CN114235763B - 一种检测汞离子（Hg2+）的生物传感器 - Google Patents

一种检测汞离子（Hg2+）的生物传感器 Download PDF

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Abstract

本发明属于传感器技术领域，提供了一种检测汞离子的生物传感器，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑7所示的发夹探针H1、H2和H3，T1和T2，挂锁探针TP、连接探针LP，和银簇，T4连接酶，Exo I酶，Exo III酶，phi29 DNA聚合酶。该传感器具有灵敏度高，检测限低，检测速度快等优点，可以弥补汞离子现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

Description

一种检测汞离子（Hg2+）的生物传感器
技术领域
本发明属于传感器技术领域，特别涉及一种检测汞离子的核酸适配体生物传感器。
背景技术
汞离子（Hg2+）是环境化学和分析化学中非常重要的重金属离子，具有很强的毒性，对生物特别是人类有着巨大的威胁。由于其具有生物蓄积性，即使是极微量的汞也对人体健康和环境都具有剧毒作用。金属汞中毒常以汞蒸气的形式引起。由于汞蒸气具有高度的扩散性和较大的脂溶性，通过呼吸道进入肺泡，经血液循环运至全身。血液中的金属汞进入脑组织后，被氧化成汞离子，逐渐在脑组织中积累，达到一定的量，就会对脑组织造成损害，另外汞离子还能够转移到肾脏。人体中积累的Hg2 +可能对肾脏，大脑，肺部，免疫系统和中枢神经系统产生不良影响。水中即使是少量的Hg2+也会对人体造成不可逆转的损害，产生头痛、低烧、肾上腺素激增、睡眠障碍等症状。
因此，开发快速、低成本、高灵敏度和选择性的快速检测活水中的Hg2+显得尤为重要。
发明内容
为了实现更加快速、低成本的检测汞离子，本发明提出了一种基于链置换和滚换扩增的核酸适配体检测汞离子的生物传感器。
一种检测汞离子的生物传感器，包括：
a）核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-7所示的发夹探针H1、H2和H3，T1和T2，挂锁探针TP、连接探针LP，和
b）银簇，T4连接酶，Exo I酶，Exo III酶，phi29 DNA聚合酶；
所述挂锁探针TP的5’端磷酸化；
所述发夹探针H3第21位为腺嘌呤核糖核苷酸。
优选地，所述挂锁探针TP和连接探针LP由成环的核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所述的成环的环状模板CT代替，且不含T4连接酶、Exo I酶和Exo III酶。
更优选地，所述环状模板CT的制备方法如下：
等摩尔的挂锁探针TP和连接探针LP在缓冲溶液中于95℃下孵育5min，冷却至室温后，加入T4连接酶，16℃下孵育过夜，然后在65℃下10min灭活酶，加入Exo I酶、Exo III酶，在37℃下消化2h，之后在85℃下20min灭活酶，获得环状模板CT。
优选地，所述发卡探针H3和银簇由H3-银簇代替。
更优选地，所述H3-银簇的制备方法如下：
将发卡探针H3缓冲溶液与AgNO3溶液按照两者摩尔比1:6在4 ℃下加入NaBH4进行还原反应，得到H3-银簇；
所述NaBH4与AgNO3摩尔比为1:1。
优选地，所述传感器中还包括汞离子标准品和/或缓冲溶液。
上述生物传感器可用于制备检测汞离子试剂盒。
上述生物传感器或试剂盒在检测汞离子中的应用。
具体地，上述应用包括以下步骤：
（1）以挂锁探针TP和连接探针LP制备环状模板CT；
（2）发夹探针H3和银簇制备H3-银簇；
（3）将T1和T2，待测样品，发夹探针H1、H2，H3-银簇，dNTP，环状模板CT，phi29 DNA聚合酶加入到均相中，混和均匀后孵育，获得反应液；
（4）反应液进行荧光检测。
优选地，步骤（3）中还包括制备目标物标准曲线的步骤。
优选地，步骤（4）中，荧光检测的激发波长为425 nm，检测波长为560nm。
本发明的检测原理如下：
本发明的传感器在对汞离子进行检测时用到以下序列：
T1：5’-CCTTCTACCAGCT-3’
T2：5’-CGTACATGTGTTGG-3’
挂锁探针TP：
5’-P-GTAATCATGTAACTATTTCGACCGGCTCGGAGAAGAGATTTTTTACTATTTCGACCGGCTCGGAGAAGAGATAAGTAGA-3’
连接探针LP：5’-TACATGATTACTCTACTTA-3’
H1：5’-AGCTGGTCATGTACGCTACATGCGAGCTTTTCGTACATGATTACT-3’
H2：5’- AGCTCGCATGTAGCGTACATGACCAGCTTTTCGCTACATGATTACT-3’
H3：5’-CGTACATGACCAGCTACTAT（rA）GGAAGAGACATGTACGCCCTTAATCCCC-3’。
如图1所示，当反应体系中存在目标物汞离子（Hg2+）时，可以和T1、T2链形成稳定的T-Hg2+-T结构，加入发夹H1后，T-Hg2+-T结构的toehold端打开发夹H1并与之杂交，加入发夹H2后，发夹H2也被打开，并形成H1-H2结构，T-Hg2+-T结构进行循环；
