CN114196717A - 一种缓解化疗药物对肠黏膜损伤且提高抑瘤率的低分子量牡蛎酶解物制备方法及其应用 - Google Patents
一种缓解化疗药物对肠黏膜损伤且提高抑瘤率的低分子量牡蛎酶解物制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于功能食品生物技术领域,公开了一种牡蛎酶解物的制备方法和应用,牡蛎肉由胰蛋白酶水解,经分离得到,其小分子肽集中于1kDa以下,其与5‑FU联用时,200‑800mg/(kg·bw)范围时,可有效缓解S‑180荷瘤小鼠的肠黏膜损伤,小肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度和绒毛面积相对于5‑FU组均显著增加;同时提高抑瘤率到38.24~47.57%,较5‑FU单独使用有明显提高;在剂量为800mg/(kg·bw)时,显著增加荷瘤小鼠总蛋白、白蛋白以及免疫球蛋白含量,改善机体营养状况以及调节血清免疫抗体水平。本发明的低分子量牡蛎酶解物可应用于5‑FU联用的功能营养食品、特医食品或药物。
Description
技术领域
本发明属于功能食品技术领域,更具体地,涉及一种缓解化疗药物对肠黏膜损伤且提高抑瘤率的低分子量牡蛎酶解物制备方法及其应用。
背景技术
据文献统计,在接受常规化疗药物之一的5-FU化疗的患者当中大约有50~80%患者伴有肠道炎症的发生。尽管5-FU具有良好的抗肿瘤作用,但严重的副作用也影响患者生活质量及化疗效果。据研究报道,5-FU在抑制肿瘤生长的同时,也易对其他正常体细胞表现出细胞毒性,如会抑制更新周期快的肠黏膜上皮细胞正常增殖,并同时诱导由细胞因子介导的肠细胞凋亡和肠道微生物群落改变,进一步导致肠道黏膜炎症的发生和恶化,使患者在化疗期间出现食欲不振,腹泻,感染和疲倦等症状,降低化疗耐受力和效果。因此,在化疗期间针对伴随产生的肠道黏膜炎症和损伤给予适当的辅助保护治疗,可预期获得更好的化疗效果。
目前市面上针对化疗伴随产生的肠道黏膜炎症的辅助保护治疗和提高机体免疫方面的单一营养素如谷氨酰胺、精氨酸等被证实通过免疫反应、紧密连接蛋白的调节改善肠损伤后黏膜修复,在炎症过程的调控以及肠道微生物群落的调节中发挥关键作用。而近年来,酶工艺的发展为食源性原料活性成分的提取研究提供了高效的途径。专利201710770663.5公开了一种以50KD海地瓜藻聚糖硫酸酯为主要活性物质的方便粥用于化疗型肠粘膜炎治疗的制备方法,但其主要成分是由特殊菌酶解获得的海地瓜岩藻多糖硫酸酯,因其酶解菌种非常规食品添加剂,其作为制备食品手段原料的风险未明。
牡蛎作为我国产量最大的养殖贝类,富含蛋白质、维生素以及微量元素铜、锌、铁、锰和硒,同时也被证实含有丰富的必需氨基酸、牛磺酸、有益胆固醇以及ω-3不饱和脂肪酸等对人体健康有益的物质。从牡蛎提取制备的寡肽和多糖等活性物质大多具有免疫调节和抗肿瘤活性。专利201310399203.8公开了一种牡蛎多糖可作为肠内营养成分辅助化疗,但其主要通过调节肠道微生物菌群来起作用,且制备过程步骤繁复,需使用有机溶剂进行分离纯化才能获得目标活性多糖。专利201310437598公开了一种含牡蛎酶解肽的肠黏膜保护与修复肠内营养制品,但其分子量范围为5kDa以下,酶解物单独作用效果未明确。专利201811570057.X公开了一种酶解来源的牡蛎多糖和牡蛎多肽的肠内营养制剂,能够作为增强免疫功能为肿瘤患者提供肠内营养支持,但未阐明单一牡蛎多肽在患者肠内营养当中的作用。专利201810327326公开了两条牡蛎来源的肠黏膜上皮细胞增殖和前移促进作用的小分子肽,但其分子量均超过1kDa,且动物实验效果未明确。
现有技术亟需一种制备方法简单,动物实验效果明确的,且具有缓解化疗药物对肠黏膜损伤,辅助提高抑瘤率并提高机体免疫指标等效果的低分子量牡蛎酶解物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题,首先提供一种低分子量牡蛎酶解物的制备方法。
