CN113981009B - 一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法 - Google Patents

一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法，属于生物陶瓷材料技术领域。该方法采用氯化钙(CaCl2)作为钙盐，磷酸氢二铵((NH4)2HPO4)作为磷酸盐，柠檬酸(C6H8O7)作为反应螯合剂，在高浓度碱性条件下加入酵母菌上清液诱导矿化生长，陈化5天后，将所得沉淀放入烘箱干燥。本发明以常见的无机盐和简单的试剂为主，成本低，简单易行且重复性很好，适合大规模生产。合成的羟基磷灰石(HA)材料与现有骨粉相近，可用于牙槽骨缺损的填充。

Description

一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法
技术领域
本发明涉及生物陶瓷材料技术领域，具体为一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法。
背景技术
生物陶瓷是一种能够直接或间接用于人体的陶瓷材料，具有良好的生物相容性，组织亲和性以及化学稳定性。在拔除牙齿后，伴随着牙槽骨高度和宽度的减少,导致牙槽骨太薄，可利用的骨量不足，后期不能直接进行植牙。牙槽骨骨量不足所导致患者牙齿松动、脱落，严重影响患者的身心健康。临床上一般会采取骨粉加骨膜用于修复缺损牙洞，人工的方式去增加牙槽骨厚度，防止牙槽骨吸收，保存拔牙位点，为后期牙齿种植创造良好的条件。羟基磷灰石具有良好的生物相容性、生物活性以及骨传导性，是人体骨的无机成分。临床上用于拔牙位点保存的骨粉材料，其主要成分就是羟基磷灰石。研究发现，人骨中的羟基磷灰石成分结晶性不高。现有针对羟基磷灰石的研究，结晶性高，且形貌与人工合成骨粉相差较大。
中国专利CN201210402691.9公开了一种利用隔膜调制矿化法制备出低结晶的纳米羟基磷灰石。主要采用有一定截留分子量的透析袋隔离胶原蛋白和无机钙盐，通过胶原蛋白分子量大的特点将原料放在透析膜内调制矿化透析膜外的钙离子的方法制备纳米羟基磷灰石材料，最终获得均匀的、结晶度低的羟基磷灰石。然而，透析袋的使用，会增加后处理和废弃物的回收麻烦。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法。研究出一种制备工艺简单、成本低廉、组分均匀可控的HA骨粉材料。在常温下利用酵母菌上清液诱导矿化生产羟基磷灰石，其结晶性及形貌与现有骨粉相近。该方法简单易行且无需高温烧结，适合大规模生产，所制备的羟基磷灰石骨粉材料是一种很有前途的牙槽骨缺损修复材料。
(二)技术方案
本发明提供如下技术方案：一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，配制钙盐溶液：称取5.8-23.1g CaCl2于烧杯中，并加入20-80mL去离子水，搅拌至完全溶解得到钙盐溶液；
步骤2，配制柠檬酸溶液：称取2.1-8.4g C6H8O7并加入20-80mL去离子水，搅拌至完全溶解得到无色透明的柠檬酸溶液；
步骤3，配制混合溶液：称取4-16g(NH4)2HPO4加入到步骤2获得的柠檬酸溶液中，搅拌至完全溶解得到混合溶液；
步骤4，配制碱性溶液：称取4.2-16.7g NaOH粉末，将称取的NaOH粉末少量多次加入到10-40mL去离子水中，搅拌均匀得到碱性溶液；
步骤5，将步骤3和步骤4获得的混合溶液、碱性溶液依次加入到步骤1获得的钙盐溶液中，搅拌均匀得到白色乳浊液为HA前驱体溶液；
步骤6，配制酵母菌培养液：称取1-4g蛋白胨，溶于50-200mL去离子水中，搅拌均匀得到蛋白胨溶液；称取1-4g NaCl，溶于50-200mL去离子水中，搅拌均匀得到NaCl溶液；将蛋白胨溶液与NaCl溶液混合搅拌均匀得到酵母菌培养液；
