CN115944776A - 生物打印仿肌腱-骨多细胞支架及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物打印仿肌腱‑骨多细胞支架及其制备方法和应用。所述仿肌腱‑骨多细胞支架包括：位于下部的骨层与位于上部的肌腱层；所述骨层的每一个单层均包含生物活性无机材料、有机水凝胶和成骨相关细胞，所述肌腱层的每一个单层均包含生物活性无机材料、有机水凝胶和成肌腱相关细胞；所述生物活性无机材料选择磷酸盐陶瓷、生物玻璃或者硅酸盐生物陶瓷；所述硅酸盐生物陶瓷为硅酸钙、硅酸锌或者含钼硅酸盐生物陶瓷中的至少一种。

Description

生物打印仿肌腱-骨多细胞支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物材料制备技术领域，具体涉及一种生物打印仿肌腱-骨多细胞支架及其制备方法和应用。

背景技术

肌腱-骨界面是肌腱和骨之间的特殊过渡区，在连接肌腱和骨以实现运动方面起着重要作用。肌腱-骨界面的复杂层次结构包括矿物成分、细胞外基质和细胞表型的梯度分布，有助于分散机械应力、增强软硬组织之间的结合强度。由于其复杂的层次结构、较差的再生能力和较长的愈合期，手术后肌腱-骨界面的完全重建仍然是一个巨大的挑战。当前用于治疗肌腱-骨损伤的生物材料往往无法同时刺激骨和肌腱的再生，从而导致重建肌腱-骨界面的愈合效率有限。

目前，仿生策略在复杂组织的再生方面引起了广泛关注。通过模拟复杂组织的结构和成分，可以制备能够满足不同组织生理特征的构建物，从而促进复杂组织的综合修复。受益于仿生策略的优势，诸如骨软骨组织和哈弗氏骨等仿生支架已被用于修复复杂组织。因此，构建具有仿生结构和再生功能的支架是一种可行的肌腱到骨的复杂组织修复方法。

生物打印是构建仿生细胞组织最突出的方法之一，该种方式能够精确分布细胞、材料和生长因子。使用生物打印技术有望通过设计多个细胞的精确分布来重现腱-骨界面的多细胞组成和分层结构。但是，如何同时调节仿生多细胞支架中的多细胞行为，使其具有复杂组织的再生功能，仍然是一个挑战。

考虑到肌腱-骨界面的复杂性和漫长的康复期，引入长效、稳定和双重生物活性的生物因子是实现仿生多细胞支架功能的关键。硅酸盐生物陶瓷可以修复和重建受损组织的陶瓷材料，硅酸盐生物陶瓷可以释放多种离子，创造生物活性离子环境，诱导细胞活动或调节免疫微环境，促进组织的再生。此外，Mo是大多数生物体必需的微量元素，是人体内各种酶的重要组成部分，同时Mo也具有诱导干细胞分泌胶原纤维和保护线粒体的功能，这些功能可以诱导肌腱再生。因此，将Mo与硅酸盐生物陶瓷结合起来制备的Mo-硅酸盐生物陶瓷材料可以作为刺激肌腱到骨的复杂组织修复的潜在生物因子，有望赋予生物仿生多细胞支架以再生功能。

发明内容

针对上述问题，本发明目的在于提供一种生物打印仿肌腱-骨多细胞支架及其制备方法和应用。

第一方面，本发明提供了一种仿肌腱-骨多细胞支架，包括：位于下部的骨层与位于上部的肌腱层；所述骨层的每一个单层均包含生物活性无机材料、有机水凝胶和成骨相关细胞，所述肌腱层的每一个单层均包含生物活性无机材料、有机水凝胶和成肌腱相关细胞；所述生物活性无机材料选择磷酸盐陶瓷、生物玻璃或者硅酸盐生物陶瓷；所述硅酸盐生物陶瓷为硅酸钙、硅酸锌或者含钼硅酸盐生物陶瓷中的至少一种。

较佳地，所述上部肌腱层与下部骨层的层数均为2～10，上部肌腱层与下部骨层的层数比为5：1～1：5；所述肌腱层单层与骨层单层的厚度均为0.1mm～0.5mm。

较佳地，所述有机水凝胶材料为海藻酸钠、壳聚糖、胶原纤维或者明胶中的至少一种，优选为甲基丙烯酰胺化明胶。

较佳地，所述成骨相关细胞包括：成骨细胞、骨髓间充质干细胞、骨祖细胞或者胚胎干细胞中的至少一种，优选为骨髓间充质干细胞；所述成肌腱相关细胞包括：肌腱成纤维细胞、成纤维细胞、腱细胞、肌腱干细胞或者脂肪干细胞中的至少一种，优选为肌腱干细胞。