本发明的第二个目的是提供上述牡蛎酶解物的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种低分子量牡蛎酶解物的制备方法,包括以下步骤:
(1)牡蛎肉均质化:新鲜牡蛎肉预处理后,采用400-600W,微波加热处理25-45s,灭菌去内源酶活,后加入等重量蒸馏水,高速剪切均质化呈无肉眼可见颗粒物浆液;
(2)酶水解:均质化后,加入蒸馏水,调节pH为8,搅拌均匀预热至30-45℃,加入3000-4000U/g的胰蛋白酶,搅拌恒温并保持pH值为8的条件下,水解4-6小时;
(3)分离:酶解完成后加热至90-100℃,保持数分钟,待冷却后,过滤,滤过液经5000~8000×g离心,收集上清液;
(4)干燥:上清液经薄膜浓缩,再经冷冻干燥或喷雾干燥获得所述低分子量牡蛎酶解物。
本发明上述牡蛎酶解物的制备包括:微波加热处理、均质化、酶解、分离、干燥工序,相对于其他牡蛎酶解物的制备方法,本发明的制备方法工序简单,制备条件温和,制备时间短,牡蛎酶解彻底,且能得到大量低分子量的牡蛎酶解物,得到的牡蛎酶解物具备优良的应用效果。
海洋生物的内源酶以及微生物的作用,在合适条件下,可使宿主机体快速发生自溶或腐败,将导致水解并非严格按照外源酶特有剪切方式进行,影响产物活性。微波加热处理,还能使牡蛎蛋白质适度变性,有利于蛋白酶水解的进行,提高水解效率。因此本发明为减少不可控自溶水解问题,提升外源蛋白酶水解效率,经大量实验摸索出合适的微波功率及处理时长,以达到净化底物,提高水解速度的目的。
本发明还提供上述方法得到的牡蛎酶解物,该牡蛎酶解物的粗蛋白含量40.4g/100g,分子质量集中在1kDa以下,所占比例为92.18%,其中467Da以下的占比达83.17%,谷氨酸含量为5.8g/100g,必需氨基酸占总氨基酸含量的36.44%。
本发明上述牡蛎酶解物在与化疗药5-FU联合使用时所具备的减轻化疗副作用下的肠黏膜损伤、提高抑瘤率以及提高机体免疫力的作用疗效,具体如下:该低分子量酶解物与5-FU联用时,在剂量范围内均可有效缓解S-180荷瘤小鼠的肠黏膜损伤,上皮细胞无出现明显坏死和脱落等现象,使小肠隐窝形态恢复到正常状态,维持绒毛结构的相对完整性,小肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度和绒毛面积相对于5-FU组均显著增加(p<0.01、p<0.001),同时,该酶解物辅助提高5-FU对S-180荷瘤小鼠的抑瘤率,200、400、800mg/(kg·bw)剂量联用组的抑瘤率分别为38.24%、46.27%、47.57%,呈现剂量依赖性,400mg/(kg·bw)剂量联用组、800mg/(kg·bw)剂量联用组较5-FU单独使用(31.00%)有明显提高(p<0.01,p<0.001)。在机体血液免疫方面,800mg/(kg·bw)剂量联用组能显著增加S-180荷瘤小鼠的机体总蛋白、白蛋白以及免疫球蛋白含量(p<0.05、p<0.01、p<0.001),明显改善机体营养状况以及调节血清免疫抗体水平。上述结果提示该低分子量的牡蛎肉胰蛋白酶水解物具有作为化疗过程辅助治疗营养食品,特医食品和药物的潜力,以期缓解肠黏膜损伤和提升机体化疗耐受力。
因此,本发明还提供上述牡蛎酶解物在制备具有下述效果的产品中的应用;
(1)减轻5-FU化疗下的肠黏膜损伤;和/或,
(2)辅助提高抑瘤率;和/或,
(3)提高机体免疫。
优选的,所述产品选择保健品、营养品、特医食品、药物。
优选的,在机体免疫方面,所述牡蛎酶解物提高了IgA、IgM、IgG、补体C4水平。
优选的,在减轻肠黏膜损伤方面,所述牡蛎酶解物改善了小肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度和绒毛面积。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明通过优化牡蛎酶解物的制备方法,得到了一种低分子量牡蛎酶解物,可显著缓解5-FU导致的肠黏膜损伤、辅助提高抑瘤率,并可以提高机体免疫力,有利于提高化疗患者耐受力,提升化疗效果;其具有易于制备的优点,只需要搅碎、酶解、离心和干燥即可获得;其具有易吸收的优点,其肽类主要成分分子量低于1kDa,有利于快速吸收利用,适合化疗过程的高效营养补充;其具有无毒副作用,食用安全的优点,原料来源于食材牡蛎,采用食品工业允许的常用工艺和方法加工而成。
