CN114164298A - 抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10及其分子标记方法 - Google Patents

抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10及其分子标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10及其分子标记方法，属于植物分子遗传学技术领域。本发明利用水稻抗病品系I5与感病品种广恢998杂交和自交获得的F2群体进行QTL‑seq和遗传连锁分析，获得抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10，其位于分子标记N10‑31‑N10‑35之间，当存在位点qSRBSDV10时，使用分子标记N10‑31能够扩增出150bp的条带，使用分子标记N10‑35能够扩增出137bp的条带。本发明可通过特定分子标记来检测抗性材料I5及其衍生品种(系)中是否含有抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10，可预测其南方水稻黑条矮缩病抗性水平，大大提高选择效率。

Description

抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10及其分子标记方法
技术领域
本发明属于植物分子遗传学技术领域，尤其涉及抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10及其分子标记方法。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主要粮食，中国60％以上的人口以稻米为主食。南方水稻黑条矮缩病是一种由白背飞虱以持久增殖型方式传播的水稻病毒性病害。水稻各生长期均可受该病危害，苗期感病可造成严重矮缩、不抽穗或仅抽包颈穗，造成严重减产甚至绝收；分蘖期或拔节期感病，会导致稻穗变小、秕谷增多，造成减产。由于生产上抗该病的水稻品种稀少，本世纪以来，该病的发生给中国中南部、越南北部及日本南部的水稻生产造成极大损失。与普通水稻黑条矮缩病不同，南方水稻黑条矮缩病是一种以白背飞虱为主要传播媒介的水稻病毒病，其病原病毒为南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，简称SRBSDV)，是呼肠孤病毒科斐济病毒属第2组的一个新种。生产上针对此病害尚无有效措施，对该病的防治主要是使用化学药剂灭杀传毒媒介白背飞虱，但由于白背飞虱的种群数量巨大、迁飞性强，且耐药、传毒持久等特点，导致防治效果不佳，此外，过量使用化学农药还会污染环境，破坏生态系统。
种植抗病品种是防控水稻病害最经济、有效的措施之一，然而，当前对该病抗源发掘的报道较少，鉴定到的抗源有限，仅有少数关于南方水稻黑条矮缩病抗性基因/QTL定位的报道，定位抗性基因、利用紧密连锁的分子标记可加速抗病育种进程，因此，加强南方水稻黑条矮缩病抗性基因/QTL的发掘、开发与抗性基因紧密连锁的分子标记，对抗南方水稻黑条矮缩病水稻育种意义重大。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10、分子标记方法及其应用。本发明利用水稻抗病品系I5与感病品种广恢998杂交和自交获得的F2群体进行QTL-seq和遗传连锁分析，获得抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10，其位于分子标记N10-31-N10-35之间，当存在位点qSRBSDV10时，使用分子标记N10-31能够扩增出150bp的条带，使用分子标记N10-35能够扩增出137bp的条带。本发明可通过特定分子标记来检测抗性材料I5及其衍生品种(系)中是否含有抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10，可预测其南方水稻黑条矮缩病抗性水平，大大提高选择效率，对水稻抗病育种有重要的指导和实践意义。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10的特异性引物组合，具体序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示或如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示。
本发明还提供了一种用于检测抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10的分子标记，所述分子标记为N10-31或N10-35；所述分子标记N10-31的引物序列如SEQ ID No.1～2所示；所述分子标记N10-35的引物序列如SEQ ID No.3～4所示。
本发明还提供了一种含有所述引物组合的试剂盒。
本发明还提供了一种所述引物组合或所述分子标记或所述试剂盒在水稻育种中的应用。
本发明还提供了一种所述引物组合或所述分子标记或所述试剂盒在快速筛选抗南方水稻黑条矮缩病品种或者品系中的应用。
本发明还提供了一种抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10的分子标记方法，用分子标记N10-31或分子标记N10-35扩增水稻抗性材料I5及其衍生品种(系)DNA，如果用分子标记N10-31能扩增出150bp的条带，或用分子标记N10-35能扩增出137bp的条带，则标志着水稻材料中存在抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10；所述分子标记N10-31的引物序列如SEQ ID No.1～2所示；所述分子标记N10-35的引物序列如SEQ ID No.3～4所示。
