CN114159466B - 一种羟基磷灰石/酵母菌生物杂化材料及其制备方法、应用 - Google Patents

一种羟基磷灰石/酵母菌生物杂化材料及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羟基磷灰石/酵母菌生物杂化材料及其制备方法、应用，涉及肿瘤治疗领域，包括：将酵母菌在液体培养基中震荡过夜后分散在去离子水中得到酵母菌分散液；分别取相同体积的Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液混合后加入所述酵母菌分散液，搅拌后离心清洗得到HA/Yeast生物杂化材料。基于HA/Yeast生物杂化材料可实现肿瘤钙过载和肿瘤免疫协同治疗，解决单一途径对肿瘤杀伤效果较弱的难题。本发明中的HA/Yeast纳米颗粒合成方法简单，分散性好，尺寸均一；酵母可通过趋向酸性环境实现肿瘤特异性靶向，并发酵产生H2S来增强肿瘤钙过载，同时激活肿瘤免疫治疗，最终实现肿瘤协同杀伤。

Description

一种羟基磷灰石/酵母菌生物杂化材料及其制备方法、应用
技术领域
本申请涉及生物杂化材料领域，尤其涉及一种羟基磷灰石/酵母菌生生物杂化材料及其制备方法、应用。
背景技术
近十几年来，随着工业化地发展、生活水平的上升以及人均寿命的提升，癌症作为一种十分棘手的疾病严重地威胁着人类的健康。我国形势依然十分严峻。癌症中心的数据表明，癌症已成为第一致死因，占居民全部死因的23％。由于癌症具有多样性、复杂性和异质性的特点，虽然癌症治疗手段多样，但全球范围内癌症疾病的发病率和死亡率依然在迅速增长。
传统的癌症治疗手段有各自的局限性，目前，临床上用于癌症治疗的手段主要包括手术治疗、放射治疗和化学治疗等都难以实现特异性较强的肿瘤治疗，对正常组织往往有着较大的损伤。因此开发高效可靠的新型肿瘤治疗方式可以有效降低癌症的死亡率，提升对人体损害。酵母菌能够作为药物载体靶向肿瘤区微环境中的弱酸性，通过发酵代谢产生不利于肿瘤生长的因子，通过其细胞壁介导肿瘤免疫治疗诱导肿瘤细胞凋亡，但单独酵母菌治疗效果有限，有关酵母菌的改性治疗还有待提升。因此研究新的与酵母菌结合材料对酵母菌用于肿瘤治疗有着十分重要意义。
目前来说酵母菌用于肿瘤治疗效果仍然有局限性，需要开发新的体系来增加活体酵母菌的作用，另外酵母菌的安全性也需要提升。
发明内容
本申请实施例的目的是提供一种羟基磷灰石/酵母菌生物杂化材料及其制备方法、应用，以解决单独酵母菌肿瘤治疗效果差，难以较强抑制肿瘤的问题。
根据本申请实施例的第一方面，提供一种羟基磷灰石/酵母菌生物杂化材料的制备方法，包括：
将酵母菌在液体培养基中震荡过夜后分散在去离子水中得到酵母菌分散液；
分别取相同体积的Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液混合后加入所述酵母菌分散液，搅拌后离心清洗得到羟基磷灰石/酵母菌(HA/Yeast)生物杂化材料。
优选地，所述Ca(NO3)2溶液的制备方法包括：
将Ca(NO3)2粉末加入到水中，搅拌获得摩尔浓度为18-20mM的Ca(NO3)2溶液，再将Ca(NO3)2溶液的pH调节到8-10。
优选地，所述磷酸铵溶液的制备方法包括：
将磷酸铵粉末加入到水中，搅拌获得摩尔浓度为10-12mM的磷酸铵溶液，再将磷酸铵溶液的pH调节到8-10。
优选地，震荡过夜温度为36-38℃。
优选地，所配置的酵母菌分散液浓度为0.8-1.2×108CFU/mL。
优选地，Ca(NO3)2溶液、磷酸铵溶液酵母菌分散液的体积比为1：1：(4-6)。
根据本申请实施例的第二方面，提供第一方面所述的制备方法制备得到的羟基磷灰石/酵母菌生物杂化材料。
根据本申请实施例的第三方面，提供第二方面的羟基磷灰石/酵母菌生物杂化材料在制备肿瘤的钙过载和免疫治疗制剂中的应用。
