CN114176129B - 一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法 - Google Patents

一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法，包括以下步骤：步骤1）、开菲尔发酵剂的制备；步骤2）、鼠李糖乳杆菌发酵剂的制备；步骤3）、牛奶酒的制备；将开菲尔发酵剂与鼠李糖乳杆菌发酵剂分别按3%~6%（v/v）和3%~5%（v/v）的接种量，接种于12%的灭菌牛乳中，采用先好氧发酵20‑28 h后静置发酵20‑28 h再好氧发酵20‑28 h制备，得到提高发酵液综合抑菌能力的牛奶酒。通过本发明，是通过添加外源益生菌鼠李糖乳杆菌与Kefir发酵剂进行混合培养的方式，从而提高了牛奶酒的综合抑菌能力。即先好氧发酵再静置发酵，再好氧发酵的方法，与原专利中所使用的方法相比，对腐败病原菌的抑制能力得到提升。本发明可应用于制作调节肠道菌群发酵产品的制备。

Description

一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法
技术领域
本发明涉及一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法，属于食品生物发酵领域。
背景技术
开菲尔粒是由古代牧民将新鲜的牛乳或山羊乳放在羊皮袋中随身携带，在崎岖的路途中颠簸摇晃，在温暖的季节，牧民也常常将羊皮袋悬挂在屋外通过阳光照射进行发酵，袋内的牛羊乳会自然酸化形成一种起泡性饮料，循环往复，便在袋内和袋壁上形成一些不规则颗粒，即为开菲尔粒。
开菲尔是一种酸性酒精型发酵饮料，乳酸菌、酵母菌及醋酸菌是开菲尔微生物区系的主要组成成分，其特有的气味和风味是由于发酵过程中通过脂解、糖酵解和蛋白质水解产生的挥发性和非挥发性化合物。这些物质在调节人体健康、维持生理机能以及预防疾病等方面发挥积极作用。
大量研究表明，开菲尔经代谢产生的活性物质能够调节肠道内的微生态平衡，抑制肠道腐败菌的生长、缓解乳糖不耐受、增强免疫力，以及降胆固醇等益生功能。这些健康益处不仅归功于开菲尔的蛋白质、维生素、脂类、矿物质、氨基酸和微量成分，还因为在发酵过程中能产生有机酸、游离脂肪酸、生物活性肽、开菲尔多糖、细菌素及少量酒精等丰富的代谢产物。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术存在的问题，提供一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法。
本发明的目的是这样实现的：一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤1)、开菲尔发酵剂的制备；
将开菲尔粒按10％(w/v)的接种量接种到灭菌脱脂乳中活化两代后将开菲尔粒滤出，得到开菲尔母发酵剂；滤除开菲尔粒的发酵乳与改良保护剂1:1混合置于西林瓶中-80℃冻干，得到开菲尔发酵剂；
步骤2)、鼠李糖乳杆菌发酵剂的制备；
将鼠李糖乳杆菌按3％(v/v)的比例接种至MRS液体培养基中，于37℃下培养24h，活化两代后按3％(v/v)的比例接种到脱脂乳培养基中，于37℃培养17h后终止发酵，即得鼠李糖乳杆菌发酵剂；
步骤3)、牛奶酒的制备；
将开菲尔发酵剂与鼠李糖乳杆菌发酵剂分别按3％～6％(v/v)和3％～5％(v/v)的接种量，接种于12％的灭菌牛乳中，采用先好氧发酵20-28h后静置发酵20-28h再好氧发酵20-28h制备，得到提高发酵液综合抑菌能力的牛奶酒。
步骤3)中，开菲尔发酵剂与鼠李糖乳杆菌发酵剂接种于12％的灭菌牛乳中，在25℃下，先好氧发酵20-28h后静置发酵20-28h再好氧发酵20-28h，制备得到牛奶酒。
一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法用于制备乳酸菌饮料的应用。