本发明以牡蛎肉制备胰蛋白酶水解物,可应用于肿瘤化疗辅助治疗,保护肠道屏障及提高机体耐受力的功能性食品、特医食品或药物。
附图说明
图1为实施例1得到的牡蛎酶解物的相对分子量分布图;
图2为实施例1的牡蛎酶解物联合5-FU抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长的效果图,图中,与模型组比较*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001,与5-FU组比较#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001,与正常组比较△p<0.05、△△p<0.01、△△△p<0.001;
图3为实施例1的牡蛎酶解物缓解5-FU对S180荷瘤小鼠肠黏膜损伤的效果图,图中,与模型组比较与模型组比较*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001,与5-FU组比较#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是,对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明,但并不构成对本发明的限定。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例以及实验例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料;所用的设备,如无特殊说明,均为常规实验设备。
文中所用的胰蛋白酶为Sigma胰蛋白酶(T1426),≥10,000BAEE units/mg。
实施例1低分子量牡蛎酶解物的制备
包括以下步骤:
(1)牡蛎肉均质化:新鲜牡蛎肉,剔除颜色较深的内脏和裙边,使用每100g肉500w-35s的微波加热处理,灭菌去内源酶活,后加入等重量4℃蒸馏水,高速剪切均质化呈无肉眼可见颗粒物浆液;
(2)酶水解:均质化后,再加入牡蛎肉2倍重量蒸馏水,使用NaOH溶液调节pH为8,搅拌均匀预热至37℃,加入3500U/g的胰蛋白酶,搅拌恒温并保持pH值为8的条件下,水解5小时;
(3)分离:酶解完成后加热至95℃,保持5分钟,待冷却后,过200目筛网,滤过液经5000~8000×g离心,收集上清液;
(4)干燥:上清液经薄膜浓缩,再经冷冻干燥或喷雾干燥获得所述低分子量牡蛎酶解物。
实施例2低分子量牡蛎酶解物的组成分析
具体操作包括以下步骤:
(1)配制样品溶液浓度为3mg·mL-1,采用凝胶排阻色谱进行牡蛎酶解物分子量分布的测定。具体条件如下:色谱柱TSK gelG2000SWXL(300mm×7.8mm),流动相:0.1%TFA-乙腈:0.1%TFA-水=20:80(v/v),监测波长220nm,流速0.5mL·min-1,柱温35℃,进样量5μL。以细胞色素C(M:12355),抑肽酶(M:6511),杆菌肽(M:1422),L-氧化型谷胱甘肽(M:612.63)和苯丙氨酸(M:165.2)作为相对分子质量标准,标准品分子量的对数(log Mw)及洗脱时间(t)的标准曲线为logMw=-0.0154t2+0.2914t+2.8323(R2=0.9989)。
(2)水分的测定依照直接干燥法(GB 5009.3-2016),灰分的测定依照食品中总灰分的测定(GB 5009.4-2016),蛋白质的测定依照凯氏定氮法(GB 5009.5-2016),脂肪的测定依照酸水解法(GB 5009.6-2016),总糖的测定依照苯酚硫酸法(GB/T 9695.31-2008)进行牡蛎酶解物组成成分分析。