在H1-H2结构体系中加入环状模板CT，再加入银簇修饰的发夹探针H3，通过滚环扩增以及发夹探针H3上的特定切割位点，切割形成释放带有银簇的输出链和用于再循环的T1和T2链，通过测定输出链的荧光检测汞离子浓度。
本发明具有以下优点：
本发明基于核酸适配体与目标物之间的特异性的组成T-Hg2+-T结构，利用链置换和滚换扩增相结合实现目标循环放大，从而实现对目标物灵敏检测的生物传感器。该传感器具有灵敏度高，检测限低，检测速度快等优点，可以弥补汞离子现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
该传感器利用了汞离子可以形成稳定的T-Hg2+-T结构的特性进行检测；利用了链置换和滚换扩增，起到了信号放大的作用，提高了检测的灵敏度；该传感器的反应条件温和，反应速度快；制备过程的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求；制备方法简单，性能稳定，适用于食品、土壤及饮用水中Hg2+的检测；检测原理的主要过程均是在均相溶液中实现的，反应速度快，操作简单，实现了目标物的灵敏检测。
附图说明
图1为本发明的检测原理图；
图2为phi29 DNA聚合酶的浓度优化结果图；
图3为发夹探针H3的浓度优化结果图；
图4为孵育时间优化结果图；
图5为传感器检测汞离子的工作曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 phi29 DNA聚合酶的优化
（1）按照核苷酸序列如SEQ ID NO: 6-7分别合成模板探针TP和连接探针LP，然后按照以下方法制备环状模板CT：
将模板探针TP和连接探针LP配制成等摩尔浓度的溶液，然后按照体积比1:1混合，加入10×T4 DNA连接酶缓冲溶液并加水稀释，95℃加热5 min，然后冷却至室温完成杂交，然后添加按照底物浓度0.3U/mol添加T4 DNA连接酶，在16℃下反应20小时；之后，反应体系在65℃温度条件下水浴15分钟，灭活体系中的T4 DNA连接酶；
然后分别加入20 U核酸外切酶I和200 U的核酸外切酶III，37℃下反应2 h；再将反应体系85℃水浴加热10 min，获得环状模板CT，4℃条件下保藏备用；
（2）按照核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-3分别合成链状发卡探针H1-3，然后按照以下方法制备发卡状探针：将链状发卡探针稀释成溶液，在95℃水浴锅加热5 min，自然冷却至室温得到发卡探针H1-3，4℃条件下保藏备用；
将15 μL 100 μM发卡探针H3与73 μL的20 mM PBS缓冲溶液（pH=7.0）混合，然后加入6 μL 1.5 mM AgNO3溶液，在4 ℃下冷却15 min后，加入6 μL 1.5 mM NaBH4剧烈摇晃1min，在4 ℃黑暗中还原6 h，得到H3-银簇；
（3）合成T1和T2并用水稀释，然后在灭菌的EP管中加入3 µL T1（1 µM）、3 µL T2（1µM）、3 µL Hg2+溶液（1×103 fM）、3 µL H1（1 µM）、3 µL H2（1 µM）、3 µL H3-银簇H3（1 µM）、3 μL环状模板CT（100 nM）、3 µL dNTP（1 mM）、3 µL phi29 DNA聚合酶（浓度分别为0.2 U/µL，0.4 U/µL，0.6 U/µL，0.8 U/µL，1.0 U/µL，1.2 U/µL，1.4 U/µL）和3 µL NEBuffer 2（1×），震荡混合，放入37℃的恒温水浴锅孵育1.5 h，获得反应液；
（4）将反应液稀释至100 µL，以425 nm为激发波长，检测560nm处荧光信号变化，检测目标物；
结果见图2，从图中可以看出，随着phi29 DNA聚合酶浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在phi29 DNA聚合酶的浓度达到1.0 U/µL之后，荧光强度基本不变，说明最适的phi29 DNA聚合酶浓度是1.0 U/µL。
实施例2 发夹探针H3浓度的优化
按照实施1中步骤进行发夹探针H3浓度的筛选，不同在于：
（2）将15 μL发卡探针H3（终浓度分别为2 µM，4 µM，6 µM，8 µM，10 µM，12 µM、14 µM）与73 μL的20 mM PBS缓冲溶液（pH=7.0）混合，然后加入6 μL 1.5 mM AgNO3溶液，在4 ℃下冷却15 min后，加入6 μL 1.5 mM NaBH4剧烈摇晃1 min，在4 ℃黑暗中还原6 h，得到H3-银簇；
结果见图3，从图中可以看出，随着发卡探针H3浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在发卡探针H3的浓度达到10 µM之后，荧光强度基本不变，说明最适的发卡探针H3浓度是10 µM。
实施例3 孵育时间的优化
按照实施1中步骤进行孵育时间的筛选，不同在于：
（3）在灭菌的EP管中加入3 µL T1（1 µM）、3 µL T2（1 µM）、3 µL Hg2+溶液（1×103 fM）、3 µL H1（1 µM）、3 µL H2（1 µM）、3 µL H3-银簇（终浓度1.0 µM）、3 μL环状模板CT（100nM）、3 µL dNTP（1 mM）、3 µL phi29 DNA聚合酶（终浓度为1.0 U/µL）和3 µL NEBuffer 2（1×），震荡混合，放入37℃的恒温水浴锅孵育30 min，45 min，60min，75 min，90 min，105min，120min，获得反应液；
