CN116814845B - 水稻抗细菌性条斑病基因xo5的分子标记与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻抗细菌性条斑病基因xo5的分子标记与应用，所述分子标记位于水稻第1染色体位置为chr 1:29987911‑‑‑29994141，与水稻细菌性条斑病抗性基因xo5不仅紧密连锁而且在植株后代与所述抗性基因共分离，因而为筛选抗性水稻品种和分子标记辅助育种提供了一条很好的途径，既可免除育种群体大量的田间接种鉴定工作，又可对育种材料进行早代选择并对目标基因进行精准的逐代跟踪。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及水稻抗细菌性条斑病基因分子标记。
背景技术
由黄单胞杆菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc)引起的细菌性条斑病是水稻生产上重要病害之一，严重影响水稻的产量和品质。实践证明，利用水稻品种的抗病性是防治水稻细菌性条斑病最经济和有效的途径，发掘和利用抗细菌性条斑病新基因一直是研究的热点之一。现有研究发现，OsSULTR3;6是水稻细菌性条斑病最重要的感病基因。Xoc分泌的三型效应分子可以特异性结合到OsSULTR3;6启动子区，通过诱导靶基因表达增强水稻的感病性。基因编辑试验已证明，阻断Xoc效应分子与OsSULTR3;6启动子区特异序列的识别，可以提高水稻细菌性条斑病的抗性[Xu Z,2021, Increasing resistance tobacterial leaf streak in rice by editing the promoter of susceptibility geneOsSULRT3;6. Plant Biotechology Journal, 2021,19:1101-1103]。
在本发明人所在实验室前期工作中，从水稻天然种质资源中发掘到OsSULTR3;6的一个隐性抗病等位基因xo5，xo5启动子区的效应蛋白结合元件（effector bindingelement, EBE）发生缺失突变。我们利用已公布的水稻基因组信息，开发OsSULTR3;6启动子区EBE毗邻区域的PCR分子标记，为水稻抗病种质资源的筛选和xo5基因的分子标记辅助育种提供依据。
发明内容
针对上述研究背景，本发明目的在于提供一种快速检测水稻抗细菌性条斑病基因xo5的方法而完成本发明。
本发明提供一种水稻抗细菌性条斑病基因xo5相连锁的分子标记，其位于水稻第1染色体位置为chr 1: 29987911--- 29994141，对于抗病水稻而言，在启动子区是29987836处有AAACGTAATTTAGAATGGCCCGTAGCCTCTCCTTGT（SEQ ID No.1）的36bp删除。
具体地，感病水稻的该段核苷酸序列为126bp：AAAATCAAGAAATGAGCCAATCCAAAACGTAATTTAGAATGGCCCGTAGCCTCTCCTTGTTGATCGCCTATATAAACCGCGCCATGCGCCCCGCTTCTGAGCACACGCTGCACGTAATCGCGAACG（SEQ ID No.2）；而抗病水稻的该段核苷酸序列为90bp：AAAATCAAGAAATGAGCCAATCCATGATCGCCTATATAAACCGCGCCATGCGCCCCGCTTCTGAGCACACGCTGCACGTAATCGCGAACG（SEQ ID No.3）。
本发明提供所述的水稻抗细菌性条斑病基因xo5相连锁的分子标记在鉴定或辅助鉴定水稻细菌性条斑病抗性，或与其相关的水稻品种筛选和选育中的应用。
本发明提供鉴定或辅助鉴定水稻细菌性条斑病抗性的引物对，所述引物对用于检测所述的分子标记，可用于检测区分感病水稻或抗病水稻。
具体地，其由引物A和引物B组成；
所述引物A为如下：AAAATCAAGAAATGAGCCAATCCA所示的单链DNA分子（SEQ IDNo.4）；
所述引物B为如下：CGTTCGCGATTACGTGCAG（SEQ ID No.5）所示的单链DNA分子。
进而本发明提供鉴定或辅助鉴定水稻细菌性条斑病抗性的试剂盒，其包括所述的引物对。
更优选地，所述引物A和所述引物B的摩尔浓度比为1:1混合。
本发明提供一种鉴定xo5基因赋予的细菌性条斑病抗性水稻植物或品种的方法，以待测水稻的基因组DNA为模板，采用所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；根据所述PCR产物鉴定待测水稻的细菌性条斑病抗性特征：若PCR产物大小为126bp，则待测水稻为或候选为感病的水稻品种；
若PCR产物大小为90bp，则待测水稻为或候选为抗病的水稻品种。
本发明提供所述的引物对，所述的试剂盒，或所述的方法在培育水稻抗细菌性条斑病抗性品种的辅助育种中的应用。
本发明提供一种培育细菌性条斑病抗性水稻植物或品种的方法，其包括如下步骤：
S1对培育的待测水稻的基因组DNA为模板，采用所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；根据所述PCR产物鉴定待测水稻的细菌性条斑病抗性特征：
若PCR产物大小为126bp，则待测水稻为或候选为感病的水稻品种；
若PCR产物大小为90bp，则待测水稻为或候选为抗病的水稻品种。
S2 选择PCR产物大小为90bp的待测水稻进行后续育种，至获得细菌性条斑病抗性水稻植物或品种。
本发明具有以下有益效果：本发明获得的分子检测标记与水稻细菌性条斑病抗性基因xo5不仅紧密连锁而且在植株后代与所述抗性基因共分离，相应的鉴定方法具有很高的可靠性。因而，该分子标记对筛选抗性水稻品种和辅助育种提供了一条很好的途径，既可免除育种群体大量的田间接种鉴定工作，又可对育种材料进行早代选择并对目标基因进行精准的逐代跟踪。
