CN114224875A - 醇类化合物的新用途及抗肿瘤药物 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种醇类化合物的新用途及抗肿瘤药物，该新用途为1‑异丙氨基‑3‑（4‑羟基‑1‑萘氧基）‑2‑丙醇或其药学上可接受的盐在制备具有抗肿瘤作用的药物中的用途。本申请的技术方案中，发明人通过实验意外发现，1‑异丙氨基‑3‑（4‑羟基‑1‑萘氧基）‑2‑丙醇或其药学上可接受的盐具有显著的抗肿瘤效应。

Description

醇类化合物的新用途及抗肿瘤药物
技术领域
本申请涉及医药技术领域，尤其涉及一种醇类化合物的新用途及抗肿瘤药物。
背景技术
普萘洛尔（1-异丙氨基-3-（1-萘氧基）-2-丙醇）作为心血管疾病的常用药物，可以非选择性阻断β受体，其在临床上用药为外消旋体形式，即R-普萘洛尔和S-普萘洛尔1：1混合形成，用于治疗心血管疾病。
根据药理学研究数据显示，普萘洛尔在肝脏被代谢成4-羟基普萘洛尔（1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇），是一种β-肾上腺素能受体拮抗剂，其药效和非选择性的普萘洛尔相似，因此，1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇也可以作为治疗心血管疾病的药物。
目前，1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇尚未被报道应用于抗肿瘤药物中。
发明内容
本申请提供一种醇类化合物的新用途及抗肿瘤药物，该醇类化合物具有显著的抗肿瘤效应。
第一方面，本申请提供了一种1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐在制备具有抗肿瘤作用的药物中的用途。
本申请的技术方案中，发明人通过实验意外发现，1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐具有显著的抗肿瘤效应。
在本申请的一些实施例中，所述肿瘤选自肺癌、胃癌、结肠癌、骨肉瘤和黑色素瘤的至少一种。
在本申请的一些实施例中，所述药物的剂型为溶液剂。
在本申请的一些实施例中，所述溶液剂中的1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐的浓度为0.1μM~50μM。
在本申请的一些实施例中，所述溶液剂中的1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐的浓度为5μM~50μM。
在本申请的一些实施例中，所述溶液剂中的1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐的浓度为10μM~50μM。
在本申请的一些实施例中，所述溶液剂中的1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐的浓度为20μM~50μM。
在本申请的一些实施例中，所述抗肿瘤作用包括抑制肿瘤细胞活力、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞生长和调控肿瘤相关基因表达中的至少一种。
第二方面，本申请还提供了一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包括1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐。
在本申请的一些实施例中，所述抗肿瘤药物为任意一种临床可接受的口服给药剂型或注射给药剂型。
说明书附图
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
图1中(A)为本申请一些实施例的普萘洛尔及其对映体和4-羟基普萘洛尔分别在不 同浓度与小鼠胃癌细胞活力的曲线关系图；
图1中(B)为本申请一些实施例的普萘洛尔及其对映体和4-羟基普萘洛尔分别在不同浓度 与小鼠结肠癌细胞活力的曲线关系图；
图1中(C)为为本申请一些实施例的普萘洛尔及其对映体和4-羟基普萘洛尔分别在不同浓 度与人胃癌细胞活力的曲线关系图；
图1中(D)为本申请一些实施例的普萘洛尔及其对映体和4-羟基普萘洛尔分别在不同浓度 与人结肠癌细胞活力的曲线关系图；
图2中(A)为本申请一些实施例的4-羟基普萘洛尔对小鼠结肠癌细胞处理24h后，细胞中 的AKT、ERK、MEK、p-AKT、p-ERK、p-MEK蛋白电泳图谱；