(3)水解氨基酸的测定依照酸水解法(GB 5009.124—2016),色氨酸的测定则采用碱水解法进行氨基酸含量分析。
结果如图1、表1和表2所示,该牡蛎酶解物的粗蛋白含量40.4g/100g,分子质量主要集中在1kDa以下,所占比例为92.18%,其中467Da以下的占比达83.17%,谷氨酸含量为5.8g/100g,必需氨基酸占总氨基酸含量的36.44%,提示牡蛎肉经过胰蛋白酶水解之后产生大量的小分子肽和寡肽等小分子物质,可能具有更高的生物利用度并发挥重要的生物活性功能。
表1实施例1中牡蛎酶解物的一般营养成分组成
项目 | 水分 | 蛋白质 | 脂肪 | 灰分 | 总糖 |
含量(g/100g) | 11.4 | 40.4 | 10.7 | 7.2 | 34.9 |
表2实施例1中牡蛎酶解物的氨基酸组成分析
注:*为必需氨基酸
实施例3低分子量牡蛎酶解物对5-FU所致S180荷瘤小鼠肠黏膜损伤的缓解作用
(1)动物造模、试验分组及给药
将0.2mL S180细胞株悬液注射至小鼠腹腔,共注射5只,待小鼠腹部明显肿胀,即为出现腹水,说明瘤株已存活,将小鼠颈椎脱臼处死,每只小鼠收集3-5mL腹水,吸取0.1mL悬液,用生理盐水稀释并调整为细胞浓度至2.6×107个/mL进行皮下注射,按每只0.2mL接种于实验小鼠右前肢腋窝皮下。
选取造模成功的小鼠随机分组,每组7-10只小鼠,分别为模型对照组、牡蛎酶解物低、中、高剂量组、5-氟尿嘧啶阳性对照组,另设一组无任何处理的正常对照组。造模成功后第2天开始给药,共连续15天,牡蛎酶解物低、中、高剂量组分别命名为OYH-L、OYH-M、OYH-H,各灌胃200mg·kg-1、400mg·kg-1、800mg·kg-1,每天一次。其中牡蛎酶解物三个剂量组和5-FU组小鼠隔两天腹腔注射一次氟尿嘧啶溶液(30mg·kg-1),正常对照组和模型对照组在试验期间每天灌胃给予等体积生理盐水。
(2)低分子量酶解物联合5-FU对荷瘤小鼠体重及肿瘤的影响
受试期间,每天观察小鼠外观,包括毛色,摄食饮水,精神状态以及活动情况。同时,每7天记录一次小鼠体重;每3天测量一次肿瘤的大小,计算其肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)=长(mm)×宽(mm)×高(mm)/2。给药结束后次日,将小鼠颈椎脱臼处死,剥离出肿瘤块称重记录并计算抑瘤率。
抑制率%=[(模型组瘤重-给药组瘤重)/模型组瘤重]×100%。
结果如图2和表3所示,各组小鼠的体重在用药过程中均呈现稳定增长的趋势。与模型组相比,经过5-FU单独用药后,荷瘤小鼠的最终体重相对降低(p<0.001)。但经过联合用药后,与5-FU组相比,中高剂量组小鼠的最终体重相对增加(p<0.05)。同时,与模型组和5-FU组相比,中高剂量OYH与5-FU的联合用药后,小鼠肿瘤体积明显减小(p<0.001),肿瘤重量也显著降低(p<0.01),三个剂量组的抑瘤率分别为38.24%、46.27%、47.57%,呈现剂量依赖性。
表3实施例1的牡蛎酶解物联合5-FU对S180荷瘤小鼠体重、瘤重和抑瘤率的影响
注:表中,与模型组相比*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001,与5-FU组比较#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001,与正常组比较△p<0.05、△△p<0.01、△△△p<0.001。
(3)低分子量牡蛎酶解物联合5-FU对荷瘤小鼠肠组织病理学的影响
截取小肠组织2cm,经中性甲醛固定,石蜡包埋,常规脱水后,进行苏木精-伊红染色,光镜下进行小肠病理学形态观察,拍照记录小肠黏膜各层的组织学形态,并测量小肠绒毛平均高度、绒毛平均面积、黏膜平均厚度和隐窝深度。
