CN114097925A - 一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法及应用，包括菌种的活化和菌液制备、五倍子粉浆制备、发酵培养和发酵五倍子成品制备，以及养殖试验和攻毒试验，通过单因素试验和正交试验确定五倍子粉最佳发酵条件为pH为6、料水比为2.5％、时间24h、温度35℃。本发明公开的一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法，相对于发酵前，发酵后五倍子总氨基酸含量提高1倍以上，没食子酸含量提高1倍以上，并通过养殖试验确定饲料中添加0.5～2％发酵五倍子可以显著提高青虾的增重率、特定生长率，并且显著降低饲料系数，提高抗氧化活性；通过攻毒试验确定饲料中添加2％发酵五倍子可显著降低青虾病原菌感染死亡率。
Description
技术领域
本发明涉及一种五倍子的发酵方法，具体为一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法及应用，属于发酵技术领域。
背景技术
五倍子(Gallnut)，别名文蛤、百虫仓、木附子等，是某些蚜虫寄主在漆树科盐肤木属树木的叶上寄生形成的虫瘿。我国主要生产五倍子的区域为四川、贵州、云南、湖南、湖北、陕西，其中四川产量最高。五倍子具有抗氧化、抗菌的功能、其主要化学成分主要包括鞣质、没食子酸等。其中没食子酸是一种天然多酚类物质，具有很强的抗氧化作用、抗病毒作用、抑菌作用。有研究发现，利用微生物发酵过程中借助微生物产生的酶系，可以有效的降解发酵原料中的一些抗营养因子，提高发酵产物的适口性，产生维生素、有机酸等未知因子，增加发酵产物的营养价值，从而能有效的提高动物采食量，增强其免疫能力。并且发酵益生菌的代谢产物能够有效降解水体中的有机物，有效净化了养殖水体的生态环境。
五倍子作为天然中草药，具有纯天然、无毒且不易产生耐药性等优点，在水产养殖中主要用于防治水产动物疾病、增强机体免疫力、以及促生长。本发明使用有益菌株对五倍子进行发酵，旨在提高五倍子的营养价值，对开发新型水产饲料添加剂奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法及应用，通过发酵提高五倍子的营养水平和有效成分。
本发明的第二个目的在于提供上述发酵五倍子粉作为饲料添加剂在水产饲料中的应用，将其添加到饲料中可显著提高动物生长性能，降低饵料系数和提高抗氧化机能。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法，包含如下步骤，
S1.菌种的活化和菌液制备
将解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCB分别接种到LB固体培养基中，35℃培养24h，用接种环挑取LB固体培养基中已活化的单菌落接种到LB液体培养基中，35℃培养24h后测定菌液浓度，使用灭菌的PBS稀释菌液，制备活菌数为1×107CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCB菌悬液；
S2.五倍子粉浆制备
将五倍子粉碎后加入去离子水形成五倍子粉浆，将五倍子粉浆的pH调节为6～7并灭菌，待灭菌完成冷却至室温，待用；
S3.发酵培养
将步骤(2)中所得的淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCB3种菌悬液按2：1∶1的比例接入到发酵罐中，总接种量为2～4％，设置发酵罐转速为180r/min，发酵温度30～35℃，发酵时间24～36h，得到五倍子发酵液；
S4.发酵五倍子成品制备
将步骤(3)中五倍子发酵液干燥后进行超微粉碎，得到发酵五倍子粉，并检测发酵前与发酵后五倍子总氨基酸和没食子酸含量，结果显示，相对于发酵前，发酵后五倍子总氨基酸含量提高1倍以上，没食子酸含量提高1倍以上。
优选地，所述LB固体培养基组成包含蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、NaCl 5g/L和琼脂15～20g/L，所述LB液体培养基组成包含蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L和NaCl 5g/L，所述LB固体培养基和LB液体培养基均以蒸馏水定容配置，pH7～7.2。
优选地，所述步骤S2中，将干燥的五倍子用多功能粉碎机粉碎后，经40～60目筛，获得五倍子粉，粉碎机型号为CWJZ-30，购自广州旭朗机械设备有限公司。
优选地，所述步骤S2中按2.5％～5％料水比称量去离子水和五倍子粉，充分搅拌均匀，制备获得五倍子浆。
优选地，所述步骤S2分别采用1mol/L的盐酸溶液和1mol/L的氢氧化钠溶液调节五倍子浆液的pH为6～7，随后在121℃下高压灭菌30min。
优选地，所述解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA保藏号为CCTCCNO：M 2015602；植物乳杆菌FF34保藏号为CCTCC NO：M 20211221；丁酸梭菌JSIM-MCB保藏号为CGMCC No.1647。
优选地，通过单因素试验和正交试验确定五倍子粉发酵的适宜料水比、pH、发酵时间和发酵温度，以单因素试验结果为基础，通过设计四因素三水平L9(34)正交实验确定最佳发酵条件为pH为6、料水比为2.5％、时间24h、温度35℃。
优选地，所述步骤S4中的干燥条件为在-20℃～-40℃条件下真空干燥。