第二方面，本发明提供了一种上述仿肌腱-骨多细胞支架的制备方法，包括：

将水凝胶、引发剂加入溶剂中得到水凝胶浆料，然后加入生物活性无机材料得到复合水凝胶墨水；向所述复合水凝胶墨水中分别独立加入成肌腱相关细胞悬液、成骨相关细胞悬液，得到含成肌腱相关细胞生物墨水与含成骨相关细胞生物墨水；

将所述含成肌腱相关细胞生物墨水与含成骨相关细胞生物墨水分别装载在不同料筒中，采用双通道挤出式生物3D打印机利用含成骨相关细胞生物墨水打印支架下部骨层，然后利用含成肌腱相关细胞生物墨水打印支架上部肌腱层，得到支架素坯；将所述支架素坯经交联固化，得到所述仿肌腱-骨多细胞支架。

较佳地，所述引发剂选自苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂蓝光引发剂(LAP)或者2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮紫外光引发剂I2959中的一种。

较佳地，所述含成肌腱相关细胞生物墨水与含成骨相关细胞生物墨水中：水凝胶的质量浓度均为5～10wt％；引发剂的质量浓度均为0.01～0.05wt％；生物活性无机材料的质量浓度均为0.1～10wt％；成肌腱相关细胞、成骨相关细胞的密度分别为(2～6)×10⁶个/mL。

较佳地，所述双通道挤出式生物3D打印的工艺参数为：挤出压力20～70KPa，料筒温度15～22℃，沉积台温度0℃～10℃。

较佳地，所述交联固化的蓝光功率为10～50mW/cm²，交联时间为5～60s。

第三方面，本发明提供了一种所述仿肌腱-骨多细胞支架在肌腱-骨损伤修复材料中的应用。

有益效果

本发明提供的仿生功能化多细胞支架中，水凝胶材料可以保护细胞在打印过程中免受剪切力的损伤，为细胞提供粘附位点以及结构支持，使其处于合适的三维培养环境状态；无机材料含钼硅酸盐生物陶瓷通过释放生物活性硅离子、钼离子等来促进成骨和成肌腱，增强肌腱-骨界面的再生，该种多细胞支架可以用于肌腱-骨复杂组织的修复，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中含钼硅酸钙生物陶瓷MS的XRD图；

图2为实施例1中MS颗粒的SEM图；

图3为实施例1中MS的EDS元素图谱；

图4为实施例1中生物墨水横截面的SEM和EDS表征图；

图5(A)为实施例1中制备得到的仿生多细胞支架GelMA-Cells、GelMA-Cells-CS、GelMA-Cells-MS的光学照片，图5(B)为第1天、第4天、第7天和第14天GelMA-Cells-MS内包裹的BMSCs和TSPCs的空间分布图，图5(C)为DAPI/F-actin染色后第7天和第14天仿生多细胞支架中BMSCs和TSPCs的共聚焦激光扫描显微镜图像；

图6(A)为仿生多细胞支架内TSPCs的成腱分化相关基因DCN、TNC、BGN、COLI的表达情况图(n＝5)，图6(B)为仿生多细胞支架内TSPCs的肌腱特异性标志物COLI和TNMD免疫荧光染色图像，图6(C)为仿生多细胞支架内BMSCs的成骨分化相关基因OCN、OPN、Runx2、BMP2的表达情况图(n＝5)，图6(D)为仿生多细胞支架内BMSCs的成骨标志物BSP和OPN的免疫荧光染色图像；

图7(A)为不同浓度Mo离子对TSPCs在5天培养期间的增殖活性影响示意图，图7(D)为不同浓度Mo离子对BMSCs在5天培养期间的增殖活性影响示意图，图7(B)为不同浓度Mo离子对TSPCs中成腱分化相关基因表达的影响示意图，图7(E)为不同浓度Mo离子下对BMSCs中成骨分化相关基因表达的影响示意图，图7(C)为不同浓度Mo离子培养的TSPCs的代表性结晶紫细胞迁移染色图，图7(F)为不同浓度Mo离子培养的BMSCs的代表性结晶紫细胞迁移染色图；

