CN114288332B - 一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法，包括以下步骤：S1、预处理；S2、混配；S3、超声波连续浸提：S3‑1：将步骤S2中得到的黄芪茎叶粗提溶液置于超声波反应器中，在100W的超声功率下、温度为40‑80℃的条件下超声浸提30‑90min，并将滤渣进行真空抽滤得到一次滤液和一次滤渣；S3‑2：将所述一次滤液经过双水相萃取得到一次精提溶液；S3‑3：将所述一次滤渣经过超滤提取得到二次精提溶液；S4、蒸发浓缩。本发明的黄芪茎叶总黄酮的提取方法在双水相萃取的基础上结合了超声波辅助、高压脉冲电场辅助以及超滤提取，多层次深度优化提取方法并获得了最优提取参数，所得数据模型真实可靠且规律性显著，可以为黄芪茎叶中总黄酮的提取提供理论参考。

Description

一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法

技术领域

本发明涉及总黄酮提取技术领域，具体是涉及一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法。

背景技术

黄芪为豆科黄芪属多年生草本植物,以蒙古黄芪和膜荚黄芪的干燥根部入药。黄芪被我国中医界广为使用，具有补气升阳，利尿脱毒，生津养血，敛疮生肌等功效，被李时珍的《本草纲目》记载，并且誉为“补药之长”。同时，由于其具有滋补的功效，也被老百姓当作重要保健品原料和滋补食材。其道地产区有山西浑源、内蒙古、河北及甘肃陇西地区。黄芪中的黄酮类化合物主要是由异黄酮、黄酮醇构成，黄酮类中则常见的有鼠李柠檬素、懈皮素、异鼠李素、山柰酚、沙苑子苷。毛蕊异黄酮葡萄糖苷更是作为黄芪饮片的含量测定项的指标成分。黄芪中的有效成分主要包含三大类，分别是黄芪多糖类、黄酮类、及皂苷类。其中，黄酮类化合物作为本实验的主要研究成分，具有清除氧自由基、抗辐射损伤、抗病毒，增强免疫的作用，具有极强的生物活性和广泛的开发前景。

目前，黄酮类化合物的传统提取方法主要包括水煎煮法，有机溶剂萃取法，醇提法等。但黄芪中同样含有黄芪多糖等其他易溶于水的有效成分，采用热水煎煮会造成大量的黄芪多糖和其他杂质的大量溶出，溶液粘稠，较难过滤。而使用有机溶剂萃取虽然具有提取充分和提取效率高的优点，但会造成毒性较大的有机溶剂在材料和提取液中残留，危害人的身体健康。

随着现代科学发展以及提取技术的进步，涌现了许多高效便捷的新型提取技术，例如：液滴逆流提取法、循环超声提取、CO2超临界流体萃取法、大孔树脂吸附法等。张志泽研究发现微波提取技术是近年来发展迅速的新型提取技术，与传统的提取方法相比，具有时间短、高效、快速、污染少、提取率高等优点。罗磊等研究表明超声辅助提取法利用超声产生的振动、空化效应以及搅拌作用等破坏细胞壁，释放出细胞质中的物质，故而提取效率高，时间短。这些新技术的推广应用，不仅达到了降低生产成本的目标，而且提高了有效成分的得率和质量，为中药产业现代化打下了坚实的基础。但是，在应用到实际生产时还未有合理的生产方式能够达到工业化生产的目的。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明提供了一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法。

本发明的技术方案是：

一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法，包括以下步骤：

S1、预处理：将黄芪茎叶置于烘箱中并在50℃条件下烘干，将烘干后的黄芪茎叶经粉碎机粉碎后过60目标准筛，将得到的黄芪茎叶粉末置于烧杯中备用；

S2、混配：向烧杯中加入体积分数为50-90％的乙醇溶液，黄芪茎叶粉末与乙醇溶液的重量比为1：10-40，搅拌1-2h，随后静置24h，得到黄芪茎叶粗提溶液；

S3、超声波连续浸提：

S3-1：将步骤S2中得到的黄芪茎叶粗提溶液置于超声波反应器中，在100W的超声功率下、温度为40-80℃的条件下超声浸提30-90min，并将滤渣进行真空抽滤得到一次滤液和一次滤渣；