结果见图4，从图中可以看出，随着孵育时间的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在孵育时间达到90 min之后，荧光强度基本不变，说明最适的孵育时间是90 min。
应用例1 生物传感器对汞离子的检测
（1）按照核苷酸序列如SEQ ID NO: 6-7分别合成模板探针TP和连接探针LP，然后按照以下方法制备环状模板CT：
将模板探针TP和连接探针LP配制成等摩尔浓度的溶液，然后按照体积比1:1混合，加入10×T4 DNA连接酶缓冲溶液并加水稀释，95℃加热5 min，然后冷却至室温完成杂交，然后添加按照底物浓度0.3U/mol添加T4 DNA连接酶，在16℃下反应20小时；之后，反应体系在65℃温度条件下水浴15分钟，灭活体系中的T4 DNA连接酶；
然后分别加入20 U核酸外切酶I和200 U的核酸外切酶III，37℃下反应2 h；再将反应体系85℃水浴加热10 min，获得环状模板CT，4℃条件下保藏备用；
（2）按照核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-3分别合成链状发卡探针H1-3，然后按照以下方法制备发卡状探针：将链状发卡探针稀释成溶液，在95℃水浴锅加热5 min，自然冷却至室温得到发卡探针H1-3，4℃条件下保藏备用；
将15 μL 100 μM发卡探针H3与73 μL的20 mM PBS缓冲溶液（pH=7.0）混合，然后加入6 μL 1.5 mM AgNO3溶液，在4 ℃下冷却15 min后，加入6 μL 1.5 mM NaBH4剧烈摇晃1min，在4 ℃黑暗中还原6 h，得到H3-银簇；
（3）合成T1和T2并用水稀释，然后在灭菌的EP管中加入3 µL T1（1 µM）、3 µL T2（1µM）、3 µL Hg2+溶液（浓度分别为0pM、1 pM、5 pM、10 pM、50 pM、100 pM、500pM、1000 pM、5000 pM）、3 µL H1（1 µM）、3 µL H2（1 µM）、3 µL H3-银簇（终浓度1.0 µM）、3 μL环状模板CT（100 nM））、3 µL dNTP（1 mM）、3 µL phi29 DNA聚合酶（终浓度为1.0 U/µL）和3 µLNEBuffer 2（1×），震荡混合，放入37℃的恒温水浴锅孵育1.5 h，获得反应液；
（4）将反应液稀释至100 µL，以425 nm为激发波长，检测560 nm处荧光信号变化，检测目标物；
结果如图5所示，图中我们可以看到，检测到的化学发光强度峰值随着Hg2+浓度的增大而增大，当浓度超过1000 pg/mL后，荧光强度趋于稳定，因此，Hg2+的最大检测浓度为1000 pg/mL。在Hg2+的浓度在1 nM到1×104 nM的对数与荧光强度值的大小成正比关系，检测范围超过了3个数量级，其线性方程是：F=0.03071+0.01697×log C，R2为0.996，其中，F是荧光信号在560 nm处的特征吸收峰，C为目标物Hg2+的浓度（nM），根据三倍标准差加上空白响应计算得出最低检测限是0.168 nM。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种检测汞离子（Hg2+）的生物传感器
<130> 20211124-2
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T1
<400> 1
ccttctacca gct 13
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2
<400> 2
cgtacatgtg ttgg 14
<210> 3
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TP
<400> 3
gtaatcatgt aactatttcg accggctcgg agaagagatt ttttactatt tcgaccggct 60
cggagaagag ataagtaga 79
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LP
<400> 4
tacatgatta ctctactta 19
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1
<400> 5
agctggtcat gtacgctaca tgcgagcttt tcgtacatga ttact 45
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H2
<400> 6
agctcgcatg tagcgtacat gaccagcttt tcgctacatg attact 46
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H3
<400> 7
cgtacatgac cagctactat aggaagagac atgtacgccc ttaatcccc 49

