CN114230565B - 5-取代吲哚3-酰胺衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及5‑取代吲哚3‑酰胺衍生物制备方法及其用途，属于医药领域。本发明提供了式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐。该类化合物能够显著抑制RIPK1激酶的活力，而且选择性较高，安全性良好，是一种RIPK1激酶抑制剂，可以作为包括但不限于炎症、免疫性疾病、肿瘤和神经退行性疾病等的潜在治疗药物。TNFα诱导的SIRS模型实验证明，本发明化合物能够在体内发挥抑制RIPK1激酶的作用，药代动力学结果显示该系列化合物具有良好药代动力学性质。本发明为靶向RIPK1的疾病治疗提供了一种新的策略和手段。

Description

5-取代吲哚3-酰胺衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及5-取代吲哚3-酰胺衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
细胞程序性坏死(necroptosis/programmed necrosis)是近年来发现的一种不同于凋亡的、新的caspase非依赖性的细胞程序性死亡方式。它受死亡信号调控，呈现坏死样结构特点。与凋亡相比，细胞程序性坏死不形成凋亡小体，染色质不凝聚；与坏死相比，细胞程序性坏死是受多种基因调控的受控细胞死亡方式。体外培养体系中加入caspase抑制剂Z-VAD-FMK后，采用TNF可诱导细胞发生程序性坏死，细胞呈现坏死的形态特征为细胞肿胀、破裂、释放细胞内容物，继而引起炎症和免疫应答。除TNF外，TLR3和TLR4的配体，某些细菌、病毒感染等均可引起细胞发生细胞程序性坏死。
受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)是一种具有特异性丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白，具有类似于其他蛋白激酶的N-末端激酶结构域，但具有不同的结合结构域。研究表明，RIPK1是细胞程序性坏死的关键调控因子，它通过RIPK1/RIPK3/MLKL信号转导轴调控细胞程序性坏死。多种死亡受体，例如TNFR、FAS、TRAILR和Toll样受体等，可在受到炎症因子刺激或外源性感染的条件下触发细胞程序性坏死上游信号。在cIAPs和caspase活性受限的情况下，RIPK1与RIPK3形成坏死小体(necrosome)。RIPK3会进一步招募MLKL，被磷酸化的MLKL会自我寡聚化然后迁移到细胞膜，对细胞膜进行“打孔”，导致细胞内容物外泄和电离平衡破坏，最终导致细胞坏死的发生。
细胞程序性坏死与炎症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病和肿瘤等相关疾病的发生发展密切相关。例如，研究表明，细胞程序性坏死是导致全身性炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)的重要原因。SIRS是由于感染或非感染因素作用于机体，引起机体失控而自我破坏的全身炎症反应。危重病人常因机体代偿性抗炎反应能力降低及代谢功能紊乱，易引发SIRS。而TNFα诱导的SIRS疾病模型在长期的研究中被证明与RIPK1依赖的necroptosis高度相关。炎症性肠病(Inflammatory boweldiseases,IBD)是指由于环境、遗传、感染、免疫等原因引起的异常免疫介导的肠道炎症，是一种慢性、非特异性肠炎性疾病。其发病机理尚不清楚，但肠道上皮细胞过度凋亡、肠黏膜屏障受损、肠上皮细胞通透性提高被认为是IBD发生的原因之一，有研究表明细胞程序性坏死在IBD的发病机制中起重要作用。此外，细胞程序性坏死在类风湿性关节炎(RA)、银屑病和多发性硬化症(MS)等多种自身免疫性疾病的发病机制中也起着重要作用。活化的小神经胶质细胞在阿尔兹海默症(AD)发生过程中起关键作用，而RIPK1在小神经胶质细胞中高表达，RIPK1抑制剂则能够在体外有效保护Aβ诱导的神经元细胞程序性坏死。除了阿尔兹海默症外，程序性坏死也参与肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞痴呆(FTD)和帕金森(PD)等众多神经退行性疾病的发生发展。Strilic等人于2016年首次揭示了肿瘤细胞可以诱导血管内皮细胞发生程序性坏死，继而肿瘤细胞穿过血管壁、并通过血液循环实现远端转移，这是导致肿瘤转移的重要原因，实验表明RIPK1抑制剂能有效的抑制肿瘤转移。此外，有研究表明RIPK1激酶可以促进胰腺癌肿瘤微环境中的耐受性巨噬细胞分化，RIPK1抑制则可以使胰腺癌肿瘤微环境中的免疫原性巨噬细胞分化，从而导致适应性免疫激活和肿瘤保护。
综上所述，RIPK1是炎症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病和肿瘤等细胞程序性坏死相关疾病的重要治疗靶标，RIPK1抑制剂有望成为这些疾病的潜在治疗药物。
发明内容
针对需要开发新的抗细胞程序性坏死相关疾病药物的问题，本发明提供5-取代吲哚3-酰胺衍生物及其制备方法和用途，本发明化合物能够在体内发挥抑制RIPK1激酶的作用，药代动力学结果显示该系列化合物具有良好药代动力学性质。本发明为靶向RIPK1治疗炎症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病和肿瘤等相关疾病提供了一种新的策略和手段。
式I所示的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
其中，
X1、X3独立选自-CR6-、N；
X2选自-NR1-、-CH＝CH-；
其中，R1选自氢、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C1-C10醚基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的C6-C20芳基、取代或未取代的3-20元杂芳基；其中，所述取代基是氘、C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
R2B选自
其中，R2选自被一个或两个R21取代或未取代的C0-C6亚烷基；其中，R21选自取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；其中，所述取代基为氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
B环选自被一个、两个或三个R22取代或未取代的C4-C10芳基，被一个、两个或三个R22取代或未取代的4-10元杂芳基或者被一个、两个或三个R22取代或未取代的C3-C10环烷基；其中，R22分别独立选自取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的4-10元杂环烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；或者，两个R22相连形成取代或未取代的4-10元杂环烷基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
R3选自氢、取代或未取代的C1-C10烷基；其中，所述取代基为氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
或者R2B与R3相连形成取代或未取代的3-10元杂环烷基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、C4-C10芳基、一个或两个R31取代的C4-C10芳基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；其中，所述R31选自C1-C10烷基或卤素；
R4、R5和R6分别独立选自氢、C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
A环选自被一个或两个RA取代或未取代的C4-C10芳基、一个或两个RA取代或未取代的4-10元杂芳基；其中，RA选自取代或未取代的氨基、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C4-C10芳基、取代或未取代的4-10元杂芳基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、；其中，所述取代基为-RA2-RA3、RA4、C1-C10烷基、卤素取代的C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；其中，RA4选自被-RA2-RA3取代或未取代的3-10元杂环烷基；
RA1选自取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C1-C10烯基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C2-C6醚基、取代或未取代的C2-C6胺基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、羟基取代的C1-C10烷基、C1-C10酯基、3-10元杂环烷基、氨基、胺基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
RA2选自取代或未取代的C0-C6亚烷基、羰基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
RA3选自取代或未取代的3-10元杂环烷基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基。
优选的，所述式I的化合物如式Ⅱ所示：
其中，
R1选自氢、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的C6-C20芳基、取代或未取代的3-20元杂芳基；其中，所述取代基是C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