步骤7，称取0.3-1.2g酵母菌加入到步骤6获得的酵母菌培养溶液，置于酸奶机发酵后，离心提取上清液；将酵母菌上清液与HA前驱体溶液混合搅拌均匀后陈化一段时间后放入烘箱干燥即可得到HA骨粉。
在上述技术方案中，所述步骤1、2、3、4、5、6、7中搅拌过程使用磁力搅拌机进行，搅拌时间为10-120min。
在上述技术方案中，所述步骤4中NaOH粉末加入去离子水的过程分5-10次加入。
在上述技术方案中，所述步骤7中酵母菌为安琪高活性干酵母或安琪甜酒曲酵母；培养溶液置于酸奶机发酵的时间为8h，离心速度为8000r/min，离心时间为5min，陈化时间为5天。
(三)有益效果
本发明提供了一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法。具备以下有益效果：
采用氯化钙(CaCl2)作为钙盐，磷酸氢二铵((NH4)2HPO4)作为磷酸盐，柠檬酸(C6H8O7)作为反应螯合剂，在碱性条件下加入酵母菌上清液诱导矿化生长，陈化5天后得到羟基磷灰石骨粉材料。该方法成本低，简单易行且重复性很好，合成的性能高，稳定性好，适合大规模生产，能够推进生物陶瓷材料商业化进程。
附图说明
图1为本发明提供的一种利用酵母菌上清液诱导矿化生产羟基磷灰石(HA)骨粉的工艺流程图。
图2(a)为现有骨粉的X射线衍射图谱；图2(b)为本发明实施例1制备得到的HA骨粉材料的X射线衍射图谱。
图3(a)为现有骨粉的扫描电镜图；图3(b,c)为本发明实施例1制备得到的HA骨粉材料的扫描电镜图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1～图3所示，本发明提供一种技术方案：一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法，如图1工艺流程图所示，具体操作步骤如下：
步骤1，配制钙盐溶液：称取5.8-23.1g CaCl2于烧杯中，并加入20-80mL去离子水，使用磁力搅拌机搅拌10-30min，得到钙盐溶液；
步骤2，配制柠檬酸溶液：称取2.1-8.4g C6H8O7并加入20-80mL去离子水，使用磁力搅拌机搅拌10-30min，得到柠檬酸溶液；
步骤3，配制混合溶液：称取4-16g(NH4)2HPO4加入到步骤2获得的柠檬酸溶液中，使用磁力搅拌机搅拌10-30min，得到混合溶液；
步骤4，配制碱性溶液：称取4.2-16.7g NaOH粉末，将称取的NaOH粉末5-10次加入到10-40mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌10-30min，得到碱性溶液；
步骤5，将步骤3和步骤4获得的混合溶液、碱性溶液依次加入到步骤1获得的钙盐溶液中，搅拌30-60min得到白色乳浊液为HA前驱体溶液；
步骤6，配制酵母菌培养液：称取1-4g蛋白胨，溶于50-200mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌10-30min，得到蛋白胨溶液；称取1-4g NaCl，溶于50-200mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌10-30min得到NaCl溶液；将蛋白胨溶液与NaCl溶液，使用磁力搅拌机混合搅拌30-60min，得到酵母菌培养液；
步骤7，称取0.3-1.2g安琪高活性干酵母或安琪甜酒曲酵母加入到步骤6获得的酵母菌培养溶液，置于酸奶机发酵8h后，在8000r/min的速度下离心5min提取上清液；将酵母菌上清液与HA前驱体溶液混合搅拌30-120min后，陈化5天即可得到HA骨粉。
实施例1：
步骤1，配制钙盐溶液：称取5.8g CaCl2于烧杯中，并加入20mL去离子水，使用磁力搅拌机搅拌10min，得到钙盐溶液；
步骤2，配制柠檬酸溶液：称取2.1g C6H8O7并加入20mL去离子水，使用磁力搅拌机搅拌10min，得到柠檬酸溶液；