S3-2：将所述一次滤液经过双水相萃取得到一次精提溶液；

S3-3：将所述一次滤渣经过超滤提取得到二次精提溶液；

S4、蒸发浓缩：将步骤S3-2中得到的一次精提溶液和步骤S3-3中得到的二次精提溶液置于旋转蒸发仪中进行蒸发浓缩，得到黄芪茎叶浓缩液。

进一步地，所述步骤S3-2中双水相萃取包括以下步骤：

S3-2-1：将硫酸铵溶解于无水乙醇溶液中，硫酸铵与无水乙醇的重量比为1：2.2-2.6，搅拌3-5min混匀，静置2h，分相形成聚合物双水相提取剂；

S3-2-2：将所述一次滤液滴加入到所述聚合物双水相提取剂中，滴加速度为3-5滴/s，同时进行搅拌，滴加结束后继续搅拌10-15min；

S3-2-3：在上述搅拌过程结束后，将一次滤液与聚合物双水相提取剂的混合溶液静置并在350-550W的微波功率下微波处理3-5min，继续静置10-12min再进行微波处理，重复3次，得到的混合溶液上相为含有黄酮的精提相，下相为硫酸铵杂质相，分离上相即得到一次精提溶液。利用双水萃取法对一次滤液进行分离处理，分离条件温和，萃取时间短，效率高。

更进一步地，所述一次滤液与所述聚合物双水相提取剂的体积比为1：3-4。该配比能够使获得的一次精提溶液浓度更高。

优选地，所述步骤S3-2-2中滴加的一次滤液中每一滴一次滤液的体积为0.04-0.07ml。控制混合的速度避免速度过快导致反应不充分。

进一步地，所述步骤S3-3中超滤提取包括以下步骤：

S3-3-1：将一次滤渣置于超声波反应器中，在120W的超声功率下、温度为70℃的条件下超声浸提40-60min，得到二次滤液并去除二次滤渣；

S3-3-2：将二次滤液过超滤膜超滤处理，所述超滤膜的平均孔径为15-30nm，在超滤时通入高压脉冲电场进行高压脉冲电场辅助处理；

S3-3-3：将超滤处理后的二次滤液进行聚酰胺柱层析处理，二次滤液的上柱流速为1-3BV/h，上柱完成后使用去离子水进行上柱除杂，去离子水的上柱流速为2-3BV/h，随后使用体积分数为75％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为2-3BV/h，收集的洗脱液即为二次精提溶液。

更进一步地，所述步骤S3-3-2中脉冲电场强度为18-25kV/cm，脉冲数为6-10。高压脉冲电场技术可以在植物细胞膜上形成不可恢复的击穿现象，增加组织柔软程度，对组织形态产生影响，促进传质的进行。

优选地，所述步骤S3-3-3在进行之前首先将聚酰胺柱在无水乙醇中浸泡处理24h，随后将浸泡后的聚酰胺柱在质量浓度为35％的磷酸氢二钾溶液中浸泡处理12h，随后将浸泡后的聚酰胺柱使用去离子水冲洗3次，烘干备用。通过聚酰胺分子中的酰胺键与分子中的酚羟基形成氢键产生吸附，分离效果好，吸附容量大。

进一步地，所述步骤S4蒸发浓缩包括以下步骤：

S4-1：将一次精提溶液置于旋转蒸发仪中进行一次蒸发浓缩，随后将蒸发浓缩后的一次精提溶液过超滤膜超滤处理，所述超滤膜的平均孔径为25-40nm，冷却备用；

S4-2：将步骤S4-1中得到的蒸发浓缩超滤后的一次精提溶液及步骤S3-3中得到的二次精提溶液混合后置于旋转蒸发仪中进行二次蒸发浓缩，得到总黄酮浓缩液。

更进一步地，所述步骤S4-1中一次蒸发浓缩温度为85-90℃，步骤S4-2中二次蒸发浓缩的温度为65-70℃。调整两次蒸发浓缩的温度，在一次蒸发浓缩中采用较高温度而在二次蒸发浓缩中采用较低温度，能够对一次精提溶液进行深度浓缩并保证了二次精提溶液的快速高效浓缩，避免因蒸发浓缩时间过长导致一部分黄酮结构收到破坏。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的黄芪茎叶总黄酮的提取方法以豆科植物黄芪的茎叶作为材料，在双水相萃取的基础上结合了超声波辅助、高压脉冲电场辅助以及超滤提取，多层次深度优化提取方法从而实现了最优提取参数，以总黄酮含量为指标，通过响应面法设计优化黄芪总黄酮的提取工艺，对提取时间、提取温度、料液比、乙醇体积分数等工艺参数进行了单因素分析，所得数据模型真实可靠且规律性显著，可以为黄芪茎叶中总黄酮的提取提供理论参考。