本申请的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
由上述实施例可知，本发明实施例提供的HA/Yeast生物杂化材料，HA/Yeast酵母的嗜酸特性使其能够主动靶向肿瘤组织微酸环境并大量富集；在肿瘤组织酸性环境中，酵母表面的羟基磷灰石(HA)会降解，产生大量的Ca2+，引起肿瘤细胞钙过载杀伤。更重要的是，酵母菌能够消耗肿瘤部位高表达的谷胱甘肽(GSH)、L-半胱氨酸等产生H2S能进一步地促使胞外Ca2+更多地进入肿瘤细胞实现肿瘤细胞更强的钙过载从而引起更强的肿瘤细胞杀伤。而且酵母菌表面细胞壁能够作为一种免疫治疗激活剂激活宿主对肿瘤的免疫杀伤。这一多功能肿瘤治疗材料利用肿瘤微环境特异性自供给H2S增强Ca2+在肿瘤细胞中的积累，增强对肿瘤细胞的杀伤，在肿瘤治疗中具有重要意义。
在本发明中，通过在酵母表明包覆絮状HA，实现增强肿瘤钙过载杀伤。迄今为止，本领域尚未开发一种利用活酵母在肿瘤组织通过原位发酵产生硫化氢增敏钙过载治疗制剂。而本发明填补了这一空白。本发明的制备方法具有工艺简单，价格低廉，分散性稳定性良好等优点，适合大规模生产。
因使用HA/Yeast酵母作为载体，HA作为加载材料，利用酵母的嗜酸、激活免疫和产硫化氢增强Ca2+离子过载特性提升对肿瘤的抑制作用，克服了纳米材料靶向性差、肿瘤部位对免疫的抑制以及正常情况下Ca2+离子难以在肿瘤细胞中大量积累的技术难题，从而使得本生物杂化材料具有十分优秀的杀伤肿瘤效果。
本发明增加纳米材料的特异性和靶向性，同时极大增强了肿瘤细胞钙过载以及肿瘤免疫治疗的作用。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
图1为本发明实施例中HA/Yeast杂化颗粒的电镜图，其中(a)为低倍扫描电镜图，(b)高倍扫描电镜图，(c)为透射电镜图片。从图1可以看出酵母菌表面有明显的矿化层包覆，说明酵母表面实现了材料的加载。
图2为本发明实施例中HA/Yeast杂化颗粒的Ca,P,O,N和S元素的能谱图。图2显示出Ca和P元素的增多，表明酵母表面材料的组成元素主要为Ca和P元素。
图3为本发明实施例中HA/Yeast杂化颗粒合成过程中的XRD分析变化。XRD结果可以明确材料物相为羟基磷灰石，结合图1和图2可知成功实现了羟基磷灰石对酵母菌的改性。
图4为本发明实施例中HA/Yeast杂化颗粒合成过程中的Zeta电位变化。可以看出羟基磷灰石的改性使得酵母菌电位上升，说明羟基磷灰石与酵母菌之间通过静电吸附结合。
图5为本发明实施例中HA/Yeast杂化颗粒体外Ca2+释放性能。可以看出HA/Yeast具有良好的酸相应Ca2+释放性能。
图6为本发明实施例中HA/Yeast杂化颗粒分别在对照组以及含3mM L-Cys或3mMGSH培养基中体外H2S释放性能。说明HA/Yeast能够有效利用GSH已经L-Cys产H2S。
图7为本发明实施例中不同pH条件下的4T1细胞在乏氧及3mM L-Cys的条件下分别与Ⅰ(培养基)Ⅱ(HA)Ⅲ(4×105CFU/mL酵母菌)Ⅳ(8×105CFU/mL酵母菌)Ⅴ(4×105CFU/mLHA/Yeast)Ⅵ(8×105CFU/mL HA/Yeast)共培养后的细胞存活率分析。从结果中可以看出HA/Yeast对细胞具有极强地杀伤作用。
图8为本发明实施例中巨噬细胞与HA/Yeast共培养后的转型情况以表征HA/Yeast的免疫激活性，从图中可以看出HA/Yeast对巨噬细胞具有较强的刺激转型作用。
图9为本发明实施例中巨噬细胞与Ⅰ(培养基)Ⅱ(HA)Ⅲ(酵母菌)Ⅳ(HA/Yeast)共培养后产NO情况以表征巨噬细胞转型为M1型。NO释放量的提升表明酵母菌以及HA/Yeast能够有效刺激巨噬细胞转型为M1型。
