CN114306731A - 多细胞打印神经化骨再生的活性支架及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多细胞打印神经化骨再生的活性支架及其制备方法和应用。所述多细胞打印神经化骨再生的活性支架为包含有神经细胞的多细胞骨再生活性支架：所述多细胞打印神经化骨再生的活性支架具有上/下层结构：其中上层结构为至少一层的包含生物活性无机材料、具有良好生物相容性的有机水凝胶材料和神经相关细胞的上层支架，下层结构为至少一层的包含生物活性无机材料、具有良好生物相容性的有机水凝胶材料和骨相关细胞的下层支架。

Description

多细胞打印神经化骨再生的活性支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种多细胞打印神经化骨再生的活性支架的制备方法和应用，该支架可以有效促进神经细胞-骨相关细胞的定向分化，是实现神经化骨再生的潜在治疗方法。同时提供了上述支架的制备方法，多种细胞在该支架上可以保持高存活率、铺展粘附良好以及优异的各向分化能力。属于生物技术领域。

背景技术

骨骼是一个具有复杂组分和结构的多功能器官，例如骨骼内部分布着大量的感觉神经纤维和交感神经纤维，它们通过分泌多种神经递质和神经营养因子等积极参与骨骼的生长发育、新陈代谢以及修复再生。目前由于意外车祸、疾病、骨肿瘤治疗等导致的大段骨缺损的修复与再生是临床上亟待解决的难题之一。近年来，随着3D打印技术和骨组织工程的快速发展，利用3D打印骨组织工程支架来修复大段骨缺损被认为是一种切实可行的方法手段。但是目前的3D打印骨组织工程支架忽略了神经系统在骨修复过程中的重要作用，导致骨再生的效果不佳。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了多细胞打印神经化骨再生的活性支架的制备方法和应用，通过将神经细胞整合到骨组织工程支架中，可以实现高效的神经化骨再生，提升骨缺损修复的质量。

一方面，本发明提供了一种多细胞打印神经化骨再生的活性支架，所述多细胞打印神经化骨再生的活性支架为包含有神经细胞的多细胞骨再生活性支架：所述多细胞打印神经化骨再生的活性支架具有上/下层结构：其中上层结构为至少一层的包含生物活性无机材料、具有良好生物相容性的有机水凝胶材料和神经相关细胞的上层支架，下层结构为至少一层的包含生物活性无机材料、具有良好生物相容性的有机水凝胶材料和骨相关细胞的下层支架。

本发明中，将神经细胞整合到骨组织工程支架中，利用神经细胞可以分泌神经营养因子等细胞因子，一方面通过促进骨相关细胞的成骨分化、加速基质矿化等过程有效促进骨再生。另外一方面，神经细胞分泌的神经营养因子也可以招募神经纤维长入到骨缺损处，诱导神经纤维分泌神经递质等进一步促进成骨，水凝胶材料为细胞提供粘附位点以及结构支撑，使其处于三维环境的状态。无机材料通过释放生物活性离子，促进神经细胞和骨相关细胞的特定分化，进一步增强神经化骨再生的效果。该多细胞神经化骨再生活性支架为促进大段骨缺损的高效修复提供了一个新的思路。因此，本发明开发出具有神经化特性的骨组织工程支架对于实现高效的神经化骨再生具有很大的现实意义。

较佳的，所述神经相关细胞包括雪旺细胞、神经干细胞、神经元、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12)中的至少一种，优选为雪旺细胞。

较佳的，所述骨相关细胞为成骨细胞、骨髓间充质干细胞、骨祖细胞、胚胎干细胞中的至少一种，优选为骨髓间充质干细胞。

较佳的，所述生物活性无机材料为能释放出Ca、Mg、Si、Sr、Mn、Li元素的生物活性陶瓷材料，优选选自硅酸钙纳米线、硅酸锰、硅酸镁、硅酸锶和硅酸钙锂中的至少一种；所述生物活性无机材料的粒径为0.01～150μm。作为一个示例，无机材料为生物活性陶瓷材料，优选为硅酸钙纳米线，纳米线的长度为1～100μm，直径为5～100nm。考虑到有机-无机复合水凝胶材料的可打印性、结构稳定性以及离子的生物活性，无机硅酸钙纳米线和有机甲基丙烯酰化明胶的质量比为0.1～10％，优选为1～5％。

所述有机水凝胶材料应当具有以下特性：(1)良好的生物相容性，即可以有效促进细胞的长期存活、铺展等正常生命活动；(2)优良的剪切稀化特性以及可打印性使其可以打印成所需要的结构；(3)良好的结构稳定性，在打印后培养的过程中，可以保持支架的形状结构不变。具有上述特性的有机水凝胶材料可以为海藻酸钠、壳聚糖、胶原、甲基丙烯酰化明胶中的至少一种；所述生物活性无机材料和具有良好生物相容性的有机水凝胶材料的质量比为0.1～10％。更优选，所述有机水凝胶材料为甲基丙烯酰化明胶。甲基丙烯酰化明胶具有优良的生物相容性、具有细胞粘附位点促进细胞粘附、温度敏感特性等适合打印，考虑到可打印性、细胞活力、材料结构稳定性等，优选甲基丙烯酰化明胶的质量浓度为5～10wt％。

较佳的，每层上层支架中神经相关细胞的浓度为20000～200000个/层；每层下层支架中骨相关细胞的浓度为20000～200000个/层。

较佳的，每层上层支架的厚度为0.1mm～0.5mm，每层下层支架的厚度为0.1mm～0.5mm；所述上层支架的层数和下层支架的层数的比为5:1～1:5。所述上层支架的层数为 1～10层，所述下层支架的层数为1～10层。