本发明还提供了一种所述分子标记的筛选方法，包括以下步骤：(1)以抗南方水稻黑条矮缩病的普通野生稻导入系材料I5为供体，感南方水稻黑条矮缩病的栽培稻品种广恢998为受体，通过杂交和自交构建了一套水稻F2分离群体；(2)采用室内接种鉴定对上述群体的F2：3系进行南方水稻黑条矮缩病的抗性鉴定；(3)在F2群体中选取高抗和高感样本，提取DNA，对抗南方水稻黑条矮缩病基因进行基因定位；(4)在初定位区间，开发InDel标记，利用遗传连锁分析技术，结合分子标记带型及抗性表型数据，将目标基因限定在两个分子标记N10-31和N10-35之间；(5)获得抗南方水稻黑条矮缩病野生稻导入新材料I5抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10一个，位于分子标记N10-31-N10-35之间，通过所述分子标记来检测抗性品种I5及其衍生品种中是否含有该主基因位点，预测其南方水稻黑条矮缩病抗性水平。
优选的，所述步骤(3)中基因定位于第10染色体上。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
(1)本发明利用抗南方水稻黑条矮缩病的普通野生稻导入新材料I5与感病品种广恢998杂交和自交获得的F2进行关联分析和遗传连锁分析，获得一个抗南方水稻黑条矮缩病基因qSRBSDV10，通过与qSRBSDV10连锁的分子标记来检测抗性材料I5及其衍生品种(系)中是否含有抗南方水稻黑条矮缩病基因，可以预测其南方水稻黑条矮缩病的抗性水平，大大提高抗南方水稻黑条矮缩病水稻的选择效率。
(2)本发明所提供的抗南方水稻黑条矮缩病基因基因的分子标记方法，具有以下优点：
①本发明利用基于重测序技术的QTL-seq方法和InDel分子标记定位了水稻抗南方水稻黑条矮缩病，开发了与基因紧密连锁的分子标记，在鉴定南方水稻黑条矮缩病抗性时具有准确、高效、易用的特点。
②通过本发明分子标记定位的抗性基因位置明确，鉴定方便快捷。通过检测这些与抗南方水稻黑条矮缩病基因连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的南方水稻黑条矮缩病抗性水平，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有南方水稻黑条矮缩病抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于水稻育种，抗性基因的检测方便快速，不易受环境影响。
③辅助育种选择目标明确，效率高。以往的传统育种技术，在提高抗性育种方法中，通常利用含抗病基因的供体亲本与受体亲本进行杂交、多次回交或聚合复交，而且要对南方水稻黑条矮缩病的抗性进行单株选择，然而，由于南方水稻黑条矮缩病不能经过白背飞虱的虫卵传毒，要经过饲养白背飞虱、饲毒和接种传毒等复杂的鉴定过程，鉴定难度很大，表型鉴定的结果可靠性低；因此，抗南方水稻黑条矮缩病育种不仅费时费工，而且难度大、成本高。通过利用本发明中的分子标记检测南方水稻黑条矮缩病基因，可以在苗期就鉴定出抗南方水稻黑条矮缩病的单株，淘汰其它植株，不仅节约成本，而且大大提高了抗南方水稻黑条矮缩病水稻的选择效率。
附图说明
图1为实施例6中抗南方水稻黑条矮缩病基因紧密连锁分子标记N10-31的电泳图谱；
图2为实施例7中抗南方水稻黑条矮缩病基因紧密连锁分子标记N10-35的电泳图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。
下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
实施例1培育新材料I5
2007年晚季，以高抗南方水稻黑条矮缩病的广西普通野生稻材料Y11为父本，华南稻区骨干恢复系广恢998为母本进行杂交获得F1；2008年晚季，以F1为母本，以广恢998为父本回交获得BC1F1；2009年晚季，随机选取以100株BC1F1为母本，广恢998为父本回交获得BC2F1；2010年早季，分析每个BC2F1单株的基因型，选取133株存在杂合带型的以BC2F1为母本，广恢998为父本回交获得BC3F1；2010年晚季，进行基因型检测，选出281份存在杂合带型的BC3F1单株进行加代繁殖，2010、2011、2012年连续进行套袋自交至2013年早季获得281份BC3F6导入系材料。2013-2014年对导入系进行抗南方水稻黑条矮缩病田间自然诱发鉴定和室内人工接种鉴定，筛选出发病率为4.52％的高抗南方水稻黑条矮缩病株系I5。
具体的田间自然诱发鉴定和室内人工接种鉴定方法如下：
把健康低龄白背飞虱转到水稻病株上饲毒2～3d，再转到健康TN1稻苗上，饲养10～12d度过循回期后作为接种传毒介体。在广西农业科学院水稻研究所人工气候室内进行接种，温度为26～28℃，相对湿度为75％～90％，将待鉴定水稻材料种植在1000ml的透明塑料杯中，每个材料30株，于1.5～2.5叶龄期接种，接虫量为每株苗2头虫，每天8时和16时驱虫两次，尽量使稻苗均匀获毒，传毒2d后将虫转移走，将已接种的水稻苗移植到防虫网室或温室，常规管理。接种20d后调查每个品种的发病株数，之后每隔7d调查一次，共调查3次，统计每个品种的发病率。重复3次，感病对照品种为TN1。
发病率＝发病株数/总株数×100％。
抗性水平分为以下级别：
0级为免疫，发病率为0；
