CN114315847B - 一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然产物化学领域，所属IPC分类号为A61K 36/59，具体涉及一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法。绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，包括以下步骤：(1)使用酸水提取粉防己根药材、过滤后得到滤液；(2)向滤液中加入多酚类成分搅拌均匀后静置、离心，收集固体；(3)将步骤(2)中的固体分散于20～40％的醇中，调pH至4.5～5.0，加入酶，酶解；(4)向步骤(3)中加入聚酰胺，搅拌吸附后过滤，收集滤液，回收溶剂得到类白色生物总碱。本发明中仅使用少量的乙醇和盐酸就能够获得很好的提取效果，该提取方法绿色环保，工艺简单，便于产业化。

Description

一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法

技术领域

本发明涉及天然产物化学领域，所属IPC分类号为A61K 36/59，具体涉及一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法。

技术背景

粉防己的主要成分是生物碱，以粉防己碱和防己诺林碱为主，二者在粉防己根中的总含量约2.0％，具有抗肿瘤、镇痛、抗炎、抗过敏、抗肝纤维化、抗肺纤维化、抗菌、保护神经系统等作用。

粉防己生物总碱的提取方法通常是酸水或醇-水提取，提取液经氯仿脱脂后调至碱性使生物碱沉淀出来，然后再经反复调酸、调减，重结晶精制；或者提取液通过树脂吸附，再用有机溶剂洗脱。现有技术使用大量的酸、碱和有机溶剂，对环境危害大，且工序相对复杂。

专利CN101288695B中使用首先使用酸水溶液将粉防己粗粉渗滤，然后再将渗滤液通过大孔树脂柱吸附，水洗后用含氨/胺的醇溶液洗脱，高纯度的粉防己生物碱，虽然获得了纯度较高的生物碱，但是在制备提取的过程中会产生大量的废水。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，包括以下步骤：

(1)使用酸水提取粉防己根药材、过滤后得到滤液；

(2)向滤液中加入多酚类成分搅拌均匀后静置、离心，收集固体；

(3)将步骤(2)中的固体分散于20～40％的醇中，调pH至4.5～5.0，加入酶，酶解；

(4)向步骤(3)中加入聚酰胺，搅拌吸附后过滤，收集滤液，回收溶剂得到类白色生物总碱。

对于步骤(1)

为了使粉防己根药材中的生物碱能够被充分溶出，将粉防己根粉碎后再进行酸提，在一些实施方式中，将粉防己粉碎，过10～100目筛(优选用30～60目筛，比如说30目筛、40目筛、50目筛、60目筛等)。

所述酸水的pH值为3～4.5(优选为3.5～4，比如说3.5、3.8、4等)；所述酸水与药材的重量比为(7～12)：1，优选为(8～10)：1。

所述酸水为无机酸与水的混合物，将无机酸和水混合均匀即可得到本发明中的酸水，所述无机酸选自硼酸、硫酸、硝酸、重铬酸、铬酸、盐酸中的一种或多种，优选的，所述无机酸为盐酸。

优选的，步骤(1)中过滤的次数为1～5次；进一步优选的，步骤(1)中过滤的次数为2次；作为优选的，2次过滤依次经过4～6μm(比如说4μm、5μm、6μm)和0.5～1μm(比如说0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm等)的膜过滤。

其中，膜材质可以为高分子膜，包括但不限于聚丙烯膜。

作为优选的，为了使得酸水能够更好、更完全的提取粉防己根药材中的生物碱，步骤(1)中的提取温度为80～95℃、提取时间为1～3h；优选的，步骤(1)中的提取温度为85～90℃、提取时间为1.5～2h。

对于步骤(2)

多酚类成分的加入量为滤液重量的0.5～3％；优选的，多酚类成分的加入量为滤液重量的1～1.5％(比如说1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等)。

所述多酚类成分选自单宁酸(tannic acid，CAS#1401-55-4)、葡萄籽多酚、(Punicalin,CAS#65995-64-4)、石榴皮鞣素(Punicalin,CAS：65995-64-4)、茶多酚(Teapolyphenol CAS#84650-60-2)中的一种或多种；优选的，所述多酚类成分选自单宁酸、葡萄籽多酚、石榴皮鞣素中的一种或多种；进一步优选的，所述多酚类成分为石榴皮鞣素和/或葡萄籽多酚。

步骤(2)中为室温静置；本发明中的室温指的是室内温度，温度范围在15～30℃。

步骤(2)中离心时的转速为7000～9000r/min(比如说7000r/min、8000r/min、9000r/min等)。

现有技术中常常使用氢氧化钠来进行提取，这样不但提纯效果差，而且还会造成大量废碱液，在本发明中发明人意外发现使用一些多酚类成分，尤其是使用石榴皮鞣素或葡萄籽多酚的时候提取效果更好，可能是因为在石榴皮鞣素或葡萄籽多酚的作用下能够与后续的单宁酶更好的相互作用。

