CN114277115A

CN114277115A - 甲状腺结节良恶性相关标志物及其应用

Info

Publication number: CN114277115A
Application number: CN202011031681.XA
Authority: CN
Inventors: 刘蕊; 苏明扬; 何其晔
Original assignee: Shanghai Fuyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Fuyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明提供一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的组合物，所述组合物包括分别用于检测样品中与甲状腺结节良恶性相关的甲基化区域的SLC16A3基因的核酸序列、PRR15基因的核酸序列、CDH1基因的核酸序列、TSHR基因的核酸序列和GRIA2基因的核酸序列以及内参基因ACTB的核酸序列，以及任选的内参基因的核酸序列。本发明通过对组织或者血浆中的上述甲基化标志物的甲基化水平进行分析，可诊断受试者甲状腺结节的良恶性。

Description

甲状腺结节良恶性相关标志物及其应用

技术领域

本发明属于分子辅助诊断领域，涉及甲状腺结节良恶性相关标志物及其应用。

背景技术

甲状腺结节(Thyroid nodule)是甲状腺细胞异常增生后在甲状腺内形成的固体或者液体填充的肿块，可随着吞咽动作随甲状腺而上下移动，甲状腺是位于颈部底部、胸骨上方的一个小腺体。虽然大多数甲状腺结节并不严重，不会引起症状，但还是有一部分甲状腺结节是癌性的。为了更早的诊断和治疗甲状腺癌，同时降低非必要的手术治疗，亟需一种高灵敏度和特异性的体外诊断方法对甲状腺结节的良恶性进行鉴别。

美国甲状腺协会(American Thyroid Association,ATA)将甲状腺结节定义为甲状腺上的一种离散型病变，借助影像学检查，可观测到结节与正常甲状腺组织结构不同，存在相对边界。目前通过超声(ultrasonography,US)、细针穿刺活检(fine needleaspiration biopsy,FNAB)、电子计算机断层扫描(Computed Tomography)、核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)和正电子发射计算机断层扫描(Positron EmissionComputed Tomography，PET)可对甲状腺结节进行筛查和评估，判断其大小和类型。目前，高分辨率的超声(US)是甲状腺结节的首选检查，但是通过超声检测到的结节通常与甲状腺功能异常无关，且高分辨率甲状腺超声的滥用使得大量无临床意义的结节(包括甲状腺微小癌)被检出，可能使临床评估偏离甲状腺功能异常。事实上这些结节(包括甲状腺微小癌)绝大部分对患者的危害甚小，可能根本无需处理，但很多患者却因此背上了沉重的精神负担。目前，细胞学检查结果中还有高达20％的结节为不确定甲状腺结节(indeterminatethyroid nodules)，这部分结节需要结合分子检测，但市面上针对甲状腺癌进行分子检测的产品阳性预测值、诊断准确性、灵敏度和特异性均较低。因此，开发具有低成本、无创、适合临床推广的甲状腺结节良恶性鉴别的高特异性、高灵敏度的分子诊断工具，对有效控制甲状腺癌的发病率和更深入的研究其发病机制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的组合物，通过运用该组合物检测含有选自SLC16A3基因，PRR15基因，CDH1基因，TSHR基因和GRIA2基因中目标位点的一个或多个的甲基化情况，实现甲状腺结节的良恶性鉴别。

本发明第一方面提供一种分离的核酸分子，包含选自以下的一种或多种：(1)由SEQ ID NO:1和2或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段；(2)由SEQ ID NO:3和4或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的PRR15基因的片段；(3)由SEQ ID NO:5和6或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的CDH1基因的片段；(4)由SEQ ID NO:7和8或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的TSHR基因的片段；(5)由SEQ ID NO:9和10或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段；和(6)(1)(2)(3)(4)和(5)所述片段的混合物。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子用于甲状腺结节良恶性鉴别的甲基化检测。

在一个或多个实施方案中，所述片段中未甲基化的胞嘧啶被转化为不与鸟嘌呤结合的碱基。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子至少包含由SEQ ID NO:9和10或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段。

本发明第二方面提供引物分子，具有选自以下的任意一种、两种、三种、四种或五种序列：(1)SEQ ID NO:1和2所示的序列或与由SEQ ID NO:1和2作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段在严谨条件下杂交的序列；(2)SEQ ID NO:3和4所示的序列或与由SEQID NO:3和4作为引物扩增得到的PRR15基因的片段在严谨条件下杂交的序列；(3)SEQ IDNO:5和6所示的序列或与由SEQ ID NO:5和6作为引物扩增得到的CDH1基因的片段在严谨条件下杂交的序列；(4)SEQ ID NO:7和8所示的序列或与由SEQ ID NO:7和8作为引物扩增得到的TSHR基因的片段在严谨条件下杂交的序列；(5)SEQ ID NO:9和10示的序列或与由SEQID NO:9和10作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段在严谨条件下杂交的序列；和(6)(1)-(5)所述序列的混合物。