一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法用于制备调节胃肠功能的活菌制剂的应用。
一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法用于制备调节胃肠功能的保健食品的应用。
所述鼠李糖乳杆菌发酵剂为鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301在脱脂乳中的培养物。
本发明方法先进科学，本发明使用传统开菲尔发酵液与鼠李糖乳杆菌hsryfm1301(专利文献“源于巴马长寿村的鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301的标志引物对、鉴定方法及其应用”中公开，其公开号CN 109439778A，公开日2019年03月08日)进行复配，从而提高kefir的综合抑菌能力及益生功能。
本发明是在现有发明申请(申请号201911213721.X)基础上进一步研究发现，可通过新的发酵方法进一步提高其抑菌能力。
为实现上述目的，本发明使用开菲尔发酵剂与鼠李糖乳杆菌发酵剂接种到灭菌牛乳中，分别在四种不同的培养条件下发酵，四种培养方式分别为摇床培养70-80h(简称：S)、先摇床培养20-28h后静置培养20-28h再摇床培养20-28h(简称：SAS)、静置培养70-80h(简称：A)、先静置培养20-28h后摇床培养20-28h再静置培养20-28h(简称：ASA)，通过对四种培养方式的比较，得出提高牛奶酒抑菌能力的最佳培养方法为SAS。
本发明的开菲尔发酵剂的制备：将开菲尔粒按10％(w/v)的接种量接种到灭菌脱脂乳中活化两代后将开菲尔粒滤出，即得开菲尔母发酵剂；滤除开菲尔粒的发酵乳与改良保护剂1:1混合置于西林瓶中-80℃冻干即得开菲尔发酵剂。
本发明的鼠李糖乳杆菌发酵剂的制备：将鼠李糖乳杆菌按3％(v/v)的比例接种至MRS液体培养基中，于37℃下培养24h，活化两代后按3％(v/v)的比例接种到脱脂乳培养基中，于37℃培养17h后终止发酵，即得鼠李糖乳杆菌发酵剂。
本发明中牛奶酒的制备：将开菲尔发酵剂与鼠李糖乳杆菌发酵剂分别按3％～6％(v/v)和3％～5％(v/v)的接种量，接种于12％的灭菌牛乳中，采用先好氧发酵20-28h后静置发酵20-28h再好氧发酵20-28h制备而得。
本发明中水分活度(简写：Aw)与pH的比较：采用水分活度仪扩散法及pH计，测定不同培养方式所得牛奶酒的Aw和pH，结果表明，SAS培养方式下牛奶酒，其Aw与pH较其他三组呈最低水平。
本发明中有机酸含量的比较：采用高效液相色谱法，测定牛奶酒上清液中5种有机酸的种类与含量，分别为酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸及富马酸。结果表明，SAS培养条件下牛奶酒，其酒石酸、乳酸及富马酸含量最高。
本发明中抑菌能力的比较：分别将金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、布氏假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌按1％的比例(v/v)接种于LB培养基，于37℃摇床培养12h，按此方法活化两代；采用单层琼脂平板扩散法测定四种培养方式下的牛奶酒对六株腐败菌的抑菌能力，结果表明，在SAS培养条件下，提高了牛奶酒对腐败菌的抑制能力，尤其是肠伤寒沙门氏菌及布氏假单胞菌。
经实验验证，本发明中的SAS培养方式，不仅可以显著提高开菲尔的产酸能力，也提高了牛奶酒的有机酸含量及其对腐败病原菌的抑制能力。同时，本发明提供了开菲尔发酵乳、开菲尔发酵乳酸菌饮料及开菲尔活菌粉剂的制备方法。