如图3所示,单独给予5-FU的小鼠小肠镜下可见小肠隐窝数量明显减少,结构基本消失,绒毛上皮细胞明显萎缩变性、坏死脱落,进而导致腺腔明显扩张,并且黏膜固有层和黏膜下层均有大量炎性细胞浸润;5-FU组小鼠的小肠绒毛高度、绒毛表面积和黏膜层宽度相对于模型组均显著减少(p<0.001)。各剂量组小鼠小肠隐窝形态明显,绒毛结构相对完整,上皮细胞无明显坏死和脱落现象,小肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度和绒毛面积相对于5-FU组均显著增加(p<0.01、p<0.001),明显改善了5-FU造成的小肠隐窝和绒毛结构的破坏,维持肠道内环境的稳态。
(4)低分子量牡蛎酶解物联合5-FU对荷瘤小鼠机体外周血免疫的影响
给药结束后次日,小鼠眼眶采血0.3mL,利用全自动血液分析仪测定小鼠血常规,检验项目包括红细胞数目,白细胞数目,红细胞压积、血红蛋白、血小板总数,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞;全血以3000rpm·min-1离心20min后,取上层血清进行血液生化指标测定,根据各试剂盒说明书操作步骤检测血清中总蛋白,白蛋白,转铁蛋白和前白蛋白,补体C3、C4,免疫球蛋白IgM、IgA、IgG含量。
结果如表4所示,与模型组和5-FU组相比,在联合给药下各剂量组的S180荷瘤小鼠白细胞数目和中性粒细胞含量均降低,中低剂量组的单核细胞含量均降低,与模型组相比具有显著性差异(p<0.05、p<0.001)但相对于5-FU组无统计学意义(p<0.05)。然而,与模型组和5-FU组相比,在联合给药下各剂量组的S180荷瘤小鼠淋巴细胞含量均增加,低剂量组的嗜酸性粒细胞含量增加,与模型组相比具有显著性差异(p<0.05、p<0.01),但与5-FU组相比均无统计学意义(p<0.05),提示牡蛎酶解物对免疫细胞数量仅产生轻微影响。在OYH与5-FU联合给药下,高剂量组的总蛋白和白蛋白含量与模型组、5-FU组相比均明显增加(p<0.01、p<0.001)。中、高剂量组的IgA和IgM水平与模型组、5-FU组相比均明显增加(p<0.05、p<0.01、p<0.001),高剂量组的IgG水平与5-FU组相比显著增加(p<0.05);各剂量组的补体C4水平与模型组相比降低(p<0.05、p<0.01),与5-FU组相比略增加,但无显著性差异(p>0.05),提示牡蛎酶解物可有效减少机体蛋白质的丢失来调节机体免疫。
表4实施例1的牡蛎酶解物联合5-FU对S180荷瘤小鼠机体血液免疫的影响
注:表中,与模型组相比*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001,与5-FU组比较#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。
对比例1未经微波处理对牡蛎酶解物的影响
本对比例牡蛎酶解物的制备方法包括以下步骤:
(1)牡蛎肉均质化:新鲜牡蛎肉,剔除颜色较深的内脏和裙边,后加入等重量4℃蒸馏水,高速剪切均质化呈无肉眼可见颗粒物浆液;
(2)酶水解:均质化后,再加入牡蛎肉2倍重量蒸馏水,使用NaOH溶液调节pH为8,搅拌均匀预热至37℃,加入3500U/g的胰蛋白酶,搅拌恒温并保持pH值为8的条件下,水解5小时;
(3)分离:酶解完成后加热至95℃,保持5分钟,待冷却后,过200目筛网,滤过液经5000~8000×g离心,收集上清液;
(4)干燥:上清液经薄膜浓缩,再经冷冻干燥或喷雾干燥获得所述低分子量牡蛎酶解物。
在第(3)步筛网过滤时,见明显未水解完成肌肉组织,滤过液经离心后,沉淀物质较经微波处理后相同条件水解的工艺(实施例1)多,提示水解未完全。经水解度分析,实施例1的酶解液水解度DH为33.45%,本对比例的水解度DH-微波为28.81%。
对比例2低功率微波处理对牡蛎酶解物的影响
本对比例牡蛎酶解物的制备方法包括以下步骤:
(1)牡蛎肉均质化:新鲜牡蛎肉,剔除颜色较深的内脏和裙边,使用每100g肉300w的微波加热处理35s,灭菌去内源酶活,后加入等重量4℃蒸馏水,高速剪切均质化呈无肉眼可见颗粒物浆液;