在一个或多个实施方案中，所述引物分子用于甲状腺结节良恶性鉴别的甲基化检测。

在一个或多个实施方案中，所述引物分子能扩增出选自以下的一个或多个片段：(1)由SEQ ID NO:1和2或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段；(2)由SEQ ID NO:3和4或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的PRR15基因的片段；(3)由SEQ ID NO:5和6或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的CDH1基因的片段；(4)由SEQ ID NO:7和8或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的TSHR基因的片段；(5)由SEQ ID NO:9和10或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段。

在一个或多个实施方案中，所述引物分子至少包含(5)SEQ ID NO:9和10示的序列或与由SEQ ID NO:9和10作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段在严谨条件下杂交的序列。

在一个或多个实施方案中，所述引物分子包含SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:10中任一项所述的序列或与其具有至少90％序列相同性的变体。

在一个或多个实施方案中，所述引物分子还包括检测内参基因ACTB的引物，其中，检测内参基因ACTB的引物的扩增片段包含由SEQ ID NO:11和12作为引物扩增得到的ACTB基因的片段，或检测内参基因ACTB的引物能扩增出由SEQ ID NO:11和12作为引物扩增得到的ACTB基因的片段。优选地，检测内参基因ACTB的引物为SEQ ID NO:11和12所示的序列或与由SEQ ID NO:11和12作为引物扩增得到的ACTB基因的片段在严谨条件下杂交的序列。

本发明第三方面提供一种探针分子，所述探针分子与本文第一方面所述的核酸分子在严谨条件下杂交。

在一个或多个实施方案中，所述探针分子能与选自以下的一个或多个片段杂交或包含能与选自以下的一个或多个片段杂交的序列：由SEQ ID NO:1和2作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段、由SEQ ID NO:3和4作为引物扩增得到的PRR15基因的片段、由SEQ IDNO:5和6作为引物扩增得到的CDH1基因的片段、由SEQ ID NO:7和8作为引物扩增得到的TSHR基因的片段、由SEQ ID NO:9和10作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段、和任选的由SEQ ID NO:11和12作为引物扩增得到的ACTB基因的片段。

优选地，探针分子包含SEQ ID NO:13、14、15、16和17所示的序列和任选的SEQ IDNO:18所示序列或与其有至少90％相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述各探针还含有可检测物。在一个或多个实施方案中，所述可检测物是5’端荧光报告基团和3’端标记淬灭基团。在一个或多个实施方案中，所述荧光报告基因选自Cy5、Texas Red、FAM、VIC和HEX。

本发明第四方面提供记载有核酸分子的序列和/或其甲基化信息的介质，所述核酸分子如本文第一方面所述。所述介质用于与基因甲基化测序数据比对以确定所述核酸分子的存在、含量和/或甲基化水平。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子的序列选自以下的一种或多种片段的序列：(1)由SEQ ID NO:1和2或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段；(2)由SEQ ID NO:3和4或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的PRR15基因的片段；(3)由SEQ ID NO:5和6或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的CDH1基因的片段；(4)由SEQ ID NO:7和8或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的TSHR基因的片段；(5)由SEQ ID NO:9和10或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段。在一个或多个实施方案中，所述核酸分子的序列至少包含(5)由SEQ ID NO:9和10或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段的序列。

在一个或多个实施方案中，所述甲基化信息包括与所述核酸分子的序列中可能被甲基化的胞嘧啶相关的信息。优选地，所述可能被甲基化的胞嘧啶是CpG中的C。

在一个或多个实施方案中，所述介质是印有所述序列和/或其甲基化信息的卡片，例如纸质、塑料、金属、玻璃卡片。

在一个或多个实施方案中，所述介质是存储有所述序列和/或其甲基化信息和计算机程序的计算机可读介质，当所述计算机程序被处理器执行时，实现下述步骤：将样品的甲基化测序数据与所述序列比较，从而获得所述样品中含所述序列的核酸分子的存在在、含量和/或甲基化水平。

本发明提供一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的组合物，所述组合物包括引物分子和/或探针分子，所述引物分子和/或探针分子用于检测待检样品中与甲状腺结节良恶性相关的甲基化区域的选自以下的一个或多个基因或其片段：SLC16A3基因，PRR15基因，CDH1基因，TSHR基因和GRIA2基因，以及内参基因。所述片段是对应于各基因的本文所述引物的扩增片段。

在一个或多个实施方案中，所述一个或多个基因至少包含GRIA2。

在一个或多个实施方案中，所述检测是检测甲基化水平。

在一个或多个实施方案中，所述组合物包含本文任一实施方案所述的引物分子和/或探针分子以及任选的核酸分子。

在一个或多个实施方案中，检测所述SLC16A3基因或其片段的引物分子包含SEQID NO:1-2中任一所示序列，检测所述PRR15基因或其片段的引物分子包含SEQ ID NO:3-4中任一所示序列，检测所述CDH1基因或其片段的引物分子包含SEQ ID NO:5-6中任一所示序列，检测所述TSHR基因或其片段的引物分子包含SEQ ID NO:7-8中任一所示序列和检测所述GRIA2基因或其片段的引物分子包含SEQ ID NO:9-10中任一所示序列。