图2中(B)为本申请一些实施例的4-羟基普萘洛尔对小鼠结肠癌细胞处理24h后，细胞中 的AKT、ERK、MEK、p-AKT、p-ERK、p-MEK的表达量的示意图；
图2中(C)为本申请一些实施例的4-羟基普萘洛尔对人结肠癌细胞处理24h后，细胞中的 AKT、ERK、MEK、p-AKT、p-ERK、p-MEK蛋白电泳图谱；
图2中(D)为本申请一些实施例的4-羟基普萘洛尔对人结肠癌细胞处理24h后，细胞中的 AKT、ERK、MEK、p-AKT、p-ERK、p-MEK的表达量的示意图；
图3中(A)为本申请一些实施例的普萘洛尔在给药后，小鼠被处死后的肿瘤(MC38)体积 变化图；
图3中(B)为本申请一些实施例的普萘洛尔给药后，小鼠内的肿瘤体积与时间的变化曲线 图；
图3中(C)为本申请一些实施例的普萘洛尔在对小鼠给药14d后，其体内的肿瘤体积的柱 状图；
图3中(D)为本申请一些实施例的普萘洛尔在对小鼠给药14d后，其体重的柱状图；
图3中(E)为本申请一些实施例的普萘洛尔在对小鼠给药后，小鼠被处死后的脾脏重量的 柱状图；
图3中(F)为本申请一些实施例的普萘洛尔在对小鼠给药14d后，小鼠被处死后的肿瘤重 量的柱状图；
图4中(A)为本申请一些实施例的4-羟基普萘洛尔在给药后，小鼠被处死后的肿瘤(MC38) 体积变化图；
图4中(B)为本申请一些实施例的4-羟基普萘洛尔给药后，小鼠内的肿瘤体积与时间的变 化曲线图；
图4中(C)为本申请一些实施例的4-羟基普萘洛尔在对小鼠给药14d后，其体内的肿瘤体 积的柱状图；
图4中(D)为本申请一些实施例的4-羟基普萘洛尔在对小鼠给药14d后，其体重的柱状图；
图4中(E)为本申请一些实施例的4-羟基普萘洛尔在对小鼠给药后，小鼠被处死后的脾脏 重量的柱状图；
图4中(F)为本申请一些实施例的4-羟基普萘洛尔在对小鼠给药14d后，小鼠被处死后的 肿瘤重量的柱状图；
图5中(A)为本申请一些实施例的不同给药组在相同条件对小鼠给药，其肿瘤组织的免疫 组化图；
图5中(B)为本申请一些实施例的不同给药组在相同条件下对小鼠给药，肿瘤组织中的Ki- 67与平均光密度值的柱状图；
图5中(C)为本申请一些实施例的不同给药组在相同条件下对小鼠给药，肿瘤组织中的p- MEK与平均光密度值的柱状图；
图5中(D)为本申请一些实施例的不同给药组在相同条件下对小鼠给药，肿瘤组织中的p- ERK与平均光密度值的柱状图；
图5中(E)为本申请一些实施例的不同给药组在相同条件下对小鼠给药，肿瘤组织中p- AKT的平均光密度值的柱状图。
通过上述附图，已示出本申请明确的实施例，后文中将有更详细的描述。这些附图和文字描述并不是为了通过任何方式限制本申请构思的范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本申请的概念。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请的实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
1.试剂和实验方法
1.1常规细胞培养
细胞系MC38（小鼠结肠癌细胞）用含1%双抗体（青霉素、链霉素）、10%FBS（胎牛血清）的RPMI-1640培养基培养基进行培养；
细胞系HCT116（人源性结肠癌细胞）用含1%双抗体（青霉素、链霉素）、10% FBS（胎牛血清）的RPMI-1640培养基进行培养。
将上述细胞在5% CO2、37°C无菌恒温细胞培养箱内培养一段时间，显微镜下观察细胞汇合度约80%~90%左右时，弃去培养上清液，用灭菌后的PBS（不含钙镁）清洗两次后，弃去清洗液，再加入1mL 0.25%的胰酶，置于培养箱内消化1min~2min，显微镜下观察大部分细胞回缩且有部分细胞脱落，加入完全培养基终止消化。移液管轻轻吹打贴壁细胞数次，尽量使细胞处于单细胞状态。将细胞悬液800RPM条件下离心5min，弃去上清液。用新鲜的培养基重悬细胞后分到新培养瓶，置于恒温培养箱中继续培养，待细胞贴壁完全之后，24h之后更换对应的完全培养基继续培养，密切关注细胞状态，如果细胞有污染或者疑似污染的情况及时处理，以免对后续实验产生不良后果。
1.2 CCK8法检测细胞活力
