CN114164048B - 一种高含量dha油脂的制取方法 - Google Patents
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Abstract
一种高含量DHA油脂的制取方法，包括下述步骤：（1）制取DHA脂肪酸：（1‑1）藻油皂化，（1‑2）酸化，（1‑3）水洗，（1‑4）脲包纯化，得到DHA脂肪酸；（2）制取DHA单甘脂：（2‑1）藻油单甘脂化，（2‑2）分子蒸馏，采用分子蒸馏法对步骤（2‑1）的反应产物进行油脂分离，得到DHA单甘脂；（3）酯化；将步骤（1）得到的DHA脂肪酸与步骤（2）得到的DHA单甘脂以3:1‑5:1的重量比例混合，然后加入到填充有固定化脂肪酶的固定化酶柱中，在温度45‑55℃的条件下反应2‑4小时；（4）分子蒸馏，采用分子蒸馏法对步骤（3）的反应产物进行油脂分离，得到高含量DHA油脂。本发明反应时间较短，生产效率较高，产物得率较高，还能提高最终产物中DHA甘油三酯的含量。
Description
技术领域
本发明涉及油脂改性技术领域，具体涉及一种高含量DHA油脂（即高DHA含量的油脂）的制取方法。
背景技术
二十二碳六烯酸简称DHA，属于ω-3系列多不饱和脂肪酸（PUFAs），是人体生长和健康所必需的多不饱和脂肪酸，人体少量合成不能满足身体需求，需从外界摄入获得。DHA是大脑和眼睛的重要组成部分，对婴儿的大脑、视觉及神经的发育有着重要作用。DHA对成人具有预防心血管疾病、心肌梗塞、脑血栓和脑梗塞的形成，改善动脉功能以及提高心脏的自主调节能力，降低心律不齐的发生和动脉粥样硬化的形成及预防老年痴呆症等方面的作用。越来越多的研究证据表明，DHA在体内可有效抑制胆固醇的合成，能够降低血液中低密度脂蛋白的含量，提高高密度脂蛋白的含量，改变血液中脂蛋白的组成，可有效促进血液的流动，降低血压，抑制血栓的形成，从而降低患动脉粥样硬化等心、脑血管疾病的风险。DHA可对心肌细胞中Na＋-Ca２＋转化器进行有效调节，可有效维持钙离子通道的动态平衡；DHA还可通过对血小板和血管壁前列腺素的产生而起到抗血栓作用。DHA 还是一种中枢神经保护素的前体，能够促进人脑的综合代谢活力，同时减缓神经退化性疾病的进程，对老年人有防止老年痴呆症的作用。
目前DHA藻油主要用于婴儿配方奶粉中和保健食品中，在医药中的应用比较有限，主要是因为其DHA含量较低，纯度不够，从而限制了其在医药领域的应用。
DHA藻油中DHA的含量为35-55%，DHA几乎分布在每个甘油三酯中，很难通过物理方法直接获得高DHA含量的油脂。
目前，主要通过直接酯化法获得高DHA含量的油脂，即以DHA脂肪酸和甘油为原料,利用脂肪酶催化合成甘油三酯。直接酯化法需要三步酯化才能生成DHA甘油三酯（第一步脂肪酸和甘油反应生成单甘脂，第二步单甘脂与脂肪酸反应生成二甘酯，最后一步二甘酯与脂肪酸反应生成甘三酯），反应时间长，产物得率低，并且DHA脂肪酸原料成本较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高含量DHA油脂的制取方法，这种方法通过两步酯化就可以获得高DHA含量的油脂，反应时间较短，生产效率较高，产物得率较高。采用的技术方案如下：
一种高含量DHA油脂的制取方法，其特征在于包括下述步骤：
（1）制取DHA脂肪酸
（1-1）藻油皂化
以藻油为原料进行皂化反应，得到皂液；
（1-2）酸化
向步骤（1-1）得到的皂液中加入过量的硫酸或磷酸，进行酸化反应，得到脂肪酸粗液；
（1-3）水洗
将步骤（1-2）得到的脂肪酸粗液加入到水洗罐中，加水进行水洗，水洗结束后静置，再将上层的脂肪酸与下层的水分离，得到脂肪酸；
（1-4）脲包纯化