R2选自被一个R21取代或未取代的C0-C6亚烷基；其中，R21选自取代或未取代的C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；其中，所述取代基为氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
B环选自被一个、两个或三个R22取代或未取代的C4-C10芳基或者被一个、两个或三个R22取代或未取代的4-10元杂芳基；其中，R22分别独立选自取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的4-10元杂环烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；或者，两个R22相连形成取代或未取代的4-10元杂环烷基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
R3选自氢、取代或未取代的C1-C10烷基；其中，所述取代基为氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
或者R2与R3相连形成取代或未取代的3-10元杂环烷基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
X1、X3独立选自CH、N；
A环选自被一个或两个RA取代或未取代的C4-C10芳基、一个或两个RA取代或未取代的4-10元杂芳基；其中，RA选自氨基、 取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C4-C10芳基、取代或未取代的4-10元杂芳基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、；其中，所述取代基为-RA2-RA3、RA4、C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；其中，RA4选自被-RA2-RA3取代或未取代的3-10元杂环烷基；
RA1选自取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C1-C10烯基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C2-C6醚基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、3-10元杂环烷基、氨基、胺基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
RA2选自取代或未取代的C0-C6亚烷基、羰基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
RA3选自取代或未取代的3-10元杂环烷基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基。
优选的，所述式I的化合物如式Ⅲ或式Ⅳ所示：
其中，R1选自氢、C1-C4烷基；R23选自氢、甲基；B环选自被一个、两个R22取代或未取代的苯基；其中，R22分别独立选自F、Cl、氰基、甲基、三氟甲基、甲氧基或三氟甲氧基。
优选的，所述式I的化合物如式Ⅴ所示：
其中，
X1、X3独立选自-CR6-、N；
X2选自-NR1-、-CH＝CH-；
所述R1选自氢、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的C6-C20芳基、取代或未取代的3-20元杂芳基；其中，所述取代基是C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
L3选自取代或未取代的C1-C4亚烷基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
R33选自氢、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的C6-C10芳基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
R4、R5和R6分别独立选自氢、C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
A环选自被一个或两个RA取代或未取代的C4-C10芳基、一个或两个RA取代或未取代的4-10元杂芳基；其中，RA选自氨基、 取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C4-C10芳基、取代或未取代的4-10元杂芳基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、；其中，所述取代基为-RA2-RA3、RA4、C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；其中，RA4选自被-RA2-RA3取代或未取代的3-10元杂环烷基；
RA1选自取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C1-C10烯基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C2-C6醚基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、C1-C10酯基、3-10元杂环烷基、氨基、胺基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
RA2选自取代或未取代的C0-C6亚烷基、羰基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
RA3选自取代或未取代的3-10元杂环烷基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基。
优选的，R33选自苯基、被一个或两个取代基取代的苯基；其中，所述取代基选自F、Cl或甲基。
优选的，所述式I的化合物如式Ⅵ所示：
其中，
X1、X3独立选自-CR6-、N；
X2选自-NR1-、-CH＝CH-；
X3选自CH、N；
所述R1选自氢、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的C6-C20芳基、取代或未取代的3-20元杂芳基；其中，所述取代基是C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
L4选自取代或未取代的C1-C3亚烷基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
R3选自氢、取代或未取代的C1-C10烷基；其中，所述取代基为氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
R4、R5和R6分别独立选自氢、C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
A环选自被一个或两个RA取代或未取代的C4-C10芳基、一个或两个RA取代或未取代的4-10元杂芳基；其中，RA选自氨基、 取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C4-C10芳基、取代或未取代的4-10元杂芳基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、；其中，所述取代基为-RA2-RA3、RA4、C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；其中，RA4选自被-RA2-RA3取代或未取代的3-10元杂环烷基；
RA1选自取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C1-C10烯基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C2-C6醚基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、3-10元杂环烷基、氨基、胺基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
RA2选自取代或未取代的C0-C6亚烷基、羰基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
RA3选自取代或未取代的3-10元杂环烷基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基。
优选的，所述L4选自的C1-C2的亚烷基。
优选的，所述X3选自CH、N。
优选的，R1选自氢、C1-C4烷基、C3醚基。
优选的，所述R4、R5和R6分别独立选自氢、F。
优选的，A环选自被一个或两个RA取代或未取代的5-9元杂芳基、被一个或两个RA取代或未取代的6元芳基；其中，RA选自氨基、被C1-C4烷基取代的氨基、被-CF3取代的氨基、被-CHF2取代的氨基、 甲基、被-RA2-RA3取代或未取代的5-6元杂芳基、被RA4取代的甲基、被-RA2-RA3取代或未取代的苯基；其中，RA4选自被-RA2-RA3取代或未取代的6元杂环烷基；RA1选自C2-C5烷基、Cl取代的C4烷基、5元杂环烷基取代的甲基、乙烯基、N,N-二甲基胺基取代的乙烯基、C3-C6环烷基、一个或两个F取代的C3-C6环烷基、4-6元杂环烷基、羟基取代的4-6元杂环烷基、-CH2OH取代的4-5元杂环烷基、甲基取代的6元杂环烷基、甲氧基、F取代的甲氧基、C2-C3醚基、羟基取代的丙胺基；
RA2选自C0-C1亚烷基、羰基；
RA3选自甲基取代或未取代的6元杂环烷基。
优选的，A环选自
其中L1选自S或NH；L2分别独立选自CH或N。
优选的，A环选自：
优选的，R2选自被一个或两个R21取代或未取代的C0-C2亚烷基；其中，R21选自甲基；