在一个或多个实施方案中，所述内参基因是ACTB。在一个或多个实施方案中，检测内参基因的引物分子包含SEQ ID NO:11-12中任一所示序列。

在一个或多个实施方案中，所述组合物还包括SLC16A3基因的探针，PRR15基因的探针，CDH1基因的探针，TSHR基因的探针和GRIA2基因的探针以及内参基因的探针，所述探针分别识别相应引物分子的扩增片段。优选地，SLC16A3基因的探针包含SEQ ID NO：13所示序列，PRR15基因的探针包含SEQ ID NO：14所示序列，CDH1基因的探针包含SEQ ID NO：15所示序列，TSHR基因的探针包含SEQ ID NO：16所示序列和GRIA2基因的探针包含SEQ ID NO：17所示序列。在一个或多个实施方案中，所述内参基因是ACTB。在一个或多个实施方案中，内参基因的探针包含SEQ ID NO:18所示序列。

本发明还提供一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物分子、任选的探针分子、任选的核酸分子、和任选的记载有核酸分子的序列和/或其甲基化信息的介质，其中，所述引物分子的扩增产物包含选自以下的一个或多个片段：由SEQ ID NO:1和2序列作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段、由SEQ IDNO:3和4序列作为引物扩增得到的PRR15基因的片段、由SEQ ID NO:5和6序列作为引物扩增得到的CDH1基因的片段、由SEQ ID NO:7和8序列作为引物扩增得到的TSHR基因的片段和由SEQ ID NO:9和10序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段；所述探针分子与所述一个或多个片段杂交；所述核酸分子的序列是所述一个或多个片段的序列。

在一个或多个实施方案中，所述引物分子和探针分子如本文任一实施方案所述。

在一个或多个实施方案中，所述引物分子包含SEQ ID NO:1-10中任一所示的序列。

在一个或多个实施方案中，所述探针分子包含SEQ ID NO:13-17中任一所示的序列。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括检测内参基因ACTB的引物和任选的检测内参基因ACTB的探针分子，其中，检测内参基因ACTB的引物能扩增出由SEQ ID NO:11和12序列作为引物扩增得到的ACTB基因的片段，检测内参基因ACTB的探针分子包含SEQ IDNO:18所示序列。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含本文任一实施方案所述的引物分子、任选的本文任一实施方案所述的核酸分子、任选的本文任一实施方案所述的探针分子和任选的本文任一实施方案所述的介质。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括经转化的阳性标准品，其中未甲基化的胞嘧啶转化为不与鸟嘌呤结合的碱基。在一个或多个实施方案中，所述阳性标准品是完全甲基化的。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括选自以下一种或多种的物质：PCR缓冲液、聚合酶、dNTP、限制性内切酶、酶切缓冲液、荧光染料、荧光淬灭剂、荧光报告剂、外切核酸酶、碱性磷酸酶、内标、对照物、KCl、MgCl₂和(NH₄)₂SO₄。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括检测DNA甲基化的试剂，所述试剂是选自以下方法的一个或多个中所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、荧光定量法。

优选地，所述试剂选自以下一种或多种：重亚硫酸盐及其衍生物、荧光染料、荧光淬灭剂、荧光报告剂、内标、对照物。

本发明还提供检测甲基化水平的试剂在制备甲状腺结节良恶性鉴别试剂盒中的应用，所述试剂用于检测DNA样品中的选自以下的一个或多个基因或其片段的甲基化水平：SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2基因，所述鉴别包括根据所述甲基化水平判读甲状腺结节良恶性。所述片段是对应于各基因的本文所述引物的扩增片段。

在一个或多个实施方案中，所述片段选自以下的一种或多种：(1)由SEQ ID NO:1和2或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段；(2)由SEQID NO:3和4或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的PRR15基因的片段；(3)由SEQ ID NO:5和6或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的CDH1基因的片段；(4)由SEQ ID NO:7和8或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的TSHR基因的片段；(5)由SEQ ID NO:9和10或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段。

在一个或多个实施方案中，所述试剂包含本文任一实施方案所述的核酸分子、引物分子、探针分子和/或介质。

在一个或多个实施方案中，所述样品来自哺乳动物的组织、细胞或者体液，例如甲状腺组织或血液。所述哺乳动物优选为人。在一个或多个实施方案中，所述样品是甲状腺结节活检物，优选是细针穿刺活检物。在一个或多个实施方案中，所述样品是血浆。

在一个或多个实施方案中，所述样品来自具有甲状腺良性或恶性结节的对象。在一个或多个实施方案中，所述样品来自甲状腺肿大的患者。

在一个或多个实施方案中，所述DNA是全基因组DNA和/或cfDNA。

在一个或多个实施方案中，所述DNA经转化，其中未甲基化的胞嘧啶转化为不与鸟嘌呤结合的碱基。所述转化使用酶促方法进行，优选脱氨酶处理，或所述转化使用非酶促方法进行，优选用亚硫酸氢盐或重硫酸盐处理。

在一个或多个实施方案中，所述检测包括但不限于：基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、荧光定量法。

在一个或多个实施方案中，所述检测是荧光定量PCR检测，还包括使用本文所述探针。

在一个或多个实施方案中，PCR的反应液包含Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(buffer)、dNTPs、KCl、MgCl₂和(NH₄)₂SO₄。优选地，Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。优选地，Mg²⁺终浓度为1.0-10.0mM。