(2)本发明的黄芪茎叶总黄酮的提取方法在提取过程中分为两大部分，一次滤液分别为双水相萃取得到一次精提溶液，一次滤渣超滤提取得到二次精提溶液，随后又在蒸发浓缩阶段通过调整蒸发浓缩的工艺参数将两部分精提溶液有机混合，调整两次蒸发浓缩的温度，在一次蒸发浓缩中采用较高温度而在二次蒸发浓缩中采用较低温度，能够对一次精提溶液进行深度浓缩并保证了二次精提溶液的快速高效浓缩，避免因蒸发浓缩时间过长导致一部分黄酮结构收到破坏，实现了总黄酮的最大提取效率，减少了外界因素对实验结果造成的干扰。

附图说明

图1是本发明的工艺方法流程图。

具体实施方式

实施例1

一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法，包括以下步骤：

S1、预处理：将黄芪茎叶置于烘箱中并在50℃条件下烘干，将烘干后的黄芪茎叶经粉碎机粉碎后过60目标准筛，将得到的黄芪茎叶粉末置于烧杯中备用；

S2、混配：向烧杯中加入体积分数为70％的乙醇溶液，黄芪茎叶粉末与乙醇溶液的重量比为1：20，搅拌1.5h，随后静置24h，得到黄芪茎叶粗提溶液；

S3、超声波连续浸提：

S3-1：将步骤S2中得到的黄芪茎叶粗提溶液置于超声波反应器中，在100W的超声功率下、温度为50℃的条件下超声浸提50min，并将滤渣进行真空抽滤得到一次滤液和一次滤渣；

S3-2：将一次滤液经过双水相萃取得到一次精提溶液，一次滤液与聚合物双水相提取剂的体积比为1：3.6，双水相萃取包括以下步骤：

S3-2-1：将硫酸铵溶解于无水乙醇溶液中，硫酸铵与无水乙醇的重量比为1：2.4，搅拌4min混匀，静置2h，分相形成聚合物双水相提取剂；

S3-2-2：将一次滤液滴加入到聚合物双水相提取剂中，滴加速度为4滴/s，每一滴一次滤液的体积为0.05ml，同时进行搅拌，滴加结束后继续搅拌13min；

S3-2-3：在上述搅拌过程结束后，将一次滤液与聚合物双水相提取剂的混合溶液静置并在450的微波功率下微波处理4min，继续静置11min再进行微波处理，重复3次，得到的混合溶液上相为含有黄酮的精提相，下相为硫酸铵杂质相，分离上相即得到一次精提溶液；

S3-3：将一次滤渣经过超滤提取得到二次精提溶液，超滤提取包括以下步骤：

S3-3-1：将一次滤渣置于超声波反应器中，在120W的超声功率下、温度为70℃的条件下超声浸提50min，得到二次滤液并去除二次滤渣；

S3-3-2：将二次滤液过超滤膜超滤处理，超滤膜的平均孔径为25nm，在超滤时通入高压脉冲电场进行高压脉冲电场辅助处理，脉冲电场强度为22kV/cm，脉冲数为8；

S3-3-3：将超滤处理后的二次滤液进行聚酰胺柱层析处理，首先将聚酰胺柱在无水乙醇中浸泡处理24h，随后将浸泡后的聚酰胺柱在质量浓度为35％的磷酸氢二钾溶液中浸泡处理12h，随后将浸泡后的聚酰胺柱使用去离子水冲洗3次，烘干备用，二次滤液的上柱流速为2BV/h，上柱完成后使用去离子水进行上柱除杂，去离子水的上柱流速为2.4BV/h，随后使用体积分数为75％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为2.6BV/h，收集的洗脱液即为二次精提溶液；