图10为本发明实施例中动物实验过程各组小鼠体重变化曲线PBS(静脉，i.t)、2mgHA(瘤内，i.v)、2×106CFU活体酵母菌(i.v)、2×106CFU死酵母菌(i.v)、2×106CFU死HA/Yeast(i.t)、2×106CFU HA/Yeast(i.v)和2×106CFU HA/Yeast(i.t)。体重无明显变化说明材料体系对小鼠副作用不明显。
图11为本发明实施例中动物实验过程各组小鼠肿瘤体积及变化曲线PBS(静脉，i.t)、2mg HA(瘤内，i.v)、2×106CFU活体酵母菌(i.v)、2×106CFU死酵母菌(i.v)、2×106CFU死HA/Yeast(i.t)、2×106CFU HA/Yeast(i.v)和2×106CFU HA/Yeast(i.t)。HA/Yeast(i.v)和HA/Yeast(i.t)组的肿瘤体积增长较小，说明HA/Yeast能够有效实现肿瘤抑制。
图12为本发明实施例中动物实验过程各组小鼠肿瘤重量柱状图PBS(静脉，i.t)、2mg HA(瘤内，i.v)、2×106CFU活体酵母菌(i.v)、2×106CFU死酵母菌(i.v)、2×106CFU死HA/Yeast(i.t)、2×106CFU HA/Yeast(i.v)和2×106CFU HA/Yeast(i.t)。肿瘤重量结果与瘤体积结果相符，同样说明HA/Yeast能够有效实现肿瘤抑制。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的装置和方法的例子。
在本申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
下面结合附图和具体实例对本发明作进一步的说明。
本发明的目的在于提供一种HA/Yeast(酵母)生物杂化材料及其制备方法、应用。酵母的嗜酸特性使其能够主动靶向肿瘤组织微酸环境并大量富集；在肿瘤组织酸性环境中，酵母表面的HA矿化层降解释放钙离子，被肿瘤细胞消化吸收，使肿瘤细胞钙过载从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。更重要的是，酵母菌消耗肿瘤部位高表达的谷胱甘肽(GSH)和L-半胱氨酸(L-Cys)生成H2S，实现肿瘤特异性H2S释放，从而实现对钙离子进入肿瘤细胞的促进，增加肿瘤钙过载杀伤。不仅如此，酵母菌细胞壁中有β-葡聚糖能够激活免疫实现对肿瘤的免疫治疗。这一多功能肿瘤治疗材料在体内外实现增敏肿瘤细胞钙过载以及免疫治疗协同在肿瘤治疗中具有重要意义。
下面通过实施例以详细说明本发明。应理解为以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述实例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
本实例提供一种HA/Yeast生物杂化材料的制备，包括：
步骤(1)，分别制备Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液并分别调节pH待用；
具体地，首先将一定Ca(NO3)2溶于去离子水中，得到17mM Ca(NO3)2溶液，再用1MNaOH溶液调节pH至8。再将一定磷酸铵溶于去离子水中得到10mM磷酸胺溶液，之后同样用1MNaOH调节pH至8。
步骤(2)，将酵母菌在液体培养基中震荡过夜后分散在去离子水中得到酵母菌分散液待用；
具体地，将一定量的酵母菌放入培养基后在36℃下震荡过夜，之后将酵母离心去除培养基后，用去离子水清洗两遍，再将酵母菌分散在去离子水中，配置浓度为0.8×108CFU/mL的酵母溶液。
步骤(3)，分别取相同体积的Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液快速混合后加入酵母菌分散液搅拌后离心清洗得到HA/Yeast。