B环选自被一个、两个或三个R22取代或未取代的C6-C10芳基，被一个、两个或三个R22取代或未取代的5-9元杂芳基或者被一个、两个或三个R22取代或未取代的C9-C10环烷基；其中，R22分别独立选自C1-C4烷基、甲氧基、卤素、卤素取代的甲基、卤素取代的甲氧基、氰基、硝基、卤素选自F、Cl、Br。
优选的，R3选自氢。
优选的，所述式I的化合物如式Ⅶ所示：
其中，
R1选自氢、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的C6-C20芳基、取代或未取代的3-20元杂芳基；其中，所述取代基是C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
R31选自C1-C6亚烷基；
R32选自被一个、两个或三个R311取代或未取代的C4-C10芳基，其中，R311分别独立选自C1-C6烷氧基，或者两个R311相连形成4-10元杂环烷基；
X1、X3独立选自CH、N；
A环选自被一个或两个RA取代或未取代的C4-C10芳基、一个或两个RA取代或未取代的4-10元杂芳基；其中，RA选自氨基、 取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C4-C10芳基、取代或未取代的4-10元杂芳基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、；其中，所述取代基为-RA2-RA3、RA4、C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；其中，RA4选自被-RA2-RA3取代或未取代的3-10元杂环烷基；
RA1选自取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C1-C10烯基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C2-C6醚基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、3-10元杂环烷基、氨基、胺基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
RA2选自取代或未取代的C0-C6亚烷基、羰基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基；
RA3选自取代或未取代的3-10元杂环烷基；其中，所述取代基为C1-C10烷基、氰基、羟基、羧基、卤素或硝基。
优选的，-R31-R32选自
优选的，式I-式Ⅶ所示化合物具体为：
本发明还提供上述化合物的制备方法，
通过如下反应步骤进行：
其中，R2B、R4、R5、X1、X2、X3和A环如上所述。
优选的，所述中间体A的合成过程为：
将原料A、醋酸钾、联硼酸频那醇酯和[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物溶于无水二氧六环，用惰性气体置换反应体系后反应，反应完毕，将反应液浓缩、拌样、柱层析，得到产品；
所述中间体A与原料B合成式I化合物的过程为：
将中间体A、原料B、[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、、三环己基磷膦和、碳酸铯溶于二氧六环/水混合液中，用惰性气体置换反应体系后反应，反应完毕，将反应液浓缩、拌样、柱层析，得到产品；
所述中间体B的合成过程为：
将原料B、醋酸钾、联硼酸频那醇酯和[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物溶于无水二氧六环，用惰性气体置换反应体系后反应，反应完毕，将反应液浓缩、拌样、柱层析，得到产品；
所述所述中间体B与原料A合成式I化合物的过程为：
将中间体B、原料A、[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、三环己基磷膦和碳酸铯溶于二氧六环/水混合液中，用惰性气体置换反应体系后反应，反应完毕，将反应液浓缩、拌样、柱层析，得到产品。
本发明还提供上述化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐在制备RIPK1抑制剂中的用途。
本发明还提供上述化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐在制备用于治疗炎症、免疫性疾病、神经退行性疾病或肿瘤的药物中的用途。
优选的，所述药物用于治疗细胞程序性坏死相关的炎症反应、免疫性疾病、神经退行性疾病或肿瘤。
优选的，所述炎症为结肠炎。
本发明还提供一种药物组合物，它是以上述化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。本发明所定义的程序性细胞坏死是一个由基因决定的细胞主动的有序的死亡方式。具体指细胞遇到内、外环境因子刺激时，受基因调控启动的自杀保护措施，包括一些分子机制的诱导激活和基因编程，通过这种方式去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。TNF、TLR3和TLR4的配体、某些细菌、病毒感染等均可引起程序性细胞坏死。
本发明中提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，Columbus，OH)命名系统命名。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀Ca-Cb烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，“C1-C4烷基”是指包含1-4个碳原子的烷基。特别地，用“C0-Cb”限定亚烷基时，表示该部位可以是无亚烷基。
“烷基”是指具有指定数目的成员原子的饱和烃链。例如，C1-C6烷基是指具有1至6个成员原子，例如1至4个成员原子的烷基基团。烷基基团可以是直链或支链的。代表性的支链烷基基团具有一个、两个或三个支链。烷基基团可任选地被一个或多个如本文所定义的取代基取代。烷基包括甲基、乙基、丙基(正丙基和异丙基)、丁基(正丁基、异丁基和叔丁基)、戊基(正戊基、异戊基和新戊基)和己基。烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团为例如C1-C6烷氧基。
“环烷基”是指具有3至14个碳原子且没有环杂原子且具有单个环或多个环(包括稠合、桥连和螺环体系)的饱和或部分饱和的环状基团。对于具有不含环杂原子的芳族和非芳族环的多环体系，当连接点位于非芳族碳原子时，适用术语“环烷基”(例如5,6,7,8,-四氢化萘-5-基)。术语“环烷基”包括环烯基基团，诸如环己烯基。环烷基基团的实例包括例如，金刚烷基、环丙基、环丁基、环己基、环戊基、环辛基、环戊烯基和环己烯基。
“烯基”是指具有2至10个碳原子和在一些实施方案中2至6个碳原子或2至4个碳原子且具有至少1个乙烯基不饱和位点(>C＝C<)的直链或支链烃基基团。例如，(Ca-Cb)烯基是指具有a至b个碳原子的烯基基团并且意在包括例如乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1,3-丁二烯基等。
“炔基”是指含有至少一个三键的直链一价烃基或支链一价烃基。术语“炔基”还意在包括具有一个三键和一个双键的那些烃基基团。例如，(C2-C6)炔基意在包括乙炔基、丙炔基等。
“卤素”为氟、氯、溴或碘。
“杂环”、“杂环烷基”指包含至少一个杂原子的饱和环或非芳香性的不饱和环；其中杂原子指氮原子、氧原子、硫原子；
“杂芳基”指包含至少一个杂原子的芳香性不饱和环基；其中杂原子指氮原子、氧原子、硫原子；
“醚基”是指醚类化合物的碳原子去掉一个H后形成的基团。C2-C6醚基是指所述醚类化合物中，氧原子两端连接的烃基的碳原子总数为2至6个。
“胺基”是指胺类化合物去掉一个H后形成的基团。胺类化合物是指氨分子中的氢原子部分或全部被烃基取代后形成的化合物，C2-C6胺基是指所述胺类化合物中，氧原子两端连接的烃基的碳原子总数为2至6个。
“酯基”是指酯类化合物的碳原子去掉一个H后形成的基团。酯类化合物是指酸与醇失水后形成的化合物，其具有“-COO-”的官能团。C1-C10酯基是指所述胺类化合物中，碳原子总数为1至10个。
“Ra和Rb相连形成杂环”指Ra和Rb中分别至少有一个原子通过化学键连接，使得通式结构中Ra和Rb共同连接的原子或原子链作为环结构的一部分骨架与Ra和Rb共同构成杂环。
“立体异构体”包括对映异构体和非对映异构体。
在本发明中，与代表取代基的符号连接的横线表示共价键。例如：“-R”是指R通过一个共价单键与其他基团连接；“-R-”是指R通过两个共价单键与其他基团连接；“-RA2-RA3”是指RA3通过一个共价单键与RA2连接，RA2通过两个共价单键分别与RA3和一个其他基团连接。
术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常
在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
术语“盐”和“可药用的盐”是指上述化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。
在某些实施方式中，本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用。也可选择将本发明的化合物与任何其它的活性试剂结合使用，用于制备调控细胞功能或治疗疾病的药物或药物组合物。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明化合物34的激酶选择性谱图；
图2为本发明化合物94的激酶选择性谱图；
图3为实施例5中细胞生存率曲线图；
图4为实施例6中化合物46和94对坏死信号通路的影响；
图5为实施例7中化合物46和94保护了TNFα诱导的小鼠SIRS模型的结果；
图6为实施例8中化合物特非那定(左)和化合物94(右)浓度-反应曲线。
图7为实施例8中小鼠结肠长度的对比实验结果；