在一个或多个实施方案中，PCR中各引物浓度为150-600nM。

在一个或多个实施方案中，PCR中各探针浓度为150-350nM。

在一个或多个实施方案中，PCR反应条件为，95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火延伸45s，50个循环。

在一个或多个实施方案中，判读方法为：根据各基因的甲基化水平计算得分，得分大于0则结果为阳性，即甲状腺结节为恶性结节。在一个或多个实施方案中，得分小于0则结果为阴性，即甲状腺结节为良性结节。

优选地，得分＝1.32–0.93×SLC16A3甲基化水平–1.21×PRR15甲基化水平-0.83×CDH1甲基化水平-0.76×TSHR2甲基化水平-1.27×GRIA2甲基化水平。

在PCR实施方案中，优选地，甲基化水平＝2^{–ΔCt待检样品}/2^{–ΔCt阳性标准品}×100％，其中，ΔCt＝Ct_目的基因–Ct_内参基因。

在测序实施方案中，甲基化水平＝甲基化碱基数/总碱基数。

本发明还提供了一种甲状腺结节良恶性鉴别的方法，包括：

(1)获取样品中选自以下一种或多种基因或其片段的甲基化水平，SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2，所述片段是对应于各基因的本文所述引物的扩增片段，

(2)根据(1)的甲基化水平判读甲状腺结节良恶性。

在一个或多个实施方案中，所述方法在步骤(1)之前还包含DNA抽提和/或质检。

在一个或多个实施方案中，所述一种或多种基因优选至少包含GRIA2。

在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括使用本文所述的核酸分子、引物分子、探针分子和/或介质检测样品中所述基因或片段的甲基化水平。

在一个或多个实施方案中，所述DNA是全基因组DNA和/或cfDNA。

在一个或多个实施方案中，PCR的反应液包含Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(buffer)、dNTPs、Mg²⁺。优选地，Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。优选地，Mg²⁺终浓度为1.0-10.0mM。

在一个或多个实施方案中，PCR中各引物浓度为150-600nM。

在一个或多个实施方案中，PCR中各探针浓度为150-350nM。

在一个或多个实施方案中，判读方法为：根据两个基因的甲基化水平计算得分，得分大于0则结果为阳性，即甲状腺结节为恶性结节。在一个或多个实施方案中，得分小于0则结果为阴性，即甲状腺结节为良性结节。

在测序实施方案中，优选地，甲基化水平＝甲基化碱基数/总碱基数。

本发明还提供一种用于鉴别甲状腺结节的的装置，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：(1)获取样品中选自以下一种或多种基因或其片段的甲基化水平，SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2，所述片段是对应于各基因的本文所述引物的扩增片段，(2)根据(1)的甲基化水平判读甲状腺结节良恶性。

在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括使用引物分子、任选的探针分子、任选的核酸分子、和任选的记载有核酸分子的序列和/或其甲基化信息的介质检测样品中所述基因或片段的甲基化水平，其中，所述引物分子的扩增产物包含选自以下的一个或多个片段：由SEQ ID NO:1和2序列作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段、由SEQ ID NO:3和4序列作为引物扩增得到的PRR15基因的片段、由SEQ ID NO:5和6序列作为引物扩增得到的CDH1基因的片段、由SEQ ID NO:7和8序列作为引物扩增得到的TSHR基因的片段和由SEQ ID NO:9和10序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段；所述探针分子与所述一个或多个片段杂交；所述核酸分子的序列是所述一个或多个片段的序列。

在一个或多个实施方案中，所述DNA是全基因组DNA和/或cfDNA。

在一个或多个实施方案中，PCR中各引物浓度为150-600nM。

在一个或多个实施方案中，PCR中各探针浓度为150-350nM。

本发明的主要优点在于：通过同时进行多个靶序列的检测，提高了甲状腺结节良恶性鉴别的灵敏度和特异性。采用PCR法，操作简单，结果易于判读，对仪器要求不高，以试剂盒的形式更方便临床上的推广应用。

附图说明

图1是本发明SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2基因在甲状腺癌和甲状腺良性结节组织DNA中的甲基化水平分析。

图2是本发明SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2联合检测甲状腺癌患者和甲状腺良性结节患者组织DNA甲基化水平的ROC曲线分析。

图3是本发明SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2基因的甲基化水平在甲状腺癌患者血浆和甲状腺良性结节患者血浆cfDNA中的甲基化水平分析。

图4是本发明SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2联合检测甲状腺癌患者和甲状腺良性结节患者血浆cfDNA甲基化水平的ROC曲线分析。

具体实施方式

发明人发现SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2基因的甲基化水平与恶性甲状腺结节相关。因此，本发明提供通过对上述基因中的一个或多个或其片段的甲基化水平进行检测从而鉴别甲状腺结节良恶性的试剂和方法。

本文提及甲状腺结节时，所述“良性”和“恶性”表示甲状腺结节的性质。通常，良性表现为结节生长缓慢、质地均匀、活动度好、表面光滑、呈囊性改变、无淋巴结肿大、无钙化等。恶性表现为不可控的恶性细胞生长、扩散和组织浸润。提示甲状腺结节为恶性的超声征象包括：结节的高度大于宽度、缺乏声晕、微小钙化、边界不规则、回声减低、实性结节、结节内部血流丰富等。在一些实施方式中，恶性甲状腺结节包括甲状腺癌。