(2)酶水解:均质化后,再加入牡蛎肉2倍重量蒸馏水,使用NaOH溶液调节pH为8,搅拌均匀预热至37℃,加入3500U/g的胰蛋白酶,搅拌恒温并保持pH值为8的条件下,水解5小时;
(3)分离:酶解完成后加热至95℃,保持5分钟,待冷却后,过200目筛网,滤过液经5000~8000×g离心,收集上清液;
(4)干燥:上清液经薄膜浓缩,再经冷冻干燥或喷雾干燥获得所述低分子量牡蛎酶解物。
在第(3)步筛网过滤时,见未水解完成肌肉组织,滤过液经离心后,沉淀物质较经微波处理后相同条件水解的工艺(实施例1)多,提示水解未完全。经水解度分析,本对比例的水解度DH-低功微波为31.27%。
对比例3短时间微波处理的对牡蛎酶解物的影响
本对比例牡蛎酶解物的制备方法包括以下步骤:
(1)牡蛎肉均质化:新鲜牡蛎肉,剔除颜色较深的内脏和裙边,使用每100g肉500w的微波加热处理20s,灭菌去内源酶活,后加入等重量4℃蒸馏水,高速剪切均质化呈无肉眼可见颗粒物浆液;
(2)酶水解:均质化后,再加入牡蛎肉2倍重量蒸馏水,使用NaOH溶液调节pH为8,搅拌均匀预热至37℃,加入3500U/g的胰蛋白酶,搅拌恒温并保持pH值为8的条件下,水解5小时;
(3)分离:酶解完成后加热至95℃,保持5分钟,待冷却后,过200目筛网,滤过液经5000~8000×g离心,收集上清液;
(4)干燥:上清液经薄膜浓缩,再经冷冻干燥或喷雾干燥获得所述低分子量牡蛎酶解物。
在第(3)步筛网过滤时,见未水解完成肌肉组织,滤过液经离心后,沉淀物质较经微波处理后相同条件水解的工艺(实施例1)多,提示水解未完全。经水解度分析,本对比例的水解度DH-短时微波为30.53%。
对比例4长时间微波处理的对牡蛎酶解物的影响
本对比例牡蛎酶解物的制备方法包括以下步骤:
(1)牡蛎肉均质化:新鲜牡蛎肉,剔除颜色较深的内脏和裙边,使用每100g肉500w的微波加热处理50s,灭菌去内源酶活,后加入等重量4℃蒸馏水,高速剪切均质化呈无肉眼可见颗粒物浆液;
(2)酶水解:均质化后,再加入牡蛎肉2倍重量蒸馏水,使用NaOH溶液调节pH为8,搅拌均匀预热至37℃,加入3500U/g的胰蛋白酶,搅拌恒温并保持pH值为8的条件下,水解5小时;
(3)分离:酶解完成后加热至95℃,保持5分钟,待冷却后,过200目筛网,滤过液经5000~8000×g离心,收集上清液;
(4)干燥:上清液经薄膜浓缩,再经冷冻干燥或喷雾干燥获得所述低分子量牡蛎酶解物。
在第(3)步筛网过滤时,未见明显的肌肉组织,提示水解较完全,经水解度分析,本对比例的水解度DH-长时微波为32.44%。
对比例5未经微波处理的牡蛎酶解物联合5-FU对S180荷瘤小鼠抑瘤率的影响
本对比例牡蛎酶解物的制备方法包括以下步骤:
(1)牡蛎肉均质化:新鲜牡蛎肉,剔除颜色较深的内脏和裙边,后加入等重量4℃蒸馏水,高速剪切均质化呈无肉眼可见颗粒物浆液;
(2)酶水解:均质化后,再加入牡蛎肉2倍重量蒸馏水,使用NaOH溶液调节pH为8,搅拌均匀预热至37℃,加入3500U/g的胰蛋白酶,搅拌恒温并保持pH值为8的条件下,水解5小时;
(3)分离:酶解完成后加热至95℃,保持5分钟,待冷却后,过200目筛网,滤过液经5000~8000×g离心,收集上清液;
(4)干燥:上清液经薄膜浓缩,再经冷冻干燥或喷雾干燥获得所述低分子量牡蛎酶解物。
将本对比例制备得到的牡蛎酶解物联合5-FU研究对S180荷瘤小鼠的抑瘤率的影响,其研究步骤同实施例3的步骤(1)和步骤(2),其中步骤(1)酶解物的用量为400mg/kg,试验结果显示,给药结束后,瘤重为0.992±0.174g,抑瘤率为36.9%,与5-FU组处理无显著差异(p>0.05)。
对比例6轻度水解牡蛎酶解物联合5-FU对S180荷瘤小鼠的抑瘤率的影响
本对比例牡蛎酶解物的制备方法包括以下步骤:
(1)牡蛎肉均质化:新鲜牡蛎肉,剔除颜色较深的内脏和裙边,使用每100g肉500w-35s的微波加热处理,灭菌去内源酶活,后加入等重量4℃蒸馏水,高速剪切均质化呈无肉眼可见颗粒物浆液;