图8为实施例10中化合物特非那定(左)和化合物94(右)对hERG电流的抑制作用浓度-反应曲线。
具体实施方式
下面参照实施例进一步阐释本公开。对本公开的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本公开限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据本申请说明书的教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本公开的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本公开的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
NMR的测定是用BRUKER 400MR DD2核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，氘代甲醇(CD3OD)和氘代氯仿(CDCl3)，内标为四甲基硅烷(TMS)。液质联用色谱LC-MS的测定用Agilent 1200Infinity II–InfinityLab LC/MSD质谱仪。HPLC的测定使用Agilent 1200Infinity II高压液相色谱仪(Sunfire C18 5um 150x4.6mm色谱柱；)。薄层层析硅胶板使用烟台江友硅胶开发有限公司HSGF254硅胶板，规格是0.9mm～1mm。TLC硅胶板使用于成化工(上海)有限公司GF254硅胶板，规格是0.2mm～0.25mm。柱层析使用青岛海浪硅胶干燥剂有限公司300～400目硅胶为载体。Flash柱使用艾杰尔飞诺美ClaricepFlash无定形硅胶纯化柱。本发明实施例中的试剂1-丙基磷酸酐,甲基溴化镁是从上海麦克林生化科技有限公司购买，4N盐酸二氧六环溶液从盘锦研峰科技有限公司购买，1M硼烷的四氢呋喃溶液、N,N-二异丙基乙胺、(S)-叔丁基亚磺酰胺是从阿达玛斯试剂购买其他试剂和起始原料从上海皓鸿生物医药科技有限公司购买，或者可以采用本领域已知的方法来合成。在无特殊说明的情况下，本发明的所有反应均在连续的磁力搅拌下，在干燥氮气或氩气下进行，溶剂为干燥溶剂，反应温度单位为摄氏度。
实施例1本发明化合物34制备(方法Ⅰ)。
i N,N-二甲基甲酰胺，(S)-1-(3-氟苯基)乙胺，1-羟基苯并三唑，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，N,N-二异丙基乙胺，65度，8小时，产率85％。
ii吡啶，环丙甲酰氯，三乙胺，0℃到常温，6小时，产率90％；
iii无水二氧六环,[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物，醋酸钾，联硼酸频那醇酯，95度，24小时,产率60％；
iv 1,4-二氧六环/水＝10：1，[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物，三环己基磷，碳酸铯,100度,16小时,产率75％；
具体操作步骤包括：
(S)-5-溴-N-(1-(3-氟苯基)乙基)-1H-吲哚-3-酰胺(中间体2)的制备：
将5-溴吲哚-3-甲酸(4.5g,18.8mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBT)(3g,21.6mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(4.3g,23.4mmol)溶于60毫升N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入N,N-二异丙基乙胺(3.6mL,23.4mmol)，常温活化羧酸0.5小时后，加入(S)-1-(3-氟苯基)乙胺(2.8g,19.8mmol)并将反应加热至65度反应8小时，TLC监控反应完成后，将反应液浓缩，用二氯甲烷和硫代硫酸钠溶液进行萃取，有机相水洗、饱和氯化钠溶液洗涤后加入硫酸钠干燥，抽滤干燥后经柱层析得到中间体2(5.7g，白色固体)，产率为85％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.46(s,1H),8.35(s,1H),8.19(d,J＝5.9Hz,1H),7.96(d,J＝2.5Hz,1H),7.25(d,J＝7.7Hz,1H),7.11–7.02(m,2H),7.00(s,1H),6.97(d,J＝7.0Hz,1H),5.21–5.11(m,1H),1.47(d,J＝7.1Hz,3H)
N-(6-溴苯并[d]噻唑-2-基)环丙甲酰胺(中间体4)的制备：
将1克中间体3(1.0g,4.4mmol)溶于15毫升干燥吡啶中，加入1.4mL三乙胺(575mg,5.7mmol)，在0度条件下缓慢滴入370μL环丙甲酰氯(499mg,4.8mmol)，温度逐渐升至室温反应6小时，直接将反应液浓缩、用二氯甲烷和饱和碳酸钠溶液进行萃取，有机相水洗、饱和氯化钠溶液洗涤后加入硫酸钠干燥，柱层析纯化得中间体4(1.2g，淡黄色固体)，产率为90％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.01(s,1H),8.11(d,J＝6.9Hz,1H),7.55(s,1H),7.02(d,J＝5.4Hz,1H),1.23(d,J＝11.0Hz,1H),1.16(dt,J＝7.4 3.9Hz,2H),0.93(td,J＝7.0,3.9Hz,2H).
N-(6-(频那醇硼酸酯)苯并[d]噻唑-2-基)环丙甲酰胺(中间体5)的制备：
将中间体4(10g,33.8mmol)、醋酸钾(6.6g,67.6mmol)、12克联硼酸频那醇酯(12g,47.2mmol)和2.8克[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(2.8g,3.4mmol)溶于200毫升无水二氧六环中，用氮气将反应体系置换三次后，置于95度反应24小时，石油醚：乙酸乙酯＝20：1展开剂监控反应，反应完毕，将反应液浓缩、拌样、柱层析，选用石油醚：乙酸乙酯＝80：1洗脱液纯化得到中间体5(6.9g，白色固体)，产率为60％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.01(s,1H),8.45(d,J＝6.7Hz,1H),8.03(s,1H),7.87(d,J＝5.7Hz,1H),1.21(d,J＝11.2Hz,1H),1.33(s,12H),1.11(dt,J＝7.4 3.9Hz,2H),0.99(td,J＝7.0,3.9Hz,2H).
(S)-5-(2-(环丙甲酰胺)苯并[d]噻唑-6-基)-N-(1-(3-氟苯基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺(化合物34)的制备：
将中间体2(400mg,1.1mmol)、中间体5(580mg,1.7mmol)、133毫克[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(133mg,0.16mmol)、41毫克三环己基膦(45mg,0.16mmol)和780毫克碳酸铯(780mg,2.4mmol)溶于100毫升1，4-二氧六环/水(10：1)的混合液中，将反应体系用氮气置换三次后置于100度反应16小时，乙酸乙酯：石油醚＝1：1展开剂监控反应，TLC监控反应完毕，将反应液浓缩、拌样、柱层析，选用乙酸乙酯：石油醚＝5:1洗脱液纯化出化合物34(318mg，类白色固体)，产率为58％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.63(s,1H),11.66(s,1H),8.43(s,1H),8.31(d,J＝7.9Hz,1H),8.21(d,J＝2.4Hz,1H),7.81–7.75(m,2H),7.70(dd,J＝8.5,1.6Hz,2H),7.53(d,J＝8.1Hz,2H),7.37(dd,J＝14.1,8.1Hz,2H),7.25(t,J＝9.4Hz,2H),7.09–7.00(m,1H),5.75(s,1H),5.27–5.15(m,1H),2.06(d,J＝11.0Hz,1H),0.96(d,J＝5.1Hz,4H).
实施例2本发明化合物94的制备(方法Ⅱ)。
i N,N-二甲基甲酰胺，碘甲烷，碳酸铯，80度，8小时，90％。
ii甲醇，水，氢氧化钠，60度，3小时，95％；
iii N,N-二甲基甲酰胺，(S)-1-(3-氟苯基)乙胺，1-羟基苯并三唑，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，N,N-二异丙基乙胺，65度，8小时，85％。
iv 1,4-二氧六环/水＝5：1，[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物，三环己基磷，碳酸铯,95度,12小时,75％；
v吡啶，环丙甲酰氯，三乙胺，0℃到常温，6小时，90％；
vi 1,4-二氧六环/水＝10：1，[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物，三环己基磷，碳酸铯,95度,12小时,75％；
具体操作步骤包括：
甲基5-溴-1-甲基-1H-吲哚-3-甲酸(中间体2)的制备：
将中间体1(1.0g,3.9mmol)，碘甲烷(700mg,4.9mmol)和碳酸铯(1.8g,5.5mmol)溶于30毫升N，N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下80度反应8小时，乙酸乙酯：石油醚＝1:3展开剂监控反应，反应完毕，直接将反应液浓缩、拌样、柱层析。乙酸乙酯：石油醚＝1:1洗脱液纯化得到中间体2(937mg，白色固体)，产率为90％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.18(s,1H),8.11(d,J＝1.9Hz,1H),7.55(d,J＝8.7Hz,1H),7.41(dd,J＝8.7,1.9Hz,1H),3.86(s,3H),3.81(s,3H).