本文中，检测DNA甲基化的方法本领域周知，例如基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP))、DNA测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱、荧光定量法。在一个或多个实施方案中，检测包括检测基因或位点处的任一条链。

因此，本发明涉及检测DNA甲基化的试剂。本领域周知上述检测DNA甲基化的方法中所用的试剂。此外，在涉及DNA扩增的检测方法中，检测DNA甲基化的试剂包括引物。所述引物序列为甲基化特异的或非特异的。

示例性地，当使用荧光定量PCR时，检测DNA甲基化的试剂还可包括探针。所述探针的序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。本文中，示例性探针序列如下：

SLC16A3基因探针：

Texas Red-ATGTAAGCGGATATAGAGCGGTAGGGTA-BHQ2

PRR15基因探针：

FAM-CCTCCGAAAACAACGTAACGCGC-BHQ1

CDH1基因探针：

Cy5-CGCCCACCCGACCTCGCAT-BHQ2

TSHR基因探针：

Texas Red-ACAACACCAACTACAACAAATCCGCCGA-BHQ2

GRIA2基因探针：

Cy5-AAAACGCTTCGCCGCCAACA-BHQ2

内参基因探针：

VIC-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1。

通常，PCR的反应液包含Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(buffer)、dNTPs、Mg²⁺。优选地，Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。示例性地，Mg²⁺终浓度为1.0-10.0mM；各引物浓度为150-600nM；各探针浓度为150-350nM；PCR反应条件为，95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火延伸54s，50个循环。

如本文所述，DNA或RNA的碱基之间可发生转化。本文所述“转化”、“胞嘧啶转化”或“CT转化”是利用非酶促或酶促方法处理DNA，将未修饰的胞嘧啶碱基(cytosine,C)转化为不与鸟嘌呤结合的碱基(例如尿嘧啶碱基(uracil,U))的过程。本领域周知进行胞嘧啶转化的非酶促或酶促方法。示例性地，非酶促方法包括亚硫酸氢盐或重硫酸盐处理，例如亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重硫酸钾和重硫酸铵等。示例性地，酶促方法包括脱氨酶处理。经转化的DNA任选经纯化。适用于本文的DNA纯化方法本领域周知。

本文术语“变体”或“突变体”是指与参照序列相比，通过一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代使核酸序列发生变化同时保留其与其他核酸杂交能力的多核苷酸。本文任一实施方案所述的突变体包括与参照序列具有至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参照序列的生物学活性的核苷酸序列。可采用例如NCBI的BLASTn计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括在参照序列的核苷酸序列中具有一个或多个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留参照序列生物学活性的核苷酸序列。所述多个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代可以是嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸之间的取代，也可以是嘌呤核苷酸之间或嘧啶核苷酸之间的取代。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的核苷酸进行保守性取代时，通常不会改变多核苷酸的稳定性和功能。保守性取代例如嘌呤核苷酸之间的(A与G)的互换，嘧啶核苷酸之间的(T或U与C)的互换。因此，在本发明多核苷酸中用来自同一残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。此外，本发明的变体中的甲基化位点(例如连续的CG)未发生突变。即本发明方法检测的是相应序列中的可甲基化位点的甲基化情况，对于非可甲基化位点的碱基可以发生突变。

本发明还提供一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括引物分子和任选的探针分子，其中，所述引物分子能扩增出由SEQ ID NO:1和2序列作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段、由SEQ ID NO:3和4序列作为引物扩增得到的PRR15基因的片段、由SEQ ID NO:5和6序列作为引物扩增得到的CHD1基因的片段、由SEQ ID NO:7和8序列作为引物扩增得到的TSHR基因的片段、和由SEQ ID NO:9和10序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段，所述探针分子包含SEQ ID NO:13、14、15、16和17所示的序列。所述试剂盒还可包括检测内参基因ACTB的引物和任选的检测内参基因ACTB的探针分子，其中，检测内参基因ACTB的引物能扩增出由SEQ ID NO:11和12序列作为引物扩增得到的ACTB基因的片段，检测内参基因ACTB的探针分子包含SEQ ID NO:18所示序列。

所述试剂盒还可包括经转化的阳性标准品，其中未甲基化的胞嘧啶转化为不与鸟嘌呤结合的碱基。所述阳性标准品可以是完全甲基化的。所述试剂盒还可包括PCR反应试剂。优选地，所述PCR反应试剂包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(buffer)、dNTPs、Mg²⁺。试剂盒还可包括检测DNA甲基化的试剂，所述试剂是选自以下方法的一个或多个中所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、荧光定量法。所述试剂可选自以下一种或多种：重亚硫酸盐及其衍生物、荧光染料、荧光淬灭剂、荧光报告剂、内标、对照物。

本发明还提供了一种甲状腺结节良恶性鉴别的方法，包括：(1)用本文所述引物检测样品中DNA的SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2的甲基化水平，和(2)根据(1)的甲基化水平判读甲状腺结节良恶性。通常，所述方法在步骤(1)之前还包括DNA抽提和/或质检。