图8(A)为3D-Micro重建RCT的肱骨缺陷部位骨缺损结果示意图，图8(B)为肌腱-骨界面再生染色示意图。

具体实施方式

通过实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明根据肌腱-骨损伤后组织细胞的结构，利用3D生物打印技术，结合含钼硅酸盐(MS)生物活性陶瓷，构建了仿生和功能性多细胞支架。通过分层打印将肌腱干/祖细胞(TSPCs)分布在顶部，将骨髓干细胞(BMSCs)分布在底部，这种仿多细胞生物支架与筋骨的分层结构和多细胞组成相似，实现了对肌腱-骨界面的高度模仿。同时，MS可以释放Mo、Si、Ca等离子，诱导成腱和成骨的分化，从而赋予生物仿生支架的再生功能。

首先，本发明提供了一种仿肌腱-骨多细胞支架，所述仿肌腱-骨多细胞支架包括：位于下部的骨层与位于上部的肌腱层；所述骨层的每一个单层均包含生物活性无机材料、具有生物相容性的有机水凝胶材料和成骨相关细胞；所述肌腱层的每一个单层均包含生物活性无机材料、具有生物相容性的有机水凝胶材料和成肌腱相关细胞。

在一些实施方式中，所述上部肌腱层的层数可以为2～10，下部骨层的层数可以为2～10；控制上部肌腱层与下部骨层的层数比可以为5：1～1：5，优选为1：1；所述肌腱层单层与骨层单层的厚度均可以设置为0.1mm～0.5mm。

将所述肌腱层和骨层控制在上述层数、层厚范围内，可以促进支架保持较好的打印性能，即支架的孔状结构和底板分离的能力较佳。所述肌腱层、骨层的层数过多或层厚过大，会导致支架无法保持稳定的大孔结构与圆柱形支架结构，进一步使得支架仿生结构的丢失。与此同时，将所述上部肌腱层与下部骨层的层数比控制在5：1～1：5(比如1：1)，有利于保持较佳的肌腱干细胞和骨干细胞的双分化性能。

在一些实施方式中，所述生物活性无机材料可以选择磷酸盐陶瓷、生物玻璃或者硅酸盐生物陶瓷；所述硅酸盐生物陶瓷可以为硅酸钙、硅酸锌或者含钼硅酸盐生物陶瓷中的至少一种，优选为含钼硅酸钙生物陶瓷。所述生物活性无机材料能够持续稳定释放出Ca、Mg、Si、Mo或Zn等元素离子。

所述含钼硅酸盐生物陶瓷中，可以控制Mo元素的摩尔比例为0.1％～50％，优选为10％。所述含钼硅酸盐生物陶瓷功能的发挥依赖于其组分的整体形与协调性，含钼硅酸盐生物陶瓷促进细胞组织再生的主要原因在于其降解所释放的多种离子所营造的微环境，即Ca，Si，Mo离子微环境。若含钼硅酸盐生物陶瓷中Mo含量过高或过低，会打破所述多离子形成的动态微环境，导致其无法促进多组织的同时再生。

在一些实施方式中，所述有机水凝胶材料可以为海藻酸钠、壳聚糖、胶原纤维或者明胶中的至少一种，优选为甲基丙烯酰胺化明胶。

在一些实施方式中，所述成骨相关细胞包括：成骨细胞、骨髓间充质干细胞、骨祖细胞或者胚胎干细胞中的至少一种，优选为骨髓间充质干细胞；所述成肌腱相关细胞包括：肌腱成纤维细胞、成纤维细胞、腱细胞、肌腱干细胞或者脂肪干细胞中的至少一种，优选为肌腱干细胞。

以下示例性说明本发明提供的仿肌腱-骨多细胞支架的制备方法，所述制备方法可以包括以下步骤。

(1)含成肌腱相关细胞生物墨水制备。将水凝胶、引发剂加入溶剂中得到水凝胶浆料，然后加入生物活性无机材料溶液混合均匀得到复合水凝胶墨水，向所述复合水凝胶墨水中加入成肌腱相关细胞悬液，得到所述含成肌腱相关细胞生物墨水(生物墨水A)。