步骤3，配制混合溶液：称取4g(NH4)2HPO4加入到步骤2获得的柠檬酸溶液中，使用磁力搅拌机搅拌10min，得到混合溶液；
步骤4，配制碱性溶液：称取4.2g NaOH粉末，将称取的NaOH粉末5次加入到10mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌10min，得到碱性溶液；
步骤5，将步骤3和步骤4获得的混合溶液、碱性溶液依次加入到步骤1获得的钙盐溶液中，搅拌30min得到白色乳浊液为HA前驱体溶液；
步骤6，配制酵母菌培养液：称取1g蛋白胨，溶于50mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌10min，得到蛋白胨溶液；称取1g NaCl，溶于50mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌10min得到NaCl溶液；将蛋白胨溶液与NaCl溶液，使用磁力搅拌机混合搅拌30min，得到酵母菌培养液；
步骤7，称取0.3g安琪高活性干酵母或安琪甜酒曲酵母加入到步骤6获得的酵母菌培养溶液，置于酸奶机发酵8h后，在8000r/min的速度下离心5min提取上清液；将酵母菌上清液与HA前驱体溶液混合搅拌30min后，陈化5天即可得到HA骨粉。
实施例2：
步骤1，配制钙盐溶液：称取11.6g CaCl2于烧杯中，并加入40mL去离子水，使用磁力搅拌机搅拌20min，得到钙盐溶液；
步骤2，配制柠檬酸溶液：称取4.2g C6H8O7并加入40mL去离子水，使用磁力搅拌机搅拌20min，得到柠檬酸溶液；
步骤3，配制混合溶液：称取8g(NH4)2HPO4加入到步骤2获得的柠檬酸溶液中，使用磁力搅拌机搅拌20min，得到混合溶液；
步骤4，配制碱性溶液：称取8.3g NaOH粉末，将称取的NaOH粉末8次加入到20mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌20min，得到碱性溶液；
步骤5，将步骤3和步骤4获得的混合溶液、碱性溶液依次加入到步骤1获得的钙盐溶液中，搅拌45min得到白色乳浊液为HA前驱体溶液；
步骤6，配制酵母菌培养液：称取2g蛋白胨，溶于100mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌20min，得到蛋白胨溶液；称取2gNaCl，溶于100mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌20min得到NaCl溶液；将蛋白胨溶液与NaCl溶液，使用磁力搅拌机混合搅拌45min，得到酵母菌培养液；
步骤7，称取0.6g安琪高活性干酵母或安琪甜酒曲酵母加入到步骤6获得的酵母菌培养溶液，置于酸奶机发酵8h后，在8000r/min的速度下离心5min提取上清液；将酵母菌上清液与HA前驱体溶液混合搅拌60min后，陈化5天即可得到HA骨粉。
实施例3：
步骤1，配制钙盐溶液：称取23.1g CaCl2于烧杯中，并加入80mL去离子水，使用磁力搅拌机搅拌30min，得到钙盐溶液；
步骤2，配制柠檬酸溶液：称取8.4g C6H8O7并加入80mL去离子水，使用磁力搅拌机搅拌30min，得到柠檬酸溶液；
步骤3，配制混合溶液：称取16g(NH4)2HPO4加入到步骤2获得的柠檬酸溶液中，使用磁力搅拌机搅拌30min，得到混合溶液；
步骤4，配制碱性溶液：称取16.7g NaOH粉末，将称取的NaOH粉末10次加入到40mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌30min，得到碱性溶液；
步骤5，将步骤3和步骤4获得的混合溶液、碱性溶液依次加入到步骤1获得的钙盐溶液中，搅拌60min得到白色乳浊液为HA前驱体溶液；