5-溴-1-甲基-1H-吲哚-3-甲酸(中间体3)的制备：
将中间体2(507mg,1.9mmol)溶于20毫升甲醇中，加入10毫升2mol/L的氢氧化钠溶液，60度条件下搅拌反应3小时，乙酸乙酯：石油醚＝1:1展开剂监控反应，反应结束后直接将反应液浓缩、加水稀释后调节pH＝4,析出固体，固体抽滤干燥得到中间体3(432mg，白色固体),产率为90％，未经进一步纯化直接进行下一步反应。
(S)-5-溴-N-(1-(3-苯基)乙基)-1-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺(中间体4)的制备：
将中间体3(987mg,3.9mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBT)(806mg,5.8mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.0g,5.8mmol)溶于20毫升N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入N,N-二异丙基乙胺(1.0g,7.8mmol)，常温活化羧酸0.5小时后，加入(S)-1-(3-氟苯基)乙胺(650mg,4.6mmol),并将反应加热至65度反应8小时，TLC监控反应完成后，将反应液浓缩，用二氯甲烷和硫代硫酸钠溶液进行萃取，有机相水洗、饱和氯化钠溶液洗涤后加入硫酸钠干燥，抽滤后柱层析得到中间体4(1.2g，白色固体)，产率为84％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.34(d,J＝8.3Hz,1H),8.26(d,J＝1.9Hz,1H),8.19(s,1H),7.49(d,J＝8.8Hz,1H),7.37–7.30(m,2H),7.22(t,J＝9.0Hz,2H),7.05(d,J＝9.3Hz,1H),5.17(d,J＝7.5Hz,1H),3.84(s,3H),1.46(d,J＝7.1Hz,3H).
(S)-N-(1-(3-苯基)乙基)-1-甲基-5-(频那醇硼酸酯)-1H-吲哚-3-甲酰胺(中间体5)的制备：
将中间体4(2.0g,5.3mmol)、醋酸钾(1.1g,11.2mmol)、联硼酸频那醇酯(1.7g,6.9mmol)和[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(410mg,0.5mmol)溶于50毫升无水二氧六环，用氮气将反应体系置换三次后，置于95度反应12小时，反应完毕，将反应液垫硅藻土过滤，浓缩、拌样、柱层析，选用石油醚：乙酸乙酯＝1：1洗脱液纯化出中间体5(1.3g，淡黄色固体)，产率为60％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.55(s,1H),8.33(d,J＝7.9Hz,1H),8.14(s,1H),7.48(t,J＝6.8Hz,2H),7.36(dd,J＝14.1,8.0Hz,1H),7.22(t,J＝9.5Hz,2H),7.06–6.99(m,1H),5.19–5.11(m,1H),3.84(s,3H),1.47(d,J＝7.1Hz,3H),1.30(s,12H).
N-(7-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙甲酰胺(中间体7)的制备：
将中间体6(1.0g,4.7mmol)溶于15毫升干燥吡啶中，加入1.4mL三乙胺(949mg,9.4mmol)，在0度条件下缓慢滴入环丙甲酰氯(541mg,5.2mmol)，温度逐渐升至室温反应6小时，直接将反应液浓缩、用二氯甲烷和饱和碳酸钠溶液进行萃取，有机相水洗、饱和氯化钠溶液洗涤后加入硫酸钠干燥，柱层析纯化得到中间体7(1.2g，黄色固体)，产率为90％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.25(s,1H),8.40(d,J＝7.1Hz,1H),7.82(s,1H),7.09(d,J＝5.9Hz,1H),1.27(d,J＝11.5Hz,1H),1.21(dt,J＝7.6,3.9Hz,2H),0.96(td,J＝7.0,3.9Hz,2H).
(S)-5-(2-(环丙甲酰胺)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-N-(1-(3-苯基)乙基)-1-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺(化合物94)的制备：
将中间体7(280mg,1.0mmol)、中间体5(422mg,1.0mmol)、[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(85mg,0.1mmol)、三环己基膦(28mg,0.1mmol)和碳酸铯(390mg,1.2mmol)溶于100毫升1，4-二氧六环/水(10：1)的混合液中，将反应体系用氮气置换三次后置于100度反应12小时，乙酸乙酯：石油醚＝3：1展开剂监控反应，与原料极性相比，产物点极性增大，TLC监控反应完毕，将反应液浓缩、拌样、柱层析，选用乙酸乙酯：石油醚＝10:1洗脱液纯化出化合物94(372mg，白色固体)，产率为75％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.04(s,1H),8.83(d,J＝7.1Hz,1H),8.53(s,1H),8.37(d,J＝8.0Hz,2H),8.22(s,1H),7.86(s,1H),7.72(d,J＝8.6Hz,1H),7.66(d,J＝8.7Hz,1H),7.46–7.40(m,1H),7.37(dd,J＝14.2,7.8Hz,2H),7.25(t,J＝9.7Hz,2H),7.05(t,J＝8.6Hz,1H),5.22(dd,J＝14.3,6.9Hz,1H),3.90(s,3H),2.07(s,1H),0.96(d,J＝5.3Hz,4H).
实施例3本发明化合物142制备(方法Ⅲ)
i 2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧三磷酸-2,4,6-三氧化物，吡啶，80℃，12小时，产率80％。
具体操作步骤包括：
(S)-5-(2-氨基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-N-(1-(3-氟苯基)乙基)-1-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺(141)的制备：
按方法II所示操作步骤可制备获得化合物141。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.55(d,J＝7.0Hz,1H),8.48(d,J＝1.8Hz,1H),8.37(d,J＝8.0Hz,1H),8.21(s,1H),7.73–7.60(m,2H),7.55(d,J＝2.0Hz,1H),7.37(q,J＝7.4Hz,1H),7.32–7.12(m,3H),7.04(td,J＝8.7,2.6Hz,1H),5.99(s,2H),5.20(q,J＝7.3Hz,1H),3.89(s,3H),1.49(d,J＝7.1Hz,3H).
5-(2-(2,2-二氟环丙烷-1-甲酰胺)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-N-((S)-1-(3-氟苯基)乙基)-1-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺(142)的制备：
将化合物141(150mg,0.35mmol)与的2，2-二氟环丙烷羧酸(85mg,0.70mmol)溶于15毫升干燥吡啶中，室温下加入2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧三磷酸-2,4,6-三氧化物(229mg,50％的乙酸乙酯溶液)，温度逐渐升至80℃反应6小时，直接将反应液浓缩，用二氯甲烷拌样，柱层析纯化得到142(149mg，淡黄色固体)，产率为80％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.41(s,1H),8.93(d,J＝7.0Hz,1H),8.60(d,J＝1.8Hz,1H),8.45(d,J＝8.1Hz,1H),8.29(s,1H),7.96(d,J＝1.9Hz,1H),7.80(dd,J＝8.6,1.9Hz,1H),7.72(d,J＝8.7Hz,1H),7.53(dd,J＝7.2,2.0Hz,1H),7.46–7.39(m,1H),7.35–7.28(m,2H),7.15–7.05(m,1H),5.27(t,J＝7.4Hz,1H),3.95(d,J＝13.0Hz,3H),2.10(d,J＝7.1Hz,1H),1.55(d,J＝7.0Hz,3H),1.31–1.18(m,2H).