(2)含成骨相关细胞生物墨水制备。将水凝胶、引发剂加入溶剂中得到水凝胶浆料，然后加入生物活性无机材料溶液混合均匀得到复合水凝胶墨水，向所述复合水凝胶墨水中加入成骨相关细胞悬液，得到所述含成骨相关细胞生物墨水(生物墨水B)。

可选的实施方式中，溶解上述引发剂、水凝胶、生物活性无机材料以及成骨、成肌腱相关细胞的溶剂可以选择磷酸缓冲盐溶液PBS。

可以控制所述生物墨水A与生物墨水B中，所述水凝胶的质量浓度均为5～10wt％。所述水凝胶在生物墨水中的质量浓度决定水凝胶的打印性能与生物相容性，质量浓度为5-10％的生物墨水能够满足水凝胶的生物打印所要求的打印性和生物相容性的平衡。所述水凝胶质量浓度过大，会引起其内部的水凝胶网络过于密实，进而导致内部细胞受到过大的力学影响而无法生存；所述水凝胶质量浓度过小，会导致水凝胶的打印性能下降，而无法满足支架对仿生结构的要求。

在一些实施方式中，所述引发剂可以选自苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂蓝光引发剂(LAP)或者2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮紫外光引发剂I2959中的一种，优选为LAP。

可以控制所述生物墨水A与生物墨水B中，LAP引发剂的质量浓度均为0.01～0.05wt％。所述引发剂具有一定毒性，生物墨水中引发剂的浓度过大，会使LAP毒性过大；生物墨水中引发剂的浓度过小，则无法起到固化水凝胶的作用。

可选的实施方式中，所述生物活性无机材料可以选择含钼硅酸钙生物陶瓷。所述含钼硅酸钙生物陶瓷的化学组成为CaMoO₄和CaSiO₃，粒径分布可以控制在1～100微米，优选为1～50微米，粒径过大易导致打印针头堵塞。

以含钼硅酸钙生物陶瓷为例，所述含钼硅酸盐(MS)生物陶瓷的制备方法可以采用以下工艺：分别配置0.1mol/L～20mol/L等浓度的硅酸钠溶液、硝酸钙溶液，优选为1mol/L；然后，向所述硝酸钙溶液中加入H₂₄Mo₇N₆O₂₄·4H₂O，配制得到硝酸钙-钼酸铵混合溶液；将所述硝酸钙-钼酸铵混合溶液滴加到所述硅酸钠溶液中并搅拌24～72h，反应完成后经过滤得到沉淀物；将所述沉淀物用去离子水洗涤3～5次、无水乙醇洗涤3～5次，研磨、过筛、干燥；经烧结后，得到MS生物陶瓷颗粒。

可选的实施方式中，可以控制所述钼酸铵在硝酸钙-钼酸铵混合溶液中的质量浓度范围为1wt％～50wt％，优选为1wt％～10wt％。

所述干燥的温度可以为50℃～100℃，优选为60℃；干燥时间可以为24h～72h，优选为24h。所述烧结的温度可以为800℃～900℃，优选为800℃；升温速率可以为1℃/min～5℃/min，优选为2℃/min；烧结时间可以为1h～5h，优选为3h。

可以控制所述生物墨水A与生物墨水B中，生物活性无机材料的质量浓度均为0.1～10wt％，优选为1～5wt％。生物活性无机材料浓度过大，会导致细胞无法生存；浓度过小，则难以满足生物仿生支架再生功能的要求。

可以控制所述生物墨水A与生物墨水B中，成肌腱相关细胞、成骨相关细胞的密度分别为(2～6)×10⁶个/mL。细胞密度过大，会存在过多的细胞调出体系，并且消耗的培养基过多；细胞密度过小，则无法满足三维培养的要求。

本发明通过沉淀法合成的含钼硅酸盐生物活性陶瓷可以稳定地释放Ca、Mo、Si离子，而且具有良好的生物相容性以及生物活性。硅元素和钼元素为人体所必需的微量元素，硅酸盐陶瓷粉体对于硬组织、软组织具有良好的修复作用，通过将钼元素和硅酸盐陶瓷粉体结合得到的含钼硅酸盐生物陶瓷粉体，不仅具有良好的降解性能，而且能够同时诱导成骨分化和成腱分化，同时促进骨和肌腱修复。