对于步骤(3)

20～40％的醇为20～40％乙醇，此处为体积分数。

步骤(3)20～40％的醇的重量为步骤(2)中固体重量比90～110倍(90倍、92倍、93倍、98.5倍、100倍、105.5倍、110倍等)。

步骤(3)中酶的重量为步骤(2)中固体重量0.05～0.2％；优选的，步骤(3)中酶的重量为步骤(2)中固体重量0.08～0.12％(比如说0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％等)。

所述酶选自木聚糖酶、单宁酶、葡聚糖酶中的一种或多种(优选用单宁酶)。

步骤(3)中酶解温度为35～50℃、酶解时间为2.5～3.5h；优选的，步骤(3)中酶解温度为40～45℃、酶解时间为3h。

在本发明中选择了特定的酶，对其进行酶解，同时控制特定的酶解条件和pH值，使得在酸性的条件下单宁快速降解，破坏单宁与生物碱的络合，更有利于后续聚酰胺的分离提纯。

对于步骤(4)

步骤(4)中聚酰胺的重量为步骤(2)中固体重量的4～10倍(优选用5～8倍，比如说5倍、6倍、7倍、8倍、10倍等)。

步骤(4)中搅拌吸附是在室温下搅拌吸附，搅拌的时间为1～2h(比如说1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h等)。

步骤(4)中过滤经过0.5～1μm(比如说0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm等)的膜过滤。

其中，聚酰胺为聚酰胺树脂。

本发明的第二个方面提供了一种生物总碱，所述生物总碱由上述任一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法提取得到。

本发明的第三个方面提供了一种生物总碱的应用，通过上述提取方法提取得到的生物总碱的应用包括用于舒缓类化妆品的原料。

与现有技术相比，本发明至少具有下述有益效果：

1.现有技术中常常会使用体积浓度大于50％的乙醇和大量盐酸来提取粉防己中的生物总碱，本发明中仅使用少量的乙醇和盐酸就能够获得很好的提取效果，该提取方法绿色环保，工艺简单，便于产业化。

2.以粉防己碱和防己诺林碱计，传统的提取方法中能够提取到总收率仅仅占70～75％，而本发明中的总收率能够达到83％，其中粉防己碱50％左右，防己诺林碱24％左右，可直接当做舒缓类化妆品原料。

3.本发明中并不需要柱层析等工艺，通过搅拌吸附即可实现生物总碱性的分离，大大提高了分离的效率。

4.本发明先使多酚与生物碱络合为不溶于水的复合物沉出，再利用单宁酶酶解多酚，破坏其与生物碱的络合，使生物碱复溶。然后利用聚酰胺对酚类物质进行高效吸附，从而使得生物碱最终的提取纯化效果更好。

5.本发明中将酸提、酶解、吸附等工艺相结合减少操作工序和有效的降低了工艺成本。

附图说明

图1实施例1制备的生物总碱的HPLC图谱；

图2实施例1生物总碱对炎症因子IL-8、MCP-1的抑制率。

具体实施方式

实施例1

一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，包括以下步骤：

(1)500g粉防己(经过HPLC测试得到粉防己碱和防己诺林碱的含量分别是1.49％、0.63％)粉碎，过40目筛，用4kg pH＝3.5的酸水(由盐酸和水配制得到)85℃提取2小时，依次经5μm和0.8μm聚丙烯膜过滤，得3.1kg滤液；

(2)向滤液中加入31g石榴皮鞣素，搅拌均匀后室温静置3h，8000r/min离心，收集固体20.3g；

(3)将步骤(2)中的固体分散于2.0kg30％的醇中，调pH至4.5～5.0，加入20.3mg单宁酶，40～45℃酶解3h；

(4)向步骤(3)中加入101.5g聚酰胺，室温搅拌吸附1.5h，0.8μm聚丙烯膜过滤，收集滤液，回收溶剂后得类白色生物总碱11.6g。

经过HPLC测试得到生物总碱中粉防己碱含量50.6％，防己诺林碱含量24.3％。

粉防己碱和防己诺林碱共8.69g，总收率8.69/(500*1.49％+500*0.63％)＝82.0％。

其中图1为实施例1生物总碱的HPLC图谱，其中，测试条件为：

色谱柱：Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)；

柱温：35℃；

检测波长：280nm；

流速：1.0ml/min；

等度洗脱：甲醇-乙腈-0.05％三乙胺水溶液＝55:25:20(V/V/V)；

洗脱时间：15min。

对比例1

一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，包括以下步骤：

(1)500g粉防己(同实施例1)粉碎，过40目筛，用4kg pH＝3.5的酸水(由盐酸和水配制得到)85℃提取2h，依次经5μm和0.8μm聚丙烯膜过滤，得3.1kg滤液。