一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明通过有益微生物发酵的方法，有效降低或消除五倍子粉中的抗营养因子，提高五倍子的营养价值；
2、本发明五倍子粉的发酵工艺优化后，具有发酵周期短，发酵条件易控制，操作简单等特点；
3、本发明提供了一种五倍子粉的发酵生产工艺方法，发酵后的五倍子中总氨基酸含量，没食子酸含量和蛋白质含量分别比发酵前提高了115.59％、147.16％和23.72％，此方法提供的发酵五倍子在青虾饲料中使用具有显著的促生长和提高免疫的功效；
4、饲料中添加0.5～2％发酵五倍子可以显著提高青虾的增重率、特定生长率，并且显著降低饲料系数，提高抗氧化活性，减少饲料投入成本，提高养殖经济效益；此外，饲料中添加2％发酵五倍子可显著降低青虾病原菌感染死亡率。因此，本发明所提供的发酵五倍子具有显著的促生长和抗病效果，在水产饲料中具有广阔的应用空间。
附图说明：
图1为本发明发酵料水比优化结果。
图2为本发明发酵时间优化结果。
图3为本发明发酵温度优化结果。
图4为本发明pH优化结果。
图5为本发明发酵五倍子投喂青虾霍乱弧菌攻毒后累计死亡率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明所采用试验方法均为常规方法，所用试验器材、材料、试剂等均可以商家途径获得。
本发明中所用到的菌株为解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCBLB这三种。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JSSW-LA，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CCTCC，保藏号：CCTCC NO：M 2015602。保藏日期2015年10月12日，保藏期限：30年。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)FF34，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CCTCC，保藏号：CCTCC NO：M 20211221。保藏日期2021年9月26日，保藏期限：30年。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学。
丁酸梭菌又名酪酸梭状芽孢杆菌，酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)JSIM-MCB 20040312，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.1647，保藏日期2006年3月10日，保藏期限：30年。保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
上述菌株均为存活状态。
一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法及应用
实施例1发酵五倍子制备
(1)菌种的活化：将解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCBLB接种到LB固体培养基中，35℃培养24h；
LB固体培养基组成包含蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂15～20g/L，以蒸馏水定容配置，pH7～7.2；
(2)菌悬液制备：用接种环挑取已活化的单菌落接种到LB液体培养基中，35℃培养24h后测定菌液浓度，使用灭菌的PBS稀释菌液，制备活菌数为1×107CFU/mL的3种菌悬液；
LB液体培养基组成包含蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，以蒸馏水定容配置，pH7～7.2；
(3)发酵培养：将五倍子粉碎后过40～60目筛获得五倍子粉，按2.5％料水比加入去离子水，采用1mol/L的盐酸和氢氧化钠溶液将五倍子粉浆的pH调节为7，将五倍子粉浆倒入发酵罐中并在121℃的高压灭菌30min，待灭菌完成冷却至室温，将步骤(2)中所得的淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCB 3种菌悬液按2∶1∶1的比例接入到发酵罐中，总接种量为五倍子粉浆的4％，设置发酵罐转速为180r/min，发酵温度35G，时间24h，得到五倍子发酵液；
(4)发酵五倍子成品制备：将步骤(3)中发酵产物在-80℃条件预冷2h，在-20℃～-40℃条件下真空干燥后进行超微粉碎，得到发酵五倍子粉。
分别测定发酵前后五倍子粉的总氨基酸、没食子酸、总蛋白含量，结果如表1所示，发酵后的五倍子中总氨基酸含量为1532.88umol/g，没食子酸含量为6.58mg/g，蛋白质含量为163.82mg/g，分别比未发酵的五倍子提高了154.17％、145.28％、24.05％，上述结果表明，发酵后五倍子粉营养成分较未发酵的五倍子粉显著提高。
表1发酵前后五倍子粉的营养物质对比
上述实施例中，粉碎机型号为CWJZ-30，购自广州旭朗机械设备有限公司。
实施例2五倍子发酵工艺的条件对比试验
通过单因素试验和正交试验确定五倍子粉发酵的适宜料水比、pH、发酵时间和发酵温度。主要操作步骤如下：
1、单因素试验
1-1、料水比的单因素对比试验