S4、蒸发浓缩：将步骤S3-2中得到的一次精提溶液和步骤S3-3中得到的二次精提溶液置于旋转蒸发仪中进行蒸发浓缩，得到黄芪茎叶浓缩液，蒸发浓缩包括以下步骤：

S4-1：将一次精提溶液置于旋转蒸发仪中进行一次蒸发浓缩，一次蒸发浓缩温度为87℃，随后将蒸发浓缩后的一次精提溶液过超滤膜超滤处理，超滤膜的平均孔径为33nm，冷却备用；

S4-2：将步骤S4-1中得到的蒸发浓缩超滤后的一次精提溶液及步骤S3-3中得到的二次精提溶液混合后置于旋转蒸发仪中进行二次蒸发浓缩，S4-2中二次蒸发浓缩的温度为68℃，得到总黄酮浓缩液。

实施例2

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S2中混配的乙醇溶液体积分数不同。

S2、混配：向烧杯中加入体积分数为50％的乙醇溶液。

实施例3

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S2中混配的乙醇溶液体积分数不同。

S2、混配：向烧杯中加入体积分数为90％的乙醇溶液。

实施例4

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S2中黄芪茎叶粉末与乙醇溶液的重量比不同。

S2、混配：黄芪茎叶粉末与乙醇溶液的重量比为1：10，搅拌2h。

实施例5

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S2中黄芪茎叶粉末与乙醇溶液的重量比不同。

S2、混配：黄芪茎叶粉末与乙醇溶液的重量比为1：40，搅拌1h。

实施例6

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S3-1中超声波浸提的温度不同。

S3-1：将步骤S2中得到的黄芪茎叶粗提溶液置于超声波反应器中，在100W的超声功率下、温度为40℃的条件下超声浸提50min，并将滤渣进行真空抽滤得到一次滤液和一次滤渣。

实施例7

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S3-1中超声波浸提的温度不同。

S3-1：将步骤S2中得到的黄芪茎叶粗提溶液置于超声波反应器中，在100W的超声功率下、温度为80℃的条件下超声浸提50min，并将滤渣进行真空抽滤得到一次滤液和一次滤渣。

实施例8

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S3-1中超声波浸提的时间不同。

S3-1：将步骤S2中得到的黄芪茎叶粗提溶液置于超声波反应器中，在100W的超声功率下、温度为50℃的条件下超声浸提30min，并将滤渣进行真空抽滤得到一次滤液和一次滤渣。

实施例9

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S3-1中超声波浸提的时间不同。

S3-1：将步骤S2中得到的黄芪茎叶粗提溶液置于超声波反应器中，在100W的超声功率下、温度为50℃的条件下超声浸提90min，并将滤渣进行真空抽滤得到一次滤液和一次滤渣。

实施例10

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S3-2中的具体工艺参数不同。

S3-2：将一次滤液经过双水相萃取得到一次精提溶液，一次滤液与聚合物双水相提取剂的体积比为1：3，双水相萃取包括以下步骤：

S3-2-1：将硫酸铵溶解于无水乙醇溶液中，硫酸铵与无水乙醇的重量比为1：2.6，搅拌3min混匀，静置2h，分相形成聚合物双水相提取剂；

S3-2-2：将一次滤液滴加入到聚合物双水相提取剂中，滴加速度为3滴/s，每一滴一次滤液的体积为0.07ml，同时进行搅拌，滴加结束后继续搅拌15min；

S3-2-3：在上述搅拌过程结束后，将一次滤液与聚合物双水相提取剂的混合溶液静置并在550W的微波功率下微波处理5min，继续静置12min再进行微波处理，重复3次，得到的混合溶液上相为含有黄酮的精提相，下相为硫酸铵杂质相，分离上相即得到一次精提溶液。