(3)仿肌腱-骨多细胞支架制备。将步骤(1)、(2)制备得到的生物墨水A、B分别装载在不同的料筒中，采用双通道挤出式生物3D打印机利用生物墨水B打印支架下部骨层，然后利用生物墨水A打印支架上部肌腱层；将得到的打印素坯经交联固化，得到所述仿肌腱-骨多细胞支架。

在一些实施方式中，所述双通道挤出式生物3D打印的工艺参数可以为：挤出压力20～70KPa，优选为20～30KPa；料筒温度15～22℃，优选为20℃；沉积台温度0℃～10℃，优选为4℃。所述3D打印的工艺参数决定于水凝胶特点和浓度。料筒温度过低，打印压力升高，对细胞损伤大；料筒温度过高，打印压力降低，水凝胶无法成型。

在一些实施方式中，所述交联固化的蓝光功率可以为10～50mW/cm²，优选为20mW/cm²；交联时间可以为5～60s，优选为15s。

通过本发明所提供的制备方法得到的所述仿肌腱-骨多细胞支架的形状、结构和尺寸可根据需要进行设置。在一些实施方式中，可以控制所述仿肌腱-骨多细胞支架具有阵列排布的均匀通孔结构，每个通孔结构的的直径可以设置为1～2mm。

通过本发明提供的制备方法得到的仿肌腱-骨多细胞支架搭载的多层不同种类活细胞具有类似于肌腱-骨的细胞组成和多级结构，较好地模拟了肌腱骨梯度细胞结构，能够同时促进成肌腱相关细胞成腱分化和成骨相关细胞成骨分化，可以明显改善腱-骨损伤的修复，具有诱导腱-骨界面再生的功能。

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围，下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

(1)共沉淀法制备含Mo(10mol％)硅酸钙生物陶瓷。

将71.05gNa₂SiO₃·9H₂O粉末加入500毫升去离子水中，得到浓度为0.5mol/L的硅酸钠溶液；通过将10mol％的Mo添加剂以四水钼酸铵(H₂₄Mo₇N₆O₂₄·4H₂O)的形式引入0.5mol/L的硝酸钙溶液中进行改性，得到硝酸钙-钼酸铵混合溶液；然后，将所述硝酸钙-钼酸铵混合溶液滴加到所述硅酸钠溶液中并搅拌24小时，反应完成后经过滤得到沉淀物；将所述沉淀物用去离子水洗3次、无水乙醇洗3次，研磨、过筛，在60℃下干燥24小时；以2℃/min的速率升温至800℃后进行煅烧3h，得到含Mo(10mol％)的硅酸钙生物陶瓷粉末。

(2)含成肌腱相关细胞生物墨水(生物墨水A)、含成骨相关细胞生物墨水(生物墨水B)制备。

将0.05g光引发剂LAP和1.2g甲基丙烯酰胺化明胶GelMA加入到10mlPBS中并在60℃下溶解，得到质量浓度为12wt％的GelMA浆料；然后，在层流培养箱中将得到的12wt％的GelMA浆料用孔径为0.22μm的细菌过滤膜过滤以消除细菌，同时将步骤(1)制备得到的Mo(10mol％)的硅酸钙生物陶瓷粉末使用紫外线进行消毒；接着，将含有MS的PBS溶液加入GelMA浆料中并混合均匀得到复合水凝胶，向所述复合水凝胶墨水中分别加入兔的肌腱干细胞(TSPCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)，得到细胞的密度均为3×10⁶个/毫升的生物墨水A、生物墨水B；分别配制不同MS含量的生物墨水GelMA-nMS(n＝0，1.5，3，4.5)，所述生物墨水中MS的质量浓度分别为0％、1.5％、3％和4.5％。其中，0％生物墨水中的含钼硅酸盐可以被索引为具有高结晶度的CaSiO₃相(PDFNo.27-0088)。

图1为实施例1中含钼硅酸钙生物陶瓷MS的XRD图。从图中可以看出，10mol％的含钼硅酸钙主要由CaSiO₃相组成，并发现了CaMoO₄相，这表明钼元素以CaMoO₄相的形式存在。