在一个或多个实施方案中，甲状腺结节良恶性判读过程为：对所测基因的甲基化水平进行数学分析，计算得分，当得分满足某一阈值时，则鉴定为恶性结节。本领域知晓常规数学分析的方法以及确定阈值的过程，示例性的方法是二元Logistic回归分析。通常，该阈值为0。即，得分大于0则结果为阳性，即甲状腺结节为恶性结节。在一个或多个实施方案中，得分小于0则结果为阴性，即甲状腺结节为良性结节。优选地，通过下述公式计算得分：得分＝1.32–0.93×SLC16A3甲基化水平–1.21×PRR15甲基化水平-0.83×CDH1甲基化水平-0.76×TSHR2甲基化水平-1.27×GRIA2甲基化水平。，其中得分≥0则甲状腺结节为恶性；得分<0则甲状腺结节为良性。

本领域知晓甲基化水平的计算方法。示例性地，在通过PCR检测甲基化的实施方案中，甲基化水平＝2^{–ΔCt待检样品}/2^{–ΔCt阳性标准品}×100％，其中ΔCt＝Ct_目的基因–Ct_内参基因。或者，在通过测序检测甲基化的实施方案中，甲基化水平＝甲基化碱基数/总碱基数。

本文中，样品来自哺乳动物，优选人。样品可来自任何器官(例如甲状腺)、组织(例如上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织)、细胞(例如甲状腺结节活检物)或者体液(例如血液、血浆、血清、组织液、尿液)。通常，只要所述样品包含基因组DNA或cfDNA(Circulating free DNA or Cell free DNA)即可。示例性地，所述样品是甲状腺结节活检物，优选是细针穿刺活检物。或者，所述样品是血浆、血液或血清。

在一个具体实施方案中，所述方法包括：(1)样本准备：包括DNA抽提、质检；(2)DNA转化：对步骤(1)得到的DNA进行重亚硫酸盐转化，未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)经过转化变为尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶转化后不发生改变；(3)反应混合液准备：包括PCR反应液，引物混合物，探针混合物；(4)PCR混合物准备：向步骤(3)中加入步骤(2)重亚硫酸盐转化的模板DNA，以及阳性标准品、阴性对照或者非模板对照(NTC)；(5)PCR反应：进行PCR反应，收集荧光。所述PCR反应液包括：Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(buffer)、dNTPs、Mg²⁺；Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶；Mg²⁺终浓度为1.0-10.0mM。引物混合物为待扩增基因引物组成的混合物，其中每一条引物终浓度为150-600nM。探针混合物为待扩增基因探针组成的混合物，其中每一条探针终浓度为150-350nM。PCR反应条件为，95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火延伸45s，50个循环。

以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例

实施例1，验证甲状腺结节良恶性与组织基因组DNA甲基化的关系。

申请人对20例甲状腺癌患者和20例甲状腺良性结节患者的组织进行基因组DNA甲基化特异的PCR，发现SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2基因在甲状腺癌和甲状腺良性结节病例的基因组DNA甲基化水平具有差异，结果如图1所示。具体实验步骤如下：

1.1，样本准备

使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，货号：51304)对20例甲状腺癌和20例甲状腺良性结节的组织(甲状腺结节活检组织)DNA进行抽提；使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，货号：Q32854)检测DNA的浓度；使用1％琼脂糖凝胶电泳进行质检。

1.2，DNA转化

使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo，货号：MECOV50)对步骤1得到的DNA进行重亚硫酸盐转化，未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)经过转化变为尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶转化后不发生改变。

1.3，PCR混合物准备

使用本发明提供的试剂盒，包括PCR反应液、引物混合物(SEQ ID NO:1-12)、探针混合物(SEQ ID NO:13-18)，进行单个样本的配制如表1和表2：

表1，PCR反应体系组成

表2，PCR反应体系组成

组分	体积(μl)
		2x PCR反应液	10
Water	3.16
		内参基因F,100μM	0.12
内参基因R,100μM	0.12
		TSHR基因F,100μM	0.12
TSHR基因R,100μM	0.12
		GRIA2基因F,100μM	0.12
GRIA2基因R,100μM	0.12
		内参基因探针,100μM(VIC/BHQ1)	0.04
TSHR基因探针,100μM(FAM/BHQ1)	0.04
		GRIA2基因探针,100μM(Texas/BHQ2)	0.04
样本DNA(10ng)/阳性对照/阴性对照	6
		总体积	20