(2)酶水解:均质化后,再加入牡蛎肉2倍重量蒸馏水,使用NaOH溶液调节pH为8,搅拌均匀预热至37℃,加入3500U/g的胰蛋白酶,搅拌恒温并保持pH值为8的条件下,水解3小时;
(3)分离:酶解完成后加热至95℃,保持5分钟,待冷却后,过200目筛网,滤过液经5000~8000×g离心,收集上清液;
(4)干燥:上清液经薄膜浓缩,再经冷冻干燥或喷雾干燥获得所述低分子量牡蛎酶解物。
将本对比例制备得到的牡蛎酶解物联合5-FU研究对S180荷瘤小鼠的抑瘤率的影响,其研究步骤同实施例3的步骤(1)和步骤(2),其中步骤(1)酶解物的用量为400mg/kg,试验结果显示,给药结束后,瘤中为1.039±0.183g,抑瘤率为33.9%,与5-FU组处理无显著差异(p>0.05)。
综上所述,本发明说述的低分子量牡蛎酶解物与5-FU的联合使用在可明显提高小鼠抑瘤率的同时有效减轻5-FU造成的肠道黏膜损伤,显著增加小肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度和绒毛面积,明显改善了小肠隐窝和上皮绒毛的状态,维持肠黏膜屏障的完整。在机体免疫方面,能显著增加机体总蛋白、白蛋白以及免疫球蛋白含量,改善机体营养状况以及调节血清免疫抗体水平。上述结果显示出牡蛎肉的胰蛋白酶水解物具有作为化疗过程辅助治疗营养食品,起到肠黏膜保护和提升机体耐受力的应用潜力。
以上对本发明的实施方式作了详细说明,但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言,在不脱离本发明原理和精神的情况下,对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型,仍落入本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种低分子量牡蛎酶解物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)牡蛎肉均质化:新鲜牡蛎肉预处理后,采用400-600W,微波加热处理25-45s,灭菌去内源酶活,后加入等重量蒸馏水,高速剪切均质化呈无肉眼可见颗粒物浆液;
(2)酶水解:均质化后,加入蒸馏水,调节pH为8,搅拌均匀预热至30-45℃,加入3000-4000U/g的胰蛋白酶,搅拌恒温并保持pH值为8的条件下,水解4-6小时;
(3)分离:酶解完成后加热至90-100℃,保持数分钟,待冷却后,过滤,滤过液经5000~8000×g离心,收集上清液;
(4)干燥:上清液经薄膜浓缩,再经冷冻干燥或喷雾干燥获得所述低分子量牡蛎酶解物。
2.权利要求1所述方法得到的牡蛎酶解物,其特征在于,该牡蛎酶解物的粗蛋白含量40.4g/100g,分子质量集中在1kDa以下,所占比例为92.18%,其中467Da以下的占比达83.17%,谷氨酸含量为5.8g/100g,必需氨基酸占总氨基酸含量的36.44%。
3.权利要求2所述牡蛎酶解物在制备具有下述效果的产品中的应用;
(1)减轻5-FU化疗下的肠黏膜损伤;和/或,
(2)辅助提高抑瘤率;和/或,
(3)提高机体免疫。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述产品选择保健品、营养品、特医食品、药物。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述牡蛎酶解物提高了IgA、IgM、IgG、补体C4水平。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述牡蛎酶解物改善了小肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度和绒毛面积。
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