图2为实施例1中MS颗粒的SEM图。从图中可以看出，MS颗粒大小均匀，粒径分布在10微米左右。

图3为实施例1中MS的EDS元素图谱。从图中可以看出，Mo附着在硅酸钙颗粒上，证明MS的成功制备。

图4为实施例1中生物墨水横截面的SEM和EDS表征图。从图中可以看出，含MS生物墨水表现出相互连接的大孔结构，MS均匀分布在里面。

(3)仿肌腱-骨多细胞支架制备。

将步骤(2)中制备得到的生物墨水A、B经紫外线和75％的酒精消毒后加入到不同的料筒中；设置双通道挤出式生物3D打印的挤出压力为27KPa，料筒温度为20.5℃，沉积台温度为4℃，进行3D打印素坯；然后，在405nm紫光灯下对构建体素坯进行交联，控制紫光功率为20mW/cm²，交联时间为15秒，得到所述仿肌腱-骨多细胞支架GelMA-Cells-MS。所述仿肌腱-骨多细胞支架的上部肌腱层与下部骨层的层数均为4层，肌腱层单层的厚度为0.1mm，骨层单层的厚度为0.1mm，所述支架的直径为14mm。

为了探索Mo离子对共培养支架的影响，将相同剂量的硅酸钙CS共培养支架GelMA-Cells-CS、未加入生物活性无机材料的共培养支架GelMA-Cells设为对照组。

图5(A)为实施例1中制备得到的仿生多细胞支架GelMA-Cells、GelMA-Cells-CS、GelMA-Cells-MS的光学照片。从图中可以看出，支架的孔结构清晰，保持了大孔结构。

图5(B)为第1天、第4天、第7天和第14天GelMA-Cells-MS内包裹的BMSCs和TSPCs的空间分布图。TSPCs在上层用绿色荧光标记，BMSCs在下层用红色荧光标记。从图中仿生多细胞支架的侧视图和三维视图可以看出，TSPCs均匀分布在支架上层，BMSCs均匀分布在支架下层，且该种分层结构在14天内保持稳定。

图5(C)为DAPI/F-actin染色后第7天和第14天仿生多细胞支架中BMSCs和TSPCs的共聚焦激光扫描显微镜图像。其中，肌动蛋白被染色为绿色，细胞核为蓝色。从图中可以看出，BMSCs和TSPCs扩展了细胞伪足并逐渐接触，在第7天和第14天，随着细胞的迁移和支架的降解，BMSCs和TSPCs相互接触更多，并分别形成逐渐广泛的肌动蛋白丝网络，而且GelMA-Cells-CS和GelMA-Cells-MS细胞的网络面积比GelMA-Cells大，表明了生物陶瓷颗粒可以促进细胞在仿生多细胞支架中的迁移和扩散。

功能化仿肌腱-骨多细胞支架的基因表达与促进成腱和成骨分化能力验证。

采用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法和和2^-ΔΔCT方法检两种干细胞中RNA表达。将生物活性支架中的两种干细胞共培养14天，用GelMA裂解缓冲液消化包裹着细胞的支架2小时，然后1000rpm下离心5分钟，弃去上清液；接着将细胞分散在Tirzol试剂中；分别用三氯甲烷和异丙醇提取RNA(根据制造商说明，用PrimeScript第一链cDNA合成试剂获得cDNA，RT-qPCR过程由StepOnePlusRealtime系统进行)。

用免疫荧光法检测支架中两种细胞的特异性蛋白表达。将生物活性支架中的两种干细胞共培养14天，然后将支架用4％多聚甲醛固定细胞40分钟，每次更换液体时，用PBS清洗三次；接着，用0.1％Triton-100将支架浸泡5分钟；然后，加入5％的BSA在室温下孵育30分钟；接着，加入第一抗体，在4℃下孵育24小时；回收第一抗体，加入第二抗体，37℃黑暗条件下孵育1小时；最后，进行细胞支架染色。

图6(A)为仿生多细胞支架内TSPCs的成腱分化相关基因DCN、TNC、BGN、COLI的表达情况图(n＝5)。从图中可以看出，GelMA-Cells-CS组对成腱分化相关基因表达的影响小于GelMA-Cells组，但COLI明显增加，相比之下GelMA-Cells-MS和GelMA-Cells-CS对肌腱基因的表达有明显的促进作用，GelMA-Cells-MS相对于GelMA-Cells-CS明显促进了成腱分化相关基因(DCN、TNC、BGN)的表达。