引物序列如下：

SLC16A3基因正向引物F：

GTAAATGAGGTTTGTGTGTTTGTTT(SEQ ID NO:1)，

SLC16A3基因反向引物R：

ACCTCTAACCCCCGCAAAC(SEQ ID NO:2)，

PRR15基因正向引物F：

TCCTCCGAAAACCTACCCG(SEQ ID NO:3)，

PRR15基因反向引物R：

AAGATTTCGCGTTTCGGTCG(SEQ ID NO:4)，

CDH1基因正向引物F：

AATTTTAGGTTAGAGGGTTATCGCG(SEQ ID NO:5)，

CDH1基因反向引物R：

TCCCCAAAACGAAACTAACGAC(SEQ ID NO:6)，

TSHR基因正向引物F：

GGAGGATGGAGAAATAGTTTCGA(SEQ ID NO:7)，

TSHR基因反向引物R：

GCCCAAATCCCTAAACAAATCG(SEQ ID NO:8)，

GRIA2基因正向引物F：

TGTTGTGTAGAAGTCGAATTGT(SEQ ID NO:9)，

GRIA2基因反向引物R：

TATAACRTAAAACAACAAAACCTAAT(SEQ ID NO:10)。

内参基因正向引物F：

TGGAGGAGGTTTAGTAAGTTTTTTG(SEQ ID NO:11)，

内参基因反向引物R：

CCTCCCTTAAAAATTACAAAAACCA(SEQ ID NO:12)。

探针序列如下：

SLC16A3基因探针：ATGTAAGCGGATATAGAGCGGTAGGGTA(SEQ ID NO:13)

PRR15基因探针：CCTCCGAAAACAACGTAACGCGC(SEQ ID NO:14)

CDH1基因探针：CGCCCACCCGACCTCGCAT(SEQ ID NO:15)

TSHR基因探针：ACAACACCAACTACAACAAATCCGCCGA(SEQ ID NO:16)

GRIA2基因探针：AAAACGCTTCGCCGCCAACA(SEQ ID NO:17)

内参基因探针：ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA(SEQ ID NO:18)。

1.4，荧光定量PCR

设置PCR程序为95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火延伸45s，50个循环。60℃退火延伸阶段收集荧光信号。

1.5，检测结果分析

利用下式计算各样品中基因的甲基化水平：

甲基化水平＝2^{–ΔCt待检样品}/2^{–ΔCt阳性标准品}×100％。

ΔCt＝Ct_目的基因–Ct_内参基因。

SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2基因在组织基因组中甲基化水平如图1所示；ROC曲线分析如图2所示。根据本发明试剂盒提供的判读标准，对甲状腺良性结节和恶性结节组织样品的诊断特异性为90％，灵敏度为85％。

实施例2，验证甲状腺结节良恶性与血浆中cfDNA甲基化的关系

申请人对196例甲状腺癌患者和148例甲状腺良性结节患者的血浆cfDNA进行甲基化特异的PCR，发现SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2基因在甲状腺癌和甲状腺良性结节病例血浆cfDNA的甲基化水平具有差异，结果如图3所示。具体实验步骤如下：

2.1，样本准备(同1.1样本准备)

2.2，DNA转化(同1.2DNA转化)

2.3，PCR混合物准备(同1.3PCR混合物准备)

2.4，荧光定量PCR(同1.4荧光定量PCR)

2.5，检测结果分析

利用下式和实施例2中的公式计算各样品基因的甲基化水平和得分：

甲基化水平＝2^{–ΔCt待检样品}/2^{–ΔCt阳性标准品}×100％。

ΔCt＝Ct_目的基因–Ct_内参基因。

得分＝1.32–0.93×SLC16A3甲基化水平–1.21×PRR15甲基化水平-0.83×CDH1甲基化水平-0.76×TSHR2甲基化水平-1.27×GRIA2甲基化水平。

SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2基因在cfDNA中甲基化水平如图3所示；ROC曲线分析如图4所示。根据本发明试剂盒提供的判读标准，对甲状腺良性结节和恶性结节患者的血浆样品的诊断特异性为87％，灵敏度为65％。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海鹍远生物技术有限公司

<120> 甲状腺结节良恶性相关标志物及其应用

<130> 206509

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gtaaatgagg tttgtgtgtt tgttt 25

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

acctctaacc cccgcaaac 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tcctccgaaa acctacccg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aagatttcgc gtttcggtcg 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aattttaggt tagagggtta tcgcg 25

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tccccaaaac gaaactaacg ac 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ggaggatgga gaaatagttt cga 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gcccaaatcc ctaaacaaat cg 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tgttgtgtag aagtcgaatt gt 22

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tataacrtaa aacaacaaaa cctaat 26

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

tggaggaggt ttagtaagtt ttttg 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

cctcccttaa aaattacaaa aacca 25

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

atgtaagcgg atatagagcg gtagggta 28

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cctccgaaaa caacgtaacg cgc 23

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

cgcccacccg acctcgcat 19

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

acaacaccaa ctacaacaaa tccgccga 28

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

aaaacgcttc gccgccaaca 20

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims

1.一种分离的核酸分子，包含选自以下的一种或多种片段：

(1)由SEQ ID NO:1和2或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段；

(2)由SEQ ID NO:3和4或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的PRR15基因的片段；

(3)由SEQ ID NO:5和6或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的CDH1基因的片段；

(4)由SEQ ID NO:7和8或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的TSHR基因的片段；

(5)由SEQ ID NO:9和10或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段，

优选地，所述核酸分子至少包含由SEQ ID NO:9和10或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段，

优选地，所述片段中未甲基化的胞嘧啶被转化为不与鸟嘌呤结合的碱基。

2.引物分子，具有选自以下的任意一种、两种、三种、四种或五种序列：

(1)SEQ ID NO:1和2所示的序列或与由SEQ ID NO:1和2作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段在严谨条件下杂交的序列；

