CN114113388B - 一种4-肟甲基-1-萘甲酸中有关物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物分析领域，公开了一种4‑肟甲基‑1‑萘甲酸中有关物质的检测方法。通过配制对照品溶液和供试品溶液，使用高效液相色谱测定对照品溶液和供试品溶液的色谱图，根据主成分自身对照法确定有关物质的含量。本检测方法具有专属性强、分离度高、线性关系优异、灵敏度高且分析时间短等诸多优点，能满足4‑肟甲基‑1‑萘甲酸中有关物质的检测要求，适合于推广应用。

Description

一种4-肟甲基-1-萘甲酸中有关物质的检测方法

技术领域

本发明药物分析化学技术领域，具体涉及一种4-肟甲基-1-萘甲酸中有关物质的检测方法。

背景技术

阿福拉纳(商品名尼可信)是国内首个对蜱虫和跳蚤两种虫类均具有强力灭除的驱虫药。其作用机理是通过抑制GABA氯离子通道，使得节肢动物神经过度兴奋致死。2017年，全球第二大动物保健企业勃林格殷格翰宣布其针对蜱虫和跳蚤的犬用口服驱虫药尼可信在中国上市，因其灭杀速度快，效果持久等特点而受欢迎。

4-肟甲基-1-萘甲酸

作为阿福拉纳原料药工艺生产过程中的中间体，在生产阿福拉纳原料药过程中具有其特定的研究意义。

目前，未见该化合物及其有关物质检测方法的相关专利文献报道。有关物质主要为4-肟甲基-1-萘甲酸合成过程中的工艺副产物及降解产物，主要有1-甲基萘(杂质A，CAS号为90-12-0)、4-乙酰-1-甲基萘(杂质B，CAS号为28418-86-2)、4-甲基-1-萘甲酸(杂质C，CAS号为4488-40-8)、4-甲酰基萘-1-羧酸(杂质D，CAS号为219685-15-1)、1,4-萘二甲酸(杂质E，CAS号为605-70-9)。这些杂质对产品质量会产生不利影响，为保证产品的质量和用药安全，因此需要对4-肟甲基-1-萘甲酸中有关物质进行检测和监控，更有利于阿福拉纳原料药的制备。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种4-肟甲基-1-萘甲酸中有关物质的检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种4-肟甲基-1-萘甲酸中有关物质的检测方法，所述有关物质为1-甲基萘、4-乙酰-1-甲基萘、4-甲基-1-萘甲酸、4-甲酰基萘-1-羧酸和1,4-萘二甲酸，包括如下步骤：

配制4-肟甲基-1-萘甲酸及有关物质的对照品溶液；

配制4-肟甲基-1-萘甲酸供试品溶液；

使用高效液相色谱法测定对照品溶液和供试品溶液的色谱图，所述高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为高氯酸水溶液，洗脱程序为梯度洗脱；

根据对照品溶液和供试品溶液的色谱图，利用主成分自身对照法确定供试品溶液中有关物质的含量。

在一些检测方法的实例中，所述流动相B中高氯酸的体积分数为0.01％～0.1％。该浓度范围下得到的检测结果更准确。另外，高氯酸溶液浓度过大会导致色谱柱改性。

在一些检测方法的实例中，梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：以体积分数计，0min～8min，30％～70％运行；8min～12min，70％～80％运行；12min～15min，80％运行；15.1min～20min，30％运行。

在一些检测方法的实例中，所述流动相的流速为0.9mL/min～1.5mL/min。

在一些检测方法的实例中，所述高效液相色谱中的色谱柱温度为25℃～35℃。

在一些检测方法的实例中，所述高效液相色谱中的进样量为5μL～15μL。

在一些检测方法的实例中，所述高效液相色谱中的检测波长为240nm～250nm。

在一些检测方法的实例中，所述对照品溶液质量浓度为2.5μg/mL～10μg/mL，供试品溶液质量浓度为0.4mg/mL～1.0mg/mL。

在一些检测方法的实例中，所述对照品溶液和供试品溶液均采用体积分数为30％～60％的乙腈水溶液进行配制。

在一些检测方法的实例中，包括如下步骤：

使用体积分数为30％～60％的乙腈水溶液配制质量浓度为2.5μg/mL～10μg/mL对照品溶液和0.4mg/mL～1.0mg/mL供试品溶液。

使用高效液相色谱测定对照品溶液和供试品溶液的液相色谱图，所述高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.01％～0.1％的高氯酸水溶液，洗脱程序为梯度洗脱，其中：梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：以体积分数计，0min～8min，30％～70％运行；8min～12min，70％～80％运行；12min～15min，80％运行；15.1min～20min，30％运行；流速为0.9mL/min～1.5mL/min，进样量为5μL～15μL，色谱柱温度为25℃～35℃，检测波长为240nm～250nm。