较佳的，所述该多细胞打印神经化骨再生的活性支架使用蓝光进行交联固化后得到。本发明中多细胞打印神经化骨再生的活性支架的形状、结构和尺寸可根据需要进行设置。例如，多细胞打印神经化骨再生的活性支架具有阵列排布的通孔结构，优选设置每个通孔结构的直径为1～2mm。

另一方面，本发明提供了一种制备多细胞神经化骨再生活性支架的方法，包括：

(1)将生物活性无机材料和具有良好生物相容性的有机水凝胶材料均匀混合得到的水凝胶浆料；

(2)将骨相关细胞和水凝胶浆料均匀混合后，得到生物墨水A；

(3)将神经细胞和水凝胶浆料均匀混合后，得到生物墨水B；

(4)利用双通道挤出式生物3D打印技术制备该复合支架，包括：首先使用生物墨水A打印下层支架结构，随后使用生物墨水B打印上层结构，在打印完成后进行交联固化，得到所述多细胞神经化骨再生活性支架。

较佳的，将两种载有细胞的水凝胶浆料分别装入两个料筒中，进行打印。随后在405 nm蓝光的作用下进行交联聚合以保持支架的结构稳定。所述水凝胶浆料中含有引发剂；所述的光交联聚合中使用的引发剂包括：蓝光引发剂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂 (LAP)或紫外光引发剂I2959中的至少一种，优选使用LAP引发剂。所述水凝胶胶料中引发剂的质量浓度为0.01～0.05wt％。

较佳的，有机-无机复合水凝胶(水凝胶浆料)的制备：将所述硅酸钙纳米线与具有良好生物相容性及打印性的甲基丙烯酰化明胶溶液均匀混合，得到该有机-无机水凝胶浆料。所述有机-无机水凝胶浆料，具有优异的生物相容性与可打印性。可以在打印的过程中有效保护细胞免受剪切力的损伤，同时在三维培养的时候为细胞提供粘附位点。作为一个优选方案，首先称取光引发剂LAP充分溶解在去离子水中，随后加入甲基丙烯酰化明胶并在45～60℃下充分溶解，接着加入硅酸钙纳米线，搅拌至充分分散，得到有机-无机水凝胶浆料。优选甲基丙烯酰化明胶的质量浓度为5～10wt％，硅酸钙和甲基丙烯酰化明胶的质量比为0.1～10％。所述水凝胶浆料中LAP引发剂的质量浓度比为0.01～0.05wt％。

较佳的，生物墨水的制备，首先是细胞浓缩液的制备，将骨髓间充质干细胞分散于细胞相容性液体制成100～300μL的细胞浓缩液A；将雪旺细胞分散于细胞相容性液体中制成100～300μL的细胞浓缩液B；所述细胞相容性液体为MEM培养基、低糖DMEM培养基和PBS中至少一种，优选为MEM培养基。随后将细胞浓缩液与上述有机-无机水凝胶浆料均匀混合即可得到载细胞的生物墨水A和B，生物墨水中的细胞密度为1000000～ 10000000个/mL。

又，较佳的，将生物墨水A和B分别装入两个生物打印机的料筒中进行双通道打印，首先打印含有骨髓间充质干细胞的生物墨水A作为支架的下层，然后打印含有雪旺细胞的生物墨水B作为支架的上层。

较佳的，使用两个气动式挤出针头1和2分别打印生物墨水A和B。首先使用针头1挤出生物墨水A打印若干层作为下层，然后使用针头2挤出生物墨水B打印若干层作为上层，上下层数比为5:1～1:5。此外，两个挤出针头的压力为20～100Kpa，挤出针头的温度控制在18～22℃，沉积台的温度控制在0～10℃。挤出针头的直径在150μm～1mm之间。

较佳的，使用蓝光进行交联固化。所述蓝光进行交联固化的功率为10～50 mW/cm²，优选为25mW/cm²；交联时间为5～60秒，优选10～30秒，更优选20秒。

较佳的，所述生物活性陶瓷材料为硅酸钙纳米线；通过将硅源溶液和钙盐溶液混合后进行水热反应，反应结束后收集白色沉淀，洗涤后得到硅酸钙纳米线；其中所述硅源为Na₂SiO₃溶液；所述钙盐为Ca(NO₃)₂、CaCl₂的至少一种。作为一个示例，将钙盐溶液与硅酸钠溶液均匀混合后，在150～250℃水热反应12～36小时，收集白色沉淀，洗涤后得到硅酸钙纳米线材料。

较佳的，所述水凝胶浆料为含有5～10wt％的甲基丙烯酰化明胶和无机硅酸钙纳米线材料，所述硅酸钙纳米线和甲基丙烯酰化明胶的质量比为0.1～10％。所述甲基丙烯酰化明胶通过甲基丙烯酸酐取代反应制备，称取明胶溶解于去离子水中，在40～60℃下充分溶解，随后加入甲基丙烯酸酐溶液，继续反应一段时间后，进行离心、透析、冷冻干燥即可。其中，甲基丙烯酸酐溶液和明胶的体积质量比为4:10～8:10，反应时间为1～3小时，离心转速为2000～4000r/min，透析时间为5～7天。