具体地，将1mL Ca(NO3)2和1mL磷酸铵溶液快速混合之后20s后加入5mL 0.8×108CFU/mL的酵母溶液后搅拌0.5小时后，用去离子水离心清洗(3000rpm,5min)得到HA/Yeast。
实施例2
本实例提供一种HA/Yeast生物杂化材料的制备，包括：
步骤(1)，分别制备Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液并分别调节pH待用；
具体地，首先将一定Ca(NO3)2溶于去离子水中，得到19mM Ca(NO3)2溶液，再用1MNaOH溶液调节pH至10。再将一定磷酸铵溶于去离子水中得到12mM磷酸胺溶液，之后同样用1M NaOH调节pH至10。
步骤(2)，将酵母菌在液体培养基中震荡过夜后分散在去离子水中得到酵母菌分散液待用；
具体地，将一定量的酵母菌放入培养基后在38℃下震荡过夜，之后将酵母离心去除培养基后，用去离子水清洗两遍，再将酵母菌分散在去离子水中，配置浓度为1.2×108CFU/mL的酵母溶液。
步骤(3)，分别取相同体积的Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液快速混合后加入酵母菌分散液搅拌后离心清洗得到HA/Yeast。
具体地，将1mL Ca(NO3)2和1mL磷酸铵溶液快速混合之后40s后加入5mL 0.8×108CFU/mL的酵母溶液后搅拌2小时后，用去离子水离心清洗(3000rpm,5min)得到HA/Yeast。
实施例3
优选的，本实例提供一种HA/Yeast生物杂化材料的制备，包括：
步骤(1)，分别制备Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液并分别调节pH待用；
具体地，首先将一定Ca(NO3)2溶于去离子水中，得到18mM Ca(NO3)2溶液，再用1MNaOH溶液调节pH至9。再将一定磷酸铵溶于去离子水中得到10.8mM磷酸胺溶液，之后同样用1M NaOH调节pH至9。
步骤(2)，将酵母菌在液体培养基中震荡过夜后分散在去离子水中得到酵母菌分散液待用；
具体地，将一定量的酵母菌放入培养基后在37℃下震荡过夜，之后将酵母离心去除培养基后，用去离子水清洗两遍，再将酵母菌分散在去离子水中，配置浓度为1×108CFU/mL的酵母溶液。
步骤(3)，分别取相同体积的Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液快速混合后加入酵母菌分散液搅拌后离心清洗得到HA/Yeast。
具体地，将1mL Ca(NO3)2和1mL磷酸铵溶液快速混合之后30s后加入5mL 1×108CFU/mL的酵母溶液后搅拌1小时后，用去离子水离心清洗(3000rpm,5min)得到HA/Yeast。
HA/Yeast的形貌分析图如图1所示，可以看出在优选条件下HA极其均匀地分布在酵母菌表面。图2和图3分别为HA/Yeast的能谱图以及XRD图，从中可以确认所加载材料为HA。图4为HA/Yeast的zeta电位图，可以看出HA的加载提升了Yeast的表面电位，说明HA与Yeast之间的结合方式为静电吸附。
实施例4
本实例提供一种HA/Yeast生物杂化材料的制备，包括：
步骤(1)，分别制备Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液并分别调节pH待用；
具体地，首先将一定Ca(NO3)2溶于去离子水中，得到17mM Ca(NO3)2溶液，再用1MNaOH溶液调节pH至8。再将一定磷酸铵溶于去离子水中得到10mM磷酸胺溶液，之后同样用1MNaOH调节pH至8。
步骤(2)，将酵母菌在液体培养基中震荡过夜后分散在去离子水中得到酵母菌分散液待用；