在一些检测方法的实例中，色谱柱为Kromasil 100-5-C18色谱柱：4.6mm×100mm，5μm。

根据对照品溶液和供试品溶液的色谱图，利用主成分自身对照法确定供试品溶液中有关物质的含量。

本发明的有益效果是：

本发明的一些实例，利用高效液相色谱对4-肟甲基-1-萘甲酸中有关物质进行检测，通过使用离液试剂，使得4-肟甲基-1-萘甲酸与杂质、杂质与杂质之间能有效分离，该方法灵敏度高、耐用性好且稳定，能充分满足有关物质测定的需求，保证产品质量，适于工业生产应用。

本发明的一些实例，通过主成分自身对照法对有关物质进行定量检测，为监控以4-肟甲基-1-萘甲酸作为中间体合成的阿福拉纳原料药的质量稳定性提供了保证。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中供试品溶液的液相色谱图；

图2为本发明实施例2中供试品溶液的液相色谱图；

图3为本发明实施例3中系统适用性溶液的液相色谱图；

图4为本发明实施例3中杂质A限度溶液的液相色谱图；

图5为本发明实施例3中杂质B限度溶液的液相色谱图；

图6为本发明实施例3中杂质C限度溶液的液相色谱图；

图7为本发明实施例3中杂质D限度溶液的液相色谱图；

图8为本发明实施例3中杂质E限度溶液的液相色谱图；

图9为对比例1中供试品溶液的液相色谱图；

图10为对比例2中供试品溶液的液相色谱图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

方便比较起见，以下实施例和对比例中，所采用的溶剂均为体积分数为40％乙腈水溶液；所述有关物质为1-甲基萘(杂质A)、4-乙酰-1-甲基萘(杂质B)、4-甲基-1-萘甲酸(杂质C)、4-甲酰基萘-1-羧酸(杂质D)和1,4-萘二甲酸(杂质E)。

实施例1

S1：对照品溶液制备：精密称取4-肟甲基-1-萘甲酸对照品10mg于20mL容量瓶中，再取此溶液1.0mL于50mL的容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀；

S2：供试品溶液制备：精密称取4-肟甲基-1-萘甲酸供试品10mg于20mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀；

S3：高效液相色谱测定：Kromasil 100-5-C18色谱柱：4.6mm×100mm，5μm；流动相为乙腈:0.01％高氯酸水溶液＝(30～80):(70～20)(v/v)进行梯度洗脱，梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：0min～8min，30％～70％运行；8min～12min，70％～80％运行；12min～15min，80％运行；15.1min～20min，30％运行；流速：1.2mL/min；柱温：30℃；紫外检测器检测波长：245nm；进样量：10μL；将样品溶液注入液相色谱仪。检测结果如图1所示。

由图1可知：主成分与各有关物质达到基线分离，利用主成分自身对照法计算得到4-肟甲基-1-萘甲酸中杂质A含量为0.0020％，杂质B含量为0.0021％，杂质C含量为0.0832％，杂质D含量为1.0931％，杂质E含量为0.0573％，且峰型良好。

实施例2

实施例2和实施例1的检测方法相同，不同之处在于S2的色谱条件，具体为：

流动相为乙腈:0.1％高氯酸水溶液＝(30～80):(70～20)(v/v)进行梯度洗脱，检测结果如图2所示。

由图2可知：各组分均能有效分离，利用主成分自身对照法计算得到4-肟甲基-1-萘甲酸中杂质A含量为0.0034％，杂质B含量为0.0019％，杂质C含量为0.0611％，杂质D含量为1.1368％，杂质E含量为0.0486％，且峰型良好。

实施例3：专属性试验

S1：杂质储备液制备：分别取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E，加入溶剂使其浓度为0.10mg/mL，作为储备液备用；