收集对数生长期MFC、MC38、SGC7901、HCT116细胞，离心后用适量的完全培养基重悬。细胞计数后，用培基稀释至合适浓度，每100µL细胞悬液含3000~5000个细胞，用排枪依次接种在96孔板中,设置3个复孔。将培养板放在培养箱中预培养24h后，吸弃培养基并加入不同浓度的普萘洛尔(PPL)、R-普萘洛尔（R-PPL）、S-普萘洛尔（S-PPL）、4-羟基普萘洛尔（4-OH PPL）继续培养48h，弃去培基，避光分别加入100µL含十分之一体积CCK8试剂的不含血清培基，37℃下避光孵育1h-2h,用酶标仪测定在450nm处的吸光度（OD值），按照说明书的指示分析细胞的相对增殖率，独立重复本实验3次，实验结果如图1所示。
1.3Western Blotting检测蛋白表达
1.3.1细胞总蛋白的提取
1)每孔含105个细胞。待细胞完全贴壁后吸弃培基，PPL、R-PPL、S-PPL、4-OH PPL分别处理24h。
2）以下过程都需要在冰上操作保持低温环境，以防止蛋白的快速降解。使用灭过菌的细胞刮将细胞轻轻地刮下，移液枪将细胞悬液转移至1.5 mL的EP管中。
3）EP管放置在低温高速离心机中离心，设置温度为4°C，转速3000 rpm离心5min，弃掉EP管中的上清PBS。
4）将RIPA裂解液、磷酸酶抑制剂和PMSF按体积比为100:1:1混合均匀后，每个EP管中加入50 µL的混合液（根据细胞数量及特性可做适当调整），移液枪轻柔吹打混合均匀（注意移液枪的枪头需要一直保持在细胞裂解液液面以下，避免产生过多的气泡），放置在冰上30min（防止蛋白降解），每10min使用涡旋机震荡充分的混匀，避免细胞裂解不足。
5）设置温度4°C，转速14000 rpm/min离心20min，用移液枪取上清约30 µL，注意小心吸取，切勿吸到下层沉淀。
6）将已经裂解好的蛋白分装到200 µL的EP管中，置于超低温冰箱备用。
1.3.2BCA法测定蛋白浓度
1）提前配制好显色反应液：根据实验需求量，BCA试剂A液与试剂B液按照50:1比例充分混合均匀，将絮状沉淀充分混匀待用；
2）取100µL蛋白标准品溶液（BSA，2µg/µL），在96孔板中加入蛋白标准品，PBS稀释使其最终浓度为0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，同时在96孔板中加入10µL的待测蛋白样品。将提前配制好显色反应液BCA工作液分别加入到标准品和样品孔，每孔总体积为200µL，锡箔纸包裹外表保持避光，将96孔板置于37°C恒温培养箱中反应0.5h。
3）绘制标准曲线：用酶标仪检测96孔板中样品在570nm波长处的OD值，相关系数（R）大于0.995，则认为蛋白浓度的测定值是可信的，根据标准曲线计算得到待测蛋白样品的浓度。
4）将蛋白样品用200µL的EP管进行分装，每管体积10µL，加入5×Loading buffer，充分混匀之后，水浴锅100°C煮10min使得蛋白变性。
1.3.3 Western Blot 实验步骤
1）分离胶制备：将玻璃板（长板和短板）、齿梳先用试管刷刷净，清洗夹板等配套仪器，自来水冲洗数遍，玻璃板（长板和短板）、齿梳需要再用ddH2O冲洗至少3遍，置于烤箱中进行烘烤干燥；
检查玻璃板（长板和短板）是否有缺损，通风橱中固定玻璃板后加入适量双蒸水进行检漏，按照10%分离胶配制表进行配制分离胶，其中，表1为10mL分离胶的试剂配制用量表，可根据需要调整用量；
混匀后用移液枪匀速地将其注入玻璃板空隙，小心加入避免产生气泡而导致后续蛋白电泳条带不齐，分离胶的液面高度距离短玻璃板上边缘2cm左右为宜，最后缓慢地加入适量ddH2O液封，室温放置一段时间，待分离胶完全凝固，分离胶与ddH2O之间有明显分界线后，倒掉多余的ddH2O，然后用吸水纸吸尽多余的液体。
表1
试剂名称 用量（mL）
双蒸水 4.0
30%甲叉双丙烯酰胺 3.3
1.5M Tris-HCl（pH 8.8） 2.5
10%十二烷基磺酸钠 0.1
10%过硫酸铵 0.1
四甲基乙二胺 0.004
总体积 10
2）配制浓缩胶：在通风橱中操作，注意需在冰上进行操作防止浓缩胶凝固。根据浓缩胶配制表配制浓缩胶，将下列试剂按顺序迅速地加入到50mL的离心管中，移液枪轻轻吹匀，然后缓慢地将浓缩胶加入至短玻璃板最上端，迅速插上1.5mm的梳齿（根据需要选择15齿/10齿梳），室温放置一段时间（约20min，温度越高凝固时间越短），待浓缩胶完全凝固后取下胶板。其中，浓缩胶配制用量如表2所示。
表2
试剂名称 用量（mL）
双蒸水 2.7
30%甲叉双丙烯酰胺 0.67
1M Tris-HCl（pH 6.8） 0.5
10%十二烷基磺酸钠 0.04
10%过硫酸铵 0.04