将步骤（1-3）得到的脂肪酸加入到尿素溶液中，然后在70-80℃的条件下搅拌0.5-2小时；停止搅拌后自然冷却至室温，然后在8-0℃的低温静置0.5-2小时；静置结束后进行真空抽滤，收集滤液并将乙醇脱去；然后采用水洗分液法对滤液进行纯化，分离得到的上层液体即为所需的DHA脂肪酸；
（2）制取DHA单甘脂
（2-1）藻油单甘脂化
向藻油中添加水，水的添加量为藻油重量的5-10%，混合均匀后得到第一混合物料；然后将第一混合物料加入到填充有固定化脂肪酶的固定化酶柱中，在温度50-55℃的条件下反应2-4小时；
（2-2）分子蒸馏
采用分子蒸馏法对步骤（2-1）的反应产物进行油脂分离：
先在分子蒸馏进料量为100-300 L/h、蒸馏温度为140-160℃、真空度为1-10pa的条件下对步骤（2-1）的反应产物进行第一次分子蒸馏；然后在分子蒸馏进料量为100-300L/h、蒸馏温度为125-135℃、真空度为1-10pa的条件下对第一次分子蒸馏所得轻相再次进行第二次分子蒸馏，所得重相即为所需的DHA单甘脂；
（3）酯化
将步骤（1）得到的DHA脂肪酸与步骤（2）得到的DHA单甘脂以3:1-5:1的重量比例混合，然后加入到填充有固定化脂肪酶的固定化酶柱中，在温度45-55℃的条件下反应2-4小时；
（4）分子蒸馏
采用分子蒸馏法对步骤（3）的反应产物进行油脂分离，获得所需的高含量DHA油脂。
优选步骤（1-1）中，向藻油中加入水和氢氧化钠，水与藻油的重量比例为1:1-1:3，氢氧化钠的加入量为藻油重量的10-15%，在充氮的条件下进行皂化反应，皂化反应的反应温度为75-85℃，反应时间3-6小时；然后静置1-2小时使皂化反应产物分层（上层为皂液，下层为水），排干下层的水后得到皂液。
步骤（1-1）中氢氧化钠与藻油发生皂化反应后，产生脂肪酸钠和甘油。
优选步骤（1-2）中，在充氮的条件下进行酸化反应，酸化反应的反应温度为75-85℃，反应时间为1-2小时。
步骤（1-2）中脂肪酸钠与硫酸或磷酸进行酸化反应后，产生脂肪酸和硫酸钠或磷酸钠。过量的硫酸或磷酸是指其所含氢离子H+的摩尔数大于钠离子的摩尔数。
优选步骤（1-3）中，水洗的方法是：向步骤（1-2）获得脂肪酸粗液中加入重量为其0.3-1倍的水（优选90-100℃的水），然后在充氮的条件下搅拌10-30分钟。优选步骤（1-3）中，水洗结束（即停止搅拌）后，静置0.5-1小时。
优选步骤（1-3）中，水洗进行2-3次，即：对第一次水洗、分离后得到的脂肪酸进行第二次水洗、分离（2次水洗）；在此基础上还可再对第二次水洗、分离后得到的脂肪酸进行第三次水洗、分离（3次水洗）。
步骤（1-3）水洗的目的是除去脂肪酸粗液中的硫酸钠或磷酸钠及多余的酸。
上述步骤（1-4）脲包纯化起到去除饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的作用，以提高DHA脂肪酸的纯度。水洗分液法是将不溶于水含杂质(杂质可溶于水)的液体物质放入分液漏斗中充分振荡后静止再分液的方法，通过水洗分液法除去滤液中可溶于水的杂质，从而提高产物DHA脂肪酸的纯度，水洗分液法分离得到的上层液体即为纯化产物。
优选步骤（1-4）中，脂肪酸与尿素的重量比例为1:2-1:4。
优选步骤（1-4）中，尿素溶液的配制方法为：将尿素加入到乙醇（优选95％乙醇）中，尿素与乙醇的重量比例为1:5-2:5，然后加热（通常加热至70-80℃）并进行搅拌，使尿素溶于乙醇中，得到尿素溶液（得到的尿素溶液为澄清的溶液）。得到尿素溶液后即可将脂肪酸加入到尿素溶液中。
步骤（1-4）中，可采用旋转蒸发器将滤液中的乙醇脱去。
优选步骤（2-1）采用的固定化脂肪酶为固定化脂肪酶LipozymeRMIM。
优选步骤（2-1）中，第一混合物料在固定化酶柱中的流速为200-1000L/h（升/小时）。
优选步骤（3）采用的固定化脂肪酶为固定化脂肪酶435或固定化脂肪酶TL。