S2：杂质限度溶液制备：移取杂质储备液0.5mL于20mL容量瓶中，得到浓度为2.50μg/mL的杂质限度溶液；

S3：系统适用性溶液制备：精密称取4-肟甲基-1-萘甲酸对照品10mg于20mL的容量瓶，并加入上述杂质储备液各0.5mL，用溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀。使得4-肟甲基-1-萘甲酸的浓度为500μg/mL，各杂质的浓度为2.50μg/mL；

S4：按照实施例1中的高效液相色谱条件进行测定，将各杂质限度溶液和系统适用性溶液注入液相色谱仪，其中系统适用性溶液连续测定6次，记录色谱图。结果如图3、图4、图5、图6、图7、图8和表1所示。

表1

组分名称	保留时间	分离度	6针峰面积RSD
				杂质E	4.61min	/	1.80％
4-肟甲基-1-萘甲酸	5.53min	9.67	0.03％
				杂质D	6.91min	11.61	1.36％
杂质C	8.97min	16.42	1.46％
				杂质B	11.57min	21.76	1.71％
杂质A	14.36min	21.54	1.58％

试验结果表明，系统适用性溶液各组分之间的分离度≥9.67，杂质限度溶液与系统适用性溶液保留时间基本一致，6针系统适用性溶液峰面积RSD在0.03％～1.80％之间，主成分拖尾因子在1.03～1.38之间，均符合方法学验证要求。

实施例4：检测限和定量限试验

根据实施例3中各有关物质限度溶液色谱图可初步得出各组分的信噪比，取限度溶液进行逐步稀释，找出信噪比为2～4对应的浓度，定为检测限浓度；信噪比为8～12对应的浓度，定为定量限浓度。最终确定有关物质的检测限、定量限如下表2所示。

表2

组分名称	杂质A	杂质B	杂质C	杂质D	杂质E
						检测限	0.07μg/mL	0.14μg/mL	0.19μg/mL	0.12μg/mL	0.13μg/mL
定量限	0.26μg/mL	0.54μg/mL	0.43μg/mL	0.40μg/mL	0.33μg/mL

试验结果表明，本发明的的检测方法对各有关物质均具备较高的灵敏度。

实施例5：线性关系试验

S1：分别制备定量限、50％、80％、100％和120％的有关物质的限度混合溶液，每个浓度各一份，每份样品检测3次；

S2：按照实施例1中的高效液相色谱条件测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到各有关物质的线性回归方程，结果见表3。

表3

组分名称	线性方程	线性范围(μg/mL)	线性系数r
				杂质A	y＝32106x-222.36	0.26～3.11	0.9998
杂质B	y＝37913x-1458.6	0.54～3.05	0.9995
				杂质C	y＝37518x+145.3	0.43～2.84	0.9995
杂质D	y＝31556x-138.96	0.40～3.23	0.9992
				杂质E	y＝21629x-827.22	0.33～2.98	0.9995

试验结果表明，在本发明检测方法下，有关物质的浓度与峰面积线性回归关系良好。

实施例6：准确度试验

S1：200％限度杂质混合溶液配制：分别吸取各杂质储备液1.0mL于同一个20mL容量瓶中，用溶剂稀释定容至刻度，混匀；

S2：加杂供试品溶液配制：精密称取3份4-肟甲基-1-萘甲酸供试品，每份10mg于20mL容量瓶，向容量瓶分别加入5.0mL、10.0mL、15.0mL 200％限度杂质混合溶液，加入溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀。得到限度为50％、100％和150％的加杂供试品溶液；

S3：按照实施例1中的高效液相色谱条件测定样品溶液的峰面积，计算加杂供试品溶液中有关物质的回收率，结果如下表4。

表4

试验结果表明，三个不同浓度下杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的回收率在89.66％～110.28％之间，符合方法学验证要求(80.0％～120.0％)。

实施例7：耐用性试验

S1：按照实施例1配制1份对照品溶液和2份供试品溶液；

S2：按照实施例1中的高效液相色谱条件，分别在柱温＝30±5℃、流速＝1.2±0.3mL/min条件下检测样品溶液，计算在不同柱温、流速下供试品溶液中有关物质含量，结果如表5、表6所示。

表5

表6

试验结果表明，柱温波动不超过5℃以及流速变化不超过0.3mL/min情况下对4-肟甲基-1-萘甲酸供试品溶液中有关物质的影响均在可接受范围内。

实施例8：稳定性试验

S1：按照实施例1配制对照品溶液和供试品溶液；

S2：按照实施例1中的高效液相色谱条件测定样品溶液，分别在配制后的0、2、4、8、12小时进行测定。计算得到供试品溶液中有关物质含量结果如表7所示。

表7

时间(小时)