实施例11

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S3-2中的具体工艺参数不同。

S3-2：将一次滤液经过双水相萃取得到一次精提溶液，一次滤液与聚合物双水相提取剂的体积比为1：4，双水相萃取包括以下步骤：

S3-2-1：将硫酸铵溶解于无水乙醇溶液中，硫酸铵与无水乙醇的重量比为1：2.2，搅拌5min混匀，静置2h，分相形成聚合物双水相提取剂；

S3-2-2：将一次滤液滴加入到聚合物双水相提取剂中，滴加速度为3滴/s，每一滴一次滤液的体积为0.04ml，同时进行搅拌，滴加结束后继续搅拌10min；

S3-2-3：在上述搅拌过程结束后，将一次滤液与聚合物双水相提取剂的混合溶液静置并在350W的微波功率下微波处理3min，继续静置10min再进行微波处理，重复3次，得到的混合溶液上相为含有黄酮的精提相，下相为硫酸铵杂质相，分离上相即得到一次精提溶液。

实施例12

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S3-3中的具体工艺参数不同。

S3-3：将一次滤渣经过超滤提取得到二次精提溶液，超滤提取包括以下步骤：

S3-3-1：将一次滤渣置于超声波反应器中，在120W的超声功率下、温度为70℃的条件下超声浸提40min，得到二次滤液并去除二次滤渣；

S3-3-2：将二次滤液过超滤膜超滤处理，超滤膜的平均孔径为15nm，在超滤时通入高压脉冲电场进行高压脉冲电场辅助处理，脉冲电场强度为18kV/cm，脉冲数为6；

S3-3-3：将超滤处理后的二次滤液进行聚酰胺柱层析处理，首先将聚酰胺柱在无水乙醇中浸泡处理24h，随后将浸泡后的聚酰胺柱在质量浓度为35％的磷酸氢二钾溶液中浸泡处理12h，随后将浸泡后的聚酰胺柱使用去离子水冲洗3次，烘干备用，二次滤液的上柱流速为1BV/h，上柱完成后使用去离子水进行上柱除杂，去离子水的上柱流速为2BV/h，随后使用体积分数为75％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集的洗脱液即为二次精提溶液。

实施例13

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S3-3中的具体工艺参数不同。

S3-3：将一次滤渣经过超滤提取得到二次精提溶液，超滤提取包括以下步骤：

S3-3-1：将一次滤渣置于超声波反应器中，在120W的超声功率下、温度为70℃的条件下超声浸提60min，得到二次滤液并去除二次滤渣；

S3-3-2：将二次滤液过超滤膜超滤处理，超滤膜的平均孔径为30nm，在超滤时通入高压脉冲电场进行高压脉冲电场辅助处理，脉冲电场强度为25kV/cm，脉冲数为10；

S3-3-3：将超滤处理后的二次滤液进行聚酰胺柱层析处理，首先将聚酰胺柱在无水乙醇中浸泡处理24h，随后将浸泡后的聚酰胺柱在质量浓度为35％的磷酸氢二钾溶液中浸泡处理12h，随后将浸泡后的聚酰胺柱使用去离子水冲洗3次，烘干备用，二次滤液的上柱流速为3BV/h，上柱完成后使用去离子水进行上柱除杂，去离子水的上柱流速为3BV/h，随后使用体积分数为75％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为3BV/h，收集的洗脱液即为二次精提溶液。

实施例14

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S4蒸发浓缩的工艺参数不同。

S4、蒸发浓缩：将步骤S3-2中得到的一次精提溶液和步骤S3-3中得到的二次精提溶液置于旋转蒸发仪中进行蒸发浓缩，得到黄芪茎叶浓缩液，蒸发浓缩包括以下步骤：

S4-1：将一次精提溶液置于旋转蒸发仪中进行一次蒸发浓缩，一次蒸发浓缩温度为85℃，随后将蒸发浓缩后的一次精提溶液过超滤膜超滤处理，超滤膜的平均孔径为25nm，冷却备用；

S4-2：将步骤S4-1中得到的蒸发浓缩超滤后的一次精提溶液及步骤S3-3中得到的二次精提溶液混合后置于旋转蒸发仪中进行二次蒸发浓缩，S4-2中二次蒸发浓缩的温度为65℃，得到总黄酮浓缩液。

实施例15

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S4蒸发浓缩的工艺参数不同。

S4、蒸发浓缩：将步骤S3-2中得到的一次精提溶液和步骤S3-3中得到的二次精提溶液置于旋转蒸发仪中进行蒸发浓缩，得到黄芪茎叶浓缩液，蒸发浓缩包括以下步骤：

S4-1：将一次精提溶液置于旋转蒸发仪中进行一次蒸发浓缩，一次蒸发浓缩温度为90℃，随后将蒸发浓缩后的一次精提溶液过超滤膜超滤处理，超滤膜的平均孔径为40nm，冷却备用；