具体地，将一定量的酵母菌放入培养基后在36℃下震荡过夜，之后将酵母离心去除培养基后，用去离子水清洗两遍，再将酵母菌分散在去离子水中，配置浓度为0.8×108CFU/mL的酵母溶液。
步骤(3)，分别取相同体积的Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液快速混合后加入酵母菌分散液搅拌后离心清洗得到HA/Yeast。
具体地，将1mL Ca(NO3)2和1mL磷酸铵溶液快速混合之后20s后加入4mL 0.8×108CFU/mL的酵母溶液后搅拌0.5小时后，用去离子水离心清洗(3000rpm,5min)得到HA/Yeast。
实施例5
本实例提供一种HA/Yeast生物杂化材料的制备，包括：
步骤(1)，分别制备Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液并分别调节pH待用；
具体地，首先将一定Ca(NO3)2溶于去离子水中，得到17mM Ca(NO3)2溶液，再用1MNaOH溶液调节pH至8。再将一定磷酸铵溶于去离子水中得到10mM磷酸胺溶液，之后同样用1MNaOH调节pH至8。
步骤(2)，将酵母菌在液体培养基中震荡过夜后分散在去离子水中得到酵母菌分散液待用；
具体地，将一定量的酵母菌放入培养基后在36℃下震荡过夜，之后将酵母离心去除培养基后，用去离子水清洗两遍，再将酵母菌分散在去离子水中，配置浓度为0.8×108CFU/mL的酵母溶液。
步骤(3)，分别取相同体积的Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液快速混合后加入酵母菌分散液搅拌后离心清洗得到HA/Yeast。
具体地，将1mL Ca(NO3)2和1mL磷酸铵溶液快速混合之后20s后加入6mL 0.8×108CFU/mL的酵母溶液后搅拌0.5小时后，用去离子水离心清洗(3000rpm,5min)得到HA/Yeast。
实施例6
本实施例提供上述实施例1-5任一项所述的HA/Yeast生物杂化材料在制备肿瘤钙过载和免疫协同治疗制剂中的应用。
将实施例1-5任一项所述的HA/Yeast生物杂化材料以1010个/mL溶解于pbs溶液中得到制剂，将所得制剂置于4℃环境下储存，治疗时通过静脉注射使用。
实施例7
材料的肿瘤钙过载治疗性能：材料肿瘤钙过载治疗性能主要由材料的钙离子释放和硫化氢释放性能体现。HA/Yeast生物杂化材料的分别加入1mL不同pH醋酸缓冲溶液中，4h后取样测试钙离子含量得到HA/Yeast的钙离子释放柱状图。HA/Yeast生物杂化材料加入普通培养基以及分别含3mM GSH或3mM L-Cys培养基中，37℃下震荡用紫外分光光度计测试不同时间点H2S产出情况，得H2S释放曲线。
从图5和图6中可以看出，HA/Yeast能够有效实现酸响应钙离子释放，以及GSH或L-Cys响应性H2S释放，表明HA/Yeast拥有良好的肿瘤特异性钙过载治疗性能。
实施例8
本实验通过在细胞层面的杀伤效果来说明材料在肿瘤细胞杀伤方面的应用。所选用的细胞为4T1小鼠乳腺癌细胞，所用的培养基都含有3mM L-Cys。如图7所示，HA对细胞没有明显杀伤，酵母在中性条件下对细胞的杀伤比HA/Yeast要强，酸性条件能极强地增强HA/Yeast对细胞的杀伤，而酵母对细胞的杀伤被酸增强不明显。酸性条件下，当HA/Yeast的浓度达到8×105CFU/mL时对细胞的杀伤效果可达80％以上，说明HA酸降解释放钙离子能够有效地被酵母菌释放的H2S增敏进入细胞实现肿瘤细胞的杀伤。
实施例9
本实验通过在细胞层面的促进巨噬细胞转型效果来说明材料在免疫治疗方面的应用。所选用的细胞为RAW 264.7。如图8所示，相比于对照组，可以看出巨噬细胞的形态变化，说明HA/Yeast能够有效刺激巨噬细胞转型。巨噬细胞产NO情况如图9所示，NO作为巨噬细胞转型为M1型肿瘤拮抗巨噬细胞的标志，能够有效证明HA/Yeast刺激了巨噬细胞转型为M1型，说明HA/Yeast能够实现肿瘤免疫治疗。