(2)SEQ ID NO:3和4所示的序列或与由SEQ ID NO:3和4作为引物扩增得到的PRR15基因的片段在严谨条件下杂交的序列；

(3)SEQ ID NO:5和6所示的序列或与由SEQ ID NO:5和6作为引物扩增得到的CDH1基因的片段在严谨条件下杂交的序列；

(4)SEQ ID NO:7和8所示的序列或与由SEQ ID NO:7和8作为引物扩增得到的TSHR基因的片段在严谨条件下杂交的序列；

(5)SEQ ID NO:9和10所示的序列或与由SEQ ID NO:9和10作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段在严谨条件下杂交的序列，

优选地，所述引物分子至少包含(5)SEQ ID NO:9和10所示的序列或与由SEQ ID NO:9和10作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段在严谨条件下杂交的序列。

3.如权利要求2所述的引物分子，其特征在于，所述引物分子能扩增出选自以下的一个或多个片段：(1)由SEQ ID NO:1和2或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段；(2)由SEQ ID NO:3和4或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的PRR15基因的片段；(3)由SEQ ID NO:5和6或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的CDH1基因的片段；(4)由SEQ ID NO:7和8或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的TSHR基因的片段；(5)由SEQ ID NO:9和10或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段，

优选地，所述引物分子包含SEQ ID NO:1-10中任一项所述的序列或与其具有至少90％序列相同性的变体。

4.探针分子，所述探针分子与权利要求1所述的核酸分子在严谨条件下杂交，或包含能与权利要求1所述的核酸分子杂交的序列，

更优选地，所述探针分子包含SEQ ID NO:13-17中任一所示的序列或与其有至少90％相同性的序列。

5.记载有核酸分子的序列和/或其甲基化信息的介质，所述核酸分子如权利要求1所述，所述介质用于与基因甲基化测序数据比对以确定所述核酸分子的存在、含量和/或甲基化水平，

优选地，所述甲基化信息包括与所述核酸分子的序列中可能被甲基化的胞嘧啶相关的信息，

优选地，所述介质是印有所述序列和/或其甲基化信息的卡片，例如纸质、塑料、金属、玻璃卡片，

优选地，所述介质是存储有所述序列和/或其甲基化信息和计算机程序的计算机可读介质，当所述计算机程序被处理器执行时，实现下述步骤：将样品的甲基化测序数据与所述序列比较，从而获得所述样品中含所述序列的核酸分子的存在在、含量和/或甲基化水平。

6.用于甲状腺结节良恶性鉴别的组合物，其特征在于，所述组合物包括引物分子和/或探针分子，所述引物分子和/或探针分子用于检测待检样品中与甲状腺结节良恶性相关的甲基化区域的选自以下的一个或多个基因或其片段：SLC16A3基因，PRR15基因，CDH1基因，TSHR基因和GRIA2基因，

优选地，所述片段选自以下的一个或多个片段：(1)由SEQ ID NO:1和2或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的SLC16A3基因的片段；(2)由SEQ ID NO:3和4或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的PRR15基因的片段；(3)由SEQ ID NO:5和6或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的CDH1基因的片段；(4)由SEQ ID NO:7和8或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的TSHR基因的片段；(5)由SEQ ID NO:9和10或与其有至少90％相同性的序列作为引物扩增得到的GRIA2基因的片段，

更优选地，所述引物分子如权利要求2或3所述，所述探针分子如权利要求3所述。

7.一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物分子、任选的探针分子、任选的核酸分子、和任选的记载有核酸分子的序列和/或其甲基化信息的介质，用于检测待检样品中与甲状腺结节良恶性相关的甲基化区域的选自以下的一个或多个基因或其片段：SLC16A3基因，PRR15基因，CDH1基因，TSHR基因和GRIA2基因，

更优选地，所述引物分子如权利要求2或3所述，所述探针分子如权利要求3所述，所述核酸分子如权利要求1所述，所述介质如权利要求4所述。

8.检测甲基化水平的试剂在制备甲状腺结节良恶性鉴别试剂盒中的应用，所述试剂用于检测DNA样品中的选自以下的一个或多个基因或其片段的甲基化水平：SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2基因，所述鉴别包括根据所述甲基化水平判读甲状腺结节良恶性，

优选地，所述样品来自哺乳动物的组织、细胞或者体液，

更优选地，所述试剂包含核酸分子、引物分子、探针分子和/或记载有核酸分子的序列和/或其甲基化信息的介质，所述核酸分子的序列是所述一个或多个片段的序列。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述引物分子如权利要求2或3所述，所述探针分子如权利要求3所述，所述核酸分子如权利要求1所述，所述介质如权利要求4所述。

10.一种用于鉴别甲状腺结节的的装置，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：(1)获取样品中选自以下一种或多种基因或其片段的甲基化水平，SLC16A3、PRR15、CDH1、TSHR和GRIA2，(2)根据(1)的甲基化水平判读甲状腺结节良恶性，

优选地，所述样品来自哺乳动物的组织、细胞或者体液，

优选地，步骤(1)包括使用引物分子、任选的探针分子、任选的核酸分子、和任选的记载有核酸分子的序列和/或其甲基化信息的介质检测样品中所述基因或片段的甲基化水平，其中，所述核酸分子的序列是所述一个或多个片段的序列。