实施例4本发明化合物162的制备(方法IV)
i氯甲酸甲酯，N,N-二异丙基乙胺，二氯甲烷，室温，6小时，90％。
ii(R)-3-吡咯烷醇，吡啶，100度，16小时，80％；
(S)-5-(2-氨基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-N-(1-(3-氟苯基)乙基)-1-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺(141)的制备：
按方法II所示操作步骤可制备获得化合物141。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.55(d,J＝7.0Hz,1H),8.48(d,J＝1.8Hz,1H),8.37(d,J＝8.0Hz,1H),8.21(s,1H),7.73–7.60(m,2H),7.55(d,J＝2.0Hz,1H),7.37(q,J＝7.4Hz,1H),7.32–7.12(m,3H),7.04(td,J＝8.7,2.6Hz,1H),5.99(s,2H),5.20(q,J＝7.3Hz,1H),3.89(s,3H),1.49(d,J＝7.1Hz,3H).
甲基(S)-(7-(3-((1-(3-氟苯基)乙基)氨甲酰基)-1-甲基-1H-吲哚-5-基)-(1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)氨基甲酸酯(166)的制备：
将中间体141(513mg,1.2mmol)加入烧瓶中，依次加入10毫升二氯甲烷，1毫升N,N-二异丙基乙胺(310mg,2.4mmol)和氯甲酸甲酯(131mg,1.4mmol)，室温条件下搅拌反应6小时，二氯甲烷：甲醇＝20:1展开剂监控反应，反应完毕，直接将反应液浓缩、拌样，硅胶柱纯化得到166(525mg，淡黄色固体)，产率为90％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.55(s,1H),8.89–8.80(m,1H),8.53(s,1H),8.39(d,J＝8.0Hz,1H),8.23(s,1H),7.86(s,1H),7.78–7.63(m,2H),7.50–7.35(m,2H),7.25(t,J＝9.7Hz,2H),7.04(d,J＝10.0Hz,1H),5.22(s,1H),3.91(s,3H),3.70(s,3H),1.50(d,J＝7.1Hz,3H).
N-((S)-1-(3-氟苯基)乙基)-5-(2-((R)-3-羟基吡咯烷-1-甲酰胺)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-1-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺(162)的制备：
将100毫克中间体166(100mg,0.2mmol)溶于吡啶中，加入50毫克(R)-3-吡咯烷醇(52mg,0.6mmol)，反应加热至100度反应16小时，二氯甲烷：甲醇＝20:1展开剂监控反应，反应完毕，将反应液浓缩，经过反相色谱柱纯化得到162(86mg，白色固体)，产率为80％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.23(s,1H),8.80(d,J＝7.1Hz,1H),8.53(s,1H),8.41(d,J＝8.0Hz,1H),8.24(s,1H),7.82(s,1H),7.72(dd,J＝8.6,1.9Hz,1H),7.66(d,J＝8.6Hz,1H),7.45–7.33(m,2H),7.29–7.20(m,2H),7.05(ddd,J＝10.3,8.2,2.7Hz,1H),5.22(q,J＝7.3Hz,1H),4.98(d,J＝3.4Hz,1H),4.30(s,1H),3.90(s,3H),3.49(s,3H),3.31(s,1H),1.96–1.88(m,1H),1.81(s,1H),1.49(d,J＝7.0Hz,3H).
本发明其他化合物均可采用与实施例1-4相似的方法进行合成，采用的合成方法及结构表征如下表所示：
表1本发明化合物的合成方法及其结构表征
实施例5本发明化合物体外激酶实验和保护细胞程序性坏死实验
体外激酶试验采用Eurofins公司提供的Kinase Profiler服务完成。实验方法如下：将待测小分子化合物(0.001-10μM)、待测蛋白激酶与包含底物、10mM醋酸镁和[γ-33P-ATP]的缓冲液共同孵育，通过加入Mg\ATPmix以开始反应，在室温下孵育一段时间后，向缓冲液中加入3％的磷酸盐溶液以终止反应。随后定量吸取10μL反应混合液滴在P30滤纸上，并用75mM的磷酸盐溶液清洗3次，再用甲醇清洗一次，将P30滤纸晾干后加入闪烁液进行闪烁计数。化合物的抑制活性用半数抑制浓度IC50来表示，IC50值由各浓度梯度对应的抑制率拟合得到。
体外保护HT-29细胞程序性坏死实验由自己完成。
1)实验材料
DMEM培养基购自Gibco公司，青、链霉素购自Hyclone公司，TNFα购自Peprotech公司，Smac mimetic和Z-VAD-FMK购自Selleck公司，CCK8购自Medchem Express公司。
2)实验方法
HT-29细胞(结肠癌细胞)采用DMEM+10％FBS+青/链霉素培养基培养。实验时，收集处于对数生长期的HT-29细胞，以每孔特定数目(贴壁细胞一般为8×103cells/well)接种于96孔板中，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。次日，用培养基稀释待测化合物到相应浓度并加入到96孔板相应孔中，每个样品3个复孔，同时设置溶剂对照组和只含培养基的空白对照组，将加药后的细胞用TNFα/Smac mimetic/Z-VAD-FMK联合诱导24h，再每孔加入10μl CCK8溶液，并在细胞培养箱中孵育1-3h，随后用酶标仪在495nm波长下检测吸光度，并根据以下公式计算药物对细胞的坏死保护率：
细胞坏死保护率＝[(X-C0)/(C-C0)]×100％
其中，C、C0和X分别代表溶剂对照组、空白对照组和药物处理组的平均吸光度值。最后，使用Graphpad Prism 5.0软件拟合细胞生存率曲线并计算出待测化合物抑制细胞程序性坏死的EC50值。结果如表2所示，其中，+++++代表IC50或EC50<0.001μM，++++代表0.01μM>IC50或EC50≧0.001μM，+++代表0.1μM>IC50或EC50≧0.01μM，++代表1μM>IC50或EC50≧0.1μM，+代表IC50或EC50≧1μM。
表2本发明化合物对RIPK1激酶抑制活性和保护细胞程序性坏死活性
将优选化合物34和94在浓度为10μM的条件下对Eurofins公司现有的422种激酶(包含突变体)进行单浓度抑制率的测试，针对具有较高抑制活性的激酶进行IC50测试，结果(试验由Eurofins公司测试并提供活性数据)如下表3、表4所示：
表3化合物34对422个激酶的单浓度抑制活性(10μM)
表4化合物94对422个激酶的单浓度抑制活性(10μM)
根据表3和表4的数据绘制了化合物34和94的选择性图谱，(绘制流程及操作参考http://bcb.med.usherbrooke.ca/kinomerenderLig.php)，如图1、图2所示。其中，红色圆形斑点表示有明显抑制作用的激酶，红色斑点的半径越大，说明对激酶的抑制作用越高，反之越小。由表3、表4和图1、图2可以看出化合物34和94具有良好的激酶选择性。