(2)用氢氧化钠将滤液pH调至12.0，室温静置3小时，8000r/min离心，收集固体12.4g。

(3)将步骤(2)的固体溶于1.3kg pH＝3.5的酸水(由盐酸和水配制得到)中，用氢氧化钠将滤液pH调至12.0，室温静置3h，8000转/分离心，收集固体10.9g，即总生物碱。

经过HPLC测试得到粉防己碱含量48.7％，防己诺林碱含量21.3％，粉防己碱和防己诺林碱共7.63g，总收率为7.63/(500*1.49％+500*0.63％)＝72.0％。

舒缓性测试

一、试验目的

通过检测受试物对辣椒素(CAP)诱导的细胞因子表达量的抑制作用来评价其舒缓功效。

二、试验原理

TRPV1(transient receptor potential vanilloid receptor-1)是瞬时受体电位家族成员之一，是初级感觉神经上对物理和化学刺激产生疼痛作用的靶点。TRPV1是一种Ca²⁺通道蛋白，可以被内源性、外源性香草醛类物质，热刺激和组织酸化等激活，引起Ca²⁺内流，在外周神经系统转导疼痛信号。

角质形成细胞(HaCaT)的TRPV1在皮肤组织中作为有效的“信号转导者”发挥重要作用，通过对刺激物发生反应，角质形成细胞能将外源性和内源性刺激加工转变成与皮肤免疫病理相关的事件，这包含着舒缓相关调节因子的网络性调节。

HaCaT在CAP刺激下TRPV1被激活，引起Ca²⁺内流、炎症因子表达量升高，最终导致皮肤疼痛、瘙痒。受试物如果对CAP诱导的细胞因子表达有抑制作用，则说明其具有舒缓功效。

三、试验方法

细胞系：HaCaT-TRPV1细胞。完全培养基：DMEM高糖培养基+10％胎牛血清(FBS)+1％青链霉素双抗(PS)；

刺激物(模型组)：20μM CAP；

阳性对照组：10μM盐酸氯丙嗪(CPZ)；

空白组：完全培养基。

受试物：实施例1的生物总碱用pH＝4.0的50％乙醇配制成0.1％的母液，再用水稀释成浓度为0.02％、0.006％和0.002％的受试物。

HaCaT-TRPV1细胞于96孔板(每孔中的培养基体积为200μl)中培养24小时后，加入100μl生物总碱浓度分别为0.02％、0.006％和0.002％的受试物(阳性对照组加100μl10μM的CPZ，空白组加100μl完全培养基)，混匀，再加入100μl20μM的CAP(此时，上清液中生物总碱的浓度分别为0.01％、0.003％和0.001％)，继续培养24小时后，取上清液检测炎症因子IL-8和MCP-1的浓度。

四、试验结果

计算公式

对检测数据进行统计分析，采用配对T-Test计算统计学差异，受试物对细胞因子的抑制率计算公式如下:

抑制率％＝(表达量_模型组-表达量_受试物组)/表达量_模型组×100％

受试物、阳性对照对细胞因子的抑制率如图2所示：

由图2可知，0.001％、0.003％、0.01％的生物总碱(由实施例1制备)对IL-8和MCP-1的表达有明显的抑制作用。说明本发明提供的粉防己生物总碱具有较强的舒缓功效。

Claims (8)

1.一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)使用酸水提取粉防己根药材、过滤后得到滤液；

(2)向滤液中加入多酚类成分搅拌均匀后静置、离心，收集固体；

(3)将步骤(2)中的固体分散于20～40％的醇中，调pH至4.5～5.0，加入酶，酶解；

(4)向步骤(3)中加入聚酰胺，搅拌吸附后过滤，收集滤液，回收溶剂得到类白色生物总碱；

所述多酚类成分为葡萄籽多酚或石榴皮鞣素，所述酶为单宁酶。

2.根据权利要求1所述的一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，其特征在于，所述酸水的pH值为3～4.5；所述酸水为无机酸与水的混合物。

3.根据权利要求2所述的一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，其特征在于，所述无机酸选自硼酸、硫酸、硝酸、重铬酸、铬酸、盐酸中的一种或多种。

4.根据权利要求1～3任一项所述的一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，其特征在于，步骤(1)中的提取温度为80～95℃、提取时间为1～3h。

5.根据权利要求1所述的一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，其特征在于，多酚类成分的加入量为滤液重量的0.5～3％。

6.根据权利要求5所述的一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，其特征在于，步骤(2)中离心时的转速为7000～9000r/min。

7.根据权利要求1所述的一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，其特征在于，步骤(3)20～40％的醇的重量为步骤(2)中固体重量比90～110倍。

8.根据权利要求7所述的一种绿色环保的粉防己生物总碱的提取方法，其特征在于，步骤(3)中酶的重量为步骤(2)中固体重量0.05～0.2％。