再一方面，本发明提供了一种多细胞神经化骨再生活性支架在制备体外三维微环境下探究神经细胞-骨相关细胞相互作用材料和制备神经化骨再生材料中的应用。

有益效果：

本发明中，多细胞打印神经化骨再生的活性支架包括有机水凝胶材料、生物活性无机材料、神经细胞以及骨相关细胞。该支架可以用于探索神经细胞和骨相关细胞的相互作用，是实现神经化骨再生的潜在有效治疗手段。本发明提供了通过上述多细胞神经化骨再生活性支架在大段骨缺损的神经化骨再生中的应用以及在体外构建神经细胞支配的骨组织工程支架的应用。

附图说明

图1为利用水热法合成的硅酸钙纳米线的微观形貌与晶相。其中(a)为扫描电镜照片；(b)为X射线衍射图谱。图1显示合成的硅酸钙纳米线形貌结构良好，长度在几到几十微米，直径为10～100nm；物相组成为水合硅酸钙的相。

图2为硅酸钙纳米线对骨髓间充质干细胞增殖和分化活力的影响。其中(a)为不同浓度的硅酸钙纳米线对骨髓间充质干细胞增殖活力的影响；(b)为空白对照组(Control)、25 μg/mL和100μg/mL浓度的硅酸钙纳米线对骨髓间充质干细胞的成骨分化相关基因表达的结果(浓度从左至右依次增大)。图2显示一定浓度的硅酸钙纳米线具有促进骨髓间充质干细胞增殖和定向分化的能力。

图3为硅酸钙纳米线对雪旺细胞增殖和分化活力的影响。其中(a)为不同浓度的硅酸钙纳米线对雪旺细胞增殖活力的影响；(b)为空白对照组(Control)、25μg/mL和100μg/mL浓度的硅酸钙纳米线对雪旺细胞的成神经分化相关基因表达的结果(浓度从左至右依次增大)；图3显示一定浓度的硅酸钙纳米线具有促进雪旺细胞的增殖和定向分化的能力。

图4为不同硅酸钙纳米线含量的甲基丙烯酰化明胶的水凝胶材料的流变学特性。其中(a)为水凝胶材料的粘度随剪切速率的变化曲线；(b)为水凝胶材料的粘度随着温度的变化曲线。图4可以看出，加入硅酸钙纳米线不影响甲基丙烯酰化明胶的剪切稀化和温度敏感特性。同时该复合水凝胶材料适用于打印。

图5为利用不同硅酸钙含量的甲基丙烯酰化明胶材料进行3D打印的表征。其中(a)为三组水凝胶材料的打印性的统计学数据；(b)为使用三组水凝胶材料打印支架的宏观光学照片。其中根据硅酸钙纳米线和甲基丙烯酰化明胶的质量比(0、2％、4％)，依次命名为GelMA、GelMA-2CS、GelMA-4CS。图5可以看出掺入一定量的无机硅酸钙纳米线可以显著提高水凝胶的打印性，使支架的结构更加规整稳定。

图6为对三组水凝胶材料对骨髓间充质干细胞的生物相容性进行表征。其中(a)为打印含有骨髓间充质干细胞的三组水凝胶支架在培养1和10天的活死细胞染色荧光显微镜照片；(b)为含有骨髓间充质干细胞的三组水凝胶支架在培养过程中细胞存活率的统计学分析；图6结果表明三组rBMSC-GelMA、rBMSC-GelMA-2CS、rBMSC-GelMA-4CS水凝胶支架均具有优异的生物相容性，使得骨髓间充质干细胞在培养的过程中可以一直保持较高的存活率。

图7为对三组水凝胶材料对雪旺细胞的生物相容性进行表征。其中(a)为打印含有雪旺细胞的三组水凝胶支架在培养1和10天的活死细胞染色荧光显微镜照片；(b)为含有雪旺细胞的三组水凝胶支架在培养过程中细胞存活率的统计学分析。图7结果表明三组SCs-GelMA、SCs-GelMA-2CS、SCs-GelMA-4CS水凝胶支架均具有优异的生物相容性，使得雪旺细胞在培养的过程中可以一直保持较高的存活率。

图8为实施例4中含有不同硅酸钙纳米线浓度的雪旺细胞-骨髓间充质干细胞复合支架中骨髓间充质干细胞的定向分化能力的表征(从左至右依次为rBMSC/SCs-GelMA、rBMSC/SCs-GelMA-2CS、rBMSC/SCs-GelMA-4CS)，结果表明含有一定量硅酸钙纳米线的水凝胶材料可以有效促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。

图9为实施例4中含有不同硅酸钙纳米线浓度的雪旺细胞-骨髓间充质干细胞复合支架中骨髓间充质干细胞的成骨相关蛋白BSP和OPN的表达情况；其中(a)为蛋白表达的共聚焦图片，(b)为BSP蛋白的平均荧光强度的统计学分析结果；(c)为OPN蛋白的平均荧光强度的统计学分析结果；结果表明含有一定量硅酸钙纳米线的水凝胶材料可以有效促进骨髓间充质干细胞的成骨相关蛋白的表达。

图10为实施例4中含有不同硅酸钙纳米线浓度的雪旺细胞-骨髓间充质干细胞复合支架中雪旺细胞的定向分化能力的表征(从左至右依次为rBMSC/SCs-GelMA、rBMSC/SCs-GelMA-2CS、rBMSC/SCs-GelMA-4CS)，结果表明含有一定量硅酸钙纳米线的水凝胶材料可以有效促进雪旺细胞神经营养因子的表达。