根据图3所示，化合物94抑制HT-29细胞程序性坏死模型的EC50值为0.012nM，其系列化合物34和46抑制HT-29细胞程序性坏死模型的EC50值分别为0.117nM、0.070nM。以上实验结果表明，本发明化合物94及其系列化合物能够保护HT-29细胞免受TSZ诱导的坏死样凋亡。
实施例6本发明化合物94及46对RIPK1信号通路的调控
1)实验材料
TNFα购自Peprotech公司，Smac mimetic和Z-VAD-FMK购自Selleck公司，RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所，cocktail购自MCE公司，PMSF蛋白酶抑制剂、十二烷基磺酸钠SDS和甘氨酸购自Sigma公司，丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷Tris、过硫酸铵APS和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺TEMED均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。
2)实验方法
细胞总蛋白的提取：在细胞上清中加入相应浓度的化合物94、46或空白溶剂处理细胞并用TNFα/Smac mimetic/Z-VAD-FMK联合诱导一定时间后，弃尽上清，用预冷的PBS或生理盐水洗三次，再加入适当体积的RIPA裂解液(含1％cocktail和1％PMSF蛋白酶抑制剂)，立即置于冰上平放裂解15min，15min后将细胞裂解液用刮刀刮下转移至1.5ml的EP管中，用超声破碎仪破碎细胞。随后将离心管置于低温高速离心机中离心(12000rpm，15min)以除去细胞碎片。再用BCA法进行蛋白定量，并用蛋白标准品制作标准曲线，根据标准曲线计算各样品蛋白浓度，再通过计算将各组蛋白样品浓度调平，加入5x蛋白上样缓冲液后置于100℃干式恒温器中保持10min。随后直接上样电泳或分装后保存于-20℃备用。蛋白样品避免反复冻融。
蛋白样品制备好后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，聚丙烯酰胺凝胶制胶配方如表5所示，一般采用10％的分离胶进行分离。电泳分离后，用槽式湿转法将蛋白充分转移至PVDF膜上，然后将PVDF膜置于5％的脱脂奶粉(脱脂奶粉用TBS/T配制)中室温封闭2h以上，按照所需蛋白的分子量取得含相应蛋白的PVDF膜带，按抗体说明书推荐的稀释比例稀释一抗并在4℃孵育蛋白条带过夜。次日，取出各条带，用TBS/T缓冲液漂洗(5min，3次)后加入1:5000稀释的HRP标记的二抗，在37℃下摇动孵育1h，随后用TBS/T洗脱除去过量抗体，在PVDF膜上均匀滴加HRP底物后，置于快速凝胶成像系统中显影并拍照。
表5 SDS-PAGE中分离胶和浓缩胶配方
3)实验结果
结果如图4所示，化合物94和46通过抑制RIPK1的自身磷酸化，影响了它下游RIPK3和MLKL的磷酸化，且这种抑制活性具有浓度依赖效应，与细胞水平的保护活性一致，说明化合物94和46通过阻断程序性坏死信号通路发挥抑制程序性坏死的作用。
实施例7本发明化合物94及46对TNFα诱导的小鼠SIRS模型的保护作用
1)实验材料
TNFα购自Peprotech公司，蓖麻油购自MCE公司，无菌生理盐水购自成都百盛科创生物科技有限公司。
2)实验方法
TNFα的造模剂量为500μg/kg，用无菌生理盐水配制，通过尾静脉注射方式造模。小鼠的体温通过红外电动体温枪来检测。溶剂为25％乙醇蓖麻油、75％生理盐水，给药方式为口服，化合物94、46和RIPK1阳性化合物GSK2982772的给药剂量均为40mg/kg，造模前口服给药。每小时记录一次体温并记录小鼠的生存情况，11h后再记录24h和48h小鼠的生存情况。用Graphpad Prism 5.0软件拟合生存期曲线。
3)实验结果
为了验证化合物94和46是否在体内也具有抗RIPK1和抑制程序性坏死的活性，本实验选择了经典炎症模型SIRS。全身性炎症反应综合征(Systemic InflammatoryResponse Syndrome，SIRS)是由于感染或非感染因素作用于机体，引起机体失控而自我破坏的全身炎症反应。危重病人常因机体代偿性抗炎反应能力降低及代谢功能紊乱，易引发SIRS。而TNFα诱导的SIRS疾病模型在长期的研究中被证明与RIPK1依赖的细胞凋亡与程序性坏死高度相关。
本实验建立了TNFα诱导的SIRS小鼠模型，以评价本发明化合物的体内活性。TNFα的造模剂量为500μg/kg，用无菌生理盐水配制，通过尾静脉注射方式进入小鼠体内。因为测小鼠的直肠温度会对小鼠造成机械性损伤，可能对实验结果产生干扰，故采用红外电动体温枪来测量小鼠的体温，同时观察生存情况。化合物94和46的给药剂量为40mg/kg，造模前给药一次。溶剂组(Vehicle)给予相应溶剂对照。
实验结果如图5所示，尾静脉注射TNFα后，溶剂组小鼠在短时间内产生体温持续下降，活动减少等症状，并在24h开始死亡。而给予化合物94和46的组别除个别小鼠外，其余的小鼠在TNFα注射后的11h内体温相对正常，小鼠的活力明显优于溶剂组，整体死亡率与溶剂组相比显著降低，且94呈现出比阳性药GSK2982772更好的保护效果。说明化合物94和46通过在体内抑制RIPK1发挥了显著的抗炎作用，抵抗了高剂量TNFα诱导小鼠所产生的死亡。
实施例8本发明化合物94对DSS诱导的小鼠IBD模型的保护作用
1)实验材料
葡聚糖硫酸钠盐(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS,36000-50000KD)购自上海翊圣生物科技有限公司，0.C.T组织固定液购自赛维尔生物公司，PEG300和吐温-80购自MCE公司，DMSO购自Sigma公司。
2)实验方法
使用重17–20g的雌性C57BL/6小鼠。实验组将DSS(2.5％wt/vol)溶于饮用水中给小鼠随意服用7天(从第0天到第7天)。分别在第2天、第4天和第6天更换新鲜的DSS溶液。第7天将所有的水换为正常的饮用水，并随机分组(每组7只)口服给药：Vehicle组(10％DMSO、40％PEG300、5％吐温-80、45％生理盐水)，GSK3145095组(40mg/kg)和化合物94组(40mg/kg)。Control组每天给予正常的饮用水，且从第7天开始口服给予相应的溶剂。每天记录小鼠的体重和存活率。用Graphpad Prism 5.0软件拟合生存期曲线。第12天处死小鼠(各2只)，观察小鼠结肠的长度变化。
3)实验结果
为了验证化合物94是否在体内自身免疫性疾病模型中也具有抗RIPK1和抑制程序性坏死的活性，本实验选择了经典结肠炎模型IBD。炎症性肠病(Inflammatory boweldiseases,IBD)是指由于环境、遗传、感染、免疫等原因引起的异常免疫介导的肠道炎症，是一种慢性、非特异性肠炎性疾病，其发病机理尚不清楚。IBD的主要病理类型是溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。虽然IBD的病因尚不清楚，但肠道上皮细胞过度凋亡、肠黏膜屏障受损、肠上皮细胞通透性提高被认为是IBD发生的原因之一。有研究表明坏死在IBD的发病机制中起重要作用。