S4-2：将步骤S4-1中得到的蒸发浓缩超滤后的一次精提溶液及步骤S3-3中得到的二次精提溶液混合后置于旋转蒸发仪中进行二次蒸发浓缩，S4-2中二次蒸发浓缩的温度为70℃，得到总黄酮浓缩液。

实验例1

对实施例1-3中的总黄酮提取率进行测定，测定结果如表1所示。

表1实施例1-3中总黄酮提取率

实施例	总黄酮提取率mg/g
		实施例1	1.92
实施例2	1.78
		实施例3	1.65

由上述表1数据可以看出，乙醇的体积分数对总黄酮的提取率有一定影响，黄酮提取率随着乙醇体积分数的增大呈现出先上升后下降的大致趋势，并于80％时达到最高值1.92mg/g。

实验例2

对实施例1、4、5中的总黄酮提取率进行测定，测定结果如表2所示。

表2实施例1、4、5中总黄酮提取率

实施例	总黄酮提取率mg/g
		实施例1	1.92
实施例4	1.76
		实施例5	1.81

由上述表2数据可以看出，黄芪茎叶粉末与乙醇溶液的重量比对总黄酮的提取率有一定影响，重量比过低时黄芪粉末不能充分散开，不利于与乙醇溶液的相互接触，黄酮类物质不能充分溶出；同时也不能采用过高的重量比，过大的重量比会吸收一定量的超声波，不利于黄芪细胞的破壁，并且造成损耗，同时也会造成溶剂的浪费。选择1：20的黄芪茎叶粉末与乙醇溶液的重量比为最佳。

实验例3

对实施例1、6、7中的总黄酮提取率进行测定，测定结果如表3所示。

表3实施例1、6、7中总黄酮提取率

实施例	总黄酮提取率mg/g
		实施例1	1.92
实施例6	1.68
		实施例7	1.71

由上述表3数据可以看出，超声波浸提的温度对总黄酮的提取率有较大的影响，黄芪茎叶总黄酮提取率50℃达到最大，提取率为1.92mg/g。结合资料与所学知识中黄酮的特性分析，可能是由于温度的升高破坏了一些黄酮类化合物的结构导致其总黄酮得率的减少。

实验例4

对实施例1、8、9中的总黄酮提取率进行测定，测定结果如表4所示。

表4实施例1、8、9中总黄酮提取率

实施例	总黄酮提取率mg/g
		实施例1	1.92
实施例8	1.76
		实施例9	1.83

由上述表4数据可以看出，超声波浸提的时间对总黄酮的提取率有一定影响，黄酮提取率随着超声浸提时间的增加呈现出先上升后下降的大致趋势，50min后黄芪茎叶总黄酮提取率降低是由于超声辅助提取条件下，造成了黄酮结构破坏。故选择提取时间为50min最优。

实验例5

在实验例1-4中对基础参数的响应面影响进行了研究，得到了最优基础参数，下面将实施例1与两组对比例进行对比，其中，对比例1为只进行了步骤S3-2双水相萃取而未进行步骤S3-3脉冲电场超滤处理，对比例2只进行了步骤S3-3脉冲电场超滤处理而未进行步骤S3-2双水相萃取，对两组对比例的最终总黄酮提取率进行测定，结果如表5所示。

表5实施例1、对比例1、2中总黄酮提取率

实施例	总黄酮提取率mg/g
		实施例1	1.92
对比例1	1.58
		对比例2	1.49

由上述表5数据可以看出，通过使用了本发明的黄芪茎叶总黄酮的提取方法对黄酮提取率有着较大的影响，与对比例1和2中仅使用单一提取方法相比黄铜的提取率有了较大的提高，说明将步骤S3-2双水相萃取以及步骤S3-3脉冲电场超滤处理相结合并采用本发明优化后的蒸发结晶方法对黄酮的提取率提高有进一步地贡献。

Claims (6)