图11为实施例4中含有不同硅酸钙纳米线浓度的雪旺细胞-骨髓间充质干细胞复合支架中雪旺细胞的定向分化能力的表征，其中(a)为不同浓度的硅酸钙纳米线水凝胶支架中雪旺细胞的神经营养因子相关蛋白S100和GDNF的表达情况；(b)为GDNF蛋白的平均荧光强度的统计学分析结果；(c)为S100蛋白的平均荧光强度的统计学分析结果。结果表明含有硅酸钙纳米线的水凝胶材料可以有效促进雪旺细胞的神经营养因子相关蛋白的表达。

图12为实施例5制备的水凝胶支架的体内修复情况的表征。其中(a)为四个组别的颅骨缺损处的Micro-CT扫描分析结果，其中红色代表新生骨；(b)为骨缺损处的新生骨体积的统计学结果；(c)为骨缺损处新生骨的骨小梁数目的统计学结果。图12的结果表明含有硅酸钙纳米线、雪旺细胞以及骨髓间充质干细胞的水凝胶支架具有最优异的促进骨再生的能力。

图13为实施例5制备的水凝胶支架对骨缺损处神经再生的表征。其中(a)为对骨缺损处的神经纤维进行免疫荧光染色的荧光照片，其中绿色代表神经纤维，红色代表细胞核；(b) 为4周时骨缺损处神经纤维密度的统计学分析结果；(c)为8周时骨缺损处神经纤维密度的统计学分析结果。图13结果表明含有硅酸钙纳米线、雪旺细胞以及骨髓间充质干细胞的水凝胶支架可以招募更多的神经纤维长入缺损处，可以更好地实现神经化。

具体实施方式

以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本公开中，多细胞神经化骨再生活性支架包括：上层的含有神经细胞的生物墨水，下层为含有骨相关细胞的生物墨水。通过简单的使用这种上下层分布设计，探究神经细胞对相关细胞以及骨再生的调控作用。其中生物墨水为含有硅酸钙纳米线的无机材料与甲基丙烯酰化明胶有机材料。甲基丙烯酰化明胶为细胞提供粘附位点、为细胞的三维培养提供结构支撑。此外支架中的无机材料硅酸钙一方面可以模拟骨组织中的无机矿物质，另外可以释放生物活性Ca、Si离子促进雪旺细胞分泌神经营养因子以及促进骨相关细胞的成骨分化。从而有效促进骨再生与神经长入，实现神经化骨再生。

上述支架中，支架上层的神经细胞可以为包括雪旺细胞、神经干细胞、神经元、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12细胞)中至少一种，优选为雪旺细胞。支架下层的骨相关细胞可以为包括成骨细胞、骨髓间充质干细胞、骨祖细胞、胚胎干细胞中至少一种，优选为骨髓间充质干细胞。其中可以根据需要设计上下层数比为5:1～1:5，更优选为1:1。

上述支架中，所使用的生物墨水为有机-无机复合水凝胶材料，其中有机水凝胶材料为壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠、甲基丙烯酰化明胶中的至少一种；无机材料为可以释放出生物活性Ca、Si离子的硅酸钙纳米线。

考虑到细胞相容性、打印性、细胞粘附性等要求，所述的水凝胶材料为甲基丙烯酰化明胶。甲基丙烯酰化明胶的质量浓度为5～10wt％，如果甲基丙烯酰化明胶的浓度过低，将不适用于打印以及结构稳定。如果浓度过高，将不利于水凝胶材料内部的细胞存活、铺展等细胞特性。优选地，所述甲基丙烯酰化明胶浓度为6％。

所述无机材料硅酸钙纳米线与甲基丙烯酰化明胶的质量比为0.1～10％，一方面硅酸钙纳米线可以影响甲基丙烯酰化明胶水凝胶的打印性，浓度过高不利于打印结构的保持；另一方面，如果硅酸钙的含量过高，将会释放过量的Ca和Si离子将会对细胞产生毒副作用；优选地，所述无机材料硅酸钙纳米线与甲基丙烯酰化明胶的质量比为1～5％。

在本发明的一实施方式中，使用水热法制备硅酸钙纳米线，将钙源溶液与硅源溶液混合后，进行水热反应，充分洗涤后即可得到该硅酸钙纳米线。

以下示例性说明本发明所述硅酸钙纳米线的制备方法。

通过水热法制备，具体制备方法如下：将适量硝酸钙溶于去离子水中得到0.2～0.6 mol/L的钙盐溶液；将硅酸钠溶于去离子水中得到0.2～0.6mol/L的硅盐溶液。随后将钙盐溶液与硅盐溶液按照体积比1:1混合后搅拌均匀，将该混合溶液装入50mL水热釜中，进行水热反应。水热温度150～250℃，水热时间为12～36h。反应完成后洗涤即可。

上述支架中，生物墨水中两种细胞的细胞密度为1000000～10000000个/mL，有利于细胞保持正常的细胞活力。当细胞密度过高时，不利于细胞在水凝胶中的存活、铺展的行为；如果细胞密度过低，细胞难以保持其正常的生存活力。优选地，生物墨水中细胞密度为3000000个/mL。

以下出示本发明一实施方式中多细胞神经化骨再生活性支架的具体制备方法。

使用双通道生物打印技术进行制备，包括以下步骤：首先取适量LAP光引发剂溶解于去离子水中，随后加入甲基丙烯酰化明胶，在50～60℃水浴下完全溶解。将硅酸钙纳米线加到甲基丙烯酰化明胶的水溶液中至充分分散，即可得到水凝胶浆料。

一些实施方式中，使用甲基丙烯酰化明胶进行3D打印的浓度为5～20wt％，优选为6wt％，因为在6％浓度下，既可以保持较好的打印结构稳定性，也有利于细胞在水凝胶中的存活以及铺展。