实施例10
本实验通过在动物(小鼠)层面的肿瘤杀伤来说明材料在肿瘤细胞杀伤方面的应用。随机将4T1肿瘤移植的老鼠分为七组。在小鼠荷瘤后第0、2、4天分别对各组小鼠进行处理，第一组静脉注射PBS溶液，第二组每只小鼠瘤内注射2mg HA，第三组每只小鼠静脉注射2×106CFU活体酵母菌，第四组每只小鼠静脉注射2×106CFU死酵母菌，第五组每只小鼠瘤内注射2×106CFU死HA/Yeast(i.t)，第六组每只小鼠静脉注射2×106CFU HA/Yeast，第七组每只小鼠瘤内注射2×106CFU HA/Yeast，分别称量小鼠体重、肿瘤尺寸以及小鼠瘤重，分别如图10-12所示。从图10中可以看出，所有小鼠的体重均无明显变化，说明上述处理对小鼠的正常生理活动并无明显影响。从图11中可以看出，与对照组相比，从肿瘤体积变化可以看出，HA组没有产生明显的肿瘤抑制效果。死Yeast@HA静脉注射和死Yeast@HA瘤内注射组治疗有一定疗效，这可能与酵母菌引起的部分免疫治疗有关。酵母组静脉注射组的治疗效果稍强，说明酵母代谢具有抑瘤作用。另外，Yeast@HA静脉注射和Yeast@HA瘤内注射组的处理效果最好，说明HA降解产Ca2+和酵母菌产H2S协同杀伤肿瘤细胞的处理方案具有很好的肿瘤抑制效果。图12中不同组别瘤重显示出单独的死或者或酵母以及死酵母杂化羟基磷灰石组中瘤重对比对照组均有一定下降。但酵母杂化羟基磷灰石组瘤内和静脉注射的治疗效果相比其他组都有着极强的杀伤，其结果与瘤体积相吻，表明酵母杂化羟基磷灰石具有十分优秀肿瘤杀伤功能。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的内容后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由权利要求指出。
应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (4)

1.一种羟基磷灰石/酵母菌生物杂化材料的制备方法，其特征在于，包括：
将酵母菌在液体培养基中震荡过夜后分散在去离子水中得到酵母菌分散液，所配置的酵母菌分散液浓度为0.8-1.2×108 CFU/mL；
分别取相同体积的Ca(NO3)2溶液和磷酸铵溶液混合后加入所述酵母菌分散液，Ca(NO3)2溶液、磷酸铵溶液酵母菌分散液的体积比为1：1：(4-6)，搅拌后离心清洗得到HA/Yeast生物杂化材料；
其中，所述Ca(NO3)2溶液的制备方法包括：
将Ca(NO3)2粉末加入到水中，搅拌获得摩尔浓度为18 -20 mM的Ca(NO3)2溶液，再将Ca(NO3)2溶液的pH调节到8-10；
其中，所述磷酸铵溶液的制备方法包括：
将磷酸铵粉末加入到水中，搅拌获得摩尔浓度为10-12 mM的磷酸铵溶液，再将磷酸铵溶液的pH调节到8-10。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，震荡过夜温度为36-38℃。
3.一种由权利要求1-2任一项所述的制备方法制备得到的羟基磷灰石/酵母菌生物杂化材料。
4.根据权利要求3所述的羟基磷灰石/酵母菌生物杂化材料在制备肿瘤的钙过载和免疫治疗制剂中的应用。
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纳米羟基磷灰石诱导的体外特异性抗肿瘤免疫反应研究;董文韬等;《浙江理工大学学报(自然科学版)》;20170930;第37卷(第05期);727-736 *

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