四甲基乙二胺 0.004
总体积 8.4
3）蛋白上样：电泳槽固定好提前配制好的胶板，平稳向上拔出齿梳后，将配制好的电泳液倒入电泳槽内，去除上样孔中的气泡；将变性后的蛋白样品根据测定的浓度选择上样体积，每孔的上样量不得超过20µL（一般来说，蛋白上样量为20µL～40µL），最后在齿梳的最左侧以及最右侧加入4µL的Marker试液，在实验记录本上并做好相应的记录。
4）电泳：首先设置80V电压的恒压电泳将蛋白跑完浓缩胶（浓缩蛋白样本），蛋白电泳至分离胶界面时，改用120V电压恒压电泳，待蛋白电泳至距离分离胶下源约1cm处，结束电泳，关闭电源。
5）切胶：取出电泳好的胶板，根据蛋白marker试液的颜色找到目的蛋白的大概位置，用切胶板将胶多余的部分切除。
6）转膜：将45µm的PVDF膜提前浸泡在甲醇中，约5min，转膜海绵和滤纸浸于转膜缓冲液中；制作转膜“三明治”：按照顺序将转膜海绵－滤纸胶－PVDF膜－滤纸－转膜海绵在转膜液叠放整齐，避免PVDF膜和胶之间 产生气泡，否则会影响蛋白转移至PVDF膜上，然后将“三明治”压紧；PVDF膜置于正极，胶置于负极，夹紧转膜仪，放入转膜槽中250mA恒流转膜100min（可根据目的蛋白的大小适当调整转膜时间以及转膜恒流），转膜槽需要置于冰浴中用于降温，防止PVDF膜变干燥影响转膜效率。
7）封闭：室温条件下，将转好的膜放于TBST配制的5%BSA中封闭不超过2h，摇床低速（50rpm）孵育。
8）洗膜：封闭后用TBST缓冲液置于摇床清洗，转速约为140rpm，共计洗3次，每次10min。
9）加一抗：将AKT、p-AKT、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK一抗按1:1000或1:2000稀释后加入抗体孵育盒，4°C摇床孵育过夜，摇床转速使用低速约为50rpm。
10）洗膜：加入提前配制好的TBST缓冲液，置于摇床洗涤，转速约为140rpm，共计洗3次，每次10min。
11）孵育二抗：将HRP标记二抗用二抗稀释液1:5000稀释后加入到二抗孵育盒，在摇床上孵育适宜时间（60min~90min），摇床速度为50rpm。
12）洗膜：加入TBST缓冲液，置于摇床洗涤，转速约为140 rpm，共计洗3次，每次10min。
13）化学发光法进行扫描成像：接通电源，开机预热20min~30min，打开软件，将PVDF膜放入Bio-Rad成像仪指定区域，将发光试剂辣根过氧化物酶ECL中的A发光液和B发光液按1:1混合配制，混匀均匀后滴加到PVDF膜上，根据Marker指示位置将目标蛋白的检测区域全部覆盖上发光液，反应1min～2min后，进行曝光扫描成像，保存图像并导出，分析实验结果，其中，检测结果如图2所示。
1.4鼠源性结肠癌细胞皮下成瘤模型构建及治疗
1.4.1小鼠的饲养条件
小鼠的日常饲养：SPF环境，用于喂养小鼠的水，饲料，小鼠垫料以及笼子应定期高温或紫外消毒；
定期更换水、饲料、小鼠垫料；小鼠的饲养密度不宜过大，单笼小鼠不超过6只；每天观察小鼠的状况。
1.4.2皮下成瘤结肠癌细胞模型的构建
1）单细胞混悬液的制备：扩大培养MC38细胞，将对数生长期（活力超过95%）细胞消化，离心制成单细胞混悬液，细胞计数后，按照5×106个/mL的细胞密度储存在预冷的RPMI-1640无血清培养基中。
2）皮下成瘤：提前用剃毛器将小鼠注射部位周围的毛发剃除，注射部位用复合碘消毒。并用棉签按压注射部位，防止细胞混悬液的流出，注射时不要将针插入至肌肉层，否则肿瘤转移会导致动物的死亡。
3）肿瘤种植成功后，需要每天观察动物的整体反应及皮下瘤体的生长情况，做好相应的实验记录。
4）药物剂量确定：MC38细胞106/100µL皮下成瘤于6周的雄性C57小鼠，当瘤体体积达到50-100mm3后随机分组给药处理14d。对照组用PBS处理，给药组包括4个剂量组，分别为4羟基普萘洛尔0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg和8mg/kg，监测肿瘤体积以及小鼠体重变化,每组三只小鼠。
1.5.免疫组化检测肿瘤组织中的p-AKT、p-MEK、p-ERK、Ki67的表达
1.5.1石蜡切片制作
1）取材：新鲜组织用4%多聚甲醛固定液固定24h以上。从固定剂中取出组织，并用通风橱中的手术器械修剪目标部位。将切下的组织样本和相应的标签纸置于脱水箱中进行脱水。