生物墨水的制备：首先制备骨髓间充质干细胞的浓缩液，然后与上述水凝胶浆料均匀混合即可得到生物墨水A，细胞密度为3000000个/mL。类似的，制备雪旺细胞的浓缩液，然后与上述水凝胶浆料均匀混合即可得到生物墨水B，细胞密度为3000000个/mL。

打印过程：使用两个气动式挤出针头1和2分别打印生物墨水A和B。首先使用针头1挤出生物墨水A打印若干层作为下层，然后使用针头2挤出生物墨水B打印若干层作为上层，上下层数比为5:1～1:5，更优选为1:1。此外，两个挤出针头的压力为20～100 Kpa，挤出针头的温度控制在18～22℃，沉积台的温度控制在0～10℃。打印完成后进行光交联20秒即可。

在本公开中，制备支架中雪旺细胞和骨髓间充质干细胞在培养的过程中均保持高的存活率，细胞在水凝胶支架上铺展良好，可以形成细胞网络，并且在无机材料硅酸钙纳米线的作用下，可以有效促进雪旺细胞分泌神经营养因子以及骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，具有高效实现神经化骨再生的潜力。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。若无特殊说明，下述实施例中所用挤出针头的直径为170μm。

实施例1

硅酸钙纳米线对骨髓间充质干细胞和雪旺细胞的增殖、迁移和分化活力的影响：

首先利用水热法制备硅酸钙纳米线，将9.446g的Ca(NO₃)₂·4H₂O和11.368g的Na₂SiO₃·9H₂O分别溶于100mL的去离子水中，磁力搅拌至完全溶解。将Na₂SiO₃·9H₂O 溶液倒入Ca(NO₃)₂·4H₂O溶液中，磁力搅拌1h形成均匀分散的白色悬浊液；然后装入水热釜中进行200℃水热24h的水热反应，冷却后经过抽滤、充分洗涤后，即可得到良好形貌的硅酸钙纳米线。

图1为按照上述方法制备的硅酸钙纳米线的扫描电镜、X射线衍射结果，表明成功制备了硅酸钙纳米线材料。

将不同质量的硅酸钙纳米线均匀分散在MEM-α培养基中，得到不同硅酸钙纳米线浓度梯度的培养基(1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、 12.5μg/mL、6.25μg/mL)，其中MEM-α培养基用于培养骨髓间充质干细胞。向上述不同梯度浓度的硅酸钙纳米线培养基中按照比例添加胎牛血清、青霉素和链霉素得到含有硅酸钙纳米线的完全培养基。将骨髓间充质干细胞按照300个/孔的细胞密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后将培养基更换为含有硅酸钙纳米线的完全培养基继续培养，在预先设定的1、3和 5天通过CCK-8(Cell Counting Kit)试剂盒的方法，在450nm下测量所有样品的吸光度来评估细胞的增殖情况。

从图2a可以看出，高浓度(＞500μg/mL)的硅酸钙纳米线具有明显的细胞毒性，而一定浓度范围的硅酸钙纳米线可以有效促进骨髓间充质干细胞的增殖，证明硅酸钙纳米线具有剂量依赖性的促骨髓间充质干细胞增殖能力。

在细胞增殖结果的基础上，选用25μg/mL和100μg/mL浓度的组别进行后续的细胞分化的实验。向25μg/mL和100μg/mL浓度的硅酸钙纳米线培养基中按照比例添加胎牛血清、青霉素和链霉素得到含有硅酸钙纳米线的完全培养基。将骨髓间充质干细胞按照 100000个/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后将培养基更换为含有硅酸钙纳米线培养基继续培养，培养基进行隔天换液，培养5天后使用Trizol试剂提取细胞的RNA，并用 ReverTraAce-α逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green荧光实时定量PCR 的方法探究其基因表达情况。

从图2b可以看出，一定浓度的硅酸钙纳米线可以有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因BMP2、OCN、OPN和RUNX2的表达。

将不同质量的硅酸钙纳米线均匀分散在低糖DMEM培养基中，得到不同硅酸钙纳米线浓度梯度的培养基(1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25 μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL)，其中低糖DMEM培养基用于培养雪旺细胞。向上述不同梯度浓度的硅酸钙纳米线培养基中按照比例添加胎牛血清、青霉素和链霉素得到含有硅酸钙纳米线的完全培养基。将雪旺细胞按照300个/孔的细胞密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后将培养基更换为含有硅酸钙纳米线的完全培养基继续培养，在预先设定的1、3和5天通过CCK-8(CellCounting Kit)试剂盒的方法，在450nm下测量所有样品的吸光度来评估细胞的增殖情况。

从图3a可以看出，高浓度(＞500μg/mL)的硅酸钙纳米线具有明显的细胞毒性，而一定浓度范围的硅酸钙纳米线可以有效促进雪旺细胞的增殖，证明硅酸钙纳米线具有剂量依赖性的促雪旺细胞增殖能力。

在细胞增殖结果的基础上，选用25μg/mL和100μg/mL浓度的组别进行后续的细胞分化的实验。向25μg/mL和100μg/mL浓度的硅酸钙纳米线培养基中按照比例添加胎牛血清、青霉素和链霉素得到含有硅酸钙纳米线的完全培养基。将雪旺细胞按照100000个/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后将培养基更换为含有硅酸钙纳米线培养基继续培养，培养基进行隔天换液，培养5天后使用Trizol试剂提取细胞的RNA，并用ReverTraAce-α逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green荧光实时定量PCR的方法探究其基因表达情况。