步骤6，配制酵母菌培养液：称取4g蛋白胨，溶于200mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌30min，得到蛋白胨溶液；称取4gNaCl，溶于200mL去离子水中，使用磁力搅拌机搅拌30min得到NaCl溶液；将蛋白胨溶液与NaCl溶液，使用磁力搅拌机混合搅拌60min，得到酵母菌培养液；
步骤7，称取1.2g安琪高活性干酵母或安琪甜酒曲酵母加入到步骤6获得的酵母菌培养溶液，置于酸奶机发酵8h后，在8000r/min的速度下离心5min提取上清液；将酵母菌上清液与HA前驱体溶液混合搅拌120min后，陈化5天即可得到HA骨粉。
对本发明实施例1所制备的HA材料进行X射线衍射分析(XRD)(如图2所示)，从图2(b)中出现了HA的特征峰，其衍射峰与HA的标准卡片对应，并且制备的HA材料结晶度较弱，基本无杂质相，与图2(a)现有骨粉的XRD图相近，因此可得出通过本发明成功制备HA骨粉材料的结论。
利用扫描电镜(SEM)对本发明实施例1所制备的HA材料的形貌进行分析(如图3所示)，从图3(c,d)可以看出制备的HA材料为纳米颗粒堆积而成的层片结构，与图3(a)现有骨粉形貌相近。
该方法采用氯化钙(CaCl2)作为钙盐，磷酸氢二铵((NH4)2HPO4)作为磷酸盐，柠檬酸(C6H8O7)作为反应螯合剂，在高浓度碱性条件下加入酵母菌上清液诱导矿化生长，陈化5天后，将所得沉淀放入烘箱干燥。本发明以常见的无机盐和简单的试剂为主，成本低，简单易行且重复性很好，适合大规模生产。合成的羟基磷灰石材料与现有骨粉相近，可用于牙槽骨缺损的填充。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，配制钙盐溶液：称取5.8-23.1g CaCl2于烧杯中，并加入20-80mL去离子水，搅拌至完全溶解得到钙盐溶液；
步骤2，配制柠檬酸溶液：称取2.1-8.4g C6H8O7并加入20-80mL去离子水，搅拌至完全溶解得到无色透明的柠檬酸溶液；
步骤3，配制混合溶液：称取4-16g(NH4)2HPO4加入到步骤2获得的柠檬酸溶液中，搅拌至完全溶解得到混合溶液；
步骤4，配制碱性溶液：称取4.2-16.7g NaOH粉末，将称取的NaOH粉末少量多次加入到10-40mL去离子水中，搅拌均匀得到碱性溶液；
步骤5，将步骤3和步骤4获得的混合溶液、碱性溶液依次加入到步骤1获得的钙盐溶液中，搅拌均匀得到白色乳浊液为HA前驱体溶液；
步骤6，配制酵母菌培养液：称取1-4g蛋白胨，溶于50-200mL去离子水中，搅拌均匀得到蛋白胨溶液；称取1-4g NaCl，溶于50-200mL去离子水中，搅拌均匀得到NaCl溶液；将蛋白胨溶液与NaCl溶液混合搅拌均匀得到酵母菌培养液；
步骤7，称取0.3-1.2g酵母菌加入到步骤6获得的酵母菌培养溶液，置于酸奶机发酵后，离心提取上清液；将酵母菌上清液与HA前驱体溶液混合搅拌均匀后陈化一段时间后放入烘箱干燥即可得到HA骨粉。
2.根据权利要求1所述的一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法，其特征在于，所述步骤1、2、3、4、5、6、7中搅拌过程使用磁力搅拌机进行，搅拌时间为10-120min。
3.根据权利要求1所述的一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法，其特征在于，所述步骤4中NaOH粉末加入去离子水的过程分5-10次加入。
4.根据权利要求1所述的一种利用酵母菌诱导矿化生产羟基磷灰石骨粉的制备方法，其特征在于，所述步骤7中酵母菌为安琪高活性干酵母或安琪甜酒曲酵母；培养溶液置于酸奶机发酵的时间为8h，离心速度为8000r/min，离心时间为5min，陈化时间为5天。
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