按料水比分别为2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％称量五倍子粉待测发酵样品和去离子水，并将其充分搅拌混匀，将所得的五倍予浆pH调节为7，在高压灭菌在中121℃灭菌30分钟，待灭菌完成冷却至室温，将淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCB 3种菌悬液按2∶1∶1的比例接入到发酵罐中，总接种量为五倍子粉浆的4％，保持发酵温度为35℃，180r/min摇床发酵48h，发酵48h后将所得发酵液在4℃，6000r/min条件下离心10分钟，取上清液，测出发酵液总氨基酸含量，确定发酵料水比。每个试验做3个重复，最终取平均值。结果如图1所示，在料水比为2.5％时，发酵后的五倍子中总氨基酸含量最高。
1-2、发酵时间的单因素对比试验
保持发酵温度为35℃，料水比10％，将配制好的五倍子粉浆pH调节为7，将淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCB 3种菌悬液按2∶1∶1的比例接入到发酵罐中，总接种量为五倍子粉浆的4％，发酵时间分别为12h，24h，36h，48h，60h，摇床转速为180r/min，将所得发酵液在4℃，6000r/min条件下离心10分钟，取上清液，测出发酵液总氨基酸，确定发酵时间。每个试验做3个重复，最终取平均值。结果如图2所示，在发酵时间为24h时，发酵后的五倍子中总氨基酸含量最高。
1-3、发酵温度的单因素对比试验
保持发酵时间为48h，料水比10％，将配制好的五倍子粉浆pH调节为7，将淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCB 3种菌悬液按2∶1∶1的比例接入到发酵罐中，总接种量为五倍子粉浆的4％，发酵温度为25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，摇床转速为180r/min，发酵48h后将所得发酵液在4℃，6000r/min条件下离心10分钟，取上清液，测出发酵液总氨基酸含量，确定发酵温度范围。每个试验做3个重复，最终取平均值。结果如图3所示，在发酵温度30℃时，发酵后的五倍子中总氨基酸含量最高。
1-4、pH的单因素对比试验
保持发酵温度35℃，发酵时间48h，料水比10％，将淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCB 3种菌悬液按2：1∶1的比例接入到发酵罐中，总接种量为五倍子粉浆的4％，发酵pH为5、6、7、8、9，摇床转速为180r/min，发酵48h后将所得发酵液在4℃，6000r/min条件下离心10分钟，取上清液，测出发酵液总氨基酸含量，确定发酵最适pH范围。每个试验做3个重复，最终取平均值。结果如图4所示，在发酵pH为6时，发酵后的五倍子中总氨基酸含量最高。
2、正交试验
以上述单因素试验结果为基础，通过设计四因素三水平L9(34)正交试验进一步确定发酵五倍子的最适发酵条件，考察因素为发酵料水比、发酵温度、发酵时间以及发酵pH。设计因素和水平如表2所示，共计做9组实验，每组发酵摇床转速均为180r/min，发酵完成后，将所得发酵液在4℃，6000r/min条件下离心10分钟，取上清液待测。L9(34)正交设计及结果如表3所示。
表2五倍子发酵正交试验各因素水平表
表3正交试验结果
注：表中T1-T3为1-3没食子酸含量之和；n为重复数；K1-K3为T1-T3/n；R为T1-T3中最大值减去最小值。
根据正交实验结果可知，本试验影响因素作用的主次因素为A＞D＞C＞B，即影响因素主次因素为pH＞温度＞时间＞料水比。结合表数据，各因素取均数估计最高者，确定最佳发酵条件为：A1B1C2D2，即最佳发酵条件为pH为6、料水比为2.5％、时间24h、温度35℃。
在最优发酵培养条件下再次进行发酵，测定总氨基酸、没食子酸、总蛋白含量。结果显示，通过本例的实施，发酵后的五倍子中总氨基酸含量为1303.53umol/g，没食子酸含量为6.51mg/g，蛋白质含量为129.67mg/g，比未发酵的五倍子提高了115.59％、147.16％、23.72％。
实施例3发酵五倍子粉在水产动物饲料中应用效果
本实施例中，设计了4组试验用配合饲料，以鱼粉、豆粕、菜粕、虾粉为主要蛋白源，鱼油和大豆油为主要脂肪源，以基础饲料作为对照组，试验组在此基础上添加0.25％、0.5％、1％、2％的发酵五倍子，试验饲料配方及主要营养物质详见表4。试验对象为青虾，购自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴大浦基地，平均规格为0.28±0.03g，每组3个重复，每个重复50尾虾。每日根据饲料分组情况投喂相应的饲料，日投喂量为虾体重的5％，根据虾的摄食情况和生长情况调整投喂量，以投喂1h后吃完为宜，每日投喂3次(8:00、12:00和18:00)，均为饱食投喂。
养殖桶直径为1m，水位保持40±5cm，定期检测水质指标，保证试验期间溶氧≥6.0mg/L，pH7.3±1.2，氨氮＜0.2mg/L，亚硝酸盐＜0.005mg/L。每天使用排污管进行排污，每周进行一次换水，保证良好的水质。每天观察虾的生长和摄食情况，发现死虾后及时捞起，称重并做好记录，养殖试验共进行56d。