优选步骤（3）中，DHA脂肪酸与DHA单甘脂的混合物在固定化酶柱中的流速为200-1000L/h（升/小时）。
一种优选方案中，步骤（2-1）中，固定化酶柱具有多个，这多个固定化酶柱并排设置。采用并排设置的多个固定化酶柱进行酶解，可提高反应效率。用于实现酯化反应的设备，更具体的结构可参考申请人公司专利号为CN202020484401.X的在先专利公开的“一种酶反应器装置”。另一种优选方案中，步骤（2-1）中，固定化酶柱具有多个，且多个固定化酶柱依次首尾相连。
一种优选方案中，步骤（3）中，固定化酶柱具有多个，这多个固定化酶柱并排设置。采用并排设置的多个固定化酶柱进行酶解，可提高反应效率。用于实现酯化反应的设备，更具体的结构可参考申请人公司专利号为CN202020484401.X的在先专利公开的“一种酶反应器装置”。另一种优选方案中，步骤（3）中，固定化酶柱具有多个，且多个固定化酶柱依次首尾相连。
本发明酯化反应中采用固定化酶柱，固定化脂肪酶易于与反应产物分离，能够提高酶的稳定性，有效地降低固定化脂肪酶的损失、可重复利用，实现了固定化脂肪酶的损失及酶活降低最小化、重复利用最大化，可大大提高反应效率，固定化脂肪酶的使用次数可达到30次以上，大大降低了用酶成本，同时脂肪酸利用率可达到90%以上。固定化酶还能有效提高其催化活性和立体选择性，从而可以增加产物的得率，提高产品质量。
优选步骤（4）中，在分子蒸馏进料量为100-300 L/h、蒸馏温度为155-175℃、真空度为1-10pa的条件下对步骤（3）的反应产物进行第一次分子蒸馏，收集重相；然后在分子蒸馏进料量为100-300 L/h、蒸馏温度为155-175℃、真空度为1-10pa的条件下对第一次分子蒸馏所得重相进行第二次分子蒸馏，所得重相即为所需的高含量DHA油脂。
上述步骤（1-1）和（2-1）所使用的藻油，可采用申请人自产的藻油，其甘油三酯Sn-2位的DHA占DHA总量的70%以上。
步骤（2）获得的DHA单甘脂主要为Sn-2DHA单甘脂。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：通过两步酯化就可以获得高DHA含量的油脂（虽然DHA含量会低于直接酯化法，但仍然可达到80%以上，可以满足医药领域的需求），反应时间较短，生产效率较高，产物得率较高，还能提高最终产物中DHA甘油三酯（即甘油三酯Sn-1、Sn-2、Sn-3位脂肪酸均为DHA的甘油三酯）的含量。
具体实施方式
实施例
本实施例中，高含量DHA油脂的制取方法包括下述步骤：
（1）制取DHA脂肪酸
（1-1）藻油皂化
以藻油为原料进行皂化反应，得到皂液；
本步骤（1-1）中，向藻油中加入水和氢氧化钠，水与藻油的重量比例为1:2，氢氧化钠的加入量为藻油重量的12%，在充氮的条件下进行皂化反应，皂化反应的反应温度为82℃，反应时间4小时；然后静置1小时使皂化反应产物分层（上层为皂液，下层为水），排干下层的水后得到皂液；
（1-2）酸化
向步骤（1-1）得到的皂液中加入过量的磷酸，进行酸化反应，得到脂肪酸粗液；
本步骤（1-2）中，在充氮的条件下进行酸化反应，酸化反应的反应温度为85℃，反应时间为1小时；
（1-3）水洗
将步骤（1-2）得到的脂肪酸粗液加入到水洗罐中，加水进行水洗，水洗结束后静置，再将上层的脂肪酸与下层的水分离，得到脂肪酸；
本步骤（1-3）中，水洗的方法是：向步骤（1-2）获得脂肪酸粗液中加入重量为其0.5倍的水（95℃的水），然后在充氮的条件下搅拌10分钟；水洗结束（即停止搅拌）后，静置0.5小时；
本步骤（1-3）中，水洗进行3次；
（1-4）脲包纯化
将步骤（1-3）得到的脂肪酸加入到尿素溶液中，然后在75℃的条件下搅拌1小时；停止搅拌后自然冷却至室温，然后在4℃的低温静置1小时；静置结束后进行真空抽滤，收集滤液并将乙醇脱去（采用旋转蒸发器将滤液中的乙醇脱去）；然后采用水洗分液法对滤液进行纯化，分离得到的上层液体即为所需的DHA脂肪酸；