2）脱水浸蜡：将脱水箱置于脱水器中并以梯度乙醇脱水。75%酒精4h，85%酒精2h，90%酒精2h，95%酒精1h，无水乙醇I浸30min，无水乙醇II浸30min，醇苯浸5minD~10min，二甲苯I 5min~10min，二甲苯II 5min~10min，65°C融化石蜡I浸1h，65°C融化石蜡II浸1h，65°C融化石蜡III浸1h。
3）包埋：将浸蜡的组织样品置于包埋机，嵌入处理。首先将熔化的蜡置于包埋框架中，在蜡固化之前将组织从脱水箱中取出，并根据嵌入表面的要求放置包埋框架，并附着相应的标签纸。在−20°C冷却后，蜡固化，从嵌入框架中取出蜡块，并修整蜡块。
4）切片：将修整过的蜡块置于石蜡切片机的指定位置并切成4µm～5µm的切片。将切片漂浮在40°C温水中，将组织弄平，拾取载玻片，并将切片在60°C的烘箱中烘烤。烘烤后取出，室温下保存备用。
1.5.2石蜡切片免疫组化实验步骤
1）石蜡切片脱蜡：将切片至于二甲苯Ⅰ中15min，二甲苯Ⅱ放置15min，二甲苯III放置15min，无水乙醇Ⅰ中5min，无水乙醇Ⅱ中5min，85%酒精5 min，75%酒精5 min，用蒸馏水冲洗。
2）抗原修复：将组织切片置于装有柠檬酸盐抗原修复缓冲液（pH 6.0）的修复试剂盒中。将其置于微波炉中进行抗原修复，中火加热8 min至沸腾，然后停火8min，然后保温，然后转为低热7min。在该过程中，必须防止缓冲剂的过度蒸发，并且不要干燥片材。自然冷却后，将载玻片置于PBS缓冲液（pH 7.4）中，在脱色摇动器上轻轻摇动，洗3次，5min每次。
3）阻断内源性的过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢水溶液中，室温避光反应25min，再将载玻片置于PBS缓冲液（pH 7.4）中，轻轻摇动，洗3次，5min每次。
4）血清封闭：将3% BSA逐滴加在组织上，并在室温下封闭30min。（用兔血清封闭的一抗是山羊来源，其他来源用BSA阻断）。
5）加入一抗：轻轻去除封闭溶液，并将按一定比例制备的一抗滴加到切片中，将切片置于湿盒中孵育，4°C过夜。（需要在湿盒中加入少量水以防止抗体蒸发）。
6）加入二抗：玻片置于pH 7.4的PBS缓冲液中，脱色摇床漂洗3次，5min每次。在切片稍干后，将对应的预先稀释好的二抗（HRP标记）滴加于切片并在室温孵50min。
7）DAB显色：玻片置于pH7.4的PBS缓冲液中，脱色摇床漂洗3次，5 min每次。在切片稍干后，加入现配的DAB显色液到圈中，并在显微镜下控制着色时间，当切片变为棕黄色时，自来水洗切片，终止显色。
8）复染细胞核：复染3min苏木素，自来水洗涤，并用苏木素分化溶液分化几秒钟，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。
9）脱水封片：依次将切片置于75%酒精中5min，85%酒精中5min，无水乙醇Ⅰ放置5min，无水乙醇Ⅱ放置5min，二甲苯Ⅰ中5min，脱水至透明，将切片从二甲苯取出并稍晾干，并中性树胶封片。
10）在显微镜镜下，收集图像用于分析。
1.5.3石蜡切片免疫组化结果判读
苏木素染色细胞核是蓝色，DAB阳性表达是棕黄色。
1.6免疫组化评分
组织切片扫描及分析方法：
组织切片扫描仪型号Pannoramic MIDI，厂家：3D HISTECH。
移动成像，扫描组织切片形成文件。该文件包含所有的组织信息。使用Pannoramic查看器软件打开文件后，可以放大1到400倍的任何放大倍率，并可以在任何位置截取图像。
Quant center是与Pannoramic viewer配套的分析软件。扫描图片后，Quantcenter中的densito quant软件自动识别并将组织切片上的所有深棕色设置为强阳性、棕黄色为中等阳性、浅黄色为弱阳性、蓝色细胞核为阴性。此外，识别每个组织并分析强阳性、中度阳性、弱阳性和阴性区域的面积（单位：像素），得到阳性百分比。
H-SCORE是指组织化学评分（histochemistry score），是一种用于免疫组化的评分方法，将切片中阳性细胞数及其染色强度转化为相应的值，实现组织染色的半定量。
H-SCORE=∑（PI×I）=（percentage of cells of weak intensity×1）+（percentage of cells of moderate intensity×2）+percentage of cells of strongintensity×3）
其中，PI表示阳性细胞数占该样本中所有细胞的百分数；I代表着色强度。
1.7实验数据统计分析