1级为高抗，发病率为0.1％～5.0％；
3级为中抗，发病率为5.1％～15.0％；
5级为中感，发病率为15.1％～30.0％；
7级为感病，发病率为30.1％～60.0％；
9级为高感，发病率大于60.1％。
实施例2
同样利用实施例1中的田间自然诱发鉴定和室内人工接种鉴定方法来鉴定广恢998的抗性，得出其平均发病率81.58％，表明广恢998高感南方水稻黑条矮缩病。
实施例3遗传分析分离群体的构建
以实施例1培育的I5为父本，以实施例2中的感南方水稻黑条矮缩病品种广恢998为母本，配制F1杂种，再进行自交加代繁种获得F2群体。F2群体再自交一代，获得衍生群体F2：3家系，用于南方水稻黑条矮缩病抗性鉴定。
实施例4广恢998/I5分离群体的抗南方水稻黑条矮缩病基因定位
(1)利用CTAB法提取亲本和F2群体株系的DNA，然后在F2群体中取高抗、高感各50株，也利用CTAB法提取水稻植株的DNA，构建DNA高、低池；
(2)利用基于重测序技术的QTL-seq方法对抗病基因进行分析和基因定位，实验步骤如下：
①重测序实验流程
样品基因组DNA检测合格后，用超声波机械打断的方法将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeqTM 2500进行测序。
②数据组装
A数据过滤
为了保证数据质量，要在信息分析前对原始数据进行质控，并且通过数据过滤来减少数据噪音。对下机的clean reads再进行更严格的过滤，得到High quality cleanreads，用于后续的信息分析。
B比对基因组
使用比对软件bwa(0.7.12)采用mem算法将过滤后的reads比对到参考基因组上，比对参数为-k 32-M；比对完之后结果使用picard(1.129)软件(MarkDuplicates)进行标记，在随后进行识别Variant时过滤掉。
C Variant分析
使用软件GATK(3.4-46)的UnifiedGenotyper模块将处理好的比对文件进行多个样本的Variant检测，检测到的变异使用VariantFiltration进行过滤，过滤参数为-Window4，-filter"QD<4.0||FS>60.0||MQ<40.0"，-G_filter"GQ<20"。使用ANNOVAR对检测出的Variant进行功能注释。
③关联分析
性状相关侯选区域的选择通过混池的欧氏距离差异进行筛选使用ED关联算法选择候选区域。对在同一条染色体上的SNP标记的ED值的3次方进行滑动窗口处理，窗口大小为1Mb，步长为2kb，获得关联的阈值，选择阈值以上的窗口区域作为与性状相关的关联区域。选取阈值显著性为0.99，获得两个与性状相关联的候选区域，分别为第10染色体上的10630000-12110000bp和12840000-15080000bp。
实施例5
利用第10染色体的InDel标记分析F2分离群体并对抗病基因进行分析，开发与抗病基因紧密连锁的分子标记。
InDel分析程序如下：
①所述12μlPCR反应体系包括：DNA(10ng/μl)，2μl；Primer(4pmol/μl)，1.5μl；2×Taq PCR Master Mix(中科瑞泰)，6μl；ddH2O，2.5μl；
②扩增反应在东盛龙ETC811扩增仪上进行，所述PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性35s，55℃复性35s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min。扩增产物用8％的非变性PAGE胶分离，通过银染显色。亲本间有多态的引物在F2群体进行分析，获取样本基因型信息；
④以水稻品种日本晴基因组序列为参考序列，利用I5和广恢998的全基因组重测序序列在第10染色体上的差异InDels，开发InDel标记。利用多态性InDel标记对F2群体的单株进行基因型分析，使用Join Map4.0进行连锁分析，绘制连锁遗传图，使用Map QTL6.0进行QTL扫描。
获得抗病基因及其分子标记：
在第10染色体上设计了90对InDel引物，经验证后发现其中21对InDel标记在亲本间具有良好的多态性，分析F2群体各单株在该区段各InDel标记的基因型并结合抗性表型进行QTL检测，结果显示在标记N10-31和N10-35之间(物理位置为13.4Mb-13.8Mb)检测到一个与南方水稻黑条矮缩病抗性相关的主效QTL，其与QTL-seq的定位区域重叠。LOD值为4.8，可以解释34.6％的表型贡献率，我们命名为qSRBSDV10，N10-31和N10-35即为与南方水稻黑条矮缩病抗性基因qSRBSDV10紧密连锁的分子标记。
其中分子标记N10-31的引物为：
上游引物：TTTTATCGAAACCGATGATT(SEQ ID No.1)
下游引物：CACCCTAAACTTTCTTCCCT(SEQ ID No.2)
分子标记N10-35的引物为：
上游引物：AGGTGAAAGATAGAGAGAGGAG(SEQ ID No.3)
下游引物：TTCCTTTACCCCTATAAGAGC(SEQ ID No.4)
实施例6利用分子标记N10-31引物检测抗南方水稻黑条矮缩病抗性
首先采用实施例2中的田间和室内鉴定方法，在抗南方水稻黑条矮缩病品种或育种材料中分别鉴定出5株高抗单株和5株高感单株。
然后用分子标记N10-31引物扩增上述10个单株的DNA，扩增结果如图1所示，其中M为Mark；P1为I5；P2为广恢998；1～5为田间和室内鉴定方法鉴定出的5株高抗单株；6～10为田间和室内鉴定方法鉴定出的5株高感单株。