0

2

4

8

12

RSD

杂质A

0.0020％

0.0019％

0.0016％

0.0020％

0.0018％

9.00％

杂质B

0.0021％

0.0018％

0.0026％

0.0023％

0.0026％

15.00％

杂质C

0.0830％

0.0557％

0.0635％

0.0720％

0.0661％

14.99％

杂质D

1.0903％

1.2359％

1.2552％

1.0288％

1.1586％

8.30％

杂质E

0.0573％

0.0558％

0.0580％

0.0555％

0.0491％

6.40％

试验结果表明，相对标准偏差(RSD)在6.40％～15.00％之间，表明本方法的稳定性良好。

对比例1

对比例1和实施例1的检测方法相同，不同之处在于S2的色谱条件，具体为：

流动相为甲醇:0.01％高氯酸水溶液＝(30～80):(70～20)(v/v)进行梯度洗脱，检测结果如图9所示。

从图9可看出，供试品溶液中杂质A未检出，且杂质D峰形不佳，理论塔板数低于5000，该色谱条件无法对4-肟甲基-1-萘甲酸中有关物质的含量进行准确检测。

对比例2

对比例2和实施例1的检测方法相同，不同之处在于S2的色谱条件，具体为：

柱温：40℃，检测结果如图10所示。

从图10可看出，温度过高导致杂质E出现峰分叉现象，该色谱条件无法对4-肟甲基-1-萘甲酸中有关物质的含量进行准确检测。

对比可知，色谱条件的改变，对于检测效果有着难以预见的影响。本发明所限定的色谱条件，可以很好地实现4-肟甲基-1-萘甲酸与各有关物质色谱峰之间的完全分离，具有专属性强、灵敏度高、回收率好、线性关系优异且耐用性好的优点。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种4-肟甲基-1-萘甲酸中有关物质的检测方法，所述有关物质为1-甲基萘、4-乙酰-1-甲基萘、4-甲基-1-萘甲酸、4-甲酰基萘-1-羧酸和1,4-萘二甲酸，包括如下步骤：

配制4-肟甲基-1-萘甲酸及有关物质的对照品溶液；

配制4-肟甲基-1-萘甲酸供试品溶液；

使用高效液相色谱测定对照品溶液和供试品溶液的色谱图，所述高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为高氯酸水溶液，洗脱程序为梯度洗脱；其中，使用的色谱柱为Kromasil 100-5-C18色谱柱：4.6mm×100mm，5µm，梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：以体积分数计，0min～8min，30％～70％运行；8min～12min，70％～80％运行；12min～15min，80％运行；15.1min～20min，30％运行；

根据对照品溶液和供试品溶液的色谱图，利用主成分自身对照法确定供试品溶液中有关物质的含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流动相B中高氯酸的体积分数为0.01%～0.1%。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱中的流速为0.9mL/min～1.5mL/min。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱中的色谱柱温度为25℃～35℃。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱中的进样量为5µL～15µL。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱中的检测波长为240nm～250nm。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述对照品溶液质量浓度为2.5µg/mL～10µg/mL，供试品溶液质量浓度为0.4mg/mL～1.0mg/mL。

8.根据权利要求1～7任一项所述的检测方法，其特征在于：所述对照品溶液和供试品溶液均采用体积分数为30%～60%的乙腈水溶液进行配制。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

使用体积分数为30%～60%的乙腈水溶液配制质量浓度为2.5µg/mL～10µg/mL对照品溶液和0.4mg/mL～1.0mg/mL供试品溶液；

使用高效液相色谱测定对照品溶液和供试品溶液的色谱图，所述高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.01%～0.1%的高氯酸水溶液，其中：梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：以体积分数计，0min～8min，30％～70％运行；8min～12min，70％～80％运行；12min～15min，80％运行；15.1min～20min，30％运行；流动相的流速为0.9mL/min～1.5mL/min；进样量为5µL～15µL；色谱柱温度为25℃～35℃；检测波长为240nm～250nm；

根据对照品溶液和供试品溶液的色谱图，利用主成分自身对照法确定供试品溶液中有关物质的含量。

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