Claims (5)

1.一种检测汞离子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以挂锁探针TP和连接探针LP制备环状模板CT；
挂锁探针TP的序列为：
5’-P-GTAATCATGTAACTATTTCGACCGGCTCGGAGAAGAGATTTTTTACTATTTCGACCGGCTCGGAGAAGAGATAAGTAGA-3’；
连接探针LP的序列为：
5’-TACATGATTACTCTACTTA-3’；
（2）发夹探针H3和银簇制备H3-银簇；
发夹探针H3的序列为：
5’-CGTACATGACCAGCTACTAT（rA）GGAAGAGACATGTACGCCCTTAATCCCC-3’；
（3）将T1和T2，待测样品，发夹探针H1、H2，H3-银簇，dNTP，环状模板CT，phi29 DNA聚合酶加入到均相中，混和均匀后孵育，获得反应液；
T1的序列为：
5’-CCTTCTACCAGCT-3’；
T2的序列为：
5’-CGTACATGTGTTGG-3’
发夹探针H1的序列为：
5’-AGCTGGTCATGTACGCTACATGCGAGCTTTTCGTACATGATTACT-3’；
发夹探针H2的序列为：
5’-AGCTCGCATGTAGCGTACATGACCAGCTTTTCGCTACATGATTACT-3’；
（4）反应液进行荧光检测；
当反应体系中存在目标物汞离子Hg2+时，Hg2+和T1、T2链形成稳定的T-Hg2+-T结构，加入发夹H1后，T-Hg2+-T结构的toehold端打开发夹H1并与之杂交，加入发夹H2后，发夹H2也被打开，并形成H1-H2结构，T-Hg2+-T结构进行循环；
在H1-H2结构体系中加入环状模板CT，再加入银簇修饰的发夹探针H3，通过滚环扩增以及发夹探针H3上的特定切割位点，切割形成释放带有银簇的输出链和用于再循环的T1和T2链，通过测定输出链的荧光检测汞离子浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括制备目标物标准曲线的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，荧光检测的激发波长为425nm，检测波长为560nm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，环状模板CT的制备方法如下：等摩尔的挂锁探针TP和连接探针LP在缓冲溶液中于95℃下孵育5min，冷却至室温后，加入T4连接酶，16℃下孵育过夜，然后在65℃下10min灭活酶，加入Exo I酶、Exo III酶，在37℃下消化2h，之后在85℃下20min灭活酶，获得环状模板CT。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，H3-银簇的制备方法如下：将发卡探针H3缓冲溶液与AgNO3溶液按照发卡探针H3与AgNO3摩尔比为1:6在4℃下加入NaBH4进行还原反应，得到H3-银簇；所述NaBH4与AgNO3摩尔比为1:1。
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