ala Gly Ser Gln Glu

290 295 300

Ala Val Ala Ile Ile Asp Gly Ala Leu Lys Ser Val Asp Ser Gln Arg

305 310 315 320

Ala Ser Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser Asn

325 330 335

Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Asn Ser Arg Ile Lys

340 345 350

Asp Thr Asp Tyr Ala Lys Glu Thr Thr Ala Met Thr Lys Ser Gln Ile

355 360 365

Leu Gln Gln Ala Ser Thr Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ser Pro

370 375 380

Ser Ala Ala Leu Ser Leu Leu Gly

385 390

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccgggatgg cgattaacgt taatactaac g 31

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccggggccc aacaagctta gcgctgc 27

Claims

1.一种重组鞭毛蛋白在制备水产动物抗哈维氏弧菌药物中的应用，其特征在于所述重组鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述重组鞭毛蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2.一种抗哈维氏弧菌药物，包括重组鞭毛蛋白；所述重组鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQID No.2所示。