养殖试验结束后，每个平行选取10只青虾继续暂养，定期投喂各组饲料，于第7天以非O1霍乱弧菌(分离于患病青虾)进行攻毒试验，挑选生长性能较好的2％添加组和对照组进行攻毒试验。每个试验缸中挑选10只，对照组和实验组设置三个重复。选用LB液体培养基进行霍乱弧菌的活化和培养，摇床温度28℃、转速180r/min条件下振荡培养18h，计算活菌数后，使用灭菌生理盐水将菌液浓度调至梯度菌悬液。正式实验开始前开展预试验确定合适的注射浓度和注射体积，注射部位为虾的第二腹节与第三腹节之间肌肉。通过预实验确定合适的注射浓度为1×108CFU/ml，注射体积为10μL，注射后于6h、12h、24h、48h观察记录青虾的死亡情况，统计累计死亡率。
表4试验饲料配方及主要营养物质
表5发酵五倍子对青虾生长性能的影响
注：数据为平均值±标准误，同一行中不相同的字母表示其两两差异显著(P＜0.05)。
表6发酵五倍子对青虾血清抗氧化酶活的影响
如表5-表6所示，通过评估生长性能、抗氧化能力和抗病力，发现在青虾的配合饲料中添加0.5～2％发酵五倍子可以显著提高青虾的增重率、特定生长率，并且显著降低饲料系数，提高抗氧化活性，减少饲料投入成本，提高养殖经济效益；此外，饲料中2％发酵五倍子可显著降低青虾病原菌感染死亡率(如图5所示)。因此，本发明所提供的发酵五倍子具有显著的促生长和抗病效果，在水产饲料中具有广阔的应用空间。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (9)
1.一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法，其特征在于：包含如下步骤，
S1.菌种的活化和菌液制备
将解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCB分别接种到LB固体培养基中，35℃培养24h，用接种环挑取LB固体培养基中已活化的单菌落接种到LB液体培养基中，35℃培养24h后测定菌液浓度，使用灭菌的PBS稀释菌液，制备活菌数为1×107CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCB菌悬液；
S2.五倍子粉浆制备
将五倍子粉碎后加入去离子水形成五倍子粉浆，将五倍子粉浆的pH调节为6～7并灭菌，待灭菌完成冷却至室温，待用；
S3.发酵培养
将步骤(2)中所得的淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、植物乳杆菌FF34和丁酸梭菌JSIM-MCB 3种菌悬液按2∶1∶1的比例接入到发酵罐中，总接种量为2～4％，设置发酵罐转速为180r/min，发酵温度30～35℃，发酵时间24～36h，得到五倍子发酵液；
S4.发酵五倍子成品制备
将步骤(3)中五倍子发酵液干燥后进行超微粉碎，得到发酵五倍子粉，并检测发酵前与发酵后五倍子总氨基酸和没食子酸含量，结果显示，相对于发酵前，发酵后五倍子总氨基酸含量提高1倍以上，没食子酸含量提高1倍以上。
2.根据权利要求1所述一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法，其特征在于：所述LB固体培养基组成包含蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、NaCl 5g/L和琼脂15～20g/L，所述LB液体培养基组成包含蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L和NaCl 5g/L，所述LB固体培养基和LB液体培养基均以蒸馏水定容配置，pH7～7.2。
3.根据权利要求1所述一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法，其特征在于：所述步骤S2中，将干燥的五倍子用多功能粉碎机粉碎后，经40～60目筛，获得五倍子粉，粉碎机型号为CWJZ-30，购自广州旭朗机械设备有限公司。
4.根据权利要求1所述一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法，其特征在于：所述步骤S2中按2.5％～5％料水比称量去离子水和五倍子粉，充分搅拌均匀，制备获得五倍子浆。
5.根据权利要求1所述一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法，其特征在于：所述步骤S2分别采用1mol/L的盐酸溶液和1mol/L的氢氧化钠溶液调节五倍子浆液的pH为6～7，随后在121℃下高压灭菌30min。
6.根据权利要求1所述一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA保藏号为CCTCC NO：M 2015602；植物乳杆菌FF34保藏号为CCTCC NO：M 20211221；丁酸梭菌JSIM-MCB保藏号为CGMCC No.1647。
7.根据权利要求1所述一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法，其特征在于：通过单因素试验和正交试验确定五倍子粉发酵的适宜料水比、pH、发酵时间和发酵温度，以单因素试验结果为基础，通过设计四因素三水平L9(34)正交实验确定最佳发酵条件为pH为6、料水比为2.5％、时间24h、温度35℃。
8.根据权利要求1所述一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法，其特征在于：所述步骤S4中的干燥条件为在-20℃～-40℃条件下真空干燥。
9.一种用于水产动物促生长和抗病的五倍子发酵方法的应用。
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