图6(B)为仿生多细胞支架内TSPCs的肌腱特异性标志物COLI和TNMD免疫荧光染色图像。TNMD是肌腱发育的重要标志，在腱细胞密度和增殖以及胶原纤维成熟方面发挥着调节作用，COLI则是肌腱的主要细胞外基质。通过免疫荧光染色和半定量统计分析研究TNMD和COLⅠ的蛋白表达图可以看出，支架中的COLⅠ被分泌到细胞外基质中，GelMA-Cells-MS支架中TNMD和COLⅠ的荧光强度高于其他组。

图6(C)为仿生多细胞支架内BMSCs的成骨分化相关基因OCN、OPN、Runx2、BMP2的表达情况图(n＝5)。从图中可以看出，GelMA-Cells-CS组对成骨分化相关基因表达的影响明显高于GelMA-Cells组，说明硅酸盐生物活性陶瓷释放的硅酸盐生物活性离子可以促进成骨分化，而且GelMA-Cells-MS的基因表达高于GelMA-Cells-CS，OPN和Runx2之间有明显差异。

图6(D)为仿生多细胞支架内BMSCs的成骨标志物BSP和OPN的免疫荧光染色图像。从图中可以看出，GelMA-Cells-MS在成骨标记物OPN和BSP的表达水平上有更高的荧光强度。

钼离子对肌腱干细胞和骨髓间干细胞的增殖、迁移和分化的影响。

钼离子对TSPCs和BMSCs的细胞增殖能力通过CCK-8分析来检测。用四水钼酸铵配制0mg/L、2mg/L、5mg/L和10mg/L的Mo离子溶液，然后在培养基中配置不同浓度Mo离子的细胞悬液；将100μL细胞悬液加入96孔板(1000个细胞)进行培养；分别在培养1、3和5天后，在每个孔中加入100μL的10％CCK-8培养基，37℃下培养1小时，之后用酶标仪在450nm处检测吸光度，用CCK-8试验测量细胞的增殖活性。

钼离子对TSPCs和BMSCs的细胞迁移能力通过transwell实验进行检测。在24孔板的每个孔中，在上腔加入300μL基础培养基(10,000个细胞)，然后在下室加入700μL含有分级浓度(2mg/L、5mg/L、10mg/L)的Mo离子培养基；6小时后，将细胞在4％多聚甲醛中固定20分钟，然后用棉签擦去上室液体，取出细胞；最后，用结晶紫对细胞进行染色，并用光学显微镜进行拍照。

钼离子对TSPCs和BMSCs的细胞分化能力通过RT-qPCR检测。将含有Mo离子梯度浓度的细胞悬液接种到6孔板上，每两天更换一次培养液，培养7天后提取细胞RNA，用RT-qPCR法研究不同浓度的Mo离子对TSPCs的成腱分化和BMSCs的成骨分化的调节作用。

图7(A)为不同浓度Mo离子对TSPCs在5天培养期间的增殖活性影响示意图，图7(D)为不同浓度Mo离子对BMSCs在5天培养期间的增殖活性影响示意图。从图中可以看出，在5天内加入Mo离子并不影响BMSCs和TSPCs的增殖活性。

图7(B)为不同浓度Mo离子对TSPCs中成腱分化相关基因表达的影响示意图，图7(E)为不同浓度Mo离子下对BMSCs中成骨分化相关基因表达的影响示意图。从图中可以看出，2mg/L和5mg/L的Mo离子明显提高了TSPCs中成腱相关基因(DCN、BGN、TNC)的表达水平；与空白组相比，钼离子明显增加了成骨基因(OCN)的表达，而5mg/L和10mg/L的Mo离子也可以上调BMP2的基因表达。

图7(C)为不同浓度Mo离子培养的TSPCs的代表性结晶紫细胞迁移染色图，图7(F)为不同浓度Mo离子培养的BMSCs的代表性结晶紫细胞迁移染色图。从图中可以看出，2mg/L和5mg/L的Mo离子可以增强TSPCs和BMSCs的细胞迁移能力。