综上，本发明涉及一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法，该方法是通过添加外源益生菌鼠李糖乳杆菌与Kefir发酵剂进行混合培养的方式，从而提高了牛奶酒的综合抑菌能力。即先好氧发酵再静置发酵，再好氧发酵的方法，与原专利中所使用的方法相比，对腐败病原菌的抑制能力得到提升。本发明可应用于制作调节肠道菌群发酵产品的制备。
附图说明
图1为不同培养方式对牛奶酒酸度变化影响的折线图
图2为不同培养方式对牛奶酒pH及Aw影响的柱状图
图3为不同培养方式对牛奶酒对病原菌抑制能力的柱状图
图4为本发明与现有发明专利申请中的方法对病原菌抑制能力的柱状图(现有发明专利申请号201911213721.X)
具体实施方式
下面结合实施例、附图对本发明作进一步详述。
实施例1
1.开菲尔发酵剂的制备；
将开菲尔粒接种于12％灭菌后的脱脂乳培养基中，室温发酵24h，用50目筛过滤在无菌条件下分离开菲尔粒，转接活化3次。将活化好的开菲尔粒按6％(w/v)比例接种到12％脱脂乳培养基中，室温发酵后。取500μL开菲尔发酵液加入西林瓶内，再加入500μL预先制备的改良冻干保护剂，充分混匀后置于-80℃超低温冰箱预冻12h，然后置于真空冷冻干燥系统冻干46h，所得冻干片即为开菲尔发酵剂，保藏于-80℃的超低温冰箱。
2.鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵剂的制备；
将鼠李糖乳杆菌按3％(v/v)的比例接种至MRS液体培养基中，于37℃下培养24h，活化两代后按3％(v/v)的比例接种到脱脂乳培养基中，于37℃培养17h后终止发酵，即得鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵剂，于4℃冷藏备用。
3.牛奶酒的制备；
将开菲尔发酵剂按6％(v/v)的比例接种到脱脂乳培养基中，于37℃下培养14h，活化两代后，与上述制备好的鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵剂分别按3％～6％(v/v)和3％～5％(v/v)的比例，接种于12％的灭菌乳中。将接种好的样品在25℃，置于摇床培养70-80h(简称：S)、先摇床培养20-28h后静置培养20-28h再摇床培养20-28h(简称：SAS)、静置培养70-80h(简称：A)、先静置培养20-28h后摇床培养20-28h再静置培养20-28h(简称：ASA)；即得不同培养条件下的牛奶酒。
4.滴定酸度的测定；
参考GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》，测定在发酵过程中不同培养方式牛奶酒的酸度。称取5g牛奶酒样品，记录质量为M(g)，用40mL蒸馏水稀释后滴加酚酞指示剂，用0.1mol/L的NaOH滴定至为红色，30s内不为滴定终点，记录消耗的NaOH滴定量V(mL)，按公式计算样品酸度。
Figure GDA0004084280960000051
实验结果如图1所示，在前24h的发酵过程中，四种培养方式所得发酵乳酸度之间无显著差异(p＞0.05)，酸度范围在48.3-50.2°T；在24h-48h发酵过程中，四组发酵乳酸度稳步上升且出现差异，待72h发酵结束，SAS培养方式的酸度达最高水平，产酸能力最强，达125.2°T。
5.Aw及pH的测定；
参考GB 2009.238-2016.水分活度仪扩散法测定发酵结束后牛奶酒的Aw；采用FE20 pH计测定发酵结束后牛奶酒的pH。
实验结果如图2所示，四种不同培养方式下的牛奶酒，其中对照组为发酵前的Aw及pH。发酵结束后，Aw都有一定程度的降低，其中，SAS培养方式的Aw为0.908与其他三组相比差异显著(p＜0.05)。pH的测定结果与Aw也的结果呈现一定的正相关，在SAS组中达到最低，为4.17。每种微生物都有其生长的最低、最佳、最高水分活度，当Aw在0.99～0.90范围内可抑制大多数细菌的生长，而抑制多数细菌增长的Aw≈0.91。