本步骤（1-4）中，脂肪酸与尿素的重量比例为1:3；
本步骤（1-4）中，尿素溶液的配制方法为：将尿素加入到乙醇（95％乙醇）中，尿素与乙醇的重量比例为1:3，然后加热（加热至75℃）并进行搅拌，使尿素溶于乙醇中，得到尿素溶液（得到的尿素溶液为澄清的溶液）；
（2）制取DHA单甘脂
（2-1）藻油单甘脂化
向藻油中添加水，水的添加量为藻油重量的7%，混合均匀后得到第一混合物料；然后将第一混合物料加入到填充有固定化脂肪酶（均为固定化脂肪酶LipozymeRMIM）的固定化酶柱中，在温度52℃的条件下反应4小时；
本步骤（2-1）中，第一混合物料在固定化酶柱中的流速为400L/h（升/小时）；
（2-2）分子蒸馏
采用分子蒸馏法对步骤（2-1）的反应产物进行油脂分离：先在分子蒸馏进料量为100 L/h、蒸馏温度为145℃、真空度为1pa的条件下对步骤（2-1）的反应产物进行第一次分子蒸馏；然后在分子蒸馏进料量为100L/h、蒸馏温度为130℃、真空度为1pa的条件下对第一次分子蒸馏所得轻相再次进行第二次分子蒸馏，所得重相即为所需的DHA单甘脂；
（3）酯化
将步骤（1）得到的DHA脂肪酸与步骤（2）得到的DHA单甘脂以4:1的重量比例混合，然后加入到填充有固定化脂肪酶（均为固定化脂肪酶435）的固定化酶柱中，在温度50℃的条件下反应4小时；
本步骤（3）中，DHA脂肪酸与DHA单甘脂的混合物在固定化酶柱中的流速为500L/h（升/小时）；
（4）分子蒸馏
采用分子蒸馏法对步骤（3）的反应产物进行油脂分离：在分子蒸馏进料量为200L/h、蒸馏温度为160℃、真空度为1pa的条件下对步骤（3）的反应产物进行第一次分子蒸馏，收集重相；然后在分子蒸馏进料量为200 L/h、蒸馏温度为160℃、真空度为1pa的条件下对第一次分子蒸馏所得重相进行第二次分子蒸馏，所得重相即为所需的高含量DHA油脂。
步骤（1-1）和（2-1）所用藻油的DHA含量为45.6%。上述步骤（1-1）和（2-1）所使用的藻油，采用申请人自产的藻油，其甘油三酯Sn-2位的DHA占DHA总量的70%以上。
经检测，所得高含量DHA油脂中甘三酯含量为93.5%，DHA含量为82.2%。
测试方法
DHA的含量检测参照GB/T 38095-2019 DHA、EPA含量测定 气相色谱法。
单、双、三甘酯含量的测定方法：采用正相高效液相色谱法（NP-HPLC）分析样品组成，液相系统为含 Waters 600泵的高效液相色谱仪（美国 Waters 公司），配备 2487 型紫外检测器（美国 Waters 公司）。色谱柱为Lichrosorb Si-60硅胶柱（250×4.6 mm，5 μm，Grace 公司，美国）。流动相 A（正己烷/异丙醇=99:1，V/V），流动相 B（异丙醇），梯度洗脱条件：0-35 min，100% A；36-55 min，80% A 和 20% B；56-65 min，100% A。洗脱流速为 1.0 mL/min，紫外检测器检测波长为 210 nm。将样品溶于正己烷后，用 0.45 μm 有机膜过滤后进样，进样体积20 μL。根据标准品的标准曲线，计算样品中各甘油酯组分的含量。
Claims (6)
1. 一种高含量DHA油脂的制取方法，其特征在于包括下述步骤：
（1）制取DHA脂肪酸
（1-1）藻油皂化
向藻油中加入水和氢氧化钠，水与藻油的重量比例为1:1-1:3，氢氧化钠的加入量为藻油重量的10-15%，在充氮的条件下进行皂化反应，皂化反应的反应温度为75-85℃，反应时间3-6小时；然后静置1-2小时使皂化反应产物分层，排干下层的水后得到皂液；
步骤（1-1）所使用的藻油，其甘油三酯Sn-2位的DHA占DHA总量的70%以上；