从图3b可以看出，一定浓度的硅酸钙纳米线可以有效促进雪旺细胞神经营养因子相关基因GDNF、NGF、BDNF和PMP22的表达。以上结果可以看出无机材料硅酸钙纳米线具有促进两种细胞定向分化的作用，在骨修复再生以及神经组织工程中具有巨大的应用潜力。

实施例2

梯度浓度硅酸钙纳米线的复合水凝胶支架的制备与表征：首先制备出含有不同硅酸钙纳米线含量的水凝胶浆料。首先称取0.025g的LAP光引发剂溶于10mL的去离子水中，接着加入 0.6g的甲基丙烯酰化明胶，在60℃下充分溶解，得到6wt％的甲基丙烯酰化明胶溶液。吸取3mL的甲基丙烯酰化明胶溶液与0.0036g的硅酸钙纳米线均匀混合后，即可得到含有2％硅酸钙纳米线的水凝胶浆料；同样地，吸取3mL的甲基丙烯酰化明胶溶液与0.0072g的硅酸钙纳米线均匀混合后，即可得到含有4％硅酸钙纳米线的水凝胶浆料。

首先评估了掺入不同含量的硅酸钙纳米线对于甲基丙烯酰化明胶水凝胶的流变学特性的影响。

从图4可以看出，加入硅酸钙纳米线不影响甲基丙烯酰化明胶本身的温度敏感特性，并且水凝胶具有良好的剪切稀化特性，表明其适用于进行3D打印。

接着进行水凝胶支架的打印过程，首先将3mL的水凝胶浆料，装入10mL的不锈钢料筒中，并放在4℃冰箱中预冷15min，然后装入打印机的预冷模块进行打印，设置打印机的料筒温度为21℃；沉积台的温度为4℃；挤出压力为20～40Kpa；挤出速度为7mm/s；打印层数为6层。打印完成后在蓝光下交联20s即可得到该有机-无机复合水凝胶支架。根据水凝胶浆料中无机材料硅酸钙纳米线的含量不同，制备所得的支架依次命名为GelMA、 GelMA-2CS、GelMA-4CS。

为了表征硅酸钙纳米线对于水凝胶支架打印性的影响情况，对支架的打印性进行评估。使用以下公式计算打印性Printability(Pr)：Pr＝L²/(16A)；其中L为每个方格的周长， A是每个方格的面积。

图5为打印后支架的照片，可以看出加入一定量的无机材料硅酸钙纳米线可以明显改善水凝胶的可打印性，使得打印的支架结构更加规整、稳定。

实施例3

梯度浓度硅酸钙纳米线的复合水凝胶支架的生物相容性表征：为了表征复合水凝胶材料的生物相容性，首先制备了负载细胞的水凝胶浆料进行生物打印，首先准备骨髓间充质干细胞的浓缩液，然后与3mL的水凝胶浆料均匀混合即可得到生物墨水A，生物墨水A中细胞密度为3000000个/mL。类似的，制备雪旺细胞的浓缩液，然后与3mL的水凝胶浆料均匀混合即可得到生物墨水B，生物墨水B中细胞密度为3000000个/mL。

接着进行水凝胶支架的打印过程，首先制备含有骨髓间充质干细胞的支架，将3mL的生物墨水A装入10mL的不锈钢料筒中，并放在4℃冰箱中预冷15min，然后装入打印机的预冷模块进行打印，设置打印机的料筒温度为21℃；沉积台的温度为4℃；挤出压力为 30Kpa；挤出速度为7mm/s；打印层数为6层。打印完成后在蓝光下交联20s即可得到该有机-无机复合水凝胶支架。根据水凝胶浆料中无机材料硅酸钙纳米线的含量不同，制备所得的支架依次命名为rBMSC-GelMA、rBMSC-GelMA-2CS、rBMSC-GelMA-4CS。

其次制备含有雪旺细胞的支架，将3mL的生物墨水B装入10mL的不锈钢料筒中，并放在4℃冰箱中预冷15min，然后装入打印机的预冷模块进行打印，设置打印机的料筒温度为21℃；沉积台的温度为4℃；挤出压力为30Kpa；挤出速度为7mm/s；打印层数为6 层。打印完成后在蓝光下交联20s即可得到该有机-无机复合水凝胶支架。根据水凝胶浆料中无机材料硅酸钙纳米线的含量不同，制备所得的支架依次命名为SCs-GelMA、SCs- GelMA-2CS、SCs-GelMA-4CS。

为了表征两种细胞在水凝胶支架中的存活情况，使用Live/dead细胞染色方法对细胞进行染色。染料工作液的配比如下：PBS：Calcein-AM：PI＝1000:2:3。在培养第1天和第10天后，对支架内的细胞进行染色。工作液在37℃的培养箱中孵育支架15min。经过PBS 洗涤后在荧光显微镜下观察细胞存活情况。其中绿色代表活细胞，红色代表死细胞。最后通过Image J计算细胞存活率。

从图6和图7可以看出骨髓间充质干细胞和雪旺细胞在GelMA、GelMA-2CS、 GelMA-4CS三种水凝胶浆料中均存活良好，长时间的培养也不会降低其细胞活性，表面该有机-无机复合水凝胶浆料优异的生物相容性。