通过Graphpad Prism 6.0版本进行重复测量分析本研究的实验数据，所有数据均由平均数±标准误（mean±SEM）来表示，单组组间差异采用（One-way ANOVA）方差分析中的最小显著差异检验（LSD-test），多组件差异采用（two-way ANOVA）方差分析中的 Tukey'smultiple comparisons test，以P <0.05判定有统计学差异。
2.实验结果
2.1普萘洛尔及其对映体及4-羟基普萘洛尔抑制肿瘤细胞的活力
通过CCK8实验检测细胞活力，结果如图1所示。将浓度分别为0μM、40μM、80μM、100μM、120μM、140μM和160μM的普萘洛尔、R-普萘洛尔、S-普萘洛尔，0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM 4-羟基普萘洛尔分别处理MFC（小鼠结肠癌细胞）细胞（结果如图1中（A））、MC38（小鼠胃癌细胞）细胞（结果如图1中（B））、SGC7901（人结肠癌细胞）（结果如图1中（C））、HCT116（人胃癌细胞）细胞（结果如图1中（D））细胞48h后，普萘洛尔及其两种对映体处理组细胞活力成浓度依赖性下降。普萘洛尔、R-普萘洛尔、S-普萘洛尔处理MFC细胞的IC50值分别为78μM，79.33μM，82.19μM。普萘洛尔、R-普萘洛尔、S-普萘洛尔处理MC38细胞的IC50值分别为97.02μΜ，90.18μM，99.38μM。普萘洛尔、R-普萘洛尔、S-普萘洛尔处理SGC7901细胞的IC50值分别为155.9μΜ，163.8μM，157.8μM。普萘洛尔、R-普萘洛尔、S-普萘洛尔处理HCT116细胞的IC50值分别为100.2μΜ，81.89μM，96.12μΜ。4-羟基普萘洛尔的IC50值显著低于其母药普萘洛尔和两种对映体，4-羟基普萘洛尔处理MFC细胞、MC38细胞、HCT116细胞、SGC7901细胞的IC50分别为2.6μΜ，4.8μΜ，5.6μΜ，16.9μΜ。
2.2 4-羟基普萘洛尔通过AKT/MAPK信号通路影响胃癌细胞增殖
为进一步阐明4-羟基普萘洛尔抑制细胞活力和诱导凋亡的具体机制，4-羟基普萘洛尔处理细胞24h后，Western blot检测MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT和p-AKT的表达，结果如图2中（A）和（C）所示，4-羟基普萘洛尔抑制了MC38、HCT116两个细胞株AKT/MAPK信号通路的表达。归一化处理数据后，对照组的相对灰度值为1，4-羟基普萘洛尔处理MC38细胞p-ERK、ERK、p-MEK、MEK、p-AKT、AKT的相对灰度值分别为0.57±0.13，0.72±0.19，0.75±0.05，0.69±0.06，0.62±0.12，0.63±0.09，具体参见图2中（B）。4-羟基普萘洛尔处理HCT116细胞p-ERK、ERK、p-MEK、MEK、p-AKT、AKT的相对灰度值分别0.41±0.0.13，0.78±0.15，0.73±0.06，0.75±0.12，0.72±0.07，0.54±0.23，具体参见图2中（D）。
2.3普萘洛尔对映体及4-羟基普萘洛尔抑制小鼠皮下结肠癌生长
体内实验采用6周龄的雄性小鼠作为动物模型，探讨普萘洛尔对映体及4-羟基普萘洛尔在动物水平对结肠癌生长的影响。
将MC38细胞按每只小鼠按106细胞数进行皮下成瘤后，瘤体达到50-100mm3左右(大约一周)，采用普萘洛尔（10 mg/kg/day，20mg/kg/day），R-普萘洛尔（10 mg/kg/day），S-普萘洛尔（10 mg/kg/day），4-羟基普萘洛尔（2 mg/kg/day，8 mg/kg/day）或PBS处理小鼠14d，结果显示普萘洛尔对映体及4-羟基普萘洛尔可以明显抑制肿瘤增长。其肿瘤体积分别为control vs P10（普萘洛尔采用的剂量为10 mg/kg/day）, 2408 ± 184.8 mm3 vs 1717± 261.2 mm3, p = 0.0561; control vs P20（普萘洛尔采用的剂量为20 mg/kg/day）,2408 ± 184.8 mm3 vs 1430 ± 283.2 mm3, p = 0.0160; control vs R10（R-普萘洛尔采用的剂量为10 mg/kg/day）, 2408 ± 184.8 mm3 vs 1586±281.7 mm3, p = 0.0348;control vs S10（S-普萘洛尔采用的剂量为10 mg/kg/day）, 2408 ± 184.8 mm3 vs 1137± 172.7 mm3, p = 0.0005（图3C）; control vs 4OH2（4-羟基普萘洛尔采用的剂量为2mg/kg/day）, 2408 ± 184.8 mm3 vs 1348 ± 343.6 mm3, p = 0.0216; control vs4OH8（4-羟基普萘洛尔采用的剂量为8 mg/kg/day）, 2408 ± 184.8 mm3 vs 613.0 ±93.81 mm3, p < 0.0001（图4C）。