功能化仿肌腱-骨多细胞支架在体内肩袖损伤修复中的应用。

建立兔子旋转袖口肌腱(RCT)模型来评估仿生和功能性多细胞支架对肌腱-骨损伤的修复效果。选择16只体重3公斤的雄性新西兰白兔，随机分为Blank、GelMA-Cells、GelMA-MS、GelMA-Cells-MS四组。首先，对兔子进行麻醉，剃除皮肤并进行消毒；然后，切开皮肤以暴露三角肌，切开三角肌以显示冈下肌；接着，沿肌腱到骨的界面分离冈下肌，冈下肌被5号线穿过，在肌腱到骨的接口处用5毫米冲头钻深度为2毫米的孔；然后，将功能化仿肌腱-骨多细胞支架放入孔中，用1毫米的克氏针创建骨隧道，通过骨隧道将肌腱缝合到骨头上；最后，依次关闭伤口。通过三维Micro-CT对肩袖损伤中的股骨缺损进行分析，用番红固绿染色试剂盒对肩袖组织进行组织切片染色，通过safranino/fastgreen(SO-FG)评估肌腱-骨修复的新纤维软骨的形成。

图8(A)为3D-Micro重建RCT的肱骨缺陷部位骨缺损结果示意图，图8(B)为肌腱-骨界面再生染色示意图。从图中可以看出，GelMA-Cells-MS在肌腱-骨界面的变色程度最高，GelMA-MS和GelMA-Cells组的变色面积高于Blank组，表明用仿生和功能性支架修复形成了新纤维软骨，与其他组相比，GelMA-Cells-MS支架在促进肌腱-骨损伤的综合修复方面具有最佳能力。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种仿肌腱-骨多细胞支架，其特征在于，包括：位于下部的骨层与位于上部的肌腱层；所述骨层的每一个单层均包含生物活性无机材料、有机水凝胶和成骨相关细胞，所述肌腱层的每一个单层均包含生物活性无机材料、有机水凝胶和成肌腱相关细胞；

所述生物活性无机材料选择磷酸盐陶瓷、生物玻璃或者硅酸盐生物陶瓷；所述硅酸盐生物陶瓷为硅酸钙、硅酸锌或者含钼硅酸盐生物陶瓷中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的仿肌腱-骨多细胞支架，其特征在于，所述上部肌腱层与下部骨层的层数均为2～10，上部肌腱层与下部骨层的层数比为5：1～1：5；所述肌腱层单层与骨层单层的厚度均为0.1mm～0.5mm。

3.根据权利要求1或2所述的仿肌腱-骨多细胞支架，其特征在于，所述有机水凝胶材料为海藻酸钠、壳聚糖、胶原纤维或者明胶中的至少一种，优选为甲基丙烯酰胺化明胶。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的仿肌腱-骨多细胞支架，其特征在于，所述成骨相关细胞包括：成骨细胞、骨髓间充质干细胞、骨祖细胞或者胚胎干细胞中的至少一种，优选为骨髓间充质干细胞；所述成肌腱相关细胞包括：肌腱成纤维细胞、成纤维细胞、腱细胞、肌腱干细胞或者脂肪干细胞中的至少一种，优选为肌腱干细胞。

5.一种权利要求1-4中任一项所述的仿肌腱-骨多细胞支架的制备方法，其特征在于，包括：

将水凝胶、引发剂加入溶剂中得到水凝胶浆料，然后加入生物活性无机材料得到复合水凝胶墨水；向所述复合水凝胶墨水中分别独立加入成肌腱相关细胞悬液、成骨相关细胞悬液，得到含成肌腱相关细胞生物墨水与含成骨相关细胞生物墨水；

将所述含成肌腱相关细胞生物墨水与含成骨相关细胞生物墨水分别装载在不同料筒中，采用双通道挤出式生物3D打印机利用含成骨相关细胞生物墨水打印支架下部骨层，然后利用含成肌腱相关细胞生物墨水打印支架上部肌腱层，得到支架素坯；将所述支架素坯经交联固化，得到所述仿肌腱-骨多细胞支架。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂选自苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂蓝光引发剂(LAP)或者2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮紫外光引发剂I2959中的一种。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述含成肌腱相关细胞生物墨水与含成骨相关细胞生物墨水中：水凝胶的质量浓度均为5～10wt％；引发剂的质量浓度均为0.01～0.05wt％；生物活性无机材料的质量浓度均为0.1～10wt％；成肌腱相关细胞、成骨相关细胞的密度分别为(2～6)×10⁶个/mL。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述双通道挤出式生物3D打印的工艺参数为：挤出压力20～70KPa，料筒温度15～22℃，沉积台温度0℃～10℃。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述交联固化的蓝光功率为10～50mW/cm²，交联时间为5～60s。

10.一种权利要求1-4中任一项所述的仿肌腱-骨多细胞支架在肌腱-骨损伤修复材料中的应用。

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