实施例4

制备多细胞神经化骨再生活性支架及其表征：使用双通道生物3D打印技术进行多细胞神经化骨再生活性支架的制备，首先制备负载细胞的水凝胶浆料，准备骨髓间充质干细胞的浓缩液，然后与3mL的水凝胶浆料均匀混合即可得到生物墨水A，生物墨水A中细胞密度为 3000000个/mL。类似的，制备雪旺细胞的浓缩液，然后与3mL的水凝胶浆料均匀混合即可得到生物墨水B，生物墨水B中细胞密度为3000000个/mL。将生物墨水A和B分别装入两个料筒中，并放在4℃冰箱中预冷15min，然后分别装入打印机的两个预冷模块进行打印，设置打印机的料筒温度为21℃；沉积台的温度为4℃；挤出压力为30Kpa；挤出速度为7mm/s；首先打印3层含有骨髓间充质干细胞的生物墨水A作为下层，然后打印3层含有雪旺细胞的生物墨水B作为上层，总打印层数为6层。打印完成后在蓝光下交联20s即可得到该双细胞复合水凝胶支架。根据水凝胶浆料中无机材料硅酸钙纳米线的含量不同，制备所得的支架依次命名为rBMSC/SCs-GelMA、rBMSC/SCs-GelMA-2CS、rBMSC/SCs- GelMA-4CS。

在体外培养10天后，使用RT-qPCR实验表征支架内细胞定向分化的情况。首先使用甲基丙烯酰化明胶裂解液对支架进行裂解，得到细胞悬浮液，接着使用Trizol试剂提取细胞的RNA，并用ReverTraAce-α逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green荧光实时定量PCR的方法探究其基因表达情况。

从图8和图10可以看出，含有2％硅酸钙纳米线的水凝胶材料可以有效促进骨髓间充质干细胞的成骨相关基因ALP、OCN、BMP2、OPN、RUNX2的表达，其中4％硅酸钙纳米线对于BMP2的基因表达也有一个十分明显的促进作用。不仅如此，含有2％硅酸钙纳米线的水凝胶材料可以下调雪旺细胞NCAM的基因表达，同时上调BDNF、GDNF、NGF 等神经营养因子的表达。其中4％硅酸钙纳米线也可以明显促进BDNF的基因表达，表明含有硅酸钙纳米线的水凝胶浆料可以有效促进雪旺细胞成熟以及神经营养因子的分泌。

为了进一步表征两种细胞定向分化的效果，对支架中骨髓间充质干细胞和雪旺细胞的特异性蛋白进行免疫荧光染色实验。其中，对于骨髓间充质干细胞进行BSP和OPN蛋白染色；对于雪旺细胞进行GDNF和S100的蛋白染色。使用扫描共聚焦显微镜拍摄荧光照片以及使用Image J对其荧光强度进行半定量统计。

从图9和图11可以看出，与纯GelMA水凝胶组相比，含有2％硅酸钙纳米线的水凝胶材料可以明显地促进骨髓间充质干细胞成骨相关蛋白BSP和OPN的高表达以及促进雪旺细胞促神经化相关蛋白S100和GDNF的高表达。总的来说，硅酸钙纳米线复合甲基丙烯酰化明胶水凝胶材料，不仅具有优异的生物相容性可以保持细胞的长期存活。无机材料硅酸钙纳米线还可以有效促进骨髓间充质干细胞的成骨分化以及雪旺细胞成熟以及神经营养因子的高表达，在骨组织再生以及神经组织再生方面具有广泛的应用前景。

实施例5

多细胞神经化骨再生活性支架在体内神经化骨再生中的应用：使用250～300g的SD大鼠建立颅骨临界缺损动物模型，沿着大鼠颅骨矢状缝两侧各造一个5mm的临界缺损。动物样品被分为4组：(1)空白对照组Blank；(2)无细胞的支架组GelMA-CS；(3)含有骨髓间充质干细胞和雪旺细胞但是没有硅酸钙纳米线的支架GelMA-Cells；(4)含有骨髓间充质干细胞和雪旺细胞以及硅酸钙纳米线的支架GelMA-CS-Cells。

首先是GelMA-CS支架的制备：吸取3mL含有0.025％LAP引发剂的甲基丙烯酰化明胶溶液与0.0036g的硅酸钙纳米线均匀混合后，即可得到含有2％硅酸钙纳米线的水凝胶浆料；首先将3mL的水凝胶浆料，装入10mL的不锈钢料筒中，并放在4℃冰箱中预冷15 min，然后装入打印机的预冷模块进行打印，设置打印机的料筒温度为21℃；沉积台的温度为4℃；挤出压力为30Kpa；挤出速度为7mm/s；层数为6层；打印高度为1mm；直径为 5mm。打印完成后在蓝光下交联20s即可得到GelMA-CS支架。

其次是GelMA-Cells支架的制备：首先制备了负载细胞的水凝胶浆料，准备骨髓间充质干细胞的浓缩液，然后与3mL的纯水凝胶浆料均匀混合即可得到生物墨水A，细胞密度为3000000个/mL。类似的，制备雪旺细胞的浓缩液，然后与3mL的纯水凝胶浆料均匀混合即可得到生物墨水B，细胞密度为3000000个/mL。将生物墨水A和B分别装入两个料筒中，并放在4℃冰箱中预冷15min，然后分别装入打印机的两个预冷模块进行打印，设置打印机的料筒温度为21℃；沉积台的温度为4℃；挤出压力为30Kpa；挤出速度为7 mm/s；首先打印3层含有骨髓间充质干细胞的生物墨水A作为下层，然后打印3层含有雪旺细胞的生物墨水B作为上层；总打印层数为6层；打印高度为1mm；直径为5mm。打印完成后在蓝光下交联20s即可得到该双细胞复合水凝胶支架GelMA-Cells。