实验组小鼠在造模7天后，出现血便、体重下降等病理症状，说明造模成功。如图6所示，造模7天后随机分组给药，Vehicle组和GSK3145095组体重持续下降，并出现小鼠死亡，而给予化合物94的组别小鼠体重逐步回升，且到第14天也未出现死亡，小鼠的活力也明显优于Vehicle组。如图7所示，第12天处死小鼠(各2只)，Vehicle组小鼠结肠长度较Control组明显缩短，而化合物94组小鼠结肠长度比Vehicle组长，与Control组小鼠结肠长度基本相当，表明化合物94可以缓解DSS诱导的小鼠结肠缩短现象，且呈现出比阳性药GSK3145095更好的治疗效果。说明化合物94通过在体内抑制RIPK1发挥了显著的抗炎作用，缓解了DSS诱导的小鼠结肠炎。
实施例9本发明代表性化合物的体内药代动力学研究
1)实验方法
准确称取适量的代表性化合物，用终体积5％DMSO、40％PEG400和55％saline溶解，涡旋或超声使充分混匀，得到1mg/mL的澄清给药溶液，根据体重，计算大鼠给药量(10mg/kg)，并通过静脉或灌胃口服给药。给药后在不同时间进行大鼠采血，采血时间点为：静脉给药后0.083h，0.25h，0.5h，1h，2h，4h，8h，24h；灌胃口服给药后0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，24h。在相应时间经颈静脉或其它合适方式采血，每个样品采集约0.20mL，肝素钠抗凝，血液样本采集后放置于冰上，并于1小时内离心分离血浆(离心条件：离心力6800g，6分钟，2-8℃)。采集的血浆样本在分析前存放于-80℃冰箱内，分析后剩余血浆样本继续于-80℃冰箱暂存，保存期限为一个月。
通过不同时间点的血药浓度数据，运用WinNonlin计算药代动力学参数，如AUC(0-t)，T1/2，Cmax，Tmax和MRT等。进行血浆药物浓度-时间曲线绘制时，BLQ均记为0。进行药代参数计算时，给药前的浓度按照0计算；Cmax之前的BLQ(包括“No peak”)按照0计算；Cmax之后出现的BLQ(包括“No peak”)一律不参与计算。本实验由上海美迪西完成。
2)实验结果
结果见表6，可以看出，单次口服给药代表性化合物10mg/kg后，大鼠对六个代表性化合物的口服吸收均较好，口服生物利用度最高为60.85％。从初步药代动力学实验可以看出，化合物单次给药后在体内蓄积的药物浓度可以达到抑制RIPK1和坏死信号通路的半数抑制浓度值，说明该系列化合物是疫类一类具有开发前景的RIPK1抑制剂。
表6代表性化合物经口服给药后大鼠体内药代动力学参数
实施例10本发明化合物94对hERG钾离子通道的影响
1)实验方法
将稳定HEK-hERG细胞用DPBS进行冲洗，用Trypsin或Tryple溶液进行消化分离，用培养基重悬细胞并存于离心管中备用。膜片钳记录之前，将细胞滴加于小培养皿中，确保细胞具有一定密度且细胞呈单个分离状态。
采用全细胞膜片钳技术记录hERG电流。取细胞悬液加于小培养皿中，置于倒置显微镜载物台上。待细胞贴壁后，用细胞外液灌流，推荐流速为1–2mL/min。玻璃微电极由微电极拉制仪两步拉制，充灌电极内液后其入水电阻值为2-5MΩ。
建立全细胞记录模式后，保持钳制电位为-80mV。给予去极化电压至+60mV持续850ms，然后复极化至-50mV维持1275ms引出hERG尾电流。这样一组脉冲程序每15秒钟重复一次，贯穿整个实验。
电流稳定后采用从低浓度到高浓度胞外连续灌流给药的方式。从低浓度开始，持续灌流至药效稳定，然后进行下一浓度的灌流。本实验将分别测试化合物94(0.3，1，3，10，30μM)和阳性化合物特非那定对hERG尾电流的阻断效应(N≥2)。
药效稳定的定义为：每个浓度给药阶段的最后5个刺激条电流值变化小于均值的10％(当电流大于等于200pA时)或小于均值的30％(当电流小于200pA时)可认为是稳定的，若不稳定，将不采取该浓度数据。
通过PatchMaster软件进行刺激发放及信号采集；膜片钳放大器放大信号，滤波为10KHz。
使用FitMaster，EXCEL，Graphpad Prism和SPSS 21.0等进行进一步数据分析和曲线拟合。数据均以均值、标准差表示。
在数据处理中，判断对hERG的阻断效应时，将尾电流的峰值和其基线进行校正。用尾流的抑制率表示不同浓度下各化合物的作用。抑制率％＝100×(给药前尾电流峰值-给药后尾电流峰值)/给药前尾电流峰值。所有细胞各个浓度的抑制率的SD≤15，作为可接受标准(除异常数据外)。
IC50数值由Hill方程进行拟合所得(如果适用)：
本实验由上海美迪西完成。
2)实验结果
阳性化合物特非那定对hERG电流的抑制作用浓度-反应曲线见图8。结果显示，特非那定对hERG钾通道的作用具有浓度依赖性，由Hill方程拟合得出特非那定对hERG电流抑制作用的IC50值为0.045μM(N＝3)，与文献报道相符。
化合物94最终浓度为0.3、1、3、10和30μM，细胞外液中DMSO最终浓度为0.3％。化合物94对hERG电流的抑制作用浓度-反应曲线见图8。在本实验条件下，化合物94在各检测浓度(0.3、1、3、10和30μM)下对hERG钾通道电流均无明显抑制作用，在30μM时对hERG钾通道电流的平均抑制率为3.40％(N＝3)，故化合物94对hERG电流抑制作用的IC50值大于30μM。这表明化合物94不会对hERG钾通道电流产生明显抑制作用而引起副作用。
综上所述，本发明提供的系列化合物能够保护HT-29细胞免受TSZ诱导的坏死样凋亡，且具有良好的激酶选择性。其作用原理是抑制RIPK1的自身磷酸化，影响了它下游RIPK3和MLKL的磷酸化，通过阻断程序性坏死信号通路发挥了抑制程序性坏死的作用。发明提供的系列化合物通过在体内抑制RIPK1发挥了显著的抗炎作用，且在各浓度下对hERG钾通道电流均无明显抑制作用，不会由于对hERG钾通道电流产生明显抑制作用而引起副作用。因而，本发明提供的系列化合物具有作为RIPK1抑制剂和抗炎药物的活性成分而进行应用的潜力。

Claims (7)

1.式Ⅲ或式Ⅳ所示化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
其中，R1选自氢、C1-C4烷基；R23选自氢、甲基；B环选自被一个、两个R22取代或未取代的苯基；其中，R22分别独立选自F、Cl、氰基、甲基、三氟甲基、甲氧基或三氟甲氧基。
2.具有如下结构的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
3.按照权利要求1或2所述的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐在制备RIPK1抑制剂中的用途。
4.按照权利要求1或2所述的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐在制备用于治疗炎症、免疫性疾病、神经退行性疾病或肿瘤的药物中的用途。
5.按照权利要求4所述的用途，其特征在于：所述药物用于治疗细胞程序性坏死相关的炎症反应、免疫性疾病、神经退行性疾病或肿瘤。
6.按照权利要求4或5所述的用途，其特征在于：所述炎症为结肠炎。
7.一种药物组合物，其特征在于：它是以权利要求1或2所述的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
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