附图说明
图1为分子标记xo5鉴定水稻细菌性条斑病抗性的电泳谱带图。
图2为人工注射接种鉴定水稻细菌性条斑病抗性的病斑图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、xo5分子标记在水稻细菌性条斑病抗性鉴定中的应用
1、植物材料
供试水稻材料日本晴、蜀恢498、KYUN TAW SEIN、PAWNG AEW 1、ATT CHHMOUS、KHAOSAHKORN、JG30、IR24、KitaaKe、宁粳46、IRBB1、IRBB3、IRBB7、CBB23种植在中国农业科学院作物科学研究所网室内，常规水肥管理。
2、水稻细菌性条斑病菌与人工接种
水稻细菌性条斑病菌中国代表菌株RS105，真空保存于–70℃，使用前，在胁本哲氏培养基上复壮，置于28℃培养48h，以无菌水配制接种菌液，浓度调至OD=1.0。
水稻植株插秧缓苗后，长至分蘖期进行人工注射接种鉴定，接种后2周左右，用病斑长度作为抗感反应参数。抗感标准：病斑延伸长度>2.0cm为感病，2.0cm~1.5cm为中感，1.5cm~1.0cm为中抗，<1.0cm为抗病。
3、PCR分子标记引物设计
依据国际水稻基因组计划测序的水稻品种日本晴的序列，设计xo5基因的紧密连锁分子标记。引物扩增的全序列，具体染色体位置为chr1:29987813---29987938,36bp 缺失位点是29987837---29987872。并就此设计检测的引物对，即利用primer Premier 5 软件，根据多态性位点、引物序列特异性、引物错配数和PCR产物长度等因素综合考虑，设计InDel分子标记。引物对如下：
引物A（正向引物）：AAAATCAAGAAATGAGCCAATCCA（SEQ ID No.4）；
引物B（反向引物）：CGTTCGCGATTACGTGCAG（SEQ ID No.5）。
4、基因组DNA提取
水稻材料分蘖期取幼嫩叶片，按照Doyle和Dickson（1987）的十六烷基三乙基溴化铵法（CTAB）提取基因组DNA。用分光光度计测定浓度，用于PCR反应的DNA浓度调至100ng•µl-1左右。
5、PCR反应及电泳
PCR扩增反应体系20 μl，包括2 μl DNA（20 ng/μl）模板，2 μl（2 pmol，F+R）引物，2 μl 10×Buffer（Mg2+ Free），1.2 μl MgCl2（25 mM），0.1 μldNTP（2.5 mM），0.2 μlrTaq（5U/μl，TaKaRa）和12.5 μl ddH2O；扩增反应在Professional Thermocycler（BiometraInc.）扩增仪上进行，反应程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃30 sec，34个循环；72℃延伸5 min。PCR产物用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（200V恒定电压，1.5小时）。
6、供试水稻的细菌性条斑病抗性鉴定
按照实施例步骤2中的方法对上述供试材料的细菌性条斑病抗性进行鉴定。
结果如表1所示。日本晴、蜀恢498、JG30、IR24、KitaaKe、宁粳46、IRBB1、IRBB7、CBB23的病斑长度均超过了1.5cm，均为感病品种；KYUN TAW SEIN、PAWNG AEW 1、ATTCHHMOUS、KHAO SAHKORN的的病斑长度小于1.0 mm，均为抗病品种。
表1.供试水稻品种的基因型及细菌性条斑病抗性鉴定结果
7、供试水稻的基因型鉴定
提取待测水稻的基因组DNA，以DNA为模板、xo5分子标记为引物进行PCR扩增，获得PCR产物。
电泳结果如图1所示。泳道1-13分别为日本晴、蜀恢498、KYUN TAW SEIN、PAWNGAEW 1、ATT CHHMOUS、KHAO SAHKORN、JG30、IR24、KitaaKe、宁粳46、IRBB1、IRBB3、IRBB7、CBB23；其中日本晴、蜀恢498、JG30、IR24、KitaaKe、宁粳46、IRBB1、IRBB3、IRBB7和CBB23的PCR产物均为126bp，按照实施例中本发明的人工接种方法鉴定测试材料的抗病性，这4个品种均为感细菌性条斑病品种。KYUN TAW SEIN、PAWNG AEW 1、ATT CHHMOUS和KHAO SAHKORN的PCR产物均为90bp，按照实施例中本发明的人工接种方法鉴定测试材料的抗病性，这5个品种均为抗细菌性条斑病品种。
由此可见，本发明的步骤6中细菌性条斑病抗性的鉴定结果与步骤7中的基因型鉴定结果完全一致。说明本发明的水稻细菌性条斑病抗性鉴定方法准确、可靠。
Claims (2)
1.一种水稻抗细菌性条斑病相关的分子标记，其特征在于，其位于水稻第1染色体位置为chr 1: 29987911--29994141，对于抗病水稻而言，在启动子区是29987836处有36bp删除，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其中，感病水稻的该段核苷酸序列为126bp，序列如SEQID No.2所示；而抗病水稻的该段核苷酸序列为90bp，序列如SEQ ID No.3所示。
2.如权利要求1所述的水稻抗细菌性条斑病相关的分子标记在鉴定或辅助鉴定水稻细菌性条斑病抗性，或与其相关的水稻品种筛选或选育中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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