6.有机酸含量的测定；
采用高效液相色谱法测定牛奶酒发酵上清液中的乳酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸的含量。牛奶酒样品制备结束后，分别将四种培养方式下的牛奶酒至于离心管中，离心(8000r/min,10min)后经0.45μm微孔滤膜过滤，置于样品瓶中。
色谱分析条件：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×150mm，5μm)；流动相：用0.1％磷酸溶液和甲醇，体积比为97.5:2.5；流速：0.7mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：210nm。
表1不同培养方式牛奶酒有机酸的含量
Figure GDA0004084280960000061
注：同一行中的不同字母(a,b,c,d)表示显著差异(p＜0.05)；
“-”代表未检出。
实验结果如表1所示，在SAS培养过程中酒石酸、乳酸以及富马酸的含量最高，较其他三组具有显著差异(p＜0.05)；苹果酸则在摇床培养过程中含量最高。有机酸具有抑制肠道腐败菌的功效，而在SAS培养过程中提高了有机酸的含量从而赋予牛奶酒更强的抑菌作用。
7.抑菌能力的测定；
准备离心管若干，取原方法培养的牛奶酒与四种培养方式下的牛奶酒于离心管中，转速8000r/min，离心10min，发酵上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，4℃冷藏备用。将四种培养方式与原发明专利(申请号201911213721.X)中的发酵方法对腐败病原菌的抑制能力进行对比。
采用单层琼脂平板扩散法(打孔法：打孔器孔径8mm)，先将30mL灭菌的LB固体培养基(含琼脂2％)倾注于直径90mm的培养皿中，保持水平待其充分凝固作为底层，同时将指示菌稀释至107CFU/mL；打孔前先用无菌三角涂布棒将指示菌均匀涂布(100μL/板)；然后向各孔内注满处理好的发酵液(150μL/孔)，并做好标记；再将平板正置于20℃培养箱，充分扩散后，将平板移至37℃培养箱，倒置培养出圈；测量抑菌圈直径(含孔洞直径，抑菌圈直径8mm表示无抑菌作用)。测定采用十字交叉法，记录数据，取平均值。
实验结果如图3所示，本发明选用四种培养方式制备牛奶酒，测定牛奶酒的产酸能力及对腐败病原菌的抑制能力，发现该培养方式较其他组别，其抑菌能力提升了18％～44％；同时，四种培养方式与原发明专利中的方法(申请号201911213721.X)相比，采用本发明专利方法下的牛奶酒对枯草芽孢杆菌、沙门氏菌及布氏假单胞菌的抑制能力最强，抑菌圈直径均大于22mm，抑菌能力较原方法提升11％～40％。
实施例2
本实施例提供了一种具有抑菌能力牛奶酒的制备方法，该方法包括以下步骤。
开菲尔发酵剂的活化：将开菲尔母发酵剂按6％的比例接种到12％脱脂乳培养基中，在37℃下活化14h，按照此方法活化两次。
鼠李糖乳杆菌发酵剂的制备：将鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301按6％的比例接种到MRS液体培养基中，于37℃条件下培养24h，活化两次后，按3％的比例接种到脱脂乳培养基中，于37℃培养17h后终止发酵。
原料乳的制备：12％的新鲜生牛乳，加入6.5％的白砂糖，搅拌至充分溶解，过筛。
均质：充分混匀后，利用均质机在20mPa的压力下进行均质。
杀菌、冷却：均质结束后放入水浴锅中95℃巴氏杀菌15min，灭菌结束在室温下冷却。
接种：将开菲尔发酵剂与鼠李糖乳杆菌发酵剂分别按3％(v/v)的接种量，接种于至杀菌后的原料乳中。
发酵：将接种好的原料乳，在25℃、摇床130r/min条件下，先摇床培养20-28h后静置培养20-28h再摇床培养20-28h。