2.4普萘洛尔对映体及其4-羟基普萘洛尔抑制小鼠肿瘤AKT/MAPK通路
通过流式细胞术检测免疫细胞在脾脏中以及肿瘤组织中的表达情况。根据实验设计进行染色，通过流式细胞术检测小鼠脾脏和肿瘤组织中的免疫细胞的比例，统计分析结果如下：皮下成瘤模型小鼠脾脏中，普萘洛尔组CD8+ T细胞的比例显著高于PBS组，p=0.0209，而阿替洛尔以及 ICI118，551组与对照组相比无明显的差异（图5A）。同时，流式细胞术还检测小鼠脾脏组织中CD4+T细胞上FoxP3表达，发现普萘洛尔可以抑制脾脏中 CD4+FoxP3+的表达（图5B）。而在黑色素瘤细胞B16F10皮下成瘤模型肿瘤组织中，利用免疫组化检测肿瘤组织中CD8+ T的浸润程度，发现普萘洛尔组CD8+T细胞的比例显著高于 PBS组和阿替洛尔以及ICI118，551处理组。
最后应说明的是：以上各实验例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实验例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实验例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实验例技术方案的范围。

Claims (10)

1.1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐在制备具有抗肿瘤作用的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、胃癌、结肠癌、骨肉瘤和黑色素瘤的至少一种。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型为溶液剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述溶液剂中的1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐的浓度为0.1μM~50μM。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述溶液剂中的1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐的浓度为5μM~50μM。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述溶液剂中的1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐的浓度为10μM~50μM。
7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述溶液剂中的1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐的浓度为20μM~50μM。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤作用包括抑制肿瘤细胞活力、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞生长和调控肿瘤相关基因表达中的至少一种。
9.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包括1-异丙氨基-3-（4-羟基-1-萘氧基）-2-丙醇或其药学上可接受的盐。
10.根据权利要求9所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物为任意一种临床可接受的口服给药剂型或注射给药剂型。
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