由图1可知：分子标记N10-31对1～5号单株DNA的扩增片段为150bp，标志着1～5号单株中存在抗南方水稻黑条矮缩病的基因qSRBSDV10；分子标记N10-31对6～10号单株DNA的扩增片段为142bp，而不是150bp，标志着6～10号单株中不存在抗南方水稻黑条矮缩病的基因qSRBSDV10。该结果与田间和室内鉴定方法一致。
实施例7利用分子标记N10-35引物检测抗南方水稻黑条矮缩病抗性
用分子标记N10-35引物扩增实施例5中1～10号单株的DNA，扩增结果如图2所示。
由图2可知：分子标记N10-35对1～5号单株DNA的扩增片段为137bp，标志着1～5号单株中存在抗南方水稻黑条矮缩病的基因qSRBSDV10；分子标记N10-35对6～10号单株DNA的扩增片段为120bp，而不是137bp，标志着6～10号单株中不存在抗南方水稻黑条矮缩病的基因qSRBSDV10。该结果也与田间和室内鉴定方法也一致。
由此可知，通过利用上述基因连锁的分子标记来检测抗性材料I5及其衍生品种(系)中是否含有抗南方水稻黑条矮缩病基因，可准确预测其南方水稻黑条矮缩病抗性水平，大大提高抗南方水稻黑条矮缩病水稻的选择效率。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所
<120> 抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10及其分子标记方法
<130> 2022.01.13
<141> 2022-01-25
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
ttttatcgaa accgatgatt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
caccctaaac tttcttccct 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
aggtgaaaga tagagagagg ag 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
ttcctttacc cctataagag c 21

Claims (8)

1.一种用于检测抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10的特异性引物组合，其特征在于，具体序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示或如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示。
2.一种用于检测抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10的分子标记，其特征在于，所述分子标记为N10-31或N10-35；所述分子标记N10-31的引物序列如SEQ ID No.1～2所示；所述分子标记N10-35的引物序列如SEQ ID No.3～4所示。
3.一种含有权利要求1所述的引物组合的试剂盒。
4.权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的分子标记或权利要求3所述的试剂盒在水稻育种中的应用。
5.权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的分子标记或权利要求3所述的试剂盒在快速筛选抗南方水稻黑条矮缩病品种或者品系中的应用。
6.一种抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10的分子标记方法，其特征在于，用分子标记N10-31或分子标记N10-35扩增水稻抗性材料I5及其衍生品种(系)DNA，如果用分子标记N10-31能扩增出150bp的条带，或用分子标记N10-35能扩增出137bp的条带，则标志着水稻材料中存在抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10；所述分子标记N10-31的引物序列如SEQID No.1～2所示；所述分子标记N10-35的引物序列如SEQ ID No.3～4所示。
7.一种权利要求2所述的分子标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以抗南方水稻黑条矮缩病的普通野生稻导入系材料I5为供体，感南方水稻黑条矮缩病的栽培稻品种广恢998为受体，通过杂交和自交构建了一套水稻F2分离群体；
(2)采用室内接种鉴定对上述群体的F2：3系进行南方水稻黑条矮缩病的抗性鉴定；
(3)在F2群体中选取高抗和高感样本，提取DNA，对抗南方水稻黑条矮缩病基因进行基因定位；
(4)在初定位区间，开发InDel标记，利用遗传连锁分析技术，结合分子标记带型及抗性表型数据，将目标基因限定在两个分子标记N10-31和N10-35之间；
(5)获得抗南方水稻黑条矮缩病野生稻导入新材料I5抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV10一个，位于分子标记N10-31-N10-35之间，通过所述分子标记来检测抗性品种I5及其衍生品种中是否含有该主基因位点，预测其南方水稻黑条矮缩病抗性水平。
8.如权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中基因定位于第10染色体上。
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