灌装：将发酵结束的牛奶酒放入包装容器中，于4℃储藏。
实施例3开菲尔芒果汁饮料的制备；
本实施例提供了一种具有益生功能的开菲尔芒果汁饮料的制备方法，该方法包括以下步骤。
开菲尔发酵剂的活化：将开菲尔母发酵剂按6％的比例接种到脱脂乳培养基中，在37℃下活化14h，按照此方法活化两次。
鼠李糖乳杆菌发酵剂的制备：将鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301按6％的比例接种到MRS液体培养基中，于37℃条件下培养24h，活化两次后，按3％的比例接种到脱脂乳培养基中，于37℃培养17h后终止发酵。
原料的制备：挑选新鲜无虫害的芒果，去皮去核，将果肉与水以1:1的比例加入至榨汁机中，榨汁30-40s，将打出的芒果汁使用纱布过滤，即得澄清无絮状物的芒果汁。
原料乳的制备：全脂乳配方为12％的全脂乳粉中加入6.5％的白砂糖，与芒果汁1:1调配。
均质：充分混匀后，利用均质机在20mPa的压力下进行均质。
杀菌、冷却：均质结束后放入水浴锅中95℃巴氏杀菌15min，灭菌结束在室温下冷却。
接种：将开菲尔发酵剂与鼠李糖乳杆菌发酵剂分别按3％(v/v)的接种量，接种于至杀菌后的原料乳中。
发酵：将接种好的原料乳在25℃、摇床130r/min条件下，先摇床培养20-28h后静置培养20-28h再摇床培养20-28h。
稳定剂的调配：将4.3-4.8％的木糖醇、0.1-0.3％的柠檬酸以及0.2-0.5％的复合稳定剂，复合稳定剂由黄原胶、琼脂、CMC-Na以及明胶混合调配而成。将复合后的稳定剂在95℃下杀菌15min，冷却后在无菌条件下加入牛乳酒中，调配混合均匀。
调酸：将加入稳定剂的复合发酵开菲尔芒果汁饮料混合均匀后，高速搅拌后将柠檬酸在10倍蒸馏水中溶解，缓缓加入至混合液中，甲酸结束之后持续搅拌10min，最终保持芒果汁发酵乳的pH值为4.15-4.25之间。
二次均质：最佳均质温度为23-28℃，均质压力18-20mPa时，产品的稳定性达到最佳。
灌装保存：将开菲尔芒果汁饮料放入玻璃包装容器中，即可食用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非是对本发明作其他形式的限制。任何熟悉本专业领域的技术人员可能利用以上叙述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例，所作的任何修改或等同替换，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤1）、开菲尔发酵剂的制备；
将开菲尔粒按10%w/v的接种量接种到灭菌脱脂乳中活化两代后将开菲尔粒滤出，得到开菲尔母发酵剂；滤除开菲尔粒的发酵乳与改良保护剂1:1混合置于西林瓶中-80℃冻干，得到开菲尔发酵剂；
步骤2）、鼠李糖乳杆菌发酵剂的制备；
将鼠李糖乳杆菌按3%v/v的比例接种至MRS液体培养基中，于37℃下培养24 h，活化两代后按3%v/v的比例接种到脱脂乳培养基中，于37℃培养17 h后终止发酵，即得鼠李糖乳杆菌发酵剂；
步骤3）、牛奶酒的制备；
将开菲尔发酵剂与鼠李糖乳杆菌发酵剂分别按3%~6%v/v和3%~5%v/v的接种量，接种于12%的灭菌牛乳中，在25℃下，采用先好氧发酵20-28 h后静置发酵20-28 h再好氧发酵20-28 h制备，得到提高发酵液综合抑菌能力的牛奶酒；
所述鼠李糖乳杆菌发酵剂为鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301在脱脂乳中的培养物。
2.权利要求1所述的方法用于制备乳酸菌饮料的应用。
3.权利要求1所述的方法用于制备调节胃肠功能的活菌制剂的应用。
4.权利要求1所述的方法用于制备调节胃肠功能的保健食品的应用。
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