（1-2）酸化
向步骤（1-1）得到的皂液中加入过量的硫酸或磷酸，进行酸化反应，得到脂肪酸粗液；
步骤（1-2）中，在充氮的条件下进行酸化反应，酸化反应的反应温度为75-85℃，反应时间为1-2小时；
（1-3）水洗
将步骤（1-2）得到的脂肪酸粗液加入到水洗罐中，加水进行水洗，水洗结束后静置，再将上层的脂肪酸与下层的水分离，得到脂肪酸；
步骤（1-3）中，水洗的方法是：向步骤（1-2）获得脂肪酸粗液中加入重量为其0.3-1倍的水，然后在充氮的条件下搅拌10-30分钟；
（1-4）脲包纯化
将步骤（1-3）得到的脂肪酸加入到尿素溶液中，然后在70-80℃的条件下搅拌0.5-2小时；停止搅拌后自然冷却至室温，然后在0-8℃的低温静置0.5-2小时；静置结束后进行真空抽滤，收集滤液并将乙醇脱去；然后采用水洗分液法对滤液进行纯化，分离得到的上层液体即为所需的DHA脂肪酸；
（2）制取DHA单甘脂
（2-1）藻油单甘脂化
向藻油中添加水，水的添加量为藻油重量的5-10%，混合均匀后得到第一混合物料；然后将第一混合物料加入到填充有固定化脂肪酶的固定化酶柱中，在温度50-55℃的条件下反应2-4小时；
步骤（2-1）所使用的藻油，其甘油三酯Sn-2位的DHA占DHA总量的70%以上；
步骤（2-1）采用的固定化脂肪酶为固定化脂肪酶LipozymeRMIM；
步骤（2-1）中，第一混合物料在固定化酶柱中的流速为200-1000L/h；
（2-2）分子蒸馏
采用分子蒸馏法对步骤（2-1）的反应产物进行油脂分离：
先在分子蒸馏进料量为100-300 L/h、蒸馏温度为140-160℃、真空度为1-10pa的条件下对步骤（2-1）的反应产物进行第一次分子蒸馏；然后在分子蒸馏进料量为100-300 L/h、蒸馏温度为125-135℃、真空度为1-10pa的条件下对第一次分子蒸馏所得轻相再次进行第二次分子蒸馏，所得重相即为所需的DHA单甘脂；
（3）酯化
将步骤（1）得到的DHA脂肪酸与步骤（2）得到的DHA单甘脂以3:1-5:1的重量比例混合，然后加入到填充有固定化脂肪酶的固定化酶柱中，在温度45-55℃的条件下反应2-4小时；
步骤（3）采用的固定化脂肪酶为固定化脂肪酶435或固定化脂肪酶TL；
步骤（3）中，DHA脂肪酸与DHA单甘脂的混合物在固定化酶柱中的流速为200-1000L/h；
（4）分子蒸馏
采用分子蒸馏法对步骤（3）的反应产物进行油脂分离，获得所需的高含量DHA油脂；
步骤（4）中，在分子蒸馏进料量为100-300 L/h、蒸馏温度为155-175℃、真空度为1-10pa的条件下对步骤（3）的反应产物进行第一次分子蒸馏，收集重相；然后在分子蒸馏进料量为100-300 L/h、蒸馏温度为155-175℃、真空度为1-10pa的条件下对第一次分子蒸馏所得重相进行第二次分子蒸馏，所得重相即为所需的高含量DHA油脂。
2.根据权利要求1所述的高含量DHA油脂的制取方法，其特征是：步骤（1-3）中，水洗结束后，静置0.5-1小时。
3.根据权利要求1或2所述的高含量DHA油脂的制取方法，其特征是：步骤（1-3）中，水洗进行2-3次。
4.根据权利要求1所述的高含量DHA油脂的制取方法，其特征是：步骤（1-4）中，脂肪酸与尿素的重量比例为1:2-1:4。
5.根据权利要求1所述的高含量DHA油脂的制取方法，其特征是：步骤（1-4）中，尿素溶液的配制方法为：将尿素加入到乙醇中，尿素与乙醇的重量比例为1:5-2:5，然后加热并进行搅拌，使尿素溶于乙醇中，得到尿素溶液。
6.根据权利要求1所述的高含量DHA油脂的制取方法，其特征是：步骤（1-4）中，采用旋转蒸发器将滤液中的乙醇脱去。
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