1.一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、预处理：将黄芪茎叶置于烘箱中并在50℃条件下烘干，将烘干后的黄芪茎叶经粉碎机粉碎后过60目标准筛，将得到的黄芪茎叶粉末置于烧杯中备用；

S2、混配：向烧杯中加入体积分数为50-90%的乙醇溶液，黄芪茎叶粉末与乙醇溶液的重量比为1：10-40，搅拌1-2h，随后静置24h，得到黄芪茎叶粗提溶液；

S3、超声波连续浸提：

S3-1：将步骤S2中得到的黄芪茎叶粗提溶液置于超声波反应器中，在100W的超声功率下、温度为40-80℃的条件下超声浸提30-90min，并进行真空抽滤得到一次滤液和一次滤渣；

S3-2：将所述一次滤液经过双水相萃取得到一次精提溶液；

双水相萃取包括以下步骤：

S3-2-1：将硫酸铵溶解于无水乙醇溶液中，硫酸铵与无水乙醇的重量比为1：2.2-2.6，搅拌3-5min混匀，静置2h，分相形成聚合物双水相提取剂；

S3-2-2：将所述一次滤液滴加入到所述聚合物双水相提取剂中，滴加速度为3-5滴/s，同时进行搅拌，滴加结束后继续搅拌10-15min；

S3-2-3：在上述搅拌过程结束后，将一次滤液与聚合物双水相提取剂的混合溶液静置并在350-550W的微波功率下微波处理3-5min，继续静置10-12min再进行微波处理，重复3次，得到的混合溶液上相为含有黄酮的精提相，下相为硫酸铵杂质相，分离上相即得到一次精提溶液；

S3-3：将所述一次滤渣经过超滤提取得到二次精提溶液；

超滤提取包括以下步骤：

S3-3-1：将一次滤渣置于超声波反应器中，在120W的超声功率下、温度为70℃的条件下超声浸提40-60min，得到二次滤液并去除二次滤渣；

S3-3-2：将二次滤液过超滤膜超滤处理，所述超滤膜的平均孔径为15-30nm，在超滤时通入高压脉冲电场进行高压脉冲电场辅助处理；

S3-3-3：将超滤处理后的二次滤液进行聚酰胺柱层析处理，二次滤液的上柱流速为1-3BV/h，上柱完成后使用去离子水进行上柱除杂，去离子水的上柱流速为2-3BV/h，随后使用体积分数为75%的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为2-3BV/h，收集的洗脱液即为二次精提溶液；

所述步骤S3-3-3在进行之前首先将聚酰胺柱在无水乙醇中浸泡处理24h，随后将浸泡后的聚酰胺柱在质量浓度为35%的磷酸氢二钾溶液中浸泡处理12h，随后将浸泡后的聚酰胺柱使用去离子水冲洗3次，烘干备用；

S4、蒸发浓缩：将步骤S3-2中得到的一次精提溶液和步骤S3-3中得到的二次精提溶液置于旋转蒸发仪中进行蒸发浓缩，得到黄芪茎叶浓缩液。

2.根据权利要求1所述的一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法，其特征在于，所述一次滤液与所述聚合物双水相提取剂的体积比为1：3-4。

3.根据权利要求1所述的一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法，其特征在于，所述步骤S3-2-2中滴加的一次滤液中每一滴一次滤液的体积为0.04-0.07ml。

4.根据权利要求1所述的一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法，其特征在于，所述步骤S3-3-2中脉冲电场强度为18-25kV/cm，脉冲数为6-10。

5.根据权利要求1所述的一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法，其特征在于，所述步骤S4蒸发浓缩包括以下步骤：

S4-1：将一次精提溶液置于旋转蒸发仪中进行一次蒸发浓缩，随后将蒸发浓缩后的一次精提溶液过超滤膜超滤处理，所述超滤膜的平均孔径为25-40nm，冷却备用；

S4-2：将步骤S4-1中得到的蒸发浓缩超滤后的一次精提溶液及步骤S3-3中得到的二次精提溶液混合后置于旋转蒸发仪中进行二次蒸发浓缩，得到总黄酮浓缩液。

6.根据权利要求5所述的一种响应面优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法，其特征在于，所述步骤S4-1中一次蒸发浓缩温度为85-90℃，步骤S4-2中二次蒸发浓缩的温度为65-70℃。

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