最后是GelMA-CS-Cells支架的制备，首先制备了负载细胞的水凝胶浆料，准备骨髓间充质干细胞的浓缩液，然后与3mL的含有硅酸钙纳米线的水凝胶浆料(硅酸钙纳米线浓度为2％)均匀混合即可得到生物墨水A，生物墨水A中细胞密度为3000000个/mL。类似的，制备雪旺细胞的浓缩液，然后与3mL的含有硅酸钙纳米线的水凝胶浆料(硅酸钙纳米线浓度为2％)均匀混合即可得到生物墨水B，生物墨水B中细胞密度为3000000个/mL。将生物墨水A和B分别装入两个料筒中，并放在4℃冰箱中预冷15min，然后分别装入打印机的两个预冷模块进行打印，设置打印机的料筒温度为21℃；沉积台的温度为4℃；挤出压力为30Kpa；挤出速度为7mm/s；首先打印3层含有骨髓间充质干细胞的生物墨水A作为下层，然后打印3层含有雪旺细胞的生物墨水B作为上层；总打印层数为6层；打印高度为1mm；直径为5mm。打印完成后在蓝光下交联20s即可得到该双细胞复合水凝胶支架GelMA-CS-Cells。

将各组支架体外培养7天后植入缺损处，在术后4周和8周进行样品的取材。使用Micro-CT分析其骨再生效果；使用免疫荧光蛋白染色对缺损处的神经长入情况进行分析。

从图12可以看出，GelMA-CS-Cells组的缺损处出现了更多的新生骨，统计学分析结果也表明，GelMA-CS-Cells具有更高的新生骨体积以及新生骨骨小梁的值，而空白组只在缺损边缘出现了少量的新生骨，证明其难以自愈合的能力。而GelMA-CS和GelMA-Cells均有一定程度的新生骨出现，说明其有一定的促进骨再生的能力，但是效果不及GelMA-CS-Cells组。

从图13免疫荧光蛋白染色的结果来看，GelMA-CS-Cells具有更高的神经纤维密度，表明支架可以诱导更多的神经纤维长入到骨缺损处，实现了神经化骨再生的治疗效果。

总而言之，这些结果表明加入的硅酸钙纳米线和外源细胞可以协同促进骨再生以及神经纤维长入，最终实现神经化骨再生的效果。展现了该神经细胞整合的组织工程支架在促进神经化组织再生方面的应用前景。

Claims (9)

1.一种多细胞打印神经化骨再生的活性支架，其特征在于，所述多细胞打印神经化骨再生的活性支架为包含有神经细胞的多细胞骨再生活性支架：所述多细胞打印神经化骨再生的活性支架具有上/下层结构：其中上层结构为至少一层的包含生物活性无机材料、具有良好生物相容性的有机水凝胶材料和神经相关细胞的上层支架，下层结构为至少一层的包含生物活性无机材料、具有良好生物相容性的有机水凝胶材料和骨相关细胞的下层支架。

2.根据权利要求1所述的多细胞神经化骨再生活性支架，其特征在于，所述神经相关细胞包括雪旺细胞、神经干细胞、神经元、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12)中的至少一种；所述骨相关细胞为成骨细胞、骨髓间充质干细胞、骨祖细胞、胚胎干细胞中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的多细胞神经化骨再生活性支架，其特征在于，所述生物活性无机材料为能释放出Ca、Mg、Si、Sr、Mn、Li元素的生物活性陶瓷材料，优选选自硅酸钙纳米线、硅酸锰、硅酸镁、硅酸锶和硅酸钙锂中的至少一种；所述生物活性无机材料的粒径为0.01～150 μm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的多细胞神经化骨再生活性支架，其特征在于，所述具有良好生物相容性的有机水凝胶材料为海藻酸钠、壳聚糖、胶原、甲基丙烯酰化明胶中的至少一种；所述生物活性无机材料和具有良好生物相容性的有机水凝胶材料的质量比为0.1～10%。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的多细胞神经化骨再生活性支架，其特征在于，每层上层支架的厚度为0.1 mm～0.5 mm，每层下层支架的厚度为0.1 mm～0.5 mm；所述上层支架的层数和下层支架的层数的比为5:1～1:5。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的多细胞神经化骨再生活性支架，其特征在于，所述多细胞打印神经化骨再生的活性支架使用光交联固化后得到。

7.一种制备权利要求1-6所述的多细胞神经化骨再生活性支架的方法，其特征在于，包括：

（1）将生物活性无机材料和具有良好生物相容性的有机水凝胶材料均匀混合得到的水凝胶浆料；

（2）将骨相关细胞和水凝胶浆料均匀混合后，得到生物墨水A；

（3）将神经细胞和水凝胶浆料均匀混合后，得到生物墨水B；

（4）利用双通道挤出式生物3D打印技术制备该复合支架，包括：首先使用生物墨水A 打印下层支架结构，随后使用生物墨水B打印上层结构，在打印完成后进行光交联固化，得到所述多细胞神经化骨再生活性支架。

8.据权利要求7所述的多细胞神经化骨再生活性支架的制备方法，其特征在于，所述水凝胶浆料中含有引发剂，所述引发剂为蓝光引发剂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)或紫外光引发剂I2959中的一种；所述水凝胶胶料中引发剂的质量浓度为0.01～0.05wt%；

优选地，使用LAP引发剂进行交联固化；所述蓝光进行交联固化的功率为10～50 mW/cm²，交联时间为5～60秒。

9.一种如权利要求1-6中任一项所述的多细胞神经化骨再生活性支架在制备体外三维微环境下探究神经细胞-骨相关细胞相互作用材料和制备